一种富铜酵母的制备方法.pdf

本发明涉及一种富铜酵母的制备方法。本发明首先制备耐高铜的酵母菌种：将不同生化特性酵母菌种在梯度铜浓度的培养基中培养，存活率最大的作为待诱变菌种；将待诱变菌种接种到硫酸二乙脂的培养基上进行诱变；将诱变的菌株接种到梯度铜浓度的培养基中培养，收集菌液、过滤、烘干，将生物量和铜含量同时高于平均值的诱变菌种作为耐高铜的酵母菌种。然后利用耐高铜的酵母菌种制备富铜酵母：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富铜酵母产品。本发明方法制备的富铜酵母添加剂，大大提高铜在动物机体吸收利用率，提高经济效益，可作为饲料添加剂应用于畜禽、水产动物等的补铜。

1、  一种富铜酵母的制备方法，首先制备耐高铜的酵母菌种，然后利用耐高铜的酵母菌种制备富铜酵母，其特征在于：
制备耐高铜的酵母菌种的方法包括以下步骤：
步骤a.选取不同生化特性的酵母菌种，将各酵母菌种分别接种到10～200μg/ml梯度铜浓度的培养基中培养20～45h，将存活率最大的酵母菌种作为待诱变菌种；
步骤b.将待诱变菌种接种到硫酸二乙脂的培养基上进行诱变，形成诱变菌种；
步骤c.将诱变的菌株进行分离筛选，接种到10～200μg/ml梯度铜浓度的培养基中培养20～45h，将培养后的菌液收集、过滤、烘干，称量并检测其铜含量，将生物量和铜含量同时具备高于平均值的诱变菌种作为耐高铜的酵母菌种；
步骤a和c中培养基的培养条件：总糖含量5～20％，铜离子含量10～200μg/ml，pH值4.0～7.0，培养温度25～36℃，氮源为尿素、硝酸铵、硫酸铵和磷酸氢氨中的一种或几种，磷源为植酸钙、磷酸氢氨、磷酸氢二氨、磷酸氢二钾中的一种或几种，铜离子来源于硫酸铜、硝酸铜、醋酸铜或氯化铜；
利用耐高铜的酵母菌种制备富铜酵母的方法是：
斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富铜酵母产品；
1)斜面菌种培养：富铜酵母菌种接种于糖含量5～20％，含铜量10～200μg/ml，pH值4.0～7.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度25～36℃，培养20～45h；
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量5～20％，含铜量10～200μg/ml，pH值4.0～7.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度25～36°C，培养20～45h；
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有50～100L糖含量5～20％，含铜量10～200μg/ml，pH值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36°C，培养20～45h；
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有1000～2000L糖含量5～20％，含铜量10～200μg/ml，pH值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，铜分批次加入，培养20～45h；
5)分离干燥：分离机分离，60～90℃烘干；
6)粉碎：利用粉碎机粉碎，得到高铜含量富铜酵母；
其中铜离子来源于硫酸铜、硝酸铜、醋酸铜或氯化铜。

一种富铜酵母的制备方法
技术领域
本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种用于动物饲料的富铜酵母的制备方法。
背景技术
铜是人类和动物必需的微量元素之一，铜是铜蓝蛋白的重要组分，参与机体的造血机能；铜也是铜酶赖氨酰氧化酶的重要组分，参与血管组织和骨骼的形成，维持血管的正常弹性和骨骼强度；同时，铜对于维持动物正常的妊娠过程、繁殖率和鸡蛋的孵化率有重要影响；此外，铜对于调节机体的免疫力方面起着重要作用，它对细胞免疫、体液免疫及抗感染都有不同程度的作用。
目前，国内大多采用高剂量硫酸铜等无机铜盐作为铜营养添加剂，但无机铜盐生物效价低、添加量大、易造成了严重的环境污染；而稳定性好、生物学效价较高的氨基酸络合铜盐(蛋氨酸铜、赖氨酸铜等)由于其生产工艺复杂、价格较高限制其应用。富铜酵母不仅可以满足动物机体对于铜的需要，而且酵母中有很丰富的营养成分，可以发挥协同作用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种富铜酵母的制备方法。
本发明方法首先制备耐高铜的酵母菌种，然后利用耐高铜的酵母菌种制备富铜酵母。
制备耐高铜的酵母菌种的方法包括以下步骤：
步骤a.选取不同生化特性的酵母菌种，将各酵母菌种分别接种到10～200μg/ml梯度铜浓度的培养基中培养20～45h，将存活率最大的酵母菌种作为待诱变菌种；
步骤b.将待诱变菌种接种到硫酸二乙脂的培养基上进行诱变，形成诱变菌种；
步骤c.将诱变的菌株进行分离筛选，接种到10～200μg/ml梯度铜浓度的培养基中培养20～45h，将培养后的菌液收集、过滤、烘干，称量并检测其铜含量，将生物量和铜含量同时具备高于平均值的诱变菌种作为耐高铜的酵母菌种。
步骤a和步骤c中培养基的培养条件：总糖含量5～20％，铜离子含量10～200μg/ml，pH值4.0～7.0，培养温度25～36°C，氮源为尿素、硝酸铵、硫酸铵和磷酸氢氨中的一种或几种，磷源为植酸钙、磷酸氢氨、磷酸氢二氨、磷酸氢二钾中的一种或几种；其中铜离子来源于硫酸铜、硝酸铜、醋酸铜或氯化铜。
利用耐高铜的酵母菌种制备富铜酵母的方法是：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富铜酵母产品。
1)斜面菌种培养：富铜酵母菌种接种于糖含量5～20％，含铜(无机铜盐)量10～200μg/ml，pH值4.0～7.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度25～36°C，培养20～45h；
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量5～20％，含铜(无机铜盐)量10～200μg/ml，pH值4.0～7.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度25～36°C，培养20～45h；
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有50～100L糖含量5～20％，含铜(无机铜盐)量10～200μg/ml，pH值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36°C，培养20～45h；
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有1000～2000L糖含量5～20％，含铜(无机铜盐)量10～200μg/ml，pH值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36°C，铜分批次加入，培养20～45h；
5)分离干燥：分离机分离，60～90°C烘干；
6)粉碎：利用粉碎机粉碎，得到高铜含量富铜酵母。
其中铜离子来源于硫酸铜、硝酸铜、醋酸铜或氯化铜。
本发明方法制备的富铜酵母添加剂，可大大提高铜在动物机体吸收利用率，减少畜禽粪便残留；同时酵母菌含有多种生物活性物质，可以改善动物胃肠道微生态环境，促进肠内营养物质的消化与吸收，减少发病，提高经济效益，可作为饲料添加剂应用于畜禽、水产动物等的补铜。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
富铜酵母的制备方法，首先制备耐高铜的酵母菌种，然后利用耐高铜的酵母菌种制备富铜酵母。
1、制备耐高铜的酵母菌种的具体实施例如下：
实施例1-1
步骤a.选取不同生化特性的酵母菌种，将各酵母菌种分别接种到10～200μg/ml梯度铜浓度(铜浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、150μg/ml、200μg/ml)的培养基中培养20h，将存活率最大的酵母菌种作为待诱变菌种；
步骤b.将待诱变菌种接种到硫酸二乙脂的培养基上进行诱变，形成诱变菌种；
步骤c.将诱变的菌株进行分离筛选，接种到10～200μg/ml梯度铜浓度(铜浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、150μg/ml、200μg/ml)的培养基中培养36h，将培养后的菌液收集、过滤、烘干，称量并检测其铜含量，将生物量和铜含量同时具备高于平均值的诱变菌种作为耐高铜的酵母菌种。
培养基的培养条件：总糖含量5％，pH值4.0，培养温度25°C，氮源为尿素，磷源为植酸钙，铜离子来源于硫酸铜。
实施例1-2
步骤a.选取不同生化特性的酵母菌种，将各酵母菌种分别接种到10～200μg/ml梯度铜浓度(铜浓度分别为10μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml、200μg/ml)的培养基中培养36h，将存活率最大的酵母菌种作为待诱变菌种；
步骤b.将待诱变菌种接种到硫酸二乙脂的培养基上进行诱变，形成诱变菌种；
步骤c.将诱变的菌株进行分离筛选，接种到10～200μg/ml梯度铜浓度(铜浓度分别为10μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml、200μg/ml)的培养基中培养36h，将培养后的菌液收集、过滤、烘干，称量并检测其铜含量，将生物量和铜含量同时具备高于平均值的诱变菌种作为耐高铜的酵母菌种。
培养基的培养条件：总糖含量10％，pH值5.0，培养温度30°C，氮源为硝酸铵，磷源为磷酸氢氨，铜离子来源于硝酸铜。
实施例1-3
步骤a.选取不同生化特性的酵母菌种，将各酵母菌种分别接种到10～200μg/ml梯度铜浓度(铜浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、200μg/ml)的培养基中培养45h，将存活率最大的酵母菌种作为待诱变菌种；
步骤b.将待诱变菌种接种到硫酸二乙脂的培养基上进行诱变，形成诱变菌种；
步骤c.将诱变的菌株进行分离筛选，接种到10～200μg/ml梯度铜浓度(铜浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、200μg/ml)的培养基中培养45h，将培养后的菌液收集、过滤、烘干，称量并检测其铜含量，将生物量和铜含量同时具备高于平均值的诱变菌种作为耐高铜的酵母菌种。
培养基的培养条件：总糖含量15％，pH值6.0，培养温度30°C，氮源为硫酸铵，磷源为磷酸氢二氨，铜离子来源于醋酸铜。
实施例1-4
步骤a.选取不同生化特性的酵母菌种，将各酵母菌种分别接种到10～200μg/ml梯度铜浓度(铜浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、150μg/ml、200μg/ml)的培养基中培养20h，将存活率最大的酵母菌种作为待诱变菌种；
步骤b.将待诱变菌种接种到硫酸二乙脂的培养基上进行诱变，形成诱变菌种；
步骤c.将诱变的菌株进行分离筛选，接种到10～200μg/ml梯度铜浓度(铜浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、150μg/ml、200μg/ml)的培养基中培养20h，将培养后的菌液收集、过滤、烘干，称量并检测其铜含量，将生物量和铜含量同时具备高于平均值的诱变菌种作为耐高铜的酵母菌种。
培养基的培养条件：总糖含量20％，pH值7.0，培养温度36°C，氮源为磷酸氢氨，磷源为植酸钙和磷酸氢氨，铜离子来源于硫酸铜。
实施例1-5
步骤a.选取不同生化特性的酵母菌种，将各酵母菌种分别接种到10～200μg/ml梯度铜浓度(铜浓度分别为10μg/ml、60μg/ml、120μg/ml、200μg/ml)的培养基中培养30h，将存活率最大的酵母菌种作为待诱变菌种；
步骤b.将待诱变菌种接种到硫酸二乙脂的培养基上进行诱变，形成诱变菌种；
步骤c.将诱变的菌株进行分离筛选，接种到10～200μg/ml梯度铜浓度(铜浓度分别为10μg/ml、60μg/ml、120μg/ml、200μg/ml)的培养基中培养30h，将培养后的菌液收集、过滤、烘干，称量并检测其铜含量，将生物量和铜含量同时具备高于平均值的诱变菌种作为耐高铜的酵母菌种。
培养基的培养条件：总糖含量18％，pH值4.5，培养温度25°C，氮源为硫酸铵和磷酸氢氨，磷源为磷酸氢二钾，铜离子来源于氯化铜。
2、利用以上任何一实施例制备的耐高铜的酵母菌种，制备富铜酵母的具体实施例如下：
实施例2-1
富铜酵母生产工艺：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富铜酵母产品。
1)斜面菌种培养：富铜酵母菌种接种于糖含量5％，含铜(硫酸铜)量10μg/ml，pH值4.5的麦芽汁固体培养基上，培养温度25°C，培养20h。
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量5％，含铜(硫酸铜)量10μg/ml，pH值4.5的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度25°C，培养20h。
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有100L糖含量5％，含铜(硫酸铜)量10μg/ml，pH值4.5的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25°C，培养20h。
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有1000L糖含量5％，含铜(硫酸铜)量10μg/ml，pH值4.5的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25°C，铜分批次加入，培养20h。
5)分离干燥：分离机分离，60°C烘干。
6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到高铜含量富铜酵母，铜含量为每千克酵母1052毫克。
实施例2-2
富铜酵母生产工艺：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富铜酵母产品。
1)斜面菌种培养：富铜酵母菌种接种于糖含量10％，含铜(硝酸铜)量200μg/ml，pH值6.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度36°C，培养45h。
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量10％，含铜(硝酸铜)量200μg/ml，pH值6.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度36°C，培养45h。
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有50L糖含量10％，含铜(硝酸铜)量200μg/ml，pH值6.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度36°C，培养45h。
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有1000L糖含量10％，含铜(硝酸铜)量200μg/ml，pH值6.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度36°C，铜分批次加入，培养45h。
5)分离干燥：分离机分离，90°C烘干。
6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到高铜含量富铜酵母，铜含量为每千克酵母5080毫克。
实施例2-3
富铜酵母生产工艺：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富铜酵母产品。
1)斜面菌种培养：富铜酵母菌种接种于糖含量20％，含铜(氯化铜)量50μg/ml，pH值7.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度28°C，培养24h。
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量20％，含铜(氯化铜)量50μg/ml，pH值7.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度28°C，培养24h。
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有100L糖含量20％，含铜(氯化铜)量50μg/ml，pH值7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度28°C，培养24h。
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有1000L糖含量20％，含铜(氯化铜)量50μg/ml，pH值7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度28°C，铜分批次加入，培养24h。
5)分离干燥：分离机分离，60°C烘干。
6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到高铜含量富铜酵母，铜含量为每千克酵母1944毫克。
实施例2-4
富铜酵母生产工艺：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富铜酵母产品。
1)斜面菌种培养：富铜酵母菌种接种于糖含量15％，含铜(醋酸铜)量100μg/ml，pH值5.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度30°C，培养40h。
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量15％，含铜(醋酸铜)量100μg/ml，pH值5.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度30°C，培养40h。
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有100L糖含量15％，含铜(醋酸铜)量100μg/ml，pH值5.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度30°C，培养40h。
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有2000L糖含量15％，含铜(醋酸铜)量100μg/ml，pH值5.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度30°C，铜分批次加入，培养40h。
5)分离干燥：分离机分离，70°C烘干。
6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到高铜含量富铜酵母，铜含量为每千克酵母2906毫克。
实施例2-5
富铜酵母生产工艺：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富铜酵母产品。
1)斜面菌种培养：富铜酵母菌种接种于糖含量12％，含铜(硝酸铜)量150μg/ml，pH值5.5的麦芽汁固体培养基上，培养温度28°C，培养36h。
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量12％，含铜(硝酸铜)量150μg/ml，pH值5.5的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度28°C，培养36h。
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有100L糖含量12％，含铜(硝酸铜)量150μg/ml，pH值5.5的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度28°C，培养36h。
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有2000L糖含量12％，含铜(硝酸铜)量150μg/ml，pH值5.5的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度28°C，铜分批次加入，培养36h。
5)分离干燥：分离机分离，60°C烘干。
6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到高铜含量富铜酵母，铜含量为每千克酵母4130毫克。