小金海棠 MxCS 蛋白及编码基因与应用 技术领域 本发明涉及一种与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用， 特别涉及小金海 棠 MxCS 蛋白及编码基因与应用。
背景技术 铁元素是作物生长必需的营养元素之一。 作物缺铁会引起叶片黄化、 早衰等现象， 严重者造成作物产量与品质下降。农业生产缺铁是一个世界性的问题， 世界各国都有大量 有关植物缺铁的报道。
Robinson， N.J. 等在 1999 年就发现从拟南芥里克隆的 FRO2 基因可以恢复拟 南 芥 frdl-1 突 变 体 的 Fe3+- 螯 合 还 原 酶 的 活 性， 并且拟南芥植株的抗缺铁能力增强 (Robinson， N.J.， et al.， A ferric-chelate reductase for iron uptake from soils. Nature1999.397 ： 694-697)。肖海华等 2008 年发现从山定子里克隆的 MbNRAMP1 基因可 以提高酵母菌抗缺铁能力 (Hai-hua Xiao et al.， The Iron-regulated Transporter， MbNRAMP1， Isolated from Malus baccatais Involved in Fe， Mn and Cd Trafficking)。 而西红柿的 LeFRO1 基因和豌豆的 PsFRO1 基因主要在叶中表达， 转基因后也可以提高植株 对缺铁的抵抗能力。凌宏清等发现转入 NAS 基因可以恢复西红柿 NA 突变体 chloronerva 的抗缺铁能力。
因此， 通过转基因技术提高或者恢复植物的抗缺铁能力为研究的热点。
发明内容 本发明的一个目的是提供一种植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的植物耐缺铁相关的蛋白， 名称为 MxCS， 来源于苹果属小金海棠 (Malus xiaojinensis)， 是如下 1) 或 2) 的蛋白质 ：
1) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ；
2) 将序列表中序列 1 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失 和 / 或添加且与植物耐缺铁相关的由 1) 衍生的蛋白质。
其中， 序列表中的序列 1 由 473 个氨基酸残基组成。
为了使 1) 中的 MxCS 便于纯化， 可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。
表 1. 标签的序列
标签 Poly-Arg残基序列5-6( 通常为 5 个 ) RRRRR3101851283 A CN 101851284说标签 Poly-His FLAG Strep-tag II c-myc 残基明书序列2/13 页2-10( 通常为 6 个 ) HHHHHH 8 8 10 DYKDDDDK WSHPQFEK EQKLISEEDL
上述 2) 中的 MxCS 可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达得到。上 述 2) 中的 MxCS 的编码基因可通过将序列表中序列 2 的自 5′末端第 86-1504 位碱基所示 的 DNA 序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义 突变， 和 / 或在其 5′端和 / 或 3′端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。所述一个或几 个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加可为不超过 10 个氨基酸残基的取代和 / 或缺 失和 / 或添加。
上述与植物耐缺铁相关蛋白的 cDNA 基因也属于本发明的保护范围。
与植物耐缺铁相关蛋白的 cDNA 基因具体可为如下 1)-4) 中任一所述的基因 ：
1) 序列表中的序列 2 所示的 DNA 分子 ；
2) 序列表中的序列 2 自 5′末端第 86 位 -1504 位脱氧核糖核苷酸所示的 DNA 分 子；
3) 在严格条件下可与 1) 或 2) 的 DNA 序列杂交且编码权利要求 1 所述蛋白的 DNA 分子 ；
4) 与 1) 或 2) 所示 DNA 序列具有 90％以上的同一性且编码权利要求 1 所述蛋白 的 DNA 分子。
所述步骤 4) 中的基因， 与 1) 或 2) 的基因最好有 95％以上的同一性。
上述序列表中的序列 2 由 1882 个核苷酸组成， 其开放阅读框架 (ORF) 为自 5′末 端第 86-1504 位脱氧核苷酸， 编码的氨基酸序列是序列表中的序列 1。
上述严格条件可为在 6×SSC， 0.5％ SDS 的溶液中， 在 65℃下杂交， 然后用 2×SSC， 0.1％ SDS 和 1×SSC， 0.1％ SDS 各洗膜一次。
扩增上述 MxCS 基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有上述与植物耐缺铁相关蛋白编码基因的重组载体、 转基因细胞系和重组菌也 属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有 MxCS 基因的重组表达载体。所述植物表达载 体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等， 如 pCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、 pBI121、 pBin19、 pCAMBIA2301、 pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表达载体。携带有本发 明与植物耐缺铁相关蛋白编码基因 MxCS 的植物表达载体可通过 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病 毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电导、 农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或 组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥或者烟草等双子叶植物。
使用 MxCS 基因构建重组植物表达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一 种增强型、 组成型、 组织特异型或诱导型启动子， 如花椰菜花叶病毒 (CAMV)35S 启动子、 泛 生素基因 Ubiquitin 启动子 (pUbi) 等， 它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用 ； 此外， 使用本发明的基因构建植物表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增 强子， 这些增强子区域可以是 ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序 列的阅读框相同， 以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是 广泛的， 可以是天然的， 也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基 因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行 加工， 如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因 (GUS 基因、 萤光素 酶基因等 )、 具有抗性的抗生素标记物 ( 庆大霉素标记物、 卡那霉素标记物等 ) 或是抗化学 试剂标记基因 ( 如抗除莠剂基因 ) 等。从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性标 记基因， 直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体为可在 pBI 121 的多克隆位点间 ( 如插入 XbaI 和 BamHI 位点 ) 插入序列表中序列 2 的自 5 ′末端第 86-1504 位脱氧核苷酸得到的重组表达载体 pBI121-35sMxCS。
本发明的另一个目的是提供一种利用 MxCS 编码基因培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法， 是将 MxCS 编码基因转入目的植物中， 得 到转基因植物 ； 所述转基因植物的耐缺铁能力高于所述目的植物 ； 所述转基因植物根系中 铁含量高于所述目的植物。
其中， MxCS 编码基因可通过上述重组表达载体导入目的植物中。
上述目的植物可为双子叶植物， 如拟南芥或烟草 ； 当所述双子叶植物为烟草时， 所 述转基因植物的叶片中铁含量高于所述目的植物。
本发明构建了 MxCS 的表达载体， 并将其转入野生型拟南芥和烟草植株中， 结果表 明， 转入 MxCS 的拟南芥植株和转入 MxCS 的烟草植株耐缺铁性均明显提高， 说明 MxCS 是与 植物耐缺铁相关的蛋白， MxCS 蛋白及其编码基因可用于提高植物的耐缺铁性， 为进一步研 究植物体内铁元素运输利用机制提供理论依据。 附图说明
图 1 为 MxCS 基因的 PCR 扩增产物结果 图 2 为不同铁处理水平下 MxCS 基因在小金海棠不同器官中的半定量 RT-PCR 结果 图 3 为 MxCS 基因瞬时表达载体 pEZS-MxCS 的酶切鉴定结果 图 4 为 MxCS 基因的亚细胞定位检测结果 图 5 为表达载体 pBI121-35sMxCS 的酶切鉴定结果 图 6 为转基因根癌农杆菌 GV3101 的菌落 PCR 检测结果 图 7 为转基因拟南芥的 PCR 鉴定结果 图 8 为不同基因型的拟南芥在正常供铁和低铁处理两周时的表型 图 9 为转基因烟草的 PCR 鉴定结果 图 10 为不同基因型的烟草植株低铁处理 5 天、 10 天的表型具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法， 所用引物合成及测序工作均 由上海生工生物技术服务有限公司完成。
限制性内切酶 BamHI、 XholI、 XbaI 等内切酶均购自大连宝生物工程有限公司， pEASY-T1-Vector Kit 购自全式金生物公司， 3’ 5’ -RACE cDNA Amplification Kit 购自 Invitrogen 公司。
Amp 抗生素、 Tris 饱和酚、 水饱和酚、 DEPC、 2000bpDNA Marker、 琼脂糖、 酵母提取 物、 胰蛋白胨均购自北京鼎国生物技术有限公司。
下述实施例中扩增 MxCS 基因全长或任一片段所用引物如表 2 所示， 其中下划线部 分表示酶切位点 ：
表 2 扩增 MxCS 基因引物序列
引物名称 F1 中 R1 中 Adp F1 F2 AAP AUAP R1 F5 全 R5 全 RT-5F RT-5R S5 R5序列 CTTGGTGGRATGAGAGGRATGAC ATCCAHARCAAMACTTCCTGAT CTGATCTAGAAGGTACCGGATCC AGAATGCCAGAAAGTATTACCTGCT TTGCACAAGTGCCAGTAGTAGCTGC GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG GGCCACGCGTCGACTAGTAC GCAGGTAATACTTTCTGGCATTCTG TTCACATTTAAAACGTAATTGAGTT TTTGTTAAAATAAAGTCCAAGCACT GTATTCTTCAGGAGCGTCACCGCGC AGTGTTACGATGGAATCGCTTGAGA CCGCTCGAGATGGTATTCTTCAGGA CGCGGATCCAGACGAAGCTGCTTTCT序列名称 序列 3 序列 4 序列 5 序列 6 序列 7 序列 8 序列 9 序列 10 序列 11 序列 12 序列 13 序列 14 序列 15 序列 166101851283 A CN 101851284说序列 GCGTCTAGAATGGTATTCTTCAGGAG CGCGGATCCAGACGAAGCTGCTTTCT明书序列名称 序列 17 序列 185/13 页引物名称 CS-5 CS-3
实施例一、 与植物耐缺铁相关蛋白 MxCS 及其编码基因的获得
一、 MxCS 基因中间片段的获得
以小金海棠 (Malus xiaojinensis)( 辽宁兴城市国家苹果种质资源圃， 编号为 DGB0458 ； 成明昊， 李晓林， 张云贵， 苹果优良砧木资源 - 小金海棠， 西南农业大学学报， 2000 年 10 月， 22(5) ： 383-386 ； 公众可从中国农业大学获得。) 为实验材料， 提取其叶片总 RNA， 将其反转录为 cDNA。以此 cDNA 为模板， 以 F1 中 ( 序列 3) 和 R1 中 ( 序列 4) 为引物， PCR 扩增 MxCS 基因的中间片段， 即为序列 2 的自 5′末端第 312-1040 位核苷酸。反应混合物如 下：
ddH2O 10×PCR 缓冲液 dNTP Mixture(2.5mM) Taq 酶 (5U/μl) F(10mM) R(10mM) 模板 ( 反转录的 cDNA) Total
17.0μl 2.5μl 2.0μl 0.5μl 1.0μl 1.0μl 1.0μl 25μlPCR 反应条件 ： 先 94℃预变性 3min ； 然后 94℃变性 40S， 62℃退火 40S， 72℃延伸 1min， 共 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 10min。
取 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 结果如图 1A 所示， 其中， M 为 2000bp 的 DNA 分 子量标准， 1 和 2 为 MxCS 基因中间片段的 PCR 产物。结果表明得到 727bp 的目的片段。切 下目的条带， 纯化回收后按照 pEASY-T1-Vector Kit 载体试剂盒 ( 购自全式金生物公司 ) 说明书将 PCR 产物连接到 pEASY-T1 上， 进行测序。经同源性比较分析后确定获得的 727bp 片段即是 MxCS 因的中间片段。
其中 ： 上述引物的序列如下 ：
F1 中 ： 5′ -CTTGGTGGRATGAGAGGRATGAC-3′ ( 序列 3) ；R1 中 ： 5′ -ATCCAHARCAAMACTTCCTGAT-3′ ( 序列 4)。
二、 MxCS 基因 3’ 端序列的获得
以步骤一获得的 cDNA 序列为模板， 在其 3′端设计引物， 进行 PCR 反应， 扩增 MxCS 基因的 3’ 端序列。Master Mix 预混物体系如下 ：
总体积 36μl， 将上述 Master Mix 预混物平均分成 4 管， 每管 9μl， 按照下表加入 引物和 cDNA 模板 ：
PCR 反应条件 ： 先 94℃预变性 3min ； 然后 94℃变性 30S， 62℃退火 30S， 72℃延伸 2min， 共 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 10min。
以引物 F1( 序列 6) 和 Adp( 序列 5) 进行第一轮 PCR， 再取 1μL 作为模板， 以 F1 和 Adp 为引物再进行 PCR 反应， PCR 反应条件与第一轮相同， 获得的产物为样品 1。同样的方 法以引物 F2( 序列 7) 和 Adp 为引物进行两次 PCR 获得的产物为样品 2。分别取 10μL 样品 1 和样品 2 进行琼脂糖凝胶电泳检测。
结果如图 1B 所示 ： 其中， M 为 2000bp 的 DNA 分子量标准， 1 为样品 1( 引物 Adp 和 F1 的 PCR 产物 )， 2 为样品 2( 引物 Adp 和 F2 的 PCR 产物 )。结果表明， 两个单引物对照组 都没有扩增出特异条带， 样品 2 和样品 1 分别为约 1000bp 和 1400bp 的片段。
切下 1000bp 和 1400bp 条带， 纯化回收后按照 pEASY-T1-Vector Kit 载体试剂盒 ( 全式金生物公司 ) 说明书将 PCR 产物分别连接到 pEASY-T1 载体上， 进行测序。经同源性 比较分析后确定获得约 1400bp 片段即是 MxCS 基因的 3’ 端序列， 也即为序列 2 的自 5′末 端第 403-1803 位核苷酸。
其中 ： 上述引物的序列如下 ：
Adp ： 5′ -CTGATCTAGAAGGTACCGGATCC-3′ ( 序列 5) ；
F1 ： 5′ -AGAATGCCAGAAAGTATTACCTGCT-3′ ( 序列 6)。
F2 ： 5′ -TTGCACAAGTGCCAGTAGTAGCTGC-3′ ( 序列 7)。
三、 MxCS 因 5’ 端序列的获得
以步骤一获得的 cDNA 序列为模板， 在其 5′端设计引物， 进行 PCR 反应， 扩增 MxCS
基因的 5’ 端序列。Master Mix 预混物体系如下 ：
总体积 40μl， 将上述 Master Mix 预混物平均分成 4 管， 每管 10μl， 按照下表加 入引物和模板 ：
PCR 反应条件 ： 先 95℃预变性 3min ； 然后 95℃变性 30S， 60℃退火 30S， 72℃延伸 1min， 共 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 10min。
将第一轮 PCR( 以 AAP( 序列 8) 和 R1( 序列 10) 为引物 ) 产物稀释 10 倍， 取 1μL 作为模板， 以 R1( 序列 10) 和 AUAP( 序列 9) 为引物， 进行巢式 PCR 反应， PCR 反应条件与第 一轮相同。
取 10μL 第二轮 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 结果如图 1C 所示， 其中， M为 2000bp 的 DNA 分子量标准， 1 为样品组 (R1 和 AUAP) 的 PCR 扩增结果， 2 为单引物 R1 对照组 的 PCR 扩增结果， 3 为单引物 AUAP 对照组的 PCR 扩增结果。结果表明， 两个单引物对照组都 没有扩增出特异条带， 只有样品组扩增得到约 670bp 的片段。
切下目的条带， 纯化回收后将 PCR 产物连接到 pEASY-T1 载体上， 进行测序。经同 源性比较分析后确定获得的约 670bp 片段即是 MxCS 基因的 5’ 端序列， 也即序列 2 的自 5′ 末端第 1-670 位核苷酸。
其中 ： 上述引物的序列如下 ：
AAP ： 5′ -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′ ( 序列 8) ；
AUAP ： 5′ -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′ ( 序列 9)。
R1 ： 5′ -GCAGGTAATACTTTCTGGCATTCTG-3′ ( 序列 10)。
四、 MxCS 基因全长 cDNA 序列的获得
将上述 PCR 扩增获得的 MxCS 基因 5’ 端序列、 中间序列以及 3’ 端序列进行同源性 比较， 利用 DNAMAN 等生物软件进行拼接校正， 拼接出 MxCS 基因全长 cDNA 序列。根据拼接 的 MxCS 基因全长 cDNA 序列设计引物 F5 全 ( 序列 11) 和 R5 全 ( 序列 12)， 以步骤一中反转 录的 cDNA 为模板， 利用 RT-PCR 方法扩增全长 MxCS 基因， 用高保真 Pfu 酶替换 Taq 酶， PCR
反应混合物如下 ：
10×PCR 缓冲液 dNTP Mixture(2.5mM) 引物 F5 全 (10mM) 引物 R5 全 (10mM) 模板 ( 反转录的 cDNA) Pfu 酶 (5U/ul) ddH2O Total
2.5μl 2.0μl 0.5μl 0.5μl 1.5μl 0.3μl 17.7μl 25μlPCR 反应条件 ： 先 94℃预变性 3min ； 然后 94℃ 50S， 56℃ 1min， 72℃ 3min， 共 35 个 循环 ； 再 72℃延伸 10min， 4℃保存。
PCR 产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳检测， 结果如图 1D 所示， 其中， M 为 2000bp 的 DNA 分子量标准， 1 为 MxCS 基因全长 cDNA 序列的 PCR 产物。 结果表明获得 1870bp 的条带。 切下 该目的条带， 纯化回收后按照 pEASY-T1-Vector Kit 载体试剂盒说明书将 PCR 产物连接到 pEASY-T1 载体上， 进行测序， 测序结果表明， 该 1870bp 的核苷酸片段即为 MxCS， 其核苷酸序 列如序列表中序列 2 的自 5′末端第 1-1869 位核苷酸所示， 其编码的氨基酸序列如序列表 中序列 1 所示。 将获得含有该 1870bp 的核苷酸片段的重组表达载体命名为 pEASYT1-MxCS。
其中 ： 上述引物的序列如下 ：
F5 全 ： 5′ -TTCACATTTAAAACGTAATTGAGTT-3′ ( 序列 11) ；
R5 全 ： 5′ -TTTGTTAAAATAAAGTCCAAGCACT-3′ ( 序列 12)。
五、 小金海棠不同器官中 MxCS 基因的表达分析
分别提取过量供铁 (Hoagland 营养液 +320μM Fe-EDTA)、 正常供铁 (Hoagland 营 养 液 +40μM Fe-EDTA) 及 低 铁 处 理 (Hoagland 营 养 液 +4μM Fe-EDTA)0、 2、 4、 6和 8 天的小金海棠幼根、 茎、 新叶 ( 未展开叶 ) 和成熟叶的总 RNA， 紫外分光光度计分别 测定不同器官、 不同处理的 RNA 的含量， 取等质量的上述 RNA， 反转录成单链 cDNA。以 该 单 链 cDNA 为 模 板， 先 以 肌 动 蛋 白 (ACTIN) 基 因 作 为 内 参， 使 用 ACTIN 引 物 Ats ： 5′ -CTACAAAGTCATCGTCCAGACAT-3′和 Atr ： 5′ -TGGGATGACATGGAGAAGATT-3′进行 PCR 扩 增， 根据琼脂糖凝胶电泳结果， 调整不同处理模板的用量， 使各个处理 ACTIN 的 PCR 扩增产 物亮度一致。不同处理模板用量确定后， 进行 ACTIN 与 MxCS 基因的扩增。MxCS 基因扩增的 引物为 ： RT-5F 和 RT-5R。每个处理的 RT-PCR 分析重复 3 次。
结果表明， MxCS 基因在根、 茎、 成熟叶和新叶中都有表达。低铁处理时， 随着处理天数的增加， MxCS 基因在茎和成熟叶中表达增强， 在新叶中的表达也增强。具体结果如图 2A-B 所示。其中， A 为低铁处理 0、 2、 4、 6 和 8 天时， MxCS 基因在根的表达情况， B 为低铁处 理 0、 2、 4、 6 和 8 天时， MxCS 基因在新叶中的表达情况。且 MxCS 基因在各检测部位的表达 量相当。
过量供铁时， 随着处理天数的增加， MxCS 基因在茎和成熟叶中表达增强， 在新叶中 的表达先增强再减弱。结果如图 2C-D 所示。其中， C 为过量供铁 0、 2、 4、 6 和 8 天时， MxCS 基因在根的表达情况， D 为过量供铁 0、 2、 4、 6 和 8 天时， MxCS 基因在新叶中的表达情况。
其中 ： 上述引物的序列如下 ：
RT-5F ： 5′ -GTATTCTTCAGGAGCGTCACCGCGC-3′ ( 序列 13) ；
RT-5R ： 5′ -AGTGTTACGATGGAATCGCTTGAGA-3′ ( 序列 14)
六、 MxCS5 基因的亚细胞定位
(1)、 MxCS 基因与 GFP 融合的瞬时表达载体的构建
使用引物 S5( 序列 15) 和 R5( 序列 16) 进行 PCR 扩增 MxCS 基因全长序列 ( 去除了 终止密码子的 MxCS 开放阅读框 )， 并将其克隆进 pEASY-T1 载体中， 经 XhoI 和 BamHI 酶切后 再克隆进 pEZS-NL 载体 ( 购自全式金生物技术有限公司 ) 中构建瞬时表达载体 pEZS-MxCS。 pEZS-MxCS 转化大肠杆菌 DH5α 菌株， 挑取阳性斑进行菌落 PCR、 酶切鉴定和测序验证， 酶切 鉴定结果如图 3 所示， 其中， M 为 1000bp 的 DNA 分子量标准， 1 为瞬时表达载体 pEZS-MxCS 的酶切鉴定效果图。对鉴定结果为阳性的菌斑摇菌， 提取质粒。 其中 ： 上述引物的序列如下 ：
S5 ： 5′ -CCGCTCGAGATGGTATTCTTCAGGA-3′ ( 序列 15)
R5 ： 5′ -CGCGGATCCAGACGAAGCTGCTTTCT-3′ ( 序列 16)
(2)、 采用基因枪法进行表达载体向洋葱表皮细胞的转化
1、 待转化洋葱表皮的制备
在无菌条件下， 撕下洋葱的内表皮， 平铺于含有 MS 培养基的培养皿中， 然后将培 养皿用锡箔纸包好备用。
2、 金粉悬浮液的制备
称 取 60mg 金 粉， 放 入 1.5ml 灭 菌 的 离 心 管 中， 加 入 1ml 无 水 乙 醇， 震 荡 1min， 10000rpm 离心 10s， 弃上清， 再加入 1ml 无水乙醇， 震荡 1min， 10000rpm 离 10s ； 弃上清， 将 金粉悬于 1ml 无菌水中， 获得金粉悬浮液， -20℃保存备用。
3、 金粉 - 质粒 DNA 复合体的制备
吸 取 8.5μl 上 述 步 骤 2 制 备 的 金 粉 悬 浮 液、 3.5μl 0.1M 亚 硝 胺、 8.5μl 2.5MCaCl2·2H2O 和 5μl 上述步骤 (1) 获得的 pEZS-MxCS， 将混合物在震荡器上振荡 3min ； 10000rpm 离心 20s ； 弃上清， 用无水乙醇漂洗 3 次 ； 加入 30μl 无水乙醇悬浮， 获得金粉 - 质 粒 DNA 复合体备用。
4、 轰击受体材料选用一定压力的压力膜， 与轰击膜一起在 70％的无水乙醇中浸泡 1-2 小时， 取出晒干 ； 金属档板用 70％的无水乙醇浸泡后在酒精灯上灭菌 ； 取 10μl 上述步 骤 3 制备好的金粉 - 质粒 DNA 复合体， 均匀涂布于轰击膜的中间位置上， 不要涂于整个膜 上， 涂布的面积与载体固体圈上的孔径范围一致 ； 将膜晒干后， 安装到发射装置上 ； 将压力 膜安装到气体加速器的下端 ； 洋葱表皮细胞置于培养皿的中部， 放入真空室内， 取下培养皿
盖； 抽真空指针到 26 ； 放气于气体加速器上， 直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时， 可裂膜破开， 气体冲到轰击膜上， 载体向下运动， 被金属档板挡住， 而下面的金属颗粒却透 过金属档板的网孔， 射向靶细胞。
5、 荧光观察
将培养皿用 Parafilm 封好， 28℃培养 24h， 在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达， 采用同样的方法处理对照质粒 pEZS-NL。 具体结果如图 4 所示。 其中， A1 为对照质粒 pEZS-NL 明视场照片， A2 为对照质粒 pEZS-NL 暗视场照片， B1 为质粒 pEZS-MxCS 明视场照片， B2 为 质粒 pEZS-MxCS 暗视场照片。结果表明， MxCS 主要定位于细胞膜上。
实施例二、 MxCS 基因转化拟南芥及其功能验证
一、 MxCS 重组表达载体 (pBI121-35sMxCS) 的构建
以实施例一中用 F5 全和 R5 全扩增的 MxCS 基因全长的 PCR 产物作模板， 以 5’ 端添 XbaI 酶切位点的引物 CS-5( 序列 17) 和 3’ 端添加 BamHI 酶切位点的引物 CS-3( 序列 18) 为引物， 进行 PCR， 回收 PCR 产物。用 XbaI 和 BamHI 分别酶切该 PCR 产物与 pBI121( 购自 北京拜尔迪生物技术有限公司 )， 分别胶回收， 将经酶切的 PCR 产物连接到酶切后的 pBI121 的大片段上， 得到重组表达载体 pBI121-35sMxCS。 将重组表达载体 pBI121-35sMxCS 转化大肠杆菌感受态细胞， 提取质粒， 用 XbaI 和 BamHI 酶切， 琼脂糖凝胶电泳检测， 得到 1400bp 左右的 MxCS 基因片段。结果如图 5 所 示， 其 中 M 为 1000bp 的 DNA 分 子 量 标 准， 1 为 PBI121-35sMxCS 的 酶 切 结 果。 结 果 表 明 pBI121-35sMxCS 为含有 MxCS 基因表达载体。
利 用 冻 融 法 将 含 有 MxCS 重 组 表 达 载 体 pBI121-35sMxCS 导 入 根 癌 农 杆 菌 GV3101( 赵军胜， 支大英， 薛哲勇， 夏光敏 . 根癌农杆菌介导的高羊茅遗传转化研究 . 遗传学 报 .2005.6 Vol 32， No.6 ： 579-585 ； 公众可从中国农业大学获得。) 中获得重组菌 GV3101/ pBI121-35sMxCS， 挑取阳性克隆， 用引物 S5( 序列 15) 和 R5( 序列 16) 进行菌落 PCR 鉴定。 阴性对照为采用同样的方法将空载体 pBI121 导入根癌农杆菌 GV3101 获得重组菌 GV3101/ pBI121 用引物 S5 和 R5 进行菌落 PCR， 阳性对照为将 MxCS 基因全长的 PCR 产物用引物 S5 和 R5 进行 PCR。结果如图 6 所示 ： 其中， M 为 2000bp Plus 的 DNA 分子量标准， 1 为假阳性 克隆， 2 为重组菌 GV3101/pBI121-35sMxCS， 3 为阴性对照重组菌 GV3101/pBI121， 4 为阳性 对照 MxCS 的 PCR 产物。结果表明， 植物表达载体 pBI121-35sMxCS 已成功转入根癌农杆菌 GV3101 中。
其中 ： 上述引物的序列如下 ：
CS-5 ： GCGTCTAGAATGGTATTCTTCAGGAG( 序列 17， 其中下划线部分为 XbaI 位点 )
CS-3 ： CGCGGATCCAGACGAAGCTGCTTTCT( 序列 18， 其中下划线部分为 BamHI 位点 )
二、 重组菌 GV3101/pBI121-35sMxCS 转化拟南芥
当野生型拟南芥 (Arabidopsis thaliana cv.Columbia ； 购自美国俄亥俄州立大 学拟南芥生物资源中心， 网址 ： http://www.arabidopsis.org/index.jsp) 植株长至茎高 3cm 时， 去除其顶生花序， 以刺激叶生花序的生长。打顶 5-7d 后进行转化， 此时叶生花序已 长出， 其下部的花已经有花粉的出现。转化前一天要浇透水， 剪掉角果和已开的花。
将上述获得的重组菌 GV3101/pBI121-35sMxCS 接种于 5mlYEB( 含卡那霉素和利福 平 ) 液体培养基中， 28℃培养 24-36h， 以 1 ∶ 50 的比例转接到 200mlYEB 培养基中， 当 OD600
值为 1.2-1.6 时 4500rpm 离心 10min 收集菌体， 沉淀用适量渗透培养基 (1/2MS+5％的蔗糖 +0.02％ SilwetL-77) 充分悬浮至 OD600 值为 0.6-0.8。
将上述悬浮液倒在小烧杯中， 将拟南芥的花浸入悬浮液中 3-5min， 保证莲座叶以 上部分浸于悬浮液中， 浸泡 5min， 可见植株上有一层薄膜。将浸泡好的拟南芥植株取出， 避 光横放 16-24h， 然后将其放正， 绑住松散花芽培育获得 T0 代转 MxCS 拟南芥。 将 T0 代转 MxCS 拟南芥培育至结实， 收获成熟种子即为 T1 代转 MxCS 拟南芥种子。
采用同样的方法将空载体 pBI121 转入野生型拟南芥， 获得 T0 代转 pBI121 拟南芥， 再收获种子获得 T1 代转 pBI121 拟南芥。
三、 转基因纯合体的筛选及 PCR 检测和测序
将收获的 T1 代转 MxCS 拟南芥种子播种于含 50mg/L 卡纳霉素的 1/2MS 培养基上， 4℃春化 2-3 天， 然后转至 22℃培养， 获得 20 株 ( 请补充 )T1 代转 MxCS 拟南芥植株。筛选 20 株 ( 请核实 ) 真叶健康且根伸长至培养基中的 T1 代转 MxCS 拟南芥植株， 提取它们的基 因组 DNA 并以其为模板， 以 F5 全和 R5 全为引物， 进行 PCR 扩增， 其中 6 株的扩增结果如图 7 所示。其中， M 为 2000bp Plus 的 DNA 分子量标准， S1-S6 为 T1 代转 MxCS 拟南芥的 PCR 结 果， CK 为 T1 代转 pBI121 拟南芥的 PCR 结果， WT 为野生型拟南芥的 PCR 结果， 把亮带切胶回 收， 连接到 pEASY-T1 载体上测序， 结果表明 S1-S6 为 T1 代转 MxCS 拟南芥阳性植株， MxCS 基 因成功转入拟南芥中。采用同样的方法鉴定出共获得 20 株阳性 T1 代转 MxCS 拟南芥。
将 PCR 检测结果为阳性的 T1 代转 MxCS 拟南芥单株收种， 得到 T2 代转 MxCS 拟南 芥种子， 将 T2 代转 MxCS 拟南芥种子再经过相同的筛选， 经卡方检验符合 3 ∶ 1 分离比的 T2 代转基因植株单株收种得到 T3 代转 MxCS 拟南芥种子， 在筛选培养基 (MS+50uM 卡纳硫酸霉 素 ) 上不发生分离的为 T3 代转 MxCS 拟南芥的纯合株系。结果共获得 T3 代转 MxCS 拟南芥 纯合株系 12 株。
采用同样的方法获得转入空载体 pBI121 的 T3 代转 pBI121 拟南芥。
四、 T3 代 转 MxCS 拟 南 芥 在 低 铁 培 养 基 (4Um Fe-EDTA) 和 正 常 供 铁 培 养 基 (100uMFe-EDTA) 上生长的表型观察
选取上述获得的 T3 代转 MxCS 拟南芥的纯合株系 1# 和 14# 的种子， 在 1/2MS 培养 基上生长一周后， 分别移入低铁培养基 ( 含有 4μM Fe-EDTA 的 1/2MS 培养基 )、 正常供铁培 养基 ( 含有 100μM Fe-EDTA 的 1/2MS 培养基 ) 中进行培养并观察表型。以野生型拟南芥 和 T3 代转 pBI121 拟南芥的种子为对照。其中， 1#T3 代转 MxCS 拟南芥测定 10 株， 14#T3 代转 MxCS 拟南芥测定 10 株， 野生型拟南芥测定 8 株， T3 代转 pBI121 拟南芥测定 10 株。2 周后 可以明显看到， 在正常供铁培养基中， T3 代转 MxCS 拟南芥、 T3 代转 pBI121 拟南芥和野生型 拟南芥都能生长正常， 且没有出现明显的表型上的差别 ； 而在低铁培养基中， 1# 和 14#T3 代 转 MxCS 拟南芥两个株系的中分别有 7 株和 8 株均表现出比 T3 代转 pBI121 拟南芥和野生型 拟南芥更耐缺铁的特征， 具体表现如图 8 所示 ： 低铁培养基培养一周后， 所有的野生型拟南 芥 (WV) 和 T3 代转 pBI121 拟南芥 (V) 开始出现明显的叶片黄化现象， 而 1#T3 代转 MxCS 拟 南芥 (1#) 和 14#T3 代转 MxCS 拟南芥 (14#) 叶片生长正常。
五、 转 MxCS 拟南芥中铁元素含量的测定
选取上述获得的 1# 和 14#T3 代转 MxCS 拟南芥种子在 1/2MS 培养基上生长一周后， 分别移入低铁培养基和正常供铁培养基中培养 2 周后， 截取上述拟南芥的根和地上部分，经过灰化处理后用原子吸收法测定其中的 Fe 元素的含量。以经同样处理获得的野生型拟 南芥种子和 T3 代转 pBI121 拟南芥种子为对照， 其中， 1#T3 代转 MxCS 拟南芥测定 3 株， 14#T3 代转 MxCS 拟南芥测定 3 株， 野生型拟南芥测定 3 株， T3 代转 pBI121 拟南芥种子测定 3 株。 测定结果如表 3 所示 ：
表 3. 各株系的铁元素含量
结果表明， 任何处理情况下， 根中铁元素的含量总是明显高于地上部分， 1# 和14#T3 代转 MxCS 拟南芥植株根部和地上部铁金属元素的含量均高于野生型和 T3 代转 pBI121 拟南芥的对照植株， 是以上对照株的 1.2-1.8 倍。野生型拟南芥植株和 T3 代转 pBI121 拟南芥植株铁金属元素的含量没有显著差异。
实施例三、 MxCS 基因转化烟草及其功能验证
一、 烟草叶片的消毒
选 取 长 势 良 好 无 病 毒 感 染 的 珊 系 烟 草 (Nicotiana tabacum cv.Xanthi) 叶 片 (Qing-Lin Liu， Ke-Dong Xu， Nan Ma， Li Zeng， Liang-Jun Zhao.Isolation and functionalcharacterization of DgZFP ： a gene encoding a Cys2/His2-type zinc finger protein inchrysanthemum.Mol Biol Rep(2010)37 ： 1137-1142 ； 公众可从中国农 业大学获得。)， 放入 2L 烧杯中， 添加洗涤液 5-10 滴， 小水冲洗 2-3 小时。先用 75％乙醇消 毒 1 分钟， 再用 1‰的升汞消毒 6-8 分钟， 加入几滴吐温 -20 后无菌水洗 2 遍。
二、 转 MxCS 烟草的获得
将实施例二中获得的重组菌 GV3101/pBI121-35sMxCS 28℃， 180rpm 摇菌过夜， 测 OD600 大于 0.6 即可。取过夜菌液 2mL 转入 50mL 的 YEB 培养基中 28℃， 180rpm 摇菌约 6 小 时。 测 OD600 为 0.6-0.7 之间， 4℃， 5000rpm 离心 10 分钟， 弃上清， 加入约 80mL 的 1/2MS+5％ 蔗糖 (pH ＝ 5.8) 重悬。上述获得的烟草叶片放入 8-10 分钟， 再用滤纸吸干后转入共培养 基 (MS+40mg/L 乙酰丁香酮 ) 上 3 天 ( 黑暗 28℃ )。转入筛选培养基上 (MS+500mg/L 的羧 苄青霉素 +100mg/L 的卡纳 +3.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤 +0.2mg/L 的萘乙酸 ) 进行培养。
等 苗 子 在 培 养 皿 中 长 出 后， 转 入 瓶 中 MS 培 养 基 (MS++500mg/L 的 羧 苄 青 霉 素 +100mg/L 的卡纳霉素 ) 生根， 待苗子长到约 6-10 厘米后转出瓶子， 洗净上面的培养基， 转入 营养土中生长， 然后记录生长状况及拍照片， 得到 6 株 T0 代转 MxCS 烟草。
采用同样方法将含有空载体 pBI121 的农杆菌 GV3101 转化烟草， 得到 T0 代转 pBI121 烟草。
三、 转 MxCS 烟草鉴定提取上述 6 株 T0 代转 MxCS 烟草的基因组 DNA 并以其为模板， 以 F5 全和 R5 全为 引物， 进行 PCR 扩增， 扩增结果如图 9 所示。其中， M 为 2000bpPlus 的 DNA 分子量标准， 1-6 为 T0 代转 MxCS 烟草的 PCR 结果， WT 为野生型烟草的 PCR 结果， 从图 9 中可以看出， 2、 5、 6 为阳性 T0 代转 MxCS 烟草植株， 将这三株的 PCR 产物胶回收连接到 pEASY-T1 载体上测序， 结果表明为序列表中序列 2 的自 5′末端第 86-1504 位核苷酸， 即 MxCS 基因成功转入烟草 中， 共获得 3 株阳性 T0 代转 MxCS 烟草。
四、 转 MxCS 烟草在低铁培养液 (4uM-Fe) 和正常供铁培养液 (40uM-Fe) 中生长的 表型观察
选取上述获得的 3 株阳性 T0 代转 MxCS 烟草， 同时以 5 株野生型烟草植株为对照， 在 Hoagland 营养液中生长一周后， 移入低铁营养液 ( 含有 4μM Fe-EDTA 的 Hoagland 营养 液 )， 以正常供铁营养液 ( 含有 40μM Fe-EDTA 的 Hoagland 营养液 ) 为对照， 进行培养并观 察表型。一周后可以明显看到， 在正常供铁营养液中， T0 代转 MxCS 烟草和野生型烟草都能 生长正常， 且没有出现明显的表型上的差别 ； 而在低铁营养液中， T0 代转 MxCS 烟草均表现 出比野生型烟草更耐缺铁的特征， 具体如图 10 所示， 低铁培养基培养 5 天后， 所有的野生型 烟草开始出现明显的叶片黄化现象， 而 3 株 T0 代转 MxCS 烟草均叶片生长正常， 其中 MxCS1 表示转 pBI121-35sMxCS 的烟草株系， WT 为野生型烟草株系。即使是在低铁培养基中培养 10 天后， 3 株 T0 代转 MxCS 烟草也仅 2 株新叶出现了轻微的黄化。说明该基因在烟草体内 有功能， 可以有助于提高植株对缺铁的抵抗能力。
五、 转 MxCS 烟草中铁元素含量的测定
选取上述获得的 3 株 T0 代转 MxCS 烟草采用实施例二中的方法测定了三株烟草叶 片中的铁元素含量， 以野生型烟草为对照， 结果如表 4 所示 ：
表 4. 各株系的铁元素含量
结果表明， 任何处理情况下， 三株 T0 代转 MxCS 烟草植株叶片中铁金属元素的含量 均高于野生型的对照植株， 是以上对照株的 1.3-1.5 倍。
15101851283 A CN 101851284序列 序列表表1/3 页<110> 中国农业大学 <120> 小金海棠 MxCS 蛋白及编码基因与应用 <130>CGGNARB102270 <160>2 <170>PatentIn version 3.2 <210>1 <211>473 <212>PRT <213> 小金海棠 (Malus xiaojinensis) <400>1 Met Val Phe Phe Arg Ser Val Thr Ala Leu Ser Lys Leu Arg 1 5 10 Leu Gly Gln Leu Ser Ser Leu Arg Asp Ser Val Arg Trp Ile 20 25 30 Gln Thr Ser Thr Asp Leu Asp Leu Arg Ser Gln Leu Ala Glu 35 40 45 Pro Glu Gln Gln Glu Arg Leu Lys Lys Leu Lys Ala Asp Tyr 50 55 60 Val Gln Leu Gly Asn Ile Thr Val Asp Met Val Ile Gly Gly 65 70 75 Gly Met Thr Gly Leu Leu Trp Glu Thr Ser Leu Leu Asp Pro 85 90 Gly Ile Arg Phe Arg Gly Leu Ser Ile Pro Glu Cys Gln Lys 100 105 110 Pro Ala Ala Lys Pro Gly Gly Glu Pro Leu Pro Glu Gly Leu 115 120 125 Leu Leu Leu Thr Gly Lys Val Pro Ser Lys Glu Gln Val Asp 130 135 140 Ser Lys Glu Leu Arg Thr Arg Ala Val Val Pro Ala Tyr Val 145 150 155 Ala Ile Asp Ala Leu Pro Ile Thr Ala His Pro Met Thr Gln16Ser Arg 15 Gln Thr Leu Ile Gly Lys Met Arg 80 Asp Glu 95 Val Leu Leu Trp Ala Leu Tyr Lys 160 Phe Thr101851283 A CN 101851284序列表2/3 页Thr Glu Ser Arg 225 Asp Val Gly Ser Pro 305 Val Tyr His Phe Lys 385 Lys His Ser Gly Asn 465165 Gly Val Met Ala Leu Gln Val 180 Lys Gly Ile His Lys Ser Lys 195 200 Leu Ser Leu Ile Ala Gln Val 210 215 Arg Ile Phe Lys Asp Gly Lys 230 Tyr Gly Ala Asn Phe Ser His 245 His Glu Leu Met Arg Leu Tyr 260 Gly Asn Val Ser Ala His Thr 275 280 Asp Pro Tyr Leu Ser Phe Ala 290 295 Leu His Gly Leu Ala Asn Gln 310 Val Asp Glu Val Gly Glu Asn 325 Val Trp Lys Thr Leu Lys Ser 340 Gly Val Leu Arg Lys Thr Asp 355 360 Ala Leu Lys His Met Pro Asp 370 375 Leu Tyr Glu Val Val Pro Pro 390 Asn Pro Trp Pro Asn Val Asp 405 Phe Gly Leu Thr Glu Ala Arg 420 Arg Ser Ile Gly Ile Gly Ser 435 440 Leu Pro Leu Glu Arg Pro Lys 450 455 Phe Cys Lys Lys Ala Ala Ser 470170 175 Asp Ser Glu Phe Gln Lys Ala Tyr 185 190 Tyr Trp Glu Pro Thr Phe Glu Asp 205 Pro Val Val Ala Ala Tyr Ile Tyr 220 Val Arg Pro Val Asn Asp Ser Leu 235 240 Met Leu Gly Phe Asp Asp Pro Ile 250 255 Val Thr Ile His Ser Asp His Glu 265 270 Gly His Leu Val Ala Ser Ala Leu 285 Ala Ala Leu Asn Gly Leu Ala Gly 300 Glu Val Leu Leu Trp Ile Lys Ser 315 320 Val Thr Thr Lys Gln Leu Lys Asp 330 335 Gly Lys Val Val Pro Gly Phe Gly 345 350 Pro Arg Tyr Thr Cys Gln Arg Glu 365 Asp Pro Leu Phe Gln Leu Val Ser 380 Val Leu Thr Glu Leu Gly Lys Val 395 400 Ala His Ser Gly Val Leu Leu Asn 410 415 Tyr Phe Thr Val Leu Phe Gly Val 425 430 Gln Leu Ile Trp Asp Arg Ala Leu 445 Ser Val Thr Met Glu Ser Leu Glu 460 Ser17101851283 A CN 101851284序列表3/3 页<210>2 <211>1882 <212>DNA <213> 小金海棠 (Malus xiaojinensis) <400>2 ttcacattta aaacgtaatt gagttggttc aggtgatcaa tcgctgcagt catcgatggt gctccgttct cgtctcgggc aactgtcgag gcagacctcc acagatctcg accttcgttc ggaacgtctg aaaaaactga aggcagatta tgatatggtg attggtggaa tgagaggaat tgatccagat gagggaattc gcttcagggg acctgctgca aagccaggtg gagaaccttt aggaaaggta cctagcaaag agcaagtaga tgtagttcca gcttatgtgt ataaggccat gacccagttc accactggtg tcatggccct tgaaaagggg atacataaat caaagtactg gattgcacaa gtgccagtag tagctgccta agtaagacct gttaatgatt ctctggatta tgacgatccc atagtgcatg agctcatgag aggtgggaat gtcagtgctc acaccggcca tctttcattt gcagctgctt taaacggctt ggaagtattg ctttggataa agtctgtggt gcagttgaaa gattatgtct ggaaaacatt acacggagtc ttgcgtaaaa cagacccacg gcacatgcct gatgatccgc tgtttcagct cgtacttact gaactaggca aggttaaaaa agttctgttg aaccattttg gtttgactga atcgaggagt atagggattg gttcccagtt tgaaaggcca aaaagtgtta cgatggaatc gtcttgagaa attgagtgct gtatcactct gtgaaagatg caacggttgt gtaaaaattt ttacagggaa acctcaacac tcacacatca attttgaagt gagataggcg ttggggcttt atttagatta aaacgtgtac tttaaagatt ctgctatgag ggcggcacat ttattattga t t taacaaaa aaaaaaaaaa aa ggtgcagagt attcttcagg tctcagggat tcagttggcg tggaaaagtt gacagggttg tttgtcaatt gcctgagggt tgcattatcc tgatgctctg ccaggtagac ggagccaact tatttatcga tggtgcaaat gctttatgtc cttagttgct ggctggccca agatgaagtt aaaaagtggg atacacatgt ggtctcgaag cccatggccc ggcaaggtat gatatgggac gcttgagaat gagtaataat cagtttctgt cacttgagca tgctgctcgg tccacaagta gaactttaat acagcgagag agcgtcaccg tccgtcagat gaattgattc caactgggca ctgtgggaaa ccagaatgcc cttctgtggc aaggaattga cctataacag agtgaattcc tttgaggatt agaattttca ttttcacaca accatccata agtgcacttt ctccatggtt ggagagaatg aaggttgttc caaagggagt ctttatgaag aatgtagatg tttactgttc cgagctcttg ttctgcaaga tgctcccgaa tggttttagt ttttcaggta ttaataaacg gtaagcgttt gagaagtgct agagaaagag cgctttccaa ggattcaaac cagaacaaca atatcacggt cctccttact agaaagtatt tgcttttgac ggactcgtgc cacatccaat agaaggcata cacttagctt aggatggaaa tgctgggttt gtgatcatga cagatccgta tggctaatca taactacaaa ctggttttgg ttgcattgaa ttgtgcctcc cacacagtgg ttttcggtgt gtttgcctct aagcagcttc tgatggcttt tgagaaattg ctttaaagaa gattggagct tacgcgtatt tggactttat 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1882