以重组甲醇营养型酵母发酵制备植酸酶的方法 【技术领域】
本发明涉及一种以重组甲醇营养型酵母发酵制备植酸酶的改进方法，属生物工程领域。
背景技术
植酸(又称肌醇六磷酸)通常以植酸盐的形式，广泛存在植物体中，不能被单胃动物所利用。植酸酶，即肌醇六磷酸水解酶(Myo-inositol-hexaphosphatephosphohydrolase)可使植酸磷降解成肌醇和磷酸，是一类催化六磷酸肌醇脱掉磷酸基团反应酶的总称，有三种类型：肌醇六磷酸3-磷酸水解酶(Myo-inositol-hexaphosphate 3-phosphohydrolase，EC 3.1.3.8)、肌醇六磷酸6-磷酸水解酶(Myo-inositol-hexaphosphate 6-phosphohydrolase，EC3.1.3.26)和非特异性的正磷酸盐单酯磷酸水解酶。植酸的水解作用是从肌醇六元环上第3个和第6个O-P键上开始，然后逐个水解。作用于植酸第6位O-P的植酸酶称为6-植酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶)，而从第3位O-P开始降解的植酸酶称为3-植酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶)。植酸酶主要由植物(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶)和微生物(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶)产生，它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷的排泄量减少40％，降低植酸盐的抗营养作用和降低植酸磷对环境的污染等作用。
现有采用发酵法制备植酸酶的方法有US 5,436,156，CN 1405303A及CN1184156A所报道的三种，从整体上说均存在着植酸酶酶活(FTU)低及制备成本高等缺陷。
【发明内容】
本发明目的在于，提供一种以重组甲醇营养型酵母发酵制备植酸酶的方法，以此克服现有技术中存在的不足。
本发明的构思是这样地：
重组甲醇营养型酵母发酵制备植酸酶分为二个阶段：一为细胞生长阶段；二为外源基因的蛋白表达阶段。在细胞生长阶段，其目标是实现高细胞密度，由于底物浓度(碳源)过高往往抑制细胞生长，因此又存在批培养(发酵)阶段和补料培养(发酵)阶段。对于本基因工程菌是表达附加值较低和发酵规模需要很大的植酸酶，细胞生长阶段所需的碳源和氮源的价格是决定整个生产过程的成本之关键，本发明中采用价格低廉的糖浆、蔗糖、糖蜜、乳糖、淀粉水解液或工业葡萄糖为碳源(现有技术中碳源为相对高价的甘油或所用葡萄糖浓度较高，达100g/L，本发明较低仅5g/L，避免了发生葡萄糖效应和供氧不足的缺点)；易于运输和贮藏铵盐、玉米浆、黄豆粉或棉籽粉为氮源(现有技术中氮源为不易贮藏和运输的氨水)。此外，本发明通过适当的补料方式及对整个发酵过程的pH值的控制，实现了低成本高密度发酵制备植酸酶的目的。
技术方案：
本发明所说的以重组甲醇营养型酵母发酵制备植酸酶的方法，包括细胞分批发酵、补料发酵及外源基因的蛋白表达阶段，涉及的启动子有醇氧化酶启动子(PAOX)和甲醇启动子(PMOX)等，其特征在于，在所说的细胞分批发酵和补料发酵阶段中的碳源为糖浆、蔗糖、糖蜜、乳糖、淀粉水解液或工业葡萄糖；氮源为铵盐、玉米浆、黄豆粉或棉籽粉；在所说的细胞分批发酵和补料发酵阶段的pH＝5.0-5.5，在所说的外源基因的蛋白表达阶段的pH＝4.0-4.8；
其中所说的重组甲醇营养型酵母包括毕赤酵母(Pichia)或汉逊酵母(P.hansenesis)等，优选的酵母是毕赤酵母(Pichia)。
所说的氮源优选铵盐，更优选为硫酸铵。
现有技术中发酵的整个过程pH均为5.0-5.5，为恒pH发酵，而本发明采用变pH控制发酵，且变pH的方式不是现有技术所说的通过加酸或加碱来实现，而是采用通过控制碳源补料方式来实现。
发明的优点在于，采用了低廉的碳源和氮源进行工程植酸酶发酵过程的细胞生长的方法，以及采用了变pH发酵的技术，从而实现工程植酸酶的高密度表达，与现有技术(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995；姚斌等，CN 1405303A和CN 1184156A)相比，本发明所说的制备方法其成本更低廉且所制得的植酸酶酶活更高。
具体实施方法
下面通过实施案例对明作进一步的说明，其目的是为更好理解本发明的内容，所举实施例并不限制本发明的保护范围：
实施例1
所用的菌株为SP8847或YY113(MutsHis+)，由上海永业农科生物技术有限公司构建。
将从平板上挑取一单菌落接入YPD种子培养基(500mL三角烧瓶装液量50mL)中(1L含：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖10g)30℃下220r/min培养20小时。然后按10％接种量接于装20L分批培养基的50L发酵罐中(1L含：工业葡萄糖5.0g，硫酸铵[(NH4)2SO4]20g，PTM1 12mL，磷酸26mL)，接种前用2mol/LKOH调pH至5.2。通过控制空气流量和转速维持溶解氧浓度在25％以上。分批培养在碳源代谢尽后结束，再补入补料培养基(1L含：工业葡萄糖500g，硫酸铵[(NH4)2SO4] 5.0g，PTM1 12mL)使细胞继续生长，在发酵的40-50小时达到高密度，即细胞光密度(OD600)在400以上。在细胞生长即将结束前1小时将pH设定值由5.2设定为4.8，使pH由于代谢碳源产生的有机酸而下降到至设定值，之后停止补碳源(工业葡萄糖)进入植酸酶表达阶段。当停止补工业葡萄糖后，当工业葡萄糖代谢尽后，溶解氧浓度(DO)将在1分钟内上升到70％以上，然后在开始补甲醇进行工程植酸酶的表达。
实施例2
除用蔗糖替代工业葡萄糖，细胞生长阶段的pH＝5.5，表达阶段的pH＝4.8外，其他条件与实施例1相同。
实施例3
除用糖浆替代工业葡萄糖，细胞生长阶段的pH＝5.0，表达阶段的pH＝4.0外，其他条件与实施例1相同。
实施例4
除用糖蜜替代工业葡萄糖，细胞生长阶段的pH＝5.2，表达阶段的pH＝4.4外，其他条件与实施例1相同。
以本发明的碳源和氮源进行细胞生长培养时，细胞光密度(OD600)可达400-700，细胞干重为150g/L以上，达到高密度发酵的要求。本发明与现有技术相比的结果见下表：
表 本发明细胞生长碳源和氮源与国内外发明生产植酸酶的比较 生长阶段 碳氮源 本发明 US.5436156 CN 1405303A CN 1184156A 碳 源 糖浆、蔗糖、 糖蜜、乳糖、 淀粉水解液或 工业葡萄糖 5.0g/L 甘露-葡聚糖 70g/L 酵母提取 12.5g/L 甘油或葡萄糖 100g/L 甘油或葡萄糖 100g/L 氮 源 铵盐、玉米浆、 黄豆粉或棉籽 粉 20g/L 水解酪蛋白 25g/L 25％氨水 闭环控制流加 25％氨水 闭环控制流加 细胞密度 (干重， g/L) ＞150 ＞100 ＞100 植酸酶酶 活/FTU 2250 280 500 500