一种沉香诱导剂及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种沉香诱导剂及其制备方法。
背景技术
白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg，又称土沉香，属瑞香科沉香属植物，为我国特有的热带及亚热带常绿乔木，是我国生产名贵芳香类药材沉香的唯一植物来源，现已被列为国家二级濒危保护植物。沉香是我国、日本、印度以及其他东南亚国家的传统名贵药材和名贵的天然香料，其性辛、苦，微温，能行气止痛、温中止呕、纳气平喘(中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005，128.)。在沉香中存在两种主要的成分倍半萜类化合物和色酮类化合物(杨峻山.沉香化学成分的研究概况[J].天然产物研究与开发，1998，10(1)：99-103.戚树源，林立东，胡厚才.白木香中色酮类化合物的形成[J].中草药，2000，31(9)：658-659.)。商业上的巨大利润和非法贸易正导致世界各地的沉香越来越少。2000年白木香被世界自然保护联盟(IUCN)列入IUCN红色名录。2004年白木香列入了《濒危野生动植物种国际贸易公约》(ITES，即华盛顿公约)附录，同时产于东南亚等各国生产沉香的沉香属所有植物均列入了该公约名录。
健康的白木香树体不能产生沉香类物质，树体必须受到各种伤害及真菌侵染后才能够产生。自上世纪30年代，国外就开展了大量接菌结香研究。从沉香属植物树体的结香部位分离报道的真菌主要有色二孢菌(Diplodia sp.)、可球二孢菌(Botryodiplodia theobromae)、镰刀菌(Fusarium sp.)、砖红镰孢(Fusariumlaseritum)、曲霉(Aspergillus sp.)、毛霉(Mucor sp.)、青霉(Penicillium sp.)、木霉(Trichoderma sp.)、裂褶菌(Schizophyllum sp.)等(Bose S R.The Nature of agarformation[J].Sci Cult，1934，4(2)：89-91.Bose S R.Enzymes of wood-rottingfungi[J].Ergeb Enzymforsch，1939，8：267-276.Subeham，Junya U，Fujino H，et al.A field survey of agarwood in Indonesia[J].J Trad Medicines，2005，22(4)：244-251.Gibson I A S.The role of fungi in the origin of oleoresin deposits(Agaru)in the wood of Aquillaria agallocha(Roxb.)[J].Bano Biggyn Patrika，1977，6(1)：16-26.Nobuchi T，Somkid S.Preliminary observation of Aquliaria crassna woodassociated with the formation of aloeswood bult[J].Kyoto Univ Forests，1991，63：226-235.Ng L T，Chang Y S，Azizol L K.A review on agar(gaharu)producingAquilaria species[J].J Trop For Products，1997，2(2)：272-285.)。研究认为沉香的形成可能是由于树干损伤后被上述一种或数种真菌侵入寄生，在真菌体内酶的作用下，使木薄壁细胞贮存的淀粉发生一系列变化，形成香脂，经多年沉积而得(Ng L T，Chang Y S，Azizol L K.A review on agar(gaharu)producingAquilaria species[J].J Trop For Products，1997，2(2)：272-285.Tamuli P，Boruah P，Samanta R.Biochemical changes in agarwood tree(Aquilariamalaccensis Lamk.)during pathogenesis[J].J Spices and Aromat Crops，2004，13：87-91.)。国内的真菌侵染研究主要集中在黄绿墨耳菌(Menanotus flavolives)对白木香的侵染。1976年广东植物研究所对凿洞后1、6、12、18、24个月的五批白木香样品进行了组织化学和解剖学研究。组织化学研究结果显示，木材薄壁细胞内的淀粉依次经过中间产物非淀粉的多糖、醛类或酮类及酚类化合物转化成了沉香。解剖学研究结果显示在白木香成香过程中伴随着真菌的生长，推断在没有菌丝存在的情况下不能结香，但是令人疑惑的是在菌丝分布最密集的区域-砍伤面下几厘米的一段木材中(腐烂区)，却很少或没有香脂的形成[11]。这似乎否定了真菌侵染能够诱导白木香结香的推测，但是该研究小组后来成功地分离了黄绿墨耳菌(Menanotus flavolives)并证实该菌可大大加速结香的进程(戚树源，林立东，胡厚才.白木香中色酮类化合物的形成[J].中草药，2000，31(9)：658-659.广东省植物研究所.初步揭开沉香结香的秘密[J].植物学报，1976，18(4)：287-291.戚树源，陆碧瑶，朱亮锋，等.白木香中白木香醛形成的研究(简报)[J].植物生理学通讯，1992，28(5)：336-339.RahmanM A，Basak A C.Agar production in agar trees by artificial inoculation andwounding[J].Bano Bigan Patrika，1980，9(1/2)：97-93.)。戚树源等(戚树源，林立东，胡厚才.白木香中色酮类化合物的形成[J].中草药，2000，31(9)：658-659.戚树源，陆碧瑶，朱亮锋，等.白木香中白木香醛形成的研究(简报)[J].植物生理学通讯，1992，28(5)：336-339.)对黄绿墨耳菌促进白木香产生沉香主要成分-白木香醛和色酮类化合的机理进行了研究。他们(戚树源，陆碧瑶，朱亮锋，等.白木香中白木香醛形成的研究(简报)[J].植物生理学通讯，1992，28(5)：336-339.)采用GC/MS/DS和扫描电镜对接种黄绿墨耳菌的白木香进行研究，研究结果表明：感染真菌1个月的木材组织中，未能检出白木香醛及其它沉香倍半萜化合物；1个月后扫描电镜中观察到感染真菌产生棕红色反应带的白木香木材组织中的细胞开始崩解死亡，同时产生3种细胞逆境代谢产物；在感染真菌2个月的木材组织中开始检出白木香醛，其白木香醛的含量随感染真菌的时间而增加。他们推论白木香木材组织细胞不能直接合成白木香醛等沉香倍半萜化合物，这些倍半萜类化合物的形成可能是感染的真菌对其细胞逆境代谢产物进一步代谢的结果。他们采用HPLC法检测白木香受黄绿墨耳菌感染后，色酮类化合物的形成规律。结果显示白木香在真菌感染后，开始形成色酮类化合物，并随时间不断增加。从第3个月后含量增加显著。在此过程中，沉香中色酮类化合物的相对含量也呈增加趋势，但不明显。由于黄绿墨耳菌为担子菌类真菌是一种无致病性、专营腐生生活的木材腐朽菌，白木香并非其天然寄主，菌株在白木香树干生长非常缓慢，导致结香效率不高且不稳定。
为建立高效、稳定的白木香结香技术体系，亟需寻找新的强诱导结香的菌株，这对我国的沉香生产也有着十分重要的意义。而且迄今为止，沉香的开发和利用都是依靠野生白木香树的采集，不仅价格昂贵，而且供应量也无法保证。
【发明内容】
为解决上述中存在的问题与缺陷，本发明提供了一种沉香诱导剂及其制备方法。所述技术方案如下：
一种沉香诱导剂，包括：
百木香树活体茎、PDA培养基、马铃薯蔗糖培养基与白木香基质。
一种沉香诱导剂的制备方法，该方法包括：
对活体茎干进行采样和分离培养，得到沉香诱导真菌；
将沉香诱导真菌接种于培养基上，以得到所需接种体；
将得到的接种体加入到基质中进行培养，形成沉香诱导剂。
对沉香诱导真菌接种于PDA平板培养基上，并置于黑暗条件25℃培养5～7天后，进行沉香诱导真菌的形态学鉴定和分子生物学鉴定。
将白木香树活体茎上正在形成沉香的部位割下，并经乙醇、升汞消毒后，置于PDA培养、分离、纯化进行保存。
将沉香诱导菌原始菌株接种在PDA活化形成一级接种体，然后接种于马铃薯蔗糖液体培养基发酵得到二级接种体。
将活化的二级接种体加入白木香基质中培养，并在30℃恒温、黑暗、通气条件下培养3～5天后，形成活性的沉香诱导剂。
本发明提供的技术方案的有益效果是：
通过本发明，能够显著地缩短沉香的形成时间，提高白木香树地栽培效益，保证沉香规模化生产的原料供应，而且在帮助山区农民脱贫致富的同时也保护了生态环境。其方法简便、成本低廉，具有良好的市场应用前景。
【附图说明】
图1是沉香诱导剂的制备方法的流程图；
图2为白木香树正在形成沉香的茎干组织和侵染的真菌样品；
图3为白木香树内侵染菌的分离培养情况；
图4为沉香诱导菌株BWL(L.theobromae)样品；
图5为通用引物ITS1/ITS4对诱导菌株BWL(L.theobromae)的PCR扩增结果；
图6为诱导菌株BWL(L.theobromae)的ITS序列。
【具体实施方式】
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述：
实施例1
本实施例提供了一种沉香诱导剂，包括百木香树活体茎、PDA培养基、马铃薯蔗糖培养基与白木香基质。
白木香基质是由一下百分比组分的材料构成：73％白木香树粉末、25％麸皮、1％蔗糖、0.5％碳酸钙、0.2％(NH4)2HPO4、0.2％K2HPO4、0.1％MgSO4·7H2O。
实施例2
本实施例提供了一种沉香诱导剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
步骤101沉香诱导真菌的采样和分离培养；
将白木香树活体茎干上正在形成沉香的部位割下(见图2)，剪成3×3mm小块。75％乙醇消毒2min，0.1％升汞消毒1min，再在无菌水中洗涤4次，用灭菌滤纸吸干，置于PDA培养基平板上25℃黑暗培养，待长出菌落后，通过挑取菌丝尖端方法对分离的真菌进行纯化。纯化后的真菌，保存在含液体石蜡的PDA斜面试管中。
步骤102沉香诱导真菌的鉴定；
直径10cm培养皿，加20ml PDA成平板，接种直径为7mm的菌落边缘菌丝块，观察不同天数可可毛色二孢菌的菌落特征。结果显示在30℃的条件下，可可毛色二孢在PDA平板生长极快，菌落直径扩展速率可达5厘米/天，初期菌落为白色，第5天产生草绿色素，以后逐渐加深而成为黑色(见图3、图4)。
将沉香诱导菌株移植于PDA平板培养基上，置黑暗条件25℃培养5～7天后，收集菌丝体，快速放入液氮中或-70℃保存。基因组DNA提取按照参考文献Doyle J J，Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities offresh leaftissues[J].Phytoehemistry Bulletin，1987，19：11-15.的方法进行。采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS 1：5’-TTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3’(White TJ，Bruns T，Lees S，Taylor J.Amplification and direct sequencing on fungal ribosomal genes forphylogenetics.In：Innis MA，Gelfand DH，Sninsky JJ and White TJ(eds)PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications Academic Press，San Diego，1990，315-322.)扩增5.8S rDNA及其两侧的ITS1和ITS2基因片段。反应体系为：总反应体系为20μL，模板DNA为50ng，引物各为10pmol/L，dNTP为250μmol/L，MgCl2为2mmol/L，Taq DNA聚合酶为1.0U。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，52℃退火1min、72℃延伸1min，共30个循环；最后一步72℃延伸5min。结果显示用ITS1和ITS4引物，对分离菌株rDNA的ITS区进行扩增，均产生一个大小约500bp的DNA片段，见图5。测序结果经BLAST搜索核酸数据库显示，序列一致于L.theobromae的ITS1、ITS2和5.8S rDNA序列(Isolate：Lasiodiplodia theobromae strain GrS1-2，Accession No.FJ904912.1)，进一步证实了分离于沉香诱导菌株是可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae(见图6)。
步骤103沉香诱导菌接种体的制备；
沉香诱导菌原始菌株接种在PDA培养基上，在30℃恒温、黑暗条件下培养5～7天，形成一级接种体。再将一级接种体接种于pH值5.5的马铃薯蔗糖液体培养基中。将0.3～0.5g菌丝体接种于1000ml马铃薯蔗糖液体中，30℃、120～150r/min下振荡培养3～5天后，得到每ml含0.2～0.4g菌丝悬浮液体，即二级接种体。
步骤104沉香诱导剂的制作；
将活化的二级接种体加入白木香基质中培养，30℃恒温、黑暗、通气条件下培养3～5天后，即具有活性的沉香诱导剂。沉香诱导剂为活性菌株，需尽快使用，在室温下可保持活力15～20天，在4℃下可保持活力3个月。
上述白木香基质的制作过程：将73％白木香树粉末、25％麸皮、1％蔗糖、0.5％碳酸钙、0.2％(NH4)·2HPO4、0.2％K2HPO4、0.1％MgSO4·7H2O进行混合，加水浸泡24～36小时，然后在121℃、0.11MPa/cm2高温高压灭菌1小时，冷却后制成白木香基质培养基，然后用于接种。
上述马铃薯蔗糖液体培养基制作过程为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000ml，家蔗糖20g，琼脂15g，融化后分装，调pH值至5.5，121℃、0.11MPa/cm2高温高压灭菌15min。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。