一种利用啤酒麦糟制备多肽的方法 【技术领域】
本方法属于食品和保健领域，特别涉及一种利用啤酒麦糟制备多肽的方法。
背景技术
啤酒糟是啤酒酿造生产的主要废弃物之一。据估计2010年我国的啤酒产量将达到3000万吨/年，啤酒糟产量也将达到750万吨/年(湿糟)。据测定，其蛋白质含量为23％～30％(干基)，可见啤酒糟是一种很好的蛋白质资源。长期以来，大多数厂家主要是将湿糟作为粗饲料直接低价出售，其收益甚微；有少数厂家则是将啤酒糟直接排放，不仅造成严重的环境污染，还导致资源的浪费。因此开发综合利用啤酒糟成为研究人员的重要任务。
生物活性肽是指具有特殊生理活性的肽类，其消化吸收性能强于氨基酸，其营养和生理效果更为优越，不仅易于消化吸收，还具有抗过敏性，降低胆固醇、血压，增强免疫力等诸多生理功能。近年来，生物活性多肽以其独具的生理活性强、免疫原性低、疗效高等诸多优点，在人类疾病治疗中的地位日趋重要，目前已成为国际研究的热点之一。因此，以啤酒糟为原料，开发制备具有生物活性的多肽，将大大提高啤酒糟的利用率，以此为基础生产高附加值的产品，更会为市场注入广大的利润空间。
开发利用啤酒糟的研究早有报道，大部分的研究仅限于利用啤酒糟生产动物饲料，只有少数报导有关于啤酒糟的综合利用，如日本麒麟株式会社开发出从啤酒糟中制取高蛋白的方法；专利文献“啤酒糟生产的生物蛋白”，以啤酒糟为原料，制备出高质量的生物蛋白，但都并未延伸到多肽及其生物活性方面。目前，对天然多肽的生物活性的研究日益增多，但对来源丰富的啤酒糟多肽的制备及活性研究并未见报道。
【发明内容】
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种利用啤酒麦糟制备多肽的方法。
本发明的又一目的在于提供一种上述方法制备的活性多肽，该多肽具有较高的抑制α-葡萄糖苷酶即降血糖活性。
本发明的再一目的在于提供上述活性多肽的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用啤酒麦糟制备多肽的方法，包括以下操作步骤：
(1)将湿啤酒糟进行干燥、粉碎和过筛，得到啤酒糟；每100g啤酒糟加入1000～4000mL抽提剂，室温下搅拌，过滤去渣，离心，得到蛋白提取液；将所得蛋白提取液调节pH4.0～5.0进行沉淀，去上清液，真空冷冻干燥，得到粗多肽；
(2)在步骤(1)所得粗多肽中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节pH值至6.5～8.5；再加入Alcalase碱性蛋白酶，加热至45～65℃，在振荡条件下水解1～5h，得到水解液；所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的加入量为10～30mL每克啤酒糟粗蛋白，所述Alcalase碱性蛋白酶的加入量为0.1～0.25mL每克啤酒糟粗蛋白；
(3)将步骤(2)所得水解液于沸水浴灭酶2～6min，离心，得到多肽液；
(4)取步骤(3)所得多肽液用凝胶柱分离，分别收集各峰后合并，浓缩，冷冻干燥，得到活性多肽。
步骤(1)所述干燥为冷冻干燥；所述粉碎为采用万能粉碎机进行粉碎；所述过筛为过100目筛；所述搅拌的时间为60～120min。
步骤(1)所述搅拌的时间为70min。
步骤(1)所述调节pH是采用摩尔浓度为0.2mol/L的柠檬酸调节至4.5～5.0。
步骤(1)所述抽提剂为乙醇-氢氧化钠混合液或碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液；所述乙醇-氢氧化钠混合液为体积比为1∶2的乙醇和氢氧化钠混合而成，所述乙醇的体积百分比浓度为70％～95％；所述氢氧化钠的摩尔浓度为0.01～0.10mol/L；所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的pH值为8.0～11.0。
步骤(2)所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的加入量为15mL每克啤酒糟粗蛋白，所述调节pH值是调节至8.0，所述Alcalase碱性蛋白酶的加入量为0.15mL每克啤酒糟粗蛋白；所述加热为加热至50℃；所述水解的时间为2h。
步骤(3)所述离心的转速为2000～6000rpm，时间为10～30min。
步骤(4)所述凝胶柱为Sephadex G15凝胶柱或Sephadex G25凝胶柱；所述取上清液的上样量是5～10ml，洗脱液为蒸馏水，流速2.0～4.0mL/min。
一种活性多肽，是根据上述方法制备的。
上述的活性多肽应用于制备降血糖药物。
本发明的原理是：
1、将冷冻干燥后的啤酒糟分别经过处理1：万能粉碎机粉碎后过100目筛和处理2：超微粉碎处理，测定处理后原料蛋白质含量以及相同条件下醇-碱提取物的蛋白含量；利用凯氏定氮法测定蛋白含量，结果表明，处理1均优于处理2，即啤酒糟的预处理采用万能粉碎机粉碎后过100目筛可显著提高目标产物啤酒糟蛋白的纯度至50％左右，因此本发明均采用此方法对啤酒糟进行初步蛋白分离。
2、本发明对Alcalase碱性蛋白酶水解啤酒糟蛋白条件的优化：考察水解温度、水解时间、液固比、加酶量、pH值等因素对啤酒糟蛋白水解度DH值的影响；以正交试验确定碱性蛋白酶Alcalase水解啤酒糟蛋白质地优化条件，结果确定碱性蛋白酶Alcalase水解啤酒糟蛋白最佳条件为：pH8.0、液固比15mL/g、加酶量0.15mL/g、水解温度50℃、水解时间2h，进一步进行验证试验；试验结果显示，在此水解条件下，碱性蛋白酶Alcalase水解啤酒糟蛋白DH值达到18.54％。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：本发明在制备过程中未引入有害物质，且产品取自天然，来源广泛，使所得天然活性物质经体外试验表明具有明显的降血糖活性，可以作为功能性因子添加到食品中，使其具有一定的降血糖功能。
【附图说明】
图1为本发明的工艺流程图。
图2为实施例2中粗多肽的Sephadex G15凝胶层析图谱。
【具体实施方式】
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1工艺流程如图1所示
(1)将湿啤酒糟(由广州珠江啤酒集团有限公司提供)进行真空冷冻干燥，万能粉碎机粉碎后，过100目筛，得到啤酒糟；每100g啤酒糟按固液比1∶10加入1000mL抽提剂，所述抽提剂为95％乙醇∶0.01mol/LNaOH＝1∶2(v∶v)，室温下搅拌60min，过滤去渣，2000rpm离心30min，得到蛋白提取液；将所得蛋白提取液用0.2mol/L柠檬酸调节pH4.5进行蛋白质等电点沉淀，去上清液，真空冷冻干燥，得到粗多肽；
(2)在步骤(1)所得粗多肽中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节pH值至6.5；加入Alcalase碱性蛋白酶(购自诺维信公司)，加热至65℃，在振荡条件下水解1h，得到水解液；所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的加入量为10mL每克啤酒糟粗蛋白，所述Alcalase碱性蛋白酶的加入量为0.15mL每克啤酒糟粗蛋白；
(3)将步骤(2)所得水解液于沸水浴灭酶2min，2000rpm离心30min，得到多肽液；
(4)将步骤(3)所得多肽液用Sephadex G15凝胶柱分离并脱盐，分离条件为：上样量5ml，洗脱液为蒸馏水，流速2.0mL/min，收集洗脱时间40min～60min内组分，浓缩，冷冻真空干燥，得到活性多肽。
将所得活性多肽对α-葡萄糖苷酶活性的影响试验结果表明，0.3mg/mL的多肽溶液在蔗糖底物浓度为0.1mol/L时，其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到最大值45.85％，即制成具有降血糖活性的活性多肽。
实施例2
(1)将湿啤酒糟(由广州珠江啤酒集团有限公司提供)进行真空冷冻干燥，万能粉碎机粉碎后，过100目筛，得到啤酒糟；每100g啤酒糟按固液比1∶40加入4000mL抽提剂，所述抽提剂为70％乙醇∶0.10mol/LNaOH＝1∶2(v∶v)，室温下搅拌120min，过滤去渣，6000rpm离心10min，得到蛋白提取液；将所得蛋白提取液用0.2mol/L柠檬酸调节pH4.0进行蛋白质等电点沉淀，去上清液，真空冷冻干燥，得到粗多肽；
(2)在步骤(1)所得粗多肽中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节pH值至8.5；加入Alcalase碱性蛋白酶(购自诺维信公司)，加热至45℃，在振荡条件下水解2h，得到水解液；所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的加入量为20mL每克啤酒糟粗蛋白，所述Alcalase碱性蛋白酶的加入量为0.25mL每克啤酒糟粗蛋白；
(3)将步骤(2)所得水解液于沸水浴灭酶5min，6000rpm离心10min，得到多肽液；
(4)将步骤(3)所得多肽液用Sephadex G15凝胶柱分离并脱盐，分离条件为：上样量5ml，洗脱液为蒸馏水，流速3.0mL/min，收集洗脱时间33min～53min内组分，浓缩，冷冻真空干燥，得到活性多肽；层析图谱如图2所示，活性多肽经凝胶柱分离后，出现两个明显的峰，即两种物质，峰I(洗脱时间为33.770min-52.488min)和峰II(洗脱时间为52.488min-115min)。
将活性多肽对α-葡萄糖苷酶活性的影响试验结果表明，0.2mg/mL的多肽溶液在蔗糖底物浓度为0.1mol/L时，其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到30.75％，即制成具有降血糖活性的活性多肽。
实施例3
(1)将湿啤酒糟(由广州珠江啤酒集团有限公司提供)进行真空冷冻干燥，超微粉碎，过100目筛，得到啤酒糟；每100g啤酒糟按固液比1∶30加入3000mL抽提剂，所述抽提剂为70％乙醇∶0.05mol/LNaOH＝1∶2(v∶v)，室温下搅拌70min，过滤去渣，4000rpm离心20min，得到蛋白提取液；将所得蛋白提取液用0.2mol/L柠檬酸调节pH 5.0进行蛋白质等电点沉淀，去上清液，真空冷冻干燥，得到粗多肽；
(2)在步骤(1)所得粗多肽中加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节pH值至7.5；加入Alcalase碱性蛋白酶(购自诺维信公司)，加热至50℃，在振荡条件下水解5h，得到水解液；所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的加入量为30mL每克啤酒糟粗蛋白，所述Alcalase碱性蛋白酶的加入量为0.10mL每克啤酒糟粗蛋白；
(3)将步骤(2)所得水解液于沸水浴灭酶3min，3000rpm离心15min，得到多肽液；
(4)将步骤(3)所得多肽液用Sephadex G25凝胶柱分离并脱盐，分离条件为：上样量10ml，洗脱液为蒸馏水，流速4.0mL/min，收集洗脱时间23min～42min内组分，浓缩，冷冻真空干燥，得到活性多肽。
将活性多肽对α-葡萄糖苷酶活性的影响试验结果表明，0.3mg/mL的多肽溶液在蔗糖底物浓度为0.15mol/L时，其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到40.25％，即制成具有降血糖活性的活性多肽。
实施例4：对本发明啤酒糟多肽进行体外降血糖活性的检测
1、活性检测方法
1.1、α-葡萄糖苷酶活力的测定
在反应体系中依次加入：pH 6.8磷酸钾缓冲溶液0.6mL，α-葡萄糖苷酶0.1mL，蔗糖底物0.1mL，混匀，在37℃条件下水浴反应10min，加入0.1mol/L碳酸钠溶液(Na2CO3)1mL终止反应；利用葡萄糖试剂盒测定葡萄糖的含量，设定5.55mmol/l葡萄糖溶液为标准对照；将在37℃、pH 6.8的条件下，1L反应体系中每分钟生成1μmol葡萄糖定义为一个酶活力单位。
1.2、啤酒糟多肽对α-葡萄糖苷酶活性的影响
取经凝胶过滤层析分离纯化后的多肽溶液0.3mL加入到反应体系中(空白对照组加入相同体积的蒸馏水)，加pH 6.8磷酸缓冲液0.6ml，加酶液0.1ml，37℃水浴10min，其他方法同酶活力测定；观察啤酒糟多肽对α-糖苷酶的抑制作用。
抑制率＝(空白组酶活力-抑制剂组酶活力)/空白组酶活力量×100％
2、活性检测结果
体外降糖活性检测表明：凝胶分离后两组物质，峰I和峰II，都具有一定的抑制α-葡萄糖苷酶作用，即降血糖作用。考察多肽浓度对降血糖活性的结果表明，随着多肽浓度的增大，多肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率先急剧升高，后又急剧降低，且在多肽浓度为0.2mg/mL～0.4mg/mL之间时，多肽呈现对α-葡萄糖苷酶较高的抑制作用；同时，在蔗糖底物浓度逐渐增大的过程中，0.3mg/mL的多肽溶液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率均呈现一致减小的趋势。在蔗糖底物浓度为最小0.1mol/L，啤酒糟多肽对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到最大值45.85％，蔗糖底物浓度0.35mol/L，抑制率为最小，仅为5.56％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。