O 型口蹄疫病毒变异株及其编码基因和应用 技术领域 本发明涉及 O 型口蹄疫病毒， 尤其涉及 O 型口蹄疫病毒变异株、 该 O 型口蹄疫病 毒变异株基因及编码的氨基酸序列以及该氨基酸序列的优势中和表位， 本发明还涉及该基 因、 氨基酸序列或优势中和表位在制备预防或治疗 O 型口蹄疫病毒疫苗中的用途， 属于 O 型 口蹄疫病毒的防治领域。
背景技术 RNA 病毒由于 RNA 依赖的 RNA 聚合酶的不保真性和高速复制的特点， 导致 RNA 病毒 具有高度的遗传变异特性。更重要的是， 这种遗传多样的子代病毒能够克服多种选择压力 如宿主免疫和抗病毒治疗等而得以存活， 导致该病毒的再次流行。
口蹄疫是由口蹄疫病毒 (FMDV) 引起的猪、 牛和羊等偶蹄动物感染的一种急性、 热 性、 高度接触性传染病。 口蹄疫的爆发和流行， 给当地畜牧业的发展和进出口贸易造成极大 损失。因此， 联合国粮农组织和世界动物卫生组织将其列为头号必须报告的动物传染病。 FMDV 为单股正链 RNA 病毒， 该病毒共有 7 个血清型 (O， A， C， Asia 1， SAT1， SAT2， SAT3)， 各 血清型内又含有多个亚型， 到目前为止口蹄疫病毒已有 65 个亚型。口蹄疫病毒各血清型之 间没有交叉保护， 即使是同一个血清型的不同亚型之间抗原差异程度也较大， 以至于一种 亚型的疫苗可能不完全保护同一血清型中的其它亚型 FMDV 的感染， 这给口蹄疫的防治带 来了极大的困难。目前， 我国使用的口蹄疫疫苗主要有灭活疫苗和合成肽疫苗两种。
灭活疫苗是基于含有各种参照株系的相关血清型或亚型的灭活病毒的混合物， 所 述的参照株系是通过监测局部流行的病毒株来确定， 需要对野生分离株包括出现的变异体 之间的抗原关系进行定期的监测。需采用最新的野生株系重新配制疫苗， 以防止由于新的 变异体的出现而丧失保护效力。合成肽疫苗是基于病毒的主要抗原位点， 利用病毒主要抗 原位点的一部分氨基酸序列合成具有一定结构的多肽， 用于免疫动物诱导中和抗体而达到 保护的目的。但是如果在病毒主要的抗原位点上发生关键氨基酸的突变， 就会导致合成肽 疫苗的免疫保护力完全丧失。我国口蹄疫的防治主要是疫苗免疫为主。在强而持续的免疫 压力下， 口蹄疫病毒的变异速度大大加快， 给该病的防治不断带来新的挑战。 实时监测 FMDV 变异情况， 对防制该病具有重要的意义。
自 1990 年至 2002 年 12 年间， O 型泛亚谱系口蹄疫病毒流行于整个亚欧大陆， 造成 重大经济损失。该毒株于 1990 年首次在印度北部发现， 1994 年向西传入沙特， 1996 年越过 中东地区传入欧洲， 1998 年流行于不丹， 1999 年底传播到东南亚的大部分地区。2001 年 3 月英国暴发了全国性的口蹄疫并造成大流行， 随后传入法国、 比利时、 荷兰等国。 与此同时， 韩国、 日本和中国的台湾等地也先后发生。我国 1999 年在西藏、 海南、 福建多个省份发生 O 由于各国采取扑杀和大规模免疫策略使 型泛亚谱系口蹄疫。在泛亚口蹄疫病毒流行期间， 得该病得以控制， 但是对该病毒的监测和防治一直是各国防治口蹄疫的重点。有研究报道 表明， 对经典的泛亚毒株基因组进行序列分析发现， 该病毒在流行的 12 年间， 主要结构蛋 白 VP1 几乎没有发生变异。但是， 近年来， 在一些以免疫策略为主防治口蹄疫的国家， 不断
有泛亚口蹄疫病毒发生变异的报道， 出现了泛亚相关病毒和泛亚 2 型毒株。 发明内容 本发明的目的之一是提供一株 O 型泛亚谱系口蹄疫病毒的变异株 ；
本发明的目的之二是提供上述 O 型泛亚谱系口蹄疫病毒变异株的基因组及其编 码的氨基酸序列 ；
本发明的目的之三是提供上述 O 型泛亚谱系口蹄疫病毒变异株的主要抗原位点 ；
本发明的目的之四是将所述的 O 型泛亚谱系口蹄疫病毒变异株以及主要抗原位 点应用于制备可预防或治疗 O 型泛亚谱系口蹄疫病毒变异株的疫苗 ；
本发明目的是通过以下技术方案来实现的 ：
本发明首先分离到一株泛亚谱系口蹄疫病毒 O/YS/CHA/05 ； 其分离方法包括 ： 取 发病猪病变组织样品 ( 水泡液和 / 或水泡皮 )， 置于无菌组织研磨器中进行研磨， 加入少量 PBS 和抗生素， 制成悬液。研磨中继续加 PBS 直至总体积为上皮样品的 10 倍， 制作成 10％ 悬液。反复冻融两次后， 用台式离心机 2000g 离心 10min， 取上清， 用 0.22μm 的滤膜过滤 后， 接种单层 BHK-21 细胞， 待细胞病变后收毒， 反复冻融三次后， 保存 -70℃备用。
由于口蹄疫病毒属于高风险性的动物致病微生物， 为此， 本发明将所分离的泛亚 谱系口蹄疫病毒 O/YS/CHA/05 株的感染性克隆质粒 (pOKT7-O/YS/CHA/05) 提交专利认可 机构保藏， 其微生物保藏号是 ： CGMCC No.3719 ； 分类命名是 ： 大肠埃希氏菌 (Escherichia coli) ； 保藏时间 ： 2010 年 4 月 9 日 ； 保藏单位是 ： 中国普通微生物菌种保藏管理中心 ； 保藏 地址是 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所 ； 将该质粒经体外转 录以及转染 BHK-21 细胞可获得 O/YS/CHA/05 病毒， 具体的体外转录方法请按照本发明实施 例 1.5 所述的体外转录方法进行， 所述的转染可按照本发明实施例 1.6 所述的转染方法进 行。
VP1 氨基酸序列比对发现该突变毒株有 7 个变异位点， 其中 5 个变异位点集中在 G-H 环内。 本发明将该泛亚谱系口蹄疫病毒 O/YS/CHA/05 株进行了全序列测定， 其核苷酸序 列为 SEQ ID NO ： 1 所示， 其编码的氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 2 所示。
为研究泛亚病毒的抗原变异和分子演化规律， 本发明构建了该病毒的反向遗传操 作平台并针对上述位于 G-H 环内的 5 个变异位点进行反向回复突变， 以追溯性研究泛亚谱 系 FMDV 抗原的分子演化规律。利用一组针对 O/YS/CHA/05 病毒的单克隆抗体分析这些拯 救的突变病毒的抗原性， 发现其中一株重组突变病毒 V-P153Q 不再被强中和性单抗 1F6 所 识别。 利用融合肽扫描技术确定单克隆抗体 1F6 所识别的表位为 147DLQVLTPK154， 它位于 O 型 FMDV VP1 蛋白的 G-H 环内， 该表位与以前本发明人实验室鉴定的一个 O 型 FMDV 保守的优势 147 中和表位 8E8 表位核心 ( DLQVLT152) 相互重叠。 利用丙氨酸扫描法， 本发明鉴定了 MAb 8E8 147 149 和 MAb 1F6 识别表位的关键氨基酸。8E8 表位关键氨基酸为， D 、 Q 、 V150 残基， 1F6 表位关 147 153 键氨基酸为， D 、 P 残基。1F6 表位对应 VP1 蛋白的氨基酸序列比对分析显示， 该表位中 152 153 152 153 T 、 P 为该毒株的变异位点， 其它 O 型毒株在该位置主要是 A 、 Q 。为进一步分析这两 个位点突变对该病毒抗原性改变的影响， 本发明又构建了一株组合突变的重组病毒 v-TP/ AQ， 以检测两个位点单独突变以及组合突变对中和性单抗 1F6、 8E8 以及鼠抗全病毒血清的 中和能力的影响， 结果表明， 单抗 1F6 对 v-P153Q、 v-TP/AQ 中和效价由原来的 4096 下降到
小于 4， 单抗 8E8 对 v-TP/AQ 中和能力由原来的 8192 下降到 256， 而鼠全病毒血清对 v-TP/ AQ 的中和能力由原来的 355 下降到 22。结果表明， 这两个位点的突变很大程度上改变了病 毒的抗原结构， 导致一个优势中和表位消失， 另一个优势中和表位显著减弱， 全病毒抗血清 的中和活性近乎消失， 这将导致现有 O 型口蹄疫灭活疫苗对变异株的保护力接近丧失， 合 成肽疫苗的保护力完全丧失。因此， 及时更新疫苗种毒以及重新换代现有合成肽疫苗对防 止该变异株的大流行是必要的。
到目前为止， O 型 FMDV 已被表明含有五个抗原位点， 其中 G-H 环即位点 A 是 FMDV 的主要抗原位点。有研究表明， 疫苗免疫产生的抗体中有 50％的抗体是针对该位点的。另 外， 位点 A 存在着多个连续的表位， 一个位点的突变将导致多个中和活性的单克隆抗体失 去中和活性。因此， 在该位点个别关键氨基酸突变均会导致变异株的产生。本发明的研究 结果表明， VP1 蛋白 152 位和 153 位氨基酸任何一个位点的突变都将影响相关中和抗体的 中和活性， 并且这两个位点同时突变具有显著的叠加效果。
本发明通过上述大量的试验研究表明， 本发明所分离的 O/YS/CHA/05 病毒为 O 型 泛亚谱系口蹄疫病毒的一个新的变异株， 可基本上逃避现有疫苗的免疫应答， 有可能导致 新一轮的口蹄疫病毒的大流行。利用本发明毒株及其相关毒株制备疫苗， 或制备含有本发 明人鉴定的 8E8 和 1F6 两个中和表位的合成肽疫苗或联合疫苗， 将能更有效地预防和制控 口蹄疫的流行。 附图说明
图 1VP1 基因的遗传进化树。
图 2O 型 FMDV O/YS/CHA/05 株基因组拼接策略示意图。
图 3O 型 FMDV O/YS/CHA/05 株抗原位点氨基酸序列比对 (A) 及重组突变病毒的构 建 (B)。
图 4 突变重组病毒的抗原性分析。
图 5 单克隆抗体 8E8 与 1F6 的中和活性比较。
图 6 单抗 8E8 识别表位最大活性单元鉴定。
图 7 单克隆抗体 8E8 与 1F6 可变区轻、 重链氨基酸序列比对。
图 8 单克隆抗体 1F6 识别表位的精确定位。
图 9 单克隆抗体 8E8 与 1F6 识别表位的关键氨基酸。
图 10 体外验证 T152、 P153 突变对单抗 8E8 和 1F6 结合活性的影响。 具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例
1、 实验材料与方法
1.1 细胞、 病毒和抗体BHK-21 细胞 ( 购于美国 ATCC)， 培养液为含 10％胎牛血清的 DMEM， 在含 5％ CO2 的 37℃培养箱中培养。所分离的 O 型口蹄疫病毒 O/YS/CHA/05 株在含 2％胎牛血清的 DMEM 培养液中繁殖， 当 80％的细胞出现 CPE 时收获病毒， 反复冻融三次后， 2000×g， (4℃ ) 离心 10min， 上清保存于 -70℃。 大肠杆菌感受态 DH5a 和 BL21(DE3) 由本实验室保存， pGEX-6p-1 载体购于 Promega 公司。pOK12 载体由 Messing 惠赠 (GenBank 登录号为 AF223639)， 本发 明用 EcoRV 和 FspI 双酶切去除了该载体的 T7 启动子序列。
O 型 FMDV O/YS/CHA/05 病毒株的单克隆抗体 8E8( 分泌单克隆抗体 8E8 的杂交 瘤细胞系的微生物保藏号是 ： CGMCC 2691 ； 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心 ； 保藏地址 ： 北京市朝阳区大屯路 ； )、 1F6( 购自哈尔滨维科生物技术开发公 司 )、 5F7、 4A8、 2B9、 4B2( 分泌单克隆抗体 4B2 的杂交瘤细胞系的微生物保藏号是 ： CGMCC No.3103 ； 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ； 保藏地址 ： 北京市 朝阳区大屯路。5F7、 4A8 和 2B9 购自哈尔滨维科生物技术开发公司 )。
1.2 所用试剂及限制性酶
PrimeSTAR DNA 聚合酶、 Primerscript II 反转录酶、 各种限制性内切酶， 均购自 TaKaRa 公司。T4DNA 连接酶购自 NEB 公司。TRIzol 购自 Gibco BRL 公司。体外转录采用 Promega 公司的 RiboMAXTM Large Scale RNA ProductionSystems-T7 试剂盒。转染试剂采 用 QIAGEN 公司的 Transfection Reagent 转染试剂盒。
羊抗鼠 IgG 荧光抗体购自 Sigma 公司。
1.3 病毒 RNA 的提取、 RT-PCR
按照 TRIzol 试剂 (Gibco BRL) 产品说明书提取病毒 RNA， 然后用 Oligod(T)-15 进 行反转录， 以此反转录产物为模板， 用表 1 引物分段扩增 O/YS/CHA/05 病毒的全基因组， 并 胶回收 PCR 产物， 送 Invitrogen 公司测序。并按 5′ RACE 试剂盒 (TaKaRa， Dalian) 使用说 明， 对病毒的 5′端做 RACE， 测序， 从而测得准确的病毒基因组全序列。另外， 为构建 O/YS/ CHA/05 病毒感染性克隆， 用表 2 中引物扩增覆盖基因组全长的 A、 B、 C、 D 四个重叠片段。同 时在病毒基因组 5′端引入 T7RNA 聚合酶启动子序列， 在病毒的 3′端引入 EcoRV 限制酶酶 切位点。 用定点突变技术， 在病毒基因组 3510nt 位置将 C 突变为 T， 使该位置 AGATCT(XbaI) 变为 AGATTT， 通过消除 XbaI 酶切位点而引入分子标签。
表 1FMDV O/YS/CHA/05 株全长基因组的测序引物
表 2 构建 FMDV O/YS/CHA/05 株感染性克隆及重组病毒的引物
1.4 重组病毒的构建为研究 O/YS/CHA/05 病毒 G-H 环内 5 个突变位点对该病毒抗原性改变的影响， 本 发明使用定点突变试剂盒 (Invitrogen) 在已构建好的 O/YS/CHA/05 感染性克隆基础上共 产生了 6 个病毒突变体 v-K138E、 v-A142T、 v-A144V、 v-T152A、 v-P153Q、 v-TP/AQ。在 G-H 环 上做特异性氨基酸突变所用引物见表 2。 使用质粒提取试剂盒 (QIAGEN) 制备体外转录所用 质粒。所有构建的重组载体经全长测序， 没有其它任何突变。
1.5 体外转录
采用 RiboMAXTM Large Scale RNA Production SystemsT7 系统进行体外转录， 反 应体系为 ： 25mmol/L rNTP 6μL， 5× 缓冲液 4μL， T7RNA 聚合酶混合液 2μL， EcoR V 线性 化的 pOKT7-O/YS/CHA/05 重组质粒以及突变病毒重组质粒 8ul(2μg)， 总体积为 20μL。将 反应物充分混匀后， 于 37℃温育 2-4h， 用 RNase-Free DNase 消化 DNA 模板， 按酚氯仿抽提 方法纯化体外转录的 RNA。
1.6 转染
BHK-21 细胞在 6 孔板中生长至 70 ％ -90 ％单层时， 用 PBS 洗两遍细胞， 加 1.5mL 正常细胞培养液。将体外转录获得的 RNA 分别转染 BHK-21 细胞。转染按 QIAGEN 公司的 Transfection Reagent 转染试剂盒说明书进行， 转染的细胞在 5％ CO2 的培养 箱中 37℃温育 4h， 用含 2％胎牛血清的 DMEM 更换培养基继续培养， 观察细胞病变， 大约 3 天 左右收获病毒， 反复冻融 3 次后再次接种 BHK-21 细胞， 直到病毒能稳定产生 CPE。 1.7 间接免疫荧光
生长在 96 孔板中的 BHK-21 细胞感染病毒 6h 后， 用 PBS 漂洗 2 次并吸净残液， 用 -20℃冷无水乙醇固定 15min， 分别滴加 1 ∶ 100 稀释的单克隆抗体 (8E8、 1F6、 5F7、 4A8、 2B9、 4B2) 腹水， 在 37℃湿盒中温育 60min， 用 PBS 漂洗 5 次， 加 FITC 羊抗鼠 IgG(1 ∶ 100) 于 37℃湿盒中温育 45min， 用 70％甘油封片， 在 0lympus 荧光显微镜下观察并拍照。
1.8GST 融合蛋白的表达
为确定单抗 1F6 识别表位的最小单元， 一系列表达 VP1 肽段 146GDLQVLTPKAART158 及 其截断肽的互补寡核苷酸链被合成 ( 见表 3)， 互补寡核苷酸链经退火可形成限制性内切酶 BamHI 和 XhoI 的粘性末端， 从而得以插入原核表达载体 pGEX-6p-1 中。构建好的载体转化 大肠杆菌 BL21(DE3)， 挑取阳性克隆， 然后加入终浓度为 1mmol/L 的 IPTG 进行诱导表达。 另 外， 为鉴定单抗 1F6 和 8E8 表位中关键氨基酸， 利用丙氨酸扫描的方法， 逐一替换 1F6 表位 中的氨基酸， 每条突变肽同样以 GST 融合蛋白方式表达。表达突变肽的互补寡核苷酸链见 表 3。
表 3 编码与 GST 蛋白融合的短肽的寡核苷酸
1.9SDS-PAGE 和 Western blot 分析
大约等量的 GST 融合蛋白样品进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blot 分析。电泳后 转印和封闭， 再与封闭液稀释的单抗腹水 (1 ∶ 1000)37℃反应 1h ； 用 Tris-HCl 洗液洗涤 3 次， 每次 10min， 然后与 1 ∶ 5000 倍稀释、 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 室温反应 1h ； 洗涤 3 次， 每 次 10min， 最后用 DAB 底物显色液显色， 观察结果。
1.10 病毒微量中和试验
用 BHK-21 细胞按常规方法测定 FMDV O/YS/CHA/05 以及各拯救的突变病毒的 TCID50， 采用固定病毒稀释抗体 ( 单抗 8E8、 1F6、 4B2 以及鼠抗全病毒血清 ) 方法进行微量 细胞中和试验 ： 选择 100TCID50 的病毒分别与等体积不同稀释度的抗体混合， 37℃水浴 1h ； 然后将上述抗体 - 病毒混合液分别接种 BHK-21 细胞单层， 每孔 100μL， 每滴度设 8 孔重复， 于 37℃ 5％ CO2 培养箱中培养每日观察细胞。另外， 设病毒腹水和正常细胞对照， 根据细胞 病变效应 (CPE) 按 Reed-Muench 方法计算病毒中和滴度， 即能保护 50％ BHK-21 细胞不出现 CPE 的腹水稀释浓度。
1.11 相加 ELISA 分析
用相加 ELISA 测定相加指数。以最适抗原浓度包被酶标板， 充分洗涤后分别加入
饱和浓度的各株纯化单克隆抗体以及两两等体积混合的单克隆抗体 100μL， 每株重复 2 个 孔， 37℃孵 1h ； 洗涤后加入 HRP- 羊抗鼠 IgG， 37℃孵育 1h ； 洗涤后显色， 分别测定 OD492 值。 按如下公式计算各株单克隆抗体两两叠加后的 AI 值 ： AI ＝ (A1.2-A1)/A2×100％。式中 A1.2 为 2 株单克隆抗体两两叠加后的 OD492 值 ； A1 为第 1 株单克隆抗体的 OD492 值 ； A2 为第 2 株单克隆抗体的 OD492 值。当两两抗体叠加的 AI 值大于 10％时， 表明这 2 株抗体所识别 的抗原表位不同 ； 当两两抗体叠加的 AI 值小于 10％时， 表明这 2 株抗体所识别的抗原表位 相同或相近。
1.12 间接 ELISA
丙氨酸扫描突变肽的 GST 融合蛋白经纯化后稀释至 20μg/mL， 加入酶标板 ( 每孔 100μL)， 4℃过夜 ； 用 PBS 洗 3 次， 5％脱脂乳封闭， 37℃孵育 1h ； 用 PB 洗 3 次， 加入单克隆 抗体 8E8 或 1F6， 37℃孵育 1h ； 洗涤后加入 1 ∶ 5000 稀释的 HRP 标记羊抗鼠二抗， OPD 显色， 于 492nm 读取 OD 值。
2、 实验结果
2.1、 O 型 FMDV O/YS/CHA/05 株全基因组序列测定
为测得 FMDV O/YS/CHA/05 株准确的病毒全长基因组， 本发明采用 PCR 产物直接测 序并对病毒的 5′端进行 5′ RACE 分析， 从而确保我们测得的 O/YS/CHA/05 株全基因组的 5′端也是真实的。O/YS/CHA/05 基因组全长 8182nt(SEQ ID NO ： 1)， VP1 进化树分析表明 该毒株属于 O 型 FMDV 泛亚谱系 ( 如图 1)。 2.2、 FMDV O/YS/CHA/05 株反向遗传操作平台的建立
根据 FMDV O/YS/CHA/05 株的全基因组测序结果， 分析可利用的酶切位点， 设计拼 接策略 ( 图 2)。将覆盖基因组全长的 A、 B、 C、 D 4 个重叠片段， 由 3′端到 5′端顺次拼接 克隆于经改造的 pOK12 载体， 得到 pOKT7-O/YS/CHA/05。 经序列测定验证所构建的全长 cDNA 序列完全符合预期设计， 即 5′端引入 T7 启动子序列、 Poly(C) 包含 16 个 C 碱基、 3′端含 有 16nt 的 poly(A) 序列。同时， FMDV 感染性克隆基因组中 3510 位置的 XbaI 限制性酶切 位点通过碱基 C 到 T 的替换已被消除， 从而可作为分子标记以区别亲本病毒。
2.3、 重组病毒的拯救
将本发明分离的毒株 O/YS/CHA/05 与泛亚经典毒株 VP1 氨基酸序列比对发现 ( 图 3A)， 共有 7 个氨基酸残基发生突变， 其中 5 个突变位于 G-H 环内。G-H 环是口蹄疫病毒的一 个主要抗原位点， 是诱导保护性抗体的抗原部位， 同时也是口蹄疫病毒细胞受体的结合部 位。该部位的氨基酸易变异， 是病毒逃逸宿主免疫应答的主要方式和途径。为研究该位点 氨基酸的变异在口蹄疫病毒抗原演化过程中的作用， 以及是否与病毒逃逸宿主免疫有关， 本发明利用反向遗传技术对这些变异进行了追溯性的回复突变， 拯救了 5 株突变病毒 ( 图 3B)。
2.4、 重组病毒的抗原性分析
使用一组针对 O/YS/CHA/05 毒株的单克隆抗体 (8E8、 1F6、 5F7、 4A8、 2B9、 4B2)， 利 用间接免疫荧光方法对这 5 株重组病毒抗原性进行分析 ( 图 4)， 发现其中一株重组突变病 毒 V-P153Q 与单抗 8E8、 5F7、 4A8、 2B9、 4B2 反应正常， 但却失去了与中和性单抗 1F6 结合的 能力， 表明这个氨基酸残基的突变破坏了 1F6 针对的表位， 可能与病毒的抗原变异有关， 因 此对单抗 1F6 以及该位点突变对病毒抗原性的影响做了进一步分析。
2.5、 中和性单抗 1F6 和 8E8 的特性
用灭活的 O/YS/CHA/05 全病毒作为抗原免疫 Balb/c 鼠， 制备单克隆抗体， 获得了 两株能够分泌强中和活性单抗的杂交瘤 8E8 和 1F6。抗体经纯化后进行亚类鉴定， 1F6 重链 类型为 IgG2b， 8E8 重链类型为 IgG2a， 二者轻链类型均为 kappa 链。1F6 单抗腹水中和效价 为 1 ∶ 4096， 单抗 8E8 腹水中和效价为 1 ∶ 8192， 纯化后两株单抗的中和效价比较结果见 图 5。叠加 ELISA 实验结果显示二者叠加 AI 小于 5％， 表明单抗 1F6 和 8E8 识别表位相同 或相近。另外， 这两株单抗识别的均是线性表位， 因为 Western blot 结果表明二者均可与 变性的 O/YS/CHA/05 病毒衣壳蛋白反应。以前本发明人实验室已经鉴定单抗 8E8 识别表位 最小单元位于 O 型 FMDV VP1 蛋白上， 识别基序为 147DLQVLT152， 本发明进一步鉴定单抗 8E8 145 154 识别表位的最大活性单元为 RGDLQVLTPK ( 见图 6)。
对 8E8 和 1F6 两株单抗抗体轻、 重链可变区进行测序并推导氨基酸序列， 二者氨基 酸序列比对结果见图 7。二者相比最明显的差异是， 单抗 8E8 在轻链可变区的 CDR1 区缺少 5 个氨基酸。而在抗体重链可变区， 单抗 1F6 在 CDR3 区缺失 3 个氨基酸。这些结果表明， 单 抗 1F6 和 8E8 识别的表位相近而不相同。
2.6、 1F6 识别表位的精确定位
由于单克隆抗体 1F6 不能够与突变病毒 v-P153Q 反应， 因此推断单抗 1F6 识别的 表位在 VP1 蛋白的 153 位氨基酸残基附近。利用肽扫描技术， 将一系列截短的 140-158 肽 进行 GST 融合表达并用 Western blot 方法检测单抗 1F6 与 GST 融合蛋白的反应 ( 图 8)。 147 结果表明， DLQVLTPK154 为单抗 1F6 识别表位的最小单元， 该表位与以前鉴定的 8E8 表位核 147 152 心 DLQVLT 重叠。
2.7、 丙氨酸扫描确定 1F6 表位与 8E8 表位关键氨基酸
为更好地了解抗原 - 抗体之间的相互作用以及表位区域个别氨基酸突变对病毒 抗原性的影响， 本发明利用丙氨酸扫描的方法， 用丙氨酸逐一取代 1F6 表位氨基酸。并进行 GST 融合表达。GST 融合蛋白经纯化后， 包被 96 孔酶标板， 用间接 ELISA 方法检测各突变肽 与 MAb 8E8 和 MAb 1F6 结合活性的影响 ( 图 9)。结果表明， 同 MAb 1F6 与原始 1F6 表位结 合活性相比， 突变肽 D147A、 P153A 与 MAb 1F6 结合活性均下降 75％以上， 表明 147 和 153 位 氨基酸残基是该表位的关键氨基酸。突变肽 Q149A、 V150A、 K154A 与 MAb 1F6 结合活性下 降也较明显， 表明这三个氨基酸残基在与 MAb 1F6 的结合中也起着重要作用。此外， 与原始 肽相比， 突变肽 D147A、 Q149A、 V150A 与 MAb 8E8 结合活性均下降 80％以上， 表明 147、 149、 147 150 位氨基酸残基是 8E8 表位的关键氨基酸。其中残基 D 是这两个重叠表位共享的关键 氨基酸。
2.8、 体外检测表位两个位点突变对单抗 8E8 和 1F6 结合活性的影响
通过对 O 型 FMDV VP1 氨基酸序列比对发现， 在 1F6 表位中 152 位苏氨酸和 153 位 脯氨酸， 为变异位点， 而其他毒株在 152 位为丙氨酸 ( 少数为苏氨酸 )， 在 153 位为谷氨酰 胺。为揭示这两个位点的突变对两株强中和活性单抗结合活性的影响， 我们在体外分别突 变以及同时突变这两个氨基酸， 并且表达突变肽的 GST 融合蛋白。大约等量的融合蛋白被 检测 ( 见图 10)， Western blot 分析表明， 突变肽 T152A 和 P153Q 与 MAb 1F6 的结合活性 均明显下降， 并且 P153Q 突变较 T152A 突变对于降低 MAb 1F6 结合活性更为明显， 当两个氨 基酸残基同时突变致使该突变肽与 MAb 1F6 的结合能力丧失。T152A 突变同样也影响 MAb8E8 的结合， 而 P153Q 突变并不改变与 MAb 8E8 的结合活性。
2.9、 体内检测两个位点突变对病毒 O/YS/CHA/05 抗原性的影响
为进一步研究 T152、 P153 这两个突变对 O/YS/CHA/05 病毒抗原性的影响， 本发明又 构建并拯救了这两个位点同时突变的重组病毒 (V-TP/AQ)， 结合前面拯救的单位点突变病 毒 (V-T152A 和 V-P153Q)， 利用病毒微量中和试验方法， 对该双位点突变病毒中和抗原性的 影响程度进行检检测 ( 图 11)。首先， 单抗 1F6 腹水对病毒的中和效价为 1 ∶ 4096， 而对 T152A 突变株的中和效价下降 2.4 倍， 对突变株 P153Q 和 TP/AQ 的中和活性完全丧失。对于 单抗 8E8 来说， T152A 突变使 MAb8E8 中和活性下降 2.6 倍， 而 P153Q 突变使 MAb 8E8 中和 活性下降 4 倍， 两位点同时突变 (TP-AQ) 具有明显的叠加效果， 使 MAb 8E8 中和活性下降 32 倍。 对于抗全病毒血清来说， 这两个位点的突变具有同样的效果， 可使全病毒血清中和效价 下降 16 倍， 由原来的 355 下降到 22。以上实验数据表明， O/YS/CHA/05 病毒为中和逃避抗 原变异株。
表 4 体内检测 T152、 P153 突变对 O/YS/CHA/05 病毒抗原性的影响
12101838658 A CN 101838659序列 序列表表1/13 页<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 <120>O 型口蹄疫病毒变异株及其编码基因和应用 <130>KLPI0768 <160>2 <170>PatentIn version 3.1 <210>1 <211>8262 <212>DNA <213>Hand-foot-and-mouth disease virus <400>1 ttgaaagggg ctacactcac ggactcacgg ctccgcgtga tgggcactcc tgatggagcc acctttcacc cgttaaaggg cgcaagatga ccggaagtaa gcgcacgaaa cacaaccgac tgacattttg ctgttgcttc cggggccgaa tattgtgaaa aaggatgccc ggggcttctt ccggcacctt tgttgtacgc agttcacactgcgttagggt gtctgtgtgc caccgcgcgg ctggttaata cgttgggggc gcttcgtgcg cccccccccc aggtaaccac taccgccttt aacggcaaat cgcgccgtcg acaaaccgtg tactgtgctt gtagcggagc agccacgtcc accactttaa ttcaggtacc taaaagcgcc tccttcgaac tttcagagag tcacaacggtctcatcccta gcgcggggac ccattttagc ctcttaccac cgtccggtgc agttgatcgc ccccccccca aagcttgcgt cccggcgtta tcgcatagtt cttgaggagg caacttggaa gactccacgc atggtggccg tcacggaccc ggtgacactg ccgaggtaac tggtttaaaa aactgtcttt atcaaaacac gagaagaaaaacacgccaac cgttggacta tggattgtgt tttccgccta tccacggttt ctggtgtgtt cctctcacaa ctgtcttgct attggatgta 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ctcagacagg cttcctggca catgttcact catggagccg agggttgaac caccgcgtct cacacacggg tgaactgcgt ccccgtaact cacggatgtc tgtgttggac cacttactac cccgaatggg ctccagctgt aacctcacac ggtggaccac accgcttcgc ttccatgctg aacgggtggt gttctggtgt cagaaacgac ggtaacactg acacaacttg tccacccaca tttagcggtc gaggaccgca ggagtcactt cttgagacca accagtgacc tacggtagcc gcagtgggga tctattgaca cggacgaaca tacaaggtac actgaaggtg gcgggtgagc ggcctggtga cctcgcaaca acgtttctgc gtgctcgccc ggtctcgccc ggacccactg cccaaaacac tcaaaattca gactccgcgg aaggctgacg ttgccagttg gccaccgttg tcgttcatac ctgatgcaaa tttgcagatc gcgcccgagg列表tgatgaacct aaaacaattg tatttggaac agtgtgcatg gcaaggacag tgacgaggac cgaccaagaa cgggcaatcc caacaattac tattagtgga ccaaaacaac tcttctcgct ccgcaacggg gacagctgag ggcagagcgg gtgctacctg ttatgcttac cggaggatgt ttaccaactc catcactgtg gactctcgtg caaggtttac ggaagggatc aaagacggct gcggttcacc tgacgtaccg gtctctggca acagtacagc gcgttacatg cgctcactgc cccttacctt cgtgcaggga ggtcgttcta gcagaccacc tggtgagaca tgtgaaagta cactttggta agtgaaacac 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gccggtaaga atgattggta gttggttgta aacgtgtggg atcatgtttg ttgaaaactc gggatgccgt gtgctctacg tcctacggag cctcacttca gttcttggtc ggaactgggt gcacgtcgtg ggacctgatg tacagatcac tgtcacaact gggcttttcc aaaaaaaaaa列表taaggaagga gaacttgatt caacaccaag cggagtgttt gatcatgttg taaagtgaaa tcgcgtgcgg cgtcgtcggc tacctacaag caaagccgcc gactttcatc ttccaggtct attgatagtt cgcacccacc ccaggacccg ggaaaacaca cgcgtcccgc aattaagggt ggccctccag cgaggttgag ctttctgaag cgacgtcctg tcaaatgcac tgattggcaa ttcggccttt caacacggat tgaacacgcc cgcgacaagc acactatgag ggttgcaagt tcaaaccatc cgatgtcact tgtgatggct ggagaagttg tctctttgag ttgggtgaac cgttgaggcg ttcaaaaaaa aa ccttacgaag gtcactgaga cctgttgagc ggtaccgcct gacggcagag gggcaggaca gacatcacga gtggtcaaca gacattgtag accaaggcgg gtcggcactc atgctgctaa gacaccagag gtggcatacg cgcctgaatg aagatgtctg ctgcacagcg gtcgacggac gggaaacgcc gctgctttga gacgagatcc cctgttgaac tcaaacaacg agatttggca gacgccaacc ttcggtttcc tatgagaaca atcatcaaca ggagttgagc gatcacgatc actccagctg ttcctcaaaa tcgaagaccc atctccgtgg 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7080 7140 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8262101838658 A CN 101838659序列表5/13 页<210>2 <211>2332 <212>PRT <213>Hand-foot-and-mouth disease virus <400>2 Met Ser Thr Thr Asp Cys Phe Ile Ala Leu Leu Tyr Ala 1 5 10 15 Ile Lys Thr Leu Phe Leu Ser Arg Thr Arg Gly Lys Met 20 25 30 Leu His Asn Gly Glu Lys Lys Thr Phe Tyr Ser Arg Pro 35 40 45 Asp Asn Cys Trp Leu Asn Ala Ile Leu Gln Leu Phe Arg 50 55 60 Glu Pro Phe Phe Asp Trp Val Tyr Cys Ser His Glu Asn 65 70 75 80 Asn Ala Ile Lys Gln Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu Glu 85 90 95 Gly Gly Pro Pro Ala Leu Val Ile Trp Asn Ile Lys His 100 105 110 Thr Gly Ile Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Glu Val Cys 115 120 125 Gly Thr Asp Met Cys Leu Ala Asp Phe His Ala Gly Ile 130 135 140 Gly Gln Glu His Ala Val Phe Ala Cys Val Thr Ser Asn 145 150 155 160 Ala Ile Asp Asp Glu Asp Phe Tyr Pro Trp Thr Pro Asp 165 170 175 Val Leu Val Phe Val Pro Tyr Asp Gln Glu Pro Leu Asn 180 185 190 Lys Thr Lys Val Gln Lys Arg Leu Arg Gly Ala Gly Gln 195 200 205 Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly Asn Thr Gly Ser 210 215 220 Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met Asp Thr 225 230 235 240 Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn Glu Gly Ser Thr 245 250 25517Phe Arg Glu Glu Phe Thr Asn Asn His Tyr Val Asp Leu Thr Leu Leu His Glu Leu Leu Asn Met Val Asp Phe Leu Gln Gly Trp Tyr Pro Ser Asp Gly Glu Trp Ser Ser Pro Ile Ile Asn Gln Leu Gly Asp Thr Thr101838658 A CN 101838659序列表Ser Lys Leu Ala Asp Lys Thr Thr Arg Val Thr Tyr Thr Ser Gly Thr His Leu Leu Leu Glu Asp Ser Tyr Val Gly Asn Glu Leu Cys Pro His Gln Val Pro Phe Pro Trp Thr Glu Gly Ala Val His Val Ala Cys Ser Ala Asp Pro Pro Gly Arg Phe Leu His Ser Asp Arg6/13 页Thr Thr Asn Thr Gln Asn Asn Asp Trp Phe 265 270 Ala Phe Ser Gly Leu Phe Gly Ala Leu Leu 280 285 Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu 295 300 Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser Val Gly 310 315 320 Thr Ala Glu Asp Phe Val Ser Gly Pro Asn 325 330 335 Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu Arg Phe Phe Lys 340 345 350 Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro Phe Gly Arg Cys Tyr 355 360 365 Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val Tyr Gly Ser Leu Thr 370 375 380 Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val Glu Val Thr Ala 385 390 395 400 Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val Ala Met Val Pro 405 410 415 Ser Ile Asp Lys Arg Gly Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Phe 420 425 430 Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr Ala His Ile Thr 435 440 445 Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Val His Arg 450 455 460 Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu Thr Val Asn Thr 465 470 475 480 Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile Ala Pro Thr Asn 485 490 495 Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly Ile Phe Pro Val 500 505 510 Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr Asp Pro Lys Thr 515 520 525 Ala Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro Pro Arg Asn Met Leu 530 535 540 Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val Ala Glu Ala Cys Pro Thr 545 550 555 560 Phe Glu Gly Asp Val Pro Tyr Val Thr Thr Lys Thr Asp18Ser Thr His 260 Ala Ser Ser 275 Lys Thr Glu 290 Asn Gly His 305 Gly Tyr Ala101838658 A CN 101838659序列表Met Ser Asn Ser Gly Thr Lys Ala Arg Lys Thr Pro Gly Leu Asn Asp Tyr Ala Gly Trp Val Ala Leu Val Pro Val Asp Pro Val Thr Arg Arg Gln Val Thr Pro Ala His Thr Ala Asp Leu Pro Asn Gly Ala Tyr His Pro His Arg Lys Ser Pro Lys Ala Ala7/13 页565 570 575 Val Leu Ala Gln Phe Asp Leu Ser Leu Ala Ala Lys His 580 585 590 Thr Phe Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr Tyr Thr Gln Tyr 595 600 605 Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly Pro Thr Asp Ala 610 615 620 Tyr Met Ile Ala Tyr Ala Pro Pro Gly Met Glu Pro Pro 625 630 635 640 Glu Ala Ala Ala His Cys Ile His Ala Glu Trp Asp Thr 645 650 655 Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr Leu Ser Ala Ala 660 665 670 Tyr Thr Ala Ser Asp Ser Ala Glu Thr Thr Asn Val Gln 675 680 685 Cys Leu Phe Gln Ile Thr His Gly Lys Ala Asp Gly Asp 690 695 700 Val Leu Ala Ser Ala Gly Lys Asp Phe Glu Leu Arg Leu 705 710 715 720 Ala Arg Thr Gln Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp 725 730 735 Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln 740 745 750 His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu 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