一种磷酸二酯及其制备方法 【技术领域】
本发明属于磷酸二酯及其制备方法，特别属于用于反义核酸和基因探针领域的磷酸二酯及其制备方法。
背景技术
核苷酸是由碱基(主要是嘌呤、嘧啶碱的衍生物)、戊糖(核糖或脱氧核糖)和磷酸连接而成的化合物，寡核苷酸是一类只有20个左右碱基对的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA在内的核苷酸)，寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。
近年来，寡核苷酸，特别是反义寡核苷酸用于多种疾病的治疗的研究受到了广泛的重视。
反义核酸是指与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之结合的一段DNA或RNA。
反义核酸技术是指利用反义核酸特异地抑制某些基因的表达。1967年，Belikova等提出了利用一段反义寡核苷酸来特异性地抑制基因表达的设想。1978年，Paul等利用一段反义DNA寡聚核苷酸链成功地抑制了劳斯(Rous)肉瘤病毒的复制，引起人们极大的关注。20世纪80年代，寡核苷酸人工合成技术的成功，反义核酸的研究快速发展起来，使反义技术在抗肿瘤、抗病毒以及细胞凋亡机理、信号传递机制等方面取得了一定的进展。
天然反义寡核苷酸是一类分子质量较小的多聚寡核苷酸，它们与生物体双链DNA的正义链或mRNA的一段序列互补。最早是由E.Coli体内质粒复制的调控而发现的。
反义RNA可由人工合成及反义表达载体两种方式得到。后者是利用基因重组技术，在适当的启动子和转录终止子间反向插入一段靶基因所得到的，反义表达的RNA可抑制同源基因的表达，效果稳定、持久。人工合成的反义寡核苷酸包括反义RNA和反义DNA，通常由15～20个核苷酸组成，为防止细胞内核酸酶的分解作用，常将其进行化学修饰。将他们运送到靶细胞，只产生短效应，不会留下长效的遗传效应，这对于前期研究尚未探明其副作用的前提下，有较好的安全性；其用量及作用的靶序列可以人为控制，原则上不会干扰其它基因结构和它们自身正常的调控方式；尤其是反义寡核苷酸不会产生耐药性，还可采用多点反义处理增强抑制效果。反义RNA的基因沉默功能不仅可以用来研究未知基因功能，而且可用于多种疾病的治疗。自Zammeenik等首次报道以反义寡核苷酸抑制劳氏肉瘤病毒复制后，反义寡核苷酸便迅速应用于肿瘤、病毒感染、寄生虫病的研究。Liu song-kai等分别利用反义RNA和siRNA抑制HIV-1复制过程中所需细胞蛋白CyPA的合成，结果均明显抑制了HIV-1在人T淋巴细胞中的复制；他们认为两种方法机制不同，靶向部位不同，联合使用可增强抑制效果。Ji Yinduo等通过构建针对金黄色葡萄球菌脂肪酸合成酶的反义表达载体，转染该菌后发现能抑制编码基因的表达，使其生长受到明显抑制，甚至停止。反义技术应用于临床治疗也屡有报道：如利用人工合成的反义寡核苷酸抑制C-myc等致癌基因或肿瘤生长因子的表达等。
反义RNA不仅可以作为基因表达的负调节因子，也可以作为正调节因子。例如：mRNA II级结构的形成有时会抑制其翻译，设计阻止mRNA II级结构形成的反义RNA可促进基因的表达。
我们知道生物体内某个基因表达不足或表达过度均会造成生物体的疾病。如细胞凋亡基因受促凋亡基因及抑凋亡基因的控制；正常表达时，在胚胎发育中可清除对机体无用的甚至有害的细胞，使组织器官结构正常、形态完整；在成年机体去除衰老、损伤、癌变的细胞，并代之以新生的细胞，以维持器官中细胞数量稳定和机体防御系统完整。若凋亡基因表达不足，导致细胞凋亡受阻，会逐步发展成肿瘤；若表达过度，则造成组织器官发育缺陷或功能降低，进而导致机体产生一系列的病变。靶向促凋亡基因的反义RNA可抑制细胞凋亡；反之，则促进细胞凋亡。
反义RNA亦具有作为新型抗菌药物的可能性：感染性疾病是由于病源菌在体内生长、繁殖或机体正常菌群失调造成的。细菌本身的某些成份和/或生长代谢过程中产生的某些物质对特定组织器官具有毒性作用，这些毒性物质就是致病菌的毒力因子。核酸序列分析技术的迅猛发展，使探明编码毒力因子的基因序列不成问题。根据基因序列设计相应的反义RNA，借助运送载体转入细菌细胞内，抑制致病基因或编码细菌生长所必需地蛋白质基因的表达，可以达到减毒、抑制或杀灭细菌的目的。反义核酸技术正在成为人类研究和治疗病毒病、肿瘤乃至各生物医学领域的一项不可或缺的手段。国外已有反义药物应用于临床，Science杂志1998年7月报道了第一个通过FDA(Food and Drug Administration)认证的反义药物，即用于治疗艾滋(AIDS)病人巨细胞病毒感染的视网膜炎的Virtravene。Virtravene是一种硫代寡核苷酸，即磷酸二酯基团中，一个非桥氧原子被硫原子所取代的寡核苷酸，该药是由美国Isis公司基于含修饰的磷酸二酯键的寡核苷酸研制而成，此外还有多种反义药物正用于临床试验或已上市。
但是，反义寡核苷酸用于作为治疗疾病的方法，目前仍存在几个亟待解决的问题：(1)转染效率：无论是载体表达的反义RNA还是体外合成的反义寡核苷酸，只有进入靶细胞，才可与同源基因结合，发挥调节作用，而且反义RNA调节具有明显的剂量依赖性。裸露的反义寡核苷酸进入细胞是一个内化过程，效率很低；而带有极性的反义寡核苷酸则是一个主动吸收过程，效率相对较高。然而，截至目前这一问题仍是反义RNA开发应用中的最大瓶颈。(2)靶序列的选择：许多研究结果表明：一些基因的反义沉默效果比另一些基因的好；同一基因，不同靶序列的沉默效果不同。靶序列的选择除根据上述反义寡核苷酸的作用机制外，目前一定程度上依靠经验，不能完全由分析基因组来确定。(3)给药途径：药物在机体内须达到一定的量并维持一定的时间才能发挥其药理作用。也就是说，药物首先应能耐受机体某些酶的作用而不被分解，安全抵达靶细胞，同时对非目标组织器官无毒副作用。事实上，目前尚无同时达到这两项要求的药物。
另外，具有调控功能的寡核苷酸可用于抑制RNA片段，防止其翻译成蛋白，在制止癌细胞活动方面能起一定的作用。具有修饰磷酸二酯键的新型寡核苷酸，因其可作为生物化学和分子生物学领域的探针，有可能成为抗癌症和抗病毒医疗制剂，而备受关注。截止目前，许多核苷酸类似物已被开发为潜在的医疗制剂，可用于调节特定基因的反基因和抗基因靶向的表达。这些研究正面临一些显著的挑战，需要进一步在分子生物学领域及临床应用方面进行探索。
【发明内容】
本发明所要解决的第1个技术问题是提供一种抗核酸酶水解能力强的磷酸二酯。
本发明所要解决的第2个技术问题是上述磷酸二酯的制备方法。
本发明解决技术问题的技术方案为：一种磷酸二酯，所述的磷酸二酯为氰基硼烷磷酸酯，其分子式为：[(R1O)(R2O)P(O)(BH2CN)]-，其结构式为：
所述的R1、R2为直链烷基、支链烷基、核糖核苷、脱氧核糖核苷以及其相应的衍生物。
优选的磷酸二酯的结构式为：
所述的B1和B2为腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶及其相应衍生物；
所述的R3和R4为氢、烷基、寡聚脱氧核苷酸、修饰的寡聚脱氧核苷酸。
优选的磷酸二酯的结构式为：
所述的B3和B4为腺嘌呤，尿嘧啶，鸟嘌呤胞嘧啶及其相应衍生物；
所述的R5和R6为氢、烷基、寡聚脱氧核苷酸、修饰的寡聚脱氧核苷酸。
最优选的R3、R4为氢，B1、B2为胸腺嘧啶；
最优选的R5、R6为氢，B3为尿嘧啶，B4为腺嘌呤；
本发明的制备方法为：a、核苷偶联、b、氰基硼烷取代、c、脱保护、d、纯化。
所述的a、核苷偶联为：
将含有保护基的核苷或脱氧核苷亚磷酰胺在四氮唑的催化下同乙酰核苷在二甲基甲酰胺中反应1-3小时，得到亚磷酸酯；保护的核苷或脱氧核苷亚磷酰胺与乙酰核苷或乙酰脱氧核苷的摩尔比为1∶1。
所述的b、氰基硼烷取代为：在50-80℃下，将a、腺苷取代所得到的亚磷酸酯与苯胺氰基硼烷在四氢肤喃中反应2-3小时；亚磷酸酯与苯胺氰基硼烷的摩尔比为1∶4-5。
优选的磷酸二酯作为酶促和非酶促反应立体化学研究的分子探针；作为癌症硼中子俘获治疗中B10的载体的应用。
在寡聚脱氧核酸(ODN)中，用S-，CH3或BH3-来取代天然磷酸二酯中的非桥氧原子可以提供抗核酸酶的能力。例如，非离子的甲基磷酸酯(CH3-ODN)对磷酸二酯酶有很强的抵抗力；阴离子的硫代磷酸酯(S--ODN)可以被磷酸二酯酶I水解，但远低于天然磷酸二酯的水解速度。硼烷磷酸酯(BH3--ODN)比S--ODN更能抵抗某些磷酸二酯酶。用氰基取代硼烷三个氢原子中的一个，鉴于BH2CN-基团的较大体积和孤对电子的缺乏，[O＝P-BH2CN]-寡核苷酸比[O＝P-S]-寡核苷酸更加亲脂油。研究表明缺电子的BH3结构易与路易斯碱(例如亚磷酸三酯)配位来形成硼烷亚磷酸三酯。
因为氰基也是个很强的拉电子基团，-BH2CN相对于-BH3来说是个更强的路易斯酸。
因为BH2CN的较大体积，亚磷酸三酯的BH2CN硼化速度比BH3硼化速度慢且对空间位阻更加敏感，但P-BH2CN的配位键或共价键一旦形成，它将比相应的P-BH3配位键和共价键稳定。例如，N，N-二异丙基氨基亚磷酸三酯的氰基硼化速度比甲氧基亚磷酸三酯慢很多。
此外，双异丙基氨基的大体积所导致的空间位阻似可解释亚磷酸酯和苯胺-氰基硼烷络合物在68℃时缓慢的氰基硼烷交换现象。另一方面，尽管DMT(4，4’-二甲氧基三苯甲基)阳离子可以引起硼烷磷酸酯的脱硼化作用，但实验结果表明氰基硼烷磷酸酯在DMT阳离子存在的情况下是稳定的。
不同于[O＝P-O]-，[O＝P-BH2CN]-键连结构可使化合物更易穿过细胞膜而进入细胞。含[O＝P-BH2CN]-磷酸二酯键的DNA和RNA类似物的合成，为制备全新种类化合物(修饰的核苷酸和核酸)提供了可能性。它们和天然核酸有相似性，亦有强的亲脂性和抗核酸酶水解的独特性质。这种强亲脂性，理想的水溶性和抗核酸酶性的新颖组合在药物设计上极其有用。
本发明与现有技术相比，提供了一种全新的磷酸二酯——氰基硼烷磷酸酯，其中磷酸二酯基团的一个非桥氧原子被氰基硼烷取代。相对于天然DNA，所构成的磷酸二酯在很宽的pH范围内都能稳定并能很好地抵抗核酸酶水解，同时，基于辛醇的配分实验(即亲脂性测量)，氰基硼烷磷酸酯可能比常规的寡核苷酸展现更大的膜通透性。
【附图说明】
图1为本发明实施例1的工艺流程图。
图2为本发明实施例2的工艺流程图。
在图1、2中，DMT为4，4’-二甲氧基三苯甲基、Ac为乙酰基、T为胸腺嘧啶、U为尿嘧啶、A为腺嘌呤、TBDMS为叔丁基二甲基硅基。
【具体实施方式】
实施例1：
DNA氰基硼烷磷酸酯类似物：双胸腺核苷氰基硼烷磷酸酯(TpBH2CNT或TpCBT)的合成：
双核苷氰基硼烷磷酸酯(TpBH2CNT或TpCBT)的合成路线如图1所示。
a、核苷偶联：
室温下，保护的胸腺核苷亚磷酰胺(1)(0.5mmol，从美国Chemgenes公司购得)在四氮唑(0.5mmol)的催化下同乙酰胸腺核苷(0.5mmol)在二甲基甲酰胺DMF(3ml)中反应1小时，得到亚磷酸酯(2)。
b、氰基硼烷取代：
在68℃下，亚磷酸酯(2)同苯胺-氰基硼烷络合物(4mmol)在四氢肤喃(12ml)中反应2小时得到亚磷酸酯-氰基硼烷(3).
C、脱保护：
用3当量的除DMT试剂(3％的二氯乙酸溶于二氯甲烷)处理化合物(3)半小时后得到保护的双核苷氰基硼烷磷酸酯(4).减压旋转蒸发除去低沸点的溶剂后，化合物(4)用体积比为1∶1的氨水/甲醇在室温下处理三小时后转化为双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)的粗产品。
d、纯化：
双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)的粗产品用QA-Cellulose(HCO3-)离子交换柱(美国Amershan公司)纯化，以0.1M碳酸氢胺溶液洗脱，收集相应组分，得到氨盐形式的双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)(0.18mmol)，从化合物(1)至双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)(TpBH2CNT或TpCBT)，总产率约为36％。
双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)的结构通过UV；31P NMR；1H NMR；MS(FAB-)；HRMS(FAB)(M-)来测定。
双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)(TpBH2CNT or TpCBT)：
UVλmax＝267nm；31P NMR(D2O，161.9MHz).(ppm)75(br)；1H NMR(D2O，400MHz).(ppm)7.52，7.48，7.47，7.46(4s，2H，H6)，6.15-6.08(m，2H，H1’)，4.77-4.71(m，1H，H3’)，4.44-4.41(m，1H，H3’)，4.04-3.99(m，4H，H5’)，3.67-3.61(m，2H，H4’)，2.38-2.19(2m，4H，H2’)，1.75，1.71(2s，6H，5-CH3)，0.98-0.52(br，2H，BH2CN)；MS(FAB-)：m/z for M-568.1；HRMS(FAB-)计算值C21H28O11N5PB(M-)568.1614，实测值568.1626.
实施例2：
RNA氰基硼烷磷酸酯类似物：尿苷腺嘌呤氰基硼烷磷酸酯(UpBH2CNA或UpCBA)的合成。
尿苷腺嘌呤氰基硼烷磷酸酯(UpBH2CNA或UpCBA)的合成路线如图二所示。
a、核苷偶联：
室温下，保护的尿嘧啶核苷亚磷酰胺(6)(0.5mmol，从美国Chemgenes公司购得)在四氮唑(0.5mmol)的催化下同二乙酰腺嘌呤核苷(0.5mmol)在二甲基甲酰胺DMF(6ml)中反应2小时，得到亚磷酸酯(7)。
b、氰基硼烷取代：
在68℃下，亚磷酸酯(7)同苯胺-氰基硼烷(4mmol)在四氢呋喃(16ml)中反应3小时得到亚磷酸酯-氰基硼烷(8)。
c、脱保护：
用4当量的除DMT试剂(3％的二氯乙酸溶于二氯甲烷)处理亚磷酸酯-氰基硼烷(8)1小时后得被保护的双核苷氰基硼烷磷酸酯(9).减压旋转蒸发除去低沸点的溶剂后，被保护的双核苷氰基硼烷磷酸酯(9)用体积比1∶1的氨水/甲醇在室温下处理三小时后转化为2’-O-叔丁基二甲基硅代-3’-O-尿苷-5’-O-腺嘌呤氰基硼烷磷酸酯(10)。其性质为：31P NMR(D2O，161.9MHz)δ(ppm)75(br)；快原子轰击质谱：M-(m/z，709.2)与C26H39O11N8PBSi(M-)相符。
将2’-O-叔丁基二甲基硅代-3’-O-尿苷-5’-O-腺嘌呤氰基硼烷磷酸酯(10)(0.25mmol)溶于2ml四叔丁基氟化胺t-Bu4F溶液(1M的四氢肤喃溶液)中搅拌2小时生成尿苷腺嘌呤氰基硼烷磷酸酯(11)(UpBH2CNA或UpCBA)的粗产品。
d、纯化：
减压旋转蒸发除去低沸点的溶剂后，尿苷腺嘌呤氰基硼烷磷酸酯(11)的粗产品用QA-Cellulose(HCO3-)离子交换柱纯化，以0.1M碳酸氢胺溶液洗脱，收集相应组分，得到氨盐形式的尿苷腺嘌呤氰基硼烷磷酸酯(11)(0.09mmol)。总产率约为18％(从6至11)。
尿苷腺嘌呤氰基硼烷磷酸酯(11)的结构通过UV；31P NMR；1H NMR；MS(FAB-)；HRMS(FAB)(M-)来测定。
UVλmax.258nm；31P NMR(D2O，161.9MHz).(ppm)74-78(br)；1H NMR(D2O，400MHz).(ppm)8.25，8.21(2s，1H，H-8)，8.06(s，1H，H-2)，7.62-7.58(m，1H，H-6)，5.94(1H，H-1’)，5.64(m，4H)，0.8-0.2(br，2H，BH2CN).MS(FAB-)：m/z for M-595.1；HRMS(FAB-)计算值C20H25O11N8PB(M-)595.1471，实测值595.1464.
实施例3：
氰基硼烷磷酸酯的基本性质。
1、酸碱水解稳定性。
氰基硼烷磷酸酯在酸碱水解中非常稳定。在37℃，pH＝3或11的条件下，用100mM醋酸/氨水来处理双胸腺核苷氰基硼烷磷酸酯(5)24个小时，利用高效液相色谱没有检测到水解或降解的产物。高效液相色谱条件：洗脱剂为80％100mM乙酸三乙基胺盐(Triethylammonium Acetate，TEAA)和20％乙氰；洗脱流速为1毫升/分钟。
2、抗核酸酶水解性。
氰基硼烷磷酸酯键对于蛇毒磷酸二酯酶(SVPDE)和牛脾磷酸二酯酶(BSPDE)的水解十分稳定。抗核酸酶水解过程用高效液相色谱监测。高效液相色谱条件：洗脱剂为80％100mM乙酸三乙基胺盐(TEAA)和20％乙氰；洗脱流速为1毫升/分钟。在天然双胸腺核苷磷酸酯(TpT)超过99％被SVPDE水解时，实施例1中的双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)大于99％是稳定的。在天然双胸腺核苷磷酸酯(TpT)超过99％被BSPDE水解时，双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)大于99％是稳定的。
3、强亲脂性。
水溶性的双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)二聚体带有一个负电荷，它的亲脂性介于普通的磷酸酯和甲基磷酸酯之间。化合物的亲脂性可用配分系数来定量。配分系数定义为某一化合物在辛醇和水二相平衡时，该化合物在辛醇相中的浓度与在水相中的浓度比。通过辛醇的配分实验测定。水溶性的双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)的配分系数为0.11。TpT的配分系数为8.7x10-5。此实验表明水溶性的双核苷氰基硼烷磷酸酯(5)的亲脂性是天然TpT亲脂性的1260倍。