一种复合酶类化痰药 【技术领域】
本发明属于医药技术领域，特别涉及酶类化痰药的处方、制剂及其临床应用，尤其是由蛋白酶和脱氧核糖核酸酶(DNase)组成的复合酶化痰药的处方、制剂及制备方法。
背景技术
正常生理状态下的痰液是呼吸道自我清洁的主要实现形式，然而在病理状态，如肺炎、支气管炎、肺癌等情况下，痰液由于其粘稠性和刺激性会引发多种生理反应，咳嗽、呼吸不顺畅等，严重情况下甚至会造成气管阻塞从而威胁到患者的生命。因此呼吸道疾病治疗中的一个重要组成部分就在于化痰。
痰液的粘稠性主要来自于其组成之一‑粘蛋白，目前市面上以此为依据设计的化痰药物已有数种，例如乙酰半胱氨酸气雾剂、木瓜蛋白酶含片等等(均已为中国药典2005版收录)。但是痰液的粘稠性并不仅仅来自于粘蛋白，在呼吸道炎症反应中，死亡的病菌、受损的呼吸道细胞、死亡的白细胞均会释放出大量的脱氧核糖核酸(DNA)进入痰液，DNA分子的高聚合度和复杂空间结构会进一步加强痰液的粘稠性从而形成浓痰，而且当DNA分子和粘蛋白分子交织在一起的时候，空间位阻加大增加了痰液中蛋白质的降解难度。因此，在化痰药处方中引入对DNA作用的药物成分例如脱氧核糖核酸酶(DNase)可能会大大提高对浓痰的化解能力。对此，国内外大量的实验室研究表明，一定剂量的DNase如人重组人脱氧核糖核酸酶I或溶血性链球菌来源的链道酶在体外对于炎性脓痰的降解作用可以在约5‑10分钟内完成，是一种快速、高效的化痰药物资源。但到目前为止，以脱氧核糖核酸酶为主药成分或主药成分之一的上市化痰药尚未出现。
需要指出的是，与蛋白酶相类似的是，脱氧核糖核酸酶也已成功地应用于多种疾病的治疗，例如链道酶注射剂应用于血栓消除(中国药典2005版收录之注射剂型)，重组人脱氧核糖核酸酶I应用于肺囊性纤维化疾病的治疗(美国上市药物)。近年来，人们也发现脱氧核糖核酸酶I对于支气管扩张病人有显著的肺功能改善作用，这表明脱氧核糖核酸酶会越来越多地应用于呼吸道疾病的治疗，其呼吸道用药的安全性毋庸置疑。
【发明内容】
本发明的目的是为克服已有技术的不足之处，提出一种复合酶类化痰药，能有效化解口腔、喉部和气管的痰液，特别是浓痰，以克服痰液对呼吸的阻塞。
本发明提出的一种复合酶类化痰药，该化痰药由一种或一种以上脱氧核糖核酸酶和一种或一种以上蛋白酶组合及药用辅料制成的固体制剂或液体制剂；在固体制剂处方中脱氧核糖核酸酶、蛋白酶、辅料的质量比例范围(W/W)为1∶(0.1‑1)∶(50‑2000)；在液体制剂处方中中脱氧核糖核酸酶、蛋白酶、辅料的质量比例范围(W/W，不包括水、抛射剂及其它共溶剂)为1∶(0.1‑1)∶(0.01‑100)。
本发明所涉及的复合酶类化痰药，其中的脱氧核糖核酸酶可包括重组人脱氧核糖核酸酶I，牛胰腺脱氧核糖核酸酶I，猪脾脏脱氧核糖核酸酶II，蚯蚓脱氧核糖核酸酶EWD1，溶血性链球菌链道酶；处方中的蛋白酶包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、沙雷氏菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、灰色链球菌蛋白酶、蚕蛹蛋白酶。
由于脱氧核糖核酸酶为一种蛋白质物质，易被蛋白酶水解从而失去应用价值，因此本发明所涉及的复合酶类化痰药其制剂形式相当重要，采用合适的工艺制备成不同的制剂形式不仅仅是临床应用的需要，也是保护和维持复合酶类化痰药的生物活性的需要。具体来说：
首先是可以通过冻干制剂、片剂、粉雾剂等制剂形式的固态特点保证蛋白酶和脱氧核糖核酸酶在充分混合的情况下而不会发生降解作用，从而可以长期保存。其中冻干制剂可现用现配成水溶液或雾化制剂，用于临时填装的气雾剂或喷雾剂，也可在临床上采用器官滴入的方式用于重症病人的化痰治疗；片剂可以以含片形式服用，用于化解口腔和喉部的痰液；而粉雾剂则可以配合特定的干粉吸入装置使用，可使药物微粒进入呼吸道，有效地化解气管的痰液。
其次，作为呼吸道或口腔后部给药，也可以采用气雾剂或喷雾剂两种液体制剂形式。由于液体制剂可能存在的蛋白酶降解脱氧核糖核酸酶的作用，因此上述两种液体制剂可以采用两种主要成分分别制备，使用前再行混合的组合；也可以在液体制剂中引入酶稳定剂，同时调节水溶液体系pH＝2‑5，从而有效地避免蛋白酶降解作用。
本发明还提出了一种采用上述复合酶类化痰药的可长期稳定的复合酶水溶液制备方法：
A)将脱氧核糖核酸酶和酶稳定剂溶解在一定量的水中得溶液I
B)用稀盐酸将溶液I调节至pH＝3‑5，得溶液II；
C)将蛋白酶溶解在溶液II中得到能够长期稳定保存的复合酶水溶液。
这其中选择金属离子(Mg
2+、Ca
2+)、氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸)、多羟基化合物(葡萄糖、甘露醇、甲壳素、山梨糖醇)的组合作为酶稳定剂，一方面可以稳定两种酶的构象，另一方面结合pH的调解可以有效抑制蛋白酶对脱氧核糖核酸酶的降解作用。
除上述处方设计、组合设计和相应的制备技术外，本发明所涉及的制剂具体制备技术均为常规技术，所选用的相关辅料均为《中国药典》收录的相应制剂辅料，不在本发明专利的保护范围之内，故不赘述。
本发明通过以上设计和步骤制备脱氧核糖核酸酶/蛋白酶类化痰药，具有以下优势：
本发明提出的组合脱氧核糖核酸酶和蛋白酶的复合酶类化痰药，可以显著提高药物化解痰液的能力，尤其是能有效化解阻塞呼吸道、严重干扰呼吸功能的浓痰；
本发明提出的复合酶水溶液制备方法，很好的保护了脱氧核糖核酸酶在蛋白酶存在下的生物活性，使得这一复合酶类药物的稳定性可以实现；
本发明可以满足多种临床应用的需要。
【具体实施方式】
实施例1
冻干制剂：取10mg溶血性链球菌链道酶粉末、5mg牛胰腺脱氧核糖核酸酶I粉末和15mg枯草杆菌蛋白酶粉末溶解于10mL生理盐水中，加入5mg乳酸钙和5g乳糖，充分溶解后用稀氢氧化钠调节pH值为7.2，置‑16℃冰冻干燥机中过夜冰冻干燥后分装。使用时用2‑10mL生理盐水溶解此冻干制剂为一次剂量(气管滴入、吸入或口腔喷雾)。
实施例2
片剂：将1g猪胰腺脱氧核糖核酸酶I粉末、1g蚯蚓脱氧核糖核酸酶EWD1、500mg木瓜蛋白酶粉末、100mg蚕蛹蛋白酶、200mg胃蛋白酶、10g碳酸钙和35g亮氨酸加入150g山梨醇糖中，搅拌混匀后压片制备可得组合酶化痰含片(每片含有10000单位木瓜蛋白酶、2000单位蚕蛹蛋白酶、4000单位胃蛋白酶、4000单位牛胰腺脱氧核糖核酸酶I和4000单位蚯蚓脱氧核糖核酸酶EWD1，每次含服1‑2片)。
实施例3
粉雾剂：取1g柠檬酸溶解于1000mL生理盐水中，加入200mg重组人脱氧核糖核酸酶I、10mg沙雷氏菌蛋白酶、10mg灰色链球菌蛋白酶搅拌溶解，再加入15克甘露醇、2克苏氨酸，充分溶解后喷雾干燥得复合酶制剂粉末，分装于硬胶囊中用于粉雾剂吸入，每胶囊的吸入量中含2000单位沙雷氏菌蛋白酶、1000单位灰色链球菌蛋白酶和2000单位重组人脱氧核糖核酸酶I。
实施例4
粉雾剂：将200mg胰蛋白酶溶解于1000mL生理盐水中，加入10克乳糖，充分溶解后喷雾干燥得含胰蛋白酶的粉末A；将500mg重组人脱氧核糖核酸酶I溶解于1000mL生理盐水中，加入10克乳糖，充分溶解后喷雾干燥得含重组人脱氧核糖核酸酶I的粉末B；将粉末A和粉末B充分搅拌混合均匀后分装于硬胶囊中用于粉雾吸入，每胶囊的吸入量中含2000单位胰蛋白酶和1000单位重组人脱氧核糖核酸酶I。
实施例5
喷雾剂(临时填充)：将5mg猪脾脏脱氧核糖核酸酶II、0.5mg冰片、1mg甲壳素溶解在10mL生理盐水中制备得药液，使用时将1mg菠萝蛋白酶粉末加入该药液中充分溶解后，将药液与乙醇按照9∶1(W/W)的比例混合均匀后装入口腔喷雾器中用于口腔喷雾。
实施例6
气雾剂(临时填充)：将10mg牛胰腺脱氧核糖核酸酶I、0.1mg木糖醇、0.1mg蜂胶溶解在5mL生理盐水中制备得药液A；将2mg糜蛋白酶、0.1mg木糖醇、0.1mg蜂胶溶解在5mL生理盐水中制备得药液B。使用前将药液A、药液 B、异丙醇、1，1，1，2‑四氟乙烷按照1∶1∶0.1∶98(W/W)的比例填充入气雾剂吸入装置中使用。
实施例7
气雾剂(长期保存)：
第一步：
A)将100mg重组人脱氧核糖核酸酶I溶解在5mL生理盐水中，加入1mg乳酸钙，充分溶解得溶液I；
B)用稀盐酸调节溶液I至pH＝3，得溶液II；
C)再在溶液II中加入25mg糜蛋白酶得到长期稳定的复合酶水溶液；
第二步：将该溶液和乙醇、1，1，1，2‑四氟乙烷按照1∶0.1∶95(W/W)的比例填充入气雾剂吸入装置中则制备成可以长期保存的吸入式气雾剂。
实施例8
喷雾剂(长期保存)：
第一步：
A)将100mg链道酶溶解在5mL生理盐水中，加入0.2mg氯化镁、1mg异亮氨酸、1mg甲壳素，充分溶解得溶液I；
B)用稀盐酸调节溶液I至pH＝4.5，得溶液II；
C)再在溶液II中加入5mg胰蛋白酶得到长期稳定的复合酶水溶液；
第二步：将该溶液和乙醇按照9∶1(W/W)的比例装入压力喷雾器中则制备成可以长期保存的口腔喷雾剂。
实施例9
气雾剂(长期保存)：
第一步：
A)将50mg牛胰腺脱氧核糖核酸酶I和50mg猪脾脏脱氧核糖核酸酶II溶解在5mL葡萄糖水溶液(5％)中，加入2mg亮氨酸、1.5mg山梨糖醇，充分溶解得溶液I；
B)用稀盐酸调节溶液I至pH＝3，得溶液II；
C)再在溶液II中加入15mg胰蛋白酶得到长期稳定的复合酶水溶液；
第二步：将该溶液和乙醇、正丁烷、1，1，1，2，3，3，3‑七氟丙烷按照1∶0.1∶5∶90(W/W)的比例填充入气雾剂吸入装置中则制备成可以长期保存的吸入式气雾剂。
实施例10
喷雾剂(长期保存)：
第一步：
A)将100mg重组人脱氧核糖核酸酶I溶解在5mL生理盐水中，加入0.1mg氯化镁、1mg半胱氨酸、2mg甘露醇，充分溶解得溶液I；
B)用稀盐酸调节溶液I至pH＝4，得溶液II；
C)再在溶液II中加入5mg木瓜蛋白酶和5mg菠萝蛋白酶得到长期稳定的复合酶水溶液；
第二步：将该溶液和乙醇按照9∶1(W/W)的比例装入压力喷雾器中则制备成可以长期保存的口腔喷雾剂。
蛋白酶对痰液的化解作用已为临床所证明，本发明所涉及的复合酶化痰药物可以在其药理基础上进强药效作用，体外化痰作用试验如表1所示：
表1
体外化痰试验痰液样本1痰液样本2痰液样本3痰液样本4痰液样本5痰液样本6平均值
木瓜蛋白酶含片18min＞30min6min＞30min5min21min22±12min
糜蛋白酶溶液16min24min9min＞30min5min22min20±11min
实施例2处方9min11min7min13min4min7min9±4min
实施例6中水溶液11min10min8min15min5min10min10±4min
实施例7中水溶液9min7min8min11min5min7min8±3min
表1中；痰液样本为临床呼吸道疾病患者咳出脓痰液；
各实验药物中各种酶的添加总量为痰液重量的1％；
化痰试验时添加适量的生理盐水并置37℃温浴轻微振荡，以痰液完全分散为化痰指标。
上述实验表明，在化痰药物处方中添加适量的脱氧核糖核酸酶确实可以大大加快痰液尤其是脓痰的化解速度。
另如上所述，本发明提出的复合酶水溶液制备方法，旨在保护脱氧核糖核酸酶在蛋白酶存在下的生物活性，结果如表2所示：
表2
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表2中的实施例5为在溶液中溶解相应量蛋白酶后的复合酶水溶液。
上述实验表明本发明提出的复合酶水溶液制备方法相对于简单配制溶解，可以极大提高脱氧核糖核酸酶在蛋白酶存在条件下的稳定性；当然该类制剂仍建议冷藏保存，随身携带药物应在1周内用完，这是由蛋白类药物的特性所决定的。