GLP-1-Fc融合蛋白质制剂 【发明领域】
本发明涉及胰高血糖素样肽类似物的可商购制剂，所述的胰高血糖素样肽类似物与免疫球蛋白的Fc部分融合。该制剂可以用于治疗糖尿病和肥胖症以及多种其它病症或障碍。
【发明背景】
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物和衍生物有希望在临床试验中用于治疗2型糖尿病。GLP-1诱导多种生物学效应，例如刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、抑制胃运动或肠运动，并且诱导重量减轻。GLP-1的显著特征是其刺激胰岛素分泌而不伴有低血糖相关危险的能力，所述低血糖相关危险见于应用胰岛素治疗或通过增加胰岛素表达起作用的某些类型的口服治疗时。
GLP-1(1-37)活性很低，并且GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2这两种天然存在的截短的肽在体内被迅速清除，并且具有极短的体内半寿期这一事实限制了涉及GLP-1肽的治疗的有效性。已知内源性产生的二肽基肽酶IV(DPP-IV)通过除去N端组氨酸和丙氨酸残基而使循环GLP-1肽失活，并且这是体内短半寿期的主要原因。
已经采取多种途径以在保持生物学活性的同时延长GLP-1肽的清除半寿期或降低该肽从机体的清除。一条途径涉及将GLP-1肽与免疫球蛋白Fc部分融合。免疫球蛋白典型地具有长体内循环半寿期。
例如，IgG分子在人体内具有至多23天的半寿期。免疫球蛋白Fc部分是这种体内稳定性的部分原因。在保留GLP-1分子生物学活性的同时，GLP-1-Fc融合蛋白质具有由免疫球蛋白Fc部分提供的稳定性的优点。
尽管此途径对于GLP-1疗法(参见WO 02/46227)是可行的，但是对多种融合蛋白质长时期反复施用时的抗原性存在普遍的顾虑。对于GLP-1-Fc融合体疗法，这尤其是一个顾虑，因为糖尿病患者一旦经诊断患有该疾病，就必须一生接受治疗。此外，如果Fc部分保留不需要的效应子功能，Fc融合蛋白质疗法可能是一个顾虑。该方法是PCT/US04/15595(WO2005/000892)的焦点，其中通过鉴定特别GLP-1-Fc融合蛋白质克服了与施用GLP-1-Fc融合蛋白质相关的关于潜在免疫原性和效应子活性的问题，所述特别GLP-1-Fc融合蛋白质反复和长期施用后，诱导免疫响应风险降低并且不再具有效应子功能。
对于在细菌细胞中合成产生或重组产生具有这种性质的融合蛋白质，在技术上过于庞大和复杂。这些融合蛋白质典型地在哺乳动物细胞、例如CHO、293或NS0中产生。观察到在哺乳动物细胞中产生的融合蛋白质比在细菌细胞中产生的非融合蛋白质更易于被内源蛋白酶降解以及化学改变。该问题试图在PCT/US 2005/045376(WO2006/068910)中克服，其中发现了包含GLP-1-Fc融合蛋白质，缓冲在约pH 6至约pH 8.5之间的制剂提供了增加的化学稳定性。
另外，当在检查中存在由宿主细胞蛋白酶引起的不稳定性时，如果其在物理上不稳定，该制剂可能不适合。本发明人还观察到另外一个问题是溶液制剂在长期贮存后形成可溶聚集物和不可溶颗粒。该问题试图通过赋形剂的特别组合和GLP-1-Fc融合蛋白质的特别浓度来克服。
发明概述
为了克服GLP-1-Fc融合蛋白质的溶液制剂在长期贮存后形成可溶聚集物和不可溶颗粒的问题，本发明人已经开发了物理和化学上稳定的溶液制剂，该溶液制剂包含约0.5至约10mg/mL GLP-1-Fc融合蛋白质、5至20mM柠檬酸盐缓冲液、0.01至0.05％(w/v)聚山梨酯-80和4.0至5.3％(w/v)甘露醇，并且pH为6-7。该制剂意外地并且相当大地提供了在长期贮存后形成较少的可溶聚集物和不可溶颗粒。另外，本发明人发现该溶液制剂经长期贮存后在注射器中比在小瓶中更稳定。
本发明还包括治疗患有糖尿病和肥胖症以及多种其它病症或障碍的患者的方法，该方法包括施用GLP-1-Fc融合蛋白质制剂。
发明详述
本发明的GLP-1-Fc融合蛋白质包含GLP-1化合物，其在C-端通过肽连接体与免疫球蛋白的Fc部分的类似物的N-端融合。融合蛋白质在生物学上用作单体或者用作同型二聚体并且比天然GLP-1具有增加的半寿期。优选的GLP-1-Fc融合蛋白质包含(SEQ ID NO：1)中给出的氨基酸序列。更优选的GLP-1-Fc融合蛋白质基本由(SEQ ID NO：1)中给出的氨基酸序列组成。最优选的GLP-1-Fc融合蛋白质由(SEQ ID NO：1)中给出的氨基酸序列组成。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys55-Pro-Pro-Cys58-Pro-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys90-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys150-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys196-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys254-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly(SEQ ID NO：1)
二硫键可以存在于链内(在A链或B链上)和/或链间(在A链和B链之间)。链内二硫键的实例是：Cys90A-Cys150A、Cys196A-Cys254A、Cys90B-Cys150B、Cys196B-Cys254B。链间二硫键的实例是：Cys55A-Cys55B、Cys58A-Cys58B。
生物学活性指的是融合蛋白质在体内与GLP-1受体结合和活化GLP-1受体并且引发响应的能力。响应包括但不限于分泌胰岛素、抑制胰高血糖素、抑制食欲、减轻重量、诱导饱腹感、抑制凋亡、诱导胰β细胞增殖以及分化胰β细胞。
GLP-1-Fc融合蛋白质制剂包含约0.25至约10mg/mL GLP-1-Fc融合蛋白质。优选融合蛋白质的浓度(mg/mL)范围为约0.5至10、0.5至5、0.5至2.5、0.5至2、0.5至1.67、0.5至1.5、0.5至1.25、0.5至1、0.5至0.9、0.5至0.8、0.5至0.75、0.6至2、0.7至2、0.8至2、0.9至2、0.5至3、0.6至3、0.7至3、0.8至3、0.9至3、0.5至4、0.6至4、0.7至4、0.8至4、0.9至4、1至2、1.1至2、1.2至2、1.3至2、1.4至2、1.5至2、1.6至2、0.7至1.67、0.9至1.1、1至4、1.0至4.0、0.5至5、0.25至7、0.25至5、0.25至4、0.25至3、0.25至2、0.25至1.5、0.25至1、0.25至0.5。优选GLP-1-Fc融合蛋白质地浓度(mg/mL)为约0.25、约0.42、约0.5、约0.6、约0.67、约0.7、约0.75、约0.8、约0.83、约0.9、约1、约1.1、约1.2、约1.25、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.67、约1.7、约1.8、约1.9、约2、约2.5、约3、约3.33、约4、约5、约6.67或约10。
GLP-1-Fc融合蛋白质制剂的缓冲范围为约5至20mM柠檬酸盐。优选柠檬酸盐浓度(mM)范围为约5至15、5至12.5、5至10、7.5至20、7.5至15、7.5至12.5、7.5至10、8至20、8至15、8至12.5、8至11、8至10、9至20、9至15、9至12.5、10至20、10至17.5、10至15、10至12.5、6至14、7至13、8至12、9至11、12至20、14至20、16至20和18至20。特别优选的柠檬酸盐的浓度范围为约9至约11和约8至约12mM。特别优选的柠檬酸盐的浓度为约10或约10.0。
pH调节的范围为约6至7以提供可接受的稳定性，以保持GLP-1-Fc融合蛋白质的溶解度和促胰岛素活性并且是非肠道施用可以接受的。可以通过加入酸、例如HCl，或加入碱例如NaOH将pH调节至预期的pH或者可以加入柠檬酸盐缓冲液和柠檬酸的组合以获得预期的缓冲浓度和预期的pH。优选pH值的范围为约6.3至6.7、6.25至6.75、6.2至6.8、6.15至6.85、6.1至6.9。优选pH值为约6.5。
GLP-1-Fc融合蛋白质制剂进一步包含甘露醇作为等张剂。甘露醇的浓度范围为4.0至5.3％(w/v)。单位“(w/v)”指的是组分的质量/最终制剂的体积。因此，甘露醇浓度为4.6％(w/v)的制剂中每mL制剂具有46mg甘露醇，或者以另一种方式表达，其具有4.6克甘露醇溶于总体积为100mL的制剂中。优选的甘露醇浓度(％(w/v))范围为约4.0至约4.1、约4.1至约4.2、约4.2至约4.3、约4.3至约4.4、约4.4至约4.5、约4.5至约4.6、约4.6至约4.7、约4.55至约4.75、约4.5至约4.8、约4.4至约4.9、约4.3至约5.0、约4.2至约5.1、约4.1至约5.2、约4.7至约4.8、约4.8至约4.9、约4.9至约5.0、约5.0至约5.1、约5.1至约5.2、约5.2至约5.3。优选的甘露醇浓度(％(w/v))为约4.3、约4.5、约4.55、约4.6、约4.65、约4.64、约4.7、约4.75、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2或约5.3。
GLP-1-Fc融合蛋白质制剂进一步包含聚山梨酯-80作为增溶剂和/或稳定剂。聚山梨酯-80的浓度范围为约0.01至0.05％(w/v)(或者以术语mg/mL表示，约0.1至0.5mg/mL)。聚山梨酯-80的该浓度是与GLP-Fc融合蛋白质和甘露醇组合确定的，以使可溶聚集物和不可溶颗粒的形成最小化。聚山梨酯-80优选的浓度(％(w/v))范围为约0.01至0.04、0.01至0.03、0.015至0.025。聚山梨酯-80优选的浓度范围为约0.018至约0.022％(w/v)。聚山梨酯-80另一个优选的浓度范围为约0.015至约0.025％(w/v)。聚山梨酯-80特别优选的浓度为约0.02％(w/v)。
特别优选的制剂包含具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的GLP-Fc融合蛋白质、浓度范围为约0.25至约10mg/mL，柠檬酸盐缓冲液、浓度为约10mM，聚山梨酯-80、浓度为约0.02％(w/v)，山梨醇、浓度为约4.6％(w/v)，并且pH为约6.5。另一个特别优选的制剂包含具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的GLP-Fc融合蛋白质、浓度范围为约0.25至约5mg/mL，柠檬酸盐缓冲液、浓度为约10mM，聚山梨酯-80、浓度为约0.02％(w/v)，山梨醇、浓度为约4.6％(w/v)，并且pH为约6.5。另一个特别的制剂包含具有SEQID NO：1氨基酸序列的GLP-Fc融合蛋白质、浓度范围为约0.25至约10mg/mL，柠檬酸盐缓冲液、浓度范围为约5至约20mM，聚山梨酯-80、浓度为约0.02％(w/v)，山梨醇、浓度范围为约4.5至约4.8％(w/v)，并且pH范围为约6.3至约6.7。另一个特别的制剂包含具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的GLP-Fc融合蛋白质、浓度范围为约0.25至约5mg/mL，柠檬酸盐缓冲液、浓度范围为约5至约20mM，聚山梨酯-80、浓度为约0.02％(w/v)，山梨醇、浓度范围为约4.5至约4.8％(w/v)，并且pH范围为约6.3至约6.7。
制剂的施用可以通过普通技术人员已知的任何有效途径。外周非肠道施用是其中一种方法。非肠道施用在医学文献中通常被理解为通过灭菌注射器或某些其它机械设备例如输注泵将剂型注射至体内。外周非肠道途径可以包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内途径施用。皮下施用是优选的途径。
本发明制剂可以用于治疗患有非胰岛素依赖性糖尿病或者处于发展成非胰岛素依赖性糖尿病危险中的个体、胰岛素依赖性糖尿病或肥胖症的个体。在上下文描述的制剂中GLP-1-Fc融合蛋白质的有效量是当施用于需要GLP-1受体刺激的个体时引起预期的治疗和/或预防效果而不引起不希望的副作用的量。
优选融合蛋白质每两周施用一次或者每周施用一次。取决于待治疗的疾病，其可能需要更频繁施用融合蛋白质，例如每周施用二至三次。
本发明将通过参考以下实施例以非限制性实施例的方式进行描述。
实施例
体外GLP-1受体活化分析
应用CRE-荧光素酶系统将稳定表达人类GLP-1受体的HEK-293细胞以30,000个细胞/孔/80μL低血清的DMEM F12培养基接种于96孔板中。接种后一天，将溶于0.5％BSA的试验蛋白质的20μL等分试样与细胞混合并且培养5小时。对于每种试验蛋白质，通常以5×浓度制备含有3pM至3nM的12个稀释物后加入细胞，从而产生剂量响应曲线，从中确定EC50值。培养后，将100μL荧光素酶试剂直接加入至各板，并且轻轻混合2分钟。将板置入Tri-lux发光计中并且计算荧光素酶表达引起的光输出。
GLP-Fc融合体制剂分析试验
GLP-Fc融合体制剂的稳定性是应用以下方法评价的：紫外-可见光谱(UV)、反相(RP)色谱、尺寸排阻色谱、阴离子交换色谱，具有RP色谱的限制消化，在550nm处吸收，动态光散射，instron，HIAC和差示扫描量热法(microDSC)。反相(RP)色谱用于监控片段形式的GLP-Fc的形成、Fc区域的氧化以及相应的完整主峰损失。尺寸排阻(SE)HPLC用于监控聚合物(可溶聚集物)的形成和相应的单体损失。阴离子交换(AEX)HPLC用于监控电荷不均匀性，特别是酸性变体(AV)的形成，所述的酸性变体通常相应于脱酰胺作用，以及相应的主峰损失。限制消化用于监控对GLP-Fc分子的肽(GLP-1)部分具有特异性的降解产物，例如H1(在SEQ ID NO：1的1位的His)和/或G2(在SEQ ID NO：1的2位的Gly)的N-端剪除、在F22(在SEQ ID NO：1的22位的Phe)和/或W25(在SEQ ID NO：1的25位的Trp)处的蛋白酶修剪、在N-端的丙酮酸化、在W25(在SEQ ID NO：1的25位的Trp)处的氧化以及在S46(在SEQ ID NO：1的46位的Ser)处的磷酸化。在550nm处的吸收监控由于不可溶颗粒的形成引起的溶液浊度。动态光散射用于测量大的可溶聚集物。Instron用于测量过滤阻力，其是半定量方法，最初发展用于测量胰高血糖素溶液中凝胶样结构的形成。该技术已经广泛用于评价GLP-1肽溶液的物理不稳定性。由于GLP-Fc融合体是GLP-1类似物与IgG4Fc链的组合，试验过滤阻力可以给物理不稳定性的性质提供进一步的参考。进行该试验以测量将溶液通过具有0.2μm孔径的13mm直径的PVDF膜过滤器推入注射器的反压。如果没有阻力或聚集，压力反馈图就没有斜度。历经一段时间斜度增加表明聚集作用和/或凝胶作用的增加。为了将运行比较简单化，仅记录最大阻力值。HIAC是广泛用于非肠道制剂的光阻碍技术，其用于监控不可溶颗粒物质的形成。差示扫描量热法用于监控解折叠特征，当蛋白质开始进行结构转化时，其通过热转化温度表明。
根据下表制备GLP-Fc融合体制剂：
制剂 GLP-Fc 1mg/mL pH 缓冲液 1 6 10mM柠檬酸盐 2 6.5 10mM柠檬酸盐 3 7 10mM柠檬酸盐 4 6 10mM组氨酸 5 6.5 10mM组氨酸
6 7 10mM磷酸盐 7 7.5 10mM磷酸盐 8 7.5 10mM氨丁三醇 9 8 10mM氨丁三醇
GLP-Fc融合体制剂是通过0.22μm聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜灭菌过滤的。将溶液在5、15、25、37和45℃下贮存在5mL玻璃小瓶中直至分析或至多20周。
pH对GLP-Fc稳定性的作用：
下表显示在37℃下修剪形式的GLP-Fc融合蛋白质的形成速率常数，其是通过RP色谱确定的。
制剂# 在37℃下的一级速率常数(周-1) 1 4.84E-03 2 5.22E-03 3 7.01E-03 4 3.83E-03 5 5.05E-03 6 1.28E-02 7 1.85E-02 8 6.43E-03 9 8.89E-03
下表显示在37℃下GLP-Fc融合蛋白质的酸性变体的酸性变体形成速率常数，其是通过AEX HPLC确定的。
制剂# 在37℃下的一级速率常数(周-1) 1 4.25E-02 2 4.05E-02 3 4.73E-02 4 2.36E-02 5 4.18E-02 6 4.31E-02 7 5.06E-02
8 5.27E-02 9 6.46E-02
下表显示在37℃下贮存20周后GLP-Fc融合蛋白质的可溶聚集物(聚合物％)的形成，其是通过SE HPLC确定的。
制剂# 在37℃下20周后聚合物％ 1 4.6 2 2.4 3 1.4 4 2.6 5 1.4 6 2.2 7 1.1 8 0.6 9 0.3
下表显示在37℃下N-端修剪(des H1/H1G2)的速率常数，其是通过限制消化确定的。
制剂#在37℃下的零级速率常数(％周-1) 10.42 20.32 30.32 40.39 50.36 60.43
制剂#在37℃下的零级速率常数(％周-1) 70.52 80.31 90.29
溶解度和粘度
下表显示pH对GLP-Fc融合体制剂的溶解度和粘度的作用。首先在适合的缓冲液中制备溶液，调节pH，然后通过应用Centricon浓缩机将溶液离心浓缩。通过视觉检查溶液达到溶液的溶解限的征象。通过UV吸收确定浓度。以Poise(P)测定粘度，其中1P＝1gcm-1s-1。20℃的水的粘度为约0.01g cm-1s-1，其与1厘泊(cP)相同。
缓冲液 pH 溶解度(mg/mL) 粘度(cP) 10mM柠檬酸盐 5.5 27.1 未测量 10mM柠檬酸盐 5.8 146.2 未测量 10mM柠檬酸盐 6.0 179.4 8.3 10mM柠檬酸盐 6.5 156.9 5.9 10mM柠檬酸盐 7.0 158.1 7.7
溶液制剂稳定性比较
进行试验设计(DoE)研究以解释关键制剂参数和分子的化学/物理稳定性性质之间的关系。基于数据，开发了定量模型以(i)定义在化学和物理稳定性方面的最佳靶制剂；(ii)探寻制剂设计空间以定义具有可接受表现的产物的参数范围以及(iii)实现在研究中探寻的设计空间内的制剂表现的足够稳定性。
在DoE研究中试验的所有制剂在下表中概述。制备多种制剂并且通过0.22μm聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜灭菌过滤。将制剂在5、25和40℃下贮存在3mL玻璃小瓶中直至分析或至多3个月。
缓冲液 pH GLP-Fc (mg/mL) 聚山梨酯80 (mg/mL) 张力剂 甘露醇 (50mg/mL) NaCl (150mM) EDTA (％) 1 10mM柠檬酸盐 6.5 10 0.05 甘露醇 0 2 10mM柠檬酸盐 7.0 10 0.35 NaCl 0 3 10mM柠檬酸盐 7.0 10 0.05 甘露醇 0 4 10mM柠檬酸盐 7.0 10 0.35 甘露醇 0 5 10mM柠檬酸盐 7.0 10 0.05 NaCl 0 6 10mM柠檬酸盐 6.5 10 0.35 甘露醇 0 7 10mM柠檬酸盐 6.0 10 0.35 NaCl 0 8 10mM柠檬酸盐 6.0 10 0.05 NaCl 0
9 10mM柠檬酸盐 6.0 10 0.35 甘露醇 0 10 10mM柠檬酸盐 6.5 10 0.2 甘露醇 0 11 10mM柠檬酸盐 7.0 10 0.2 甘露醇 0 12 10mM柠檬酸盐 6.0 10 0.2 甘露醇 0 13 10mM柠檬酸盐 6.5 10 0.2 NaCl 0 14 10mM柠檬酸盐 6.0 10 0.05 甘露醇 0 15 10mM柠檬酸盐 6.5 10 0.2 甘露醇 0 16 10mM柠檬酸盐 6.5 10 0.2 NaCl 0 17 10mM柠檬酸盐 6.5 10 0.2 甘露醇 0.01
9 10mM柠檬酸盐 6.0 10 0.35 甘露醇 0 18 10mM柠檬酸盐 6.5 10 0.2 NaCl 0.01 19 10mM组氨酸 6.5 10 0.2 甘露醇 0.01 20 10mM组氨酸 6.5 10 0.2 NaCl 0.01
制剂的稳定性通过监控主峰的降低％来评价，其是通过反相(RP)色谱测定的。所有制剂的速率常数如下表所示。
制剂#在40℃下的零级速率常数(％月-1) 17.65 29.78 39.08 48.44 59.06 68.16 77.41 86.90 97.03 106.98 118.31 127.10 137.42 147.97
制剂#在40℃下的零级速率常数(％月-1) 157.41
16 7.30 17 4.92 18 5.52 19 5.69 20 5.52
有两种类型的修剪形式可以通过RP色谱监控。第一种是通过残留蛋白酶在GLP区域的F22和/或W25处的修剪形式。第二种类型是通过化学机制在连接区域的修剪。所有制剂的速率常数如下表所示，其是通过RP色谱确定的。
制剂#在40℃下的零级速率常数(％月-1) 12.02 23.27 33.02 42.79 53.29 62.07 71.77 81.73 91.75 101.83 112.81
制剂#在40℃下的零级速率常数(％月-1) 121.75 132.02 141.90 151.92 161.97 171.51 181.61 191.52 201.45
可溶聚集体的形成是通过尺寸排阻HPLC监控的。在40℃下单体减少的速率常数如下表所示。
制剂#在40℃下的零级速率常数(％月-1) 11.08 22.18 31.19 41.21 51.63 61.38 72.39 81.93
制剂#在40℃下的零级速率常数(％月-1) 92.11 101.01 111.04 122.25 131.66 142.35 151.14 161.69 170.54 181.15 190.53 201.00
通过在GLP区域的限制消化的N-端修剪是通过限制消化分析确定的。Des H1/H1G2的速率常数如下表所示。
制剂#在40℃下的零级速率常数(％月-1) 12.39 22.77 32.45 42.47 52.35
制剂#在40℃下的零级速率常数(％月-1) 62.72
7 2.84 8 2.51 9 2.83 10 2.37 11 2.38 12 2.86 13 2.37 14 2.64 15 2.48 16 2.44 17 1.82 18 2.17 19 1.66 20 2.17
通过在400RPM下进行轨道振荡24小时的搅拌后可溶聚集物的形成是通过SE HPLC监控的。单体％结果如下表所示。
制剂# 单体％ 1 94.5 2 98.0 3 96.1 4 98.1
制剂# 单体％ 5 97.8 6 98.2 7 97.9 8 97.3 9 98.0 10 98.0 11 98.2 12 97.9 13 98.1 14 94.4
15 98.1 16 98.1 17 98.2 18 98.1 19 98.5 20 98.3
对于搅拌稳定性，主要关注的是不可溶颗粒物质的形成，其可以通过HIAC测量监控。通过在400RPM下进行轨道振荡24小时的搅拌后的HIAC结果如下表所示。
制剂# HIAC 10μm颗粒计数 1 400 2 10 3 361
制剂# HIAC 10μm颗粒计数 4 5 5 918 6 7 7 205 8 1251 9 17 10 4 11 10 12 26 13 29 14 1218 15 24 16 2 17 14 18 16 19 9 20 2
在注射器和小瓶中的NaCl与甘露醇制剂的比较
制剂 组分 1 1mg/mL GLP-Fc、10mM柠檬酸盐pH 6.5、 150mM NaCl、0.02％(w/v)聚山梨酯80
制剂 组分 2 1mg/mL GLP-Fc、10mM柠檬酸盐pH 6.5、 5％(w/v)甘露醇、0.02％(w/v)聚山梨酯80
以上两种制剂在5℃下的稳定性比较，比较甘露醇和NaCl以及注射器和小瓶贮存。
ND＝未测定
以上两种制剂在25℃下的稳定性比较，比较甘露醇和NaCl以及注射器和小瓶贮存。
ND＝未测定
以上两种制剂在40℃下的稳定性比较，比较甘露醇和NaCl以及注射器和小瓶贮存。
ND＝未测定
甘露醇浓度确定
获得GLP-Fc融合蛋白质溶液制剂的靶张力为290毫重量克分子渗透浓度/Kg所需的甘露醇浓度是通过滴定试验确定的。下表概述了产生的重量克分子渗透浓度，其是甘露醇浓度的函数。基于重量克分子渗透浓度结果与甘露醇浓度的线性回归分析，统计学p值＜0.01，确定甘露醇浓度为46.4mg/mL或4.64％。