本发明涉及一种新的与源于神经的可塑性相关并且可在海马状突起的齿状脑回中诱导产生的基因及其编码的多肽。 在本文中将编码此类多肽的基因命名为“候选可塑性相关基因”（CPGs）以及用术语“cpg-1”表示新的由cpg产生的并由本发明鉴定和分离的cDNA。本文中以术语“cpg-1产物”表示cpg-1的产物。
下列表中列出的是本说明书中涉及的参考文献。
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由于神经系统具有对生物环境的适应性（Plasticity）使之能应付外部世界发生的变化，并改变其对变化的输入信号的应答。例如在CNS发育期间以及在成年人脑地学习和记忆时显示出高度的适应性。成年哺乳动物脑中显示有高度适应性的区域之一是海马状突起，已知该区域与学习和记忆有关，并且已在该脑区域中广泛地研究其对生物环境的适应性。在海马状突起中主要研究长期强化作用（LTP），大多数人认为该LTP与长期记忆机制有关（Bliss and Lomo，1973，Madison et al.，1991）。该脑区域也是研究其他适应性机制的焦点，这些机制包括感情激动（Mc Namara，1988）以及其他癫痛发作模型（Ben-Ari and Represa，1990;Stasheff et al.，1989）。在LTP，激动和癫痛发作当中，神经系统的适应性表现为沿预先由一种强烈的和/或复发性电刺激激发的途径持续强化。
类似于进行短期记忆的短期适应性变化涉及到蛋白质的转译后修饰，例如离子通道（Seigel-baum et al，1982）。但是，长期的持续性适应性变化似乎需要从新激活基因表达。在海马状突起中诱导LTP，癫痛发作或激动的处理和产生其他适应性现象的处理都能激活大多数即刻早期基因（IEGs）如c-fos以及zif/268的转录（Cole et al.，1989;Wisden et al.，1990;Sheng and Greenberg，1990）。许多的这些IEGs编码控制“下游”基因表达的转录因子（Goelet et al，1986;Sheng and Greenberg，1990），据认为“下游”基因的产物导致长期的适应性变化。
为了鉴别参与长期适应性的基因，使用一种高度灵敏的鉴别CDNA克隆方法。将52个候选的适应性相关基因（CPGs）的CDNA，以及用谷氨酸盐类似物红藻氨酸（Rainate）在海马状齿状脑回（DG）中引导出的基因进行克隆。发现克隆的CPGs之一，cpg-1，与活化的成年齿状脑回高度特异并预定着产生了一种新的DG特异性蛋白。
第一方面本发明提供了一个本文中命名为“cpg-1”的新的CDNA序列。第二方面，本发明提供了由此编码的多肽。本文中命名为“cpg-1产物”，据认为这是一种新的神经肽或一种神经营养因子或其任何之一的前体。
根据本发明，提供了选自于下列组中的DNA分子：
（ⅰ）含有下列核酸编码序列的DNA分子：
1 ATGGCCAAGAAGTCACATCCTTACCTACAC
31 TGGTATAAGAACGAAAACGGCCCATCAGTA
61 ATCAGGCCTGGAGGGAGGAGAGGTTCAGGG
91 AGCCCTAGCTCTACCGCTGCTCTCTTTGTC
121 TCTGTAGATGCAAGCAGAGGGCGAACATTA
151 CCTTCAGTTATACACCCCTTGGTGACCAAA
181 TCTAAAGGTCACACAGATGGTCCTGGTGAA
211 ACGAAATGCTCATTAAACCAAACCCCAAGC
241 CACGTTTGTGGAAAGGAACTGTTAGGGACA
271 AGGGGAGGGGGA;
（ⅱ）具有（ⅰ）中核酸序列的DNA分子，但其中以所说序列编码的多肽基本上保留了与未变化的DNA序列编码的多肽相同生物学特性的方式叠加，取代或缺失了一个或多个密码子;
（ⅲ）编码具有由（ⅰ）或（ⅱ）的DNA分子所编码的多肽的氨基酸序列的多肽的DNA分子，但由于遗传密码的简并特性其又与（ⅱ）或（ⅰ）中DNA序列不同;
（ⅳ）一种具有一段核苷酸编码序列的DNA分子，它与（ⅰ），（ⅱ）或（ⅲ）的DNA分子同源，来源于除大鼠以外的哺乳动物，并且能编码具有类似于由（ⅰ），（ⅱ）或（ⅲ）的序列编码的多肽的生物学活性的多肽。
（ⅴ）（ⅰ）-（ⅳ）编码序列的片段，其能编码基本上保留了由未分段的DNA分子编码的肽的生物学特性的肽;
（ⅵ）含有（ⅰ）-（ⅴ）片段的DNA编码序列汇及在3′和5′末端有附加DNA序列的一种DNA分子;以及
（ⅶ）含有上面（ⅰ）-（ⅵ）所述任一编码序列的重组DNA分子。
在上述（ⅰ）中定义的DNA分子是cpg-1。
根据所述的本发明的第二方面，提供了选自于下列组中的多肽：
（ⅰ）具有下列氨基酸序列的多肽;
1 M A K K S H P Y L H W Y K N E N G P S V
21 I R P G R R G S G S P S S T A A L F V
41 S V D A S R G R T L P S V I H P L V T K
61 S K G H T D G P G E T K C S L N Q T P S
81 H V C G K E L L G T R G G G
（ⅱ）将（ⅰ）中的一个或多个氨基酸残基进行叠加，缺失或取代或化学修饰但基本上不影响该多肽的生物学活性而得到的多肽;
（ⅲ）多肽（ⅰ）或（ⅱ）的生物学活性片段;
（ⅳ）未浮于其他哺乳动物并具有相似于（ⅰ），（ⅱ）或（ⅲ）的多肽的生物学活性的与（ⅰ），（ⅱ）或（ⅲ）的多肽相同源的多肽。
上述（ⅰ）中定义多肽在本文中命名为“cpg-1产物”，这是一种高度碱性的94氢基酸的小蛋白，包含有一个重复的6氨基酸成分并且在73和83位上含有由三个氨基酸（70-72位上的E，T和K）引导的二个半胱氨酸，这是神经营养因子簇中的保守区。
用合适的表达载体将所说的DNA分子克隆于合适宿主细胞中制备所说的cpg-1产物。在合适宿主中克隆和表达DNA分子的方法是本领域普遍已知的，其描述不在本文描述范围内：关于一般性参考，读者可参考J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis in Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989。一种特定的宿主细胞例子是大肠杆菌。
Cpg-1是一种量少的基因，其表达不连续，仅在特定刺激后被激活。与其他CPGs相似。在用红藻氨酸注射后6小时在海马状突起DG中诱导出cpg-1。用一种适合检测并选择性地分离编码CPG产物的CDNA（cpg CDNA）的新高度灵敏的鉴别CDNA克隆方法将有利于分离cpg-1，该方法包括：
（a）从怀疑其能表达CPG产物的细胞（CPG+细胞）中获得RNA样品，与逆转录酶一起保温，从而获得单链CDNA;
（b）将步骤（a）获得的单链CDNA与非特异性mRNA进行反应，所述非特异性mRNA从不表达CPG产物的细胞中获得;
（c）将留下的未杂交的单链CDNA与DNA聚合酶保温，从而获得双链CDNA。
（d）通过将所说双链CDNA作为插入片段导入一种病毒载体或质粒中而制备cDNA文件;
（e）将病毒载体或质粒在其易感染的培养细胞平板上培养，由此形成的噬菌斑或菌落分别是由病毒感染或质粒转染得到的;
（f）挑取单个的噬菌斑或菌落并从其中重新得到病毒载体或DNA质粒;
（g）用限制性酶消化所说质粒，该酶能识别载体或质粒中含有的cDNA插入物两侧的限制性位点，从而使所说cDNA插入物游离。
（h）将两种经消化的cDNA样品平行地进行凝胶电泳，将每个样品的分离出的DNA吸印至滤膜上;
（i）用是来自于CPG+细胞的cDNA的第一DNA探针与一个印迹杂交，用是来自于不表达CPG产物的cDNA的第二个DNA探针与另一了印迹杂交，其中与第一DNA探针阳性杂交但极少显示与第二DNA探针杂交的cDNA分子即是所说的cpg cDNA;并且
（j）或者还可以分离所说cpg DNA。
在下文中，使用公知的并承认的术语“吸印”和“印迹”分别表示通过凝胶电泳分离DNA，将其吸印至滤膜上并然后用一种DNA或RNA探针进行杂交的方法，以及得到的印迹。
根据现有技术中的方法，可直接从平板上制备印迹，然后用探针与全部噬菌斑的DNA内含物杂交。阳性杂交反应表明该噬菌斑含有所需的DNA。但是，现有技术存在的问题是有时即使在质粒中存在DNA序列，但由于各种因素如滤膜上的DNA量低，RNA含量低（其中从组织总RNA制备该探针），非特异性背景“噪音”（非特异性杂交）遮掩了“真实”信号等，限制了灵敏度因而也不发生杂交。
根据本发明中使用的方法，通过首先从噬菌斑或菌落中分离和纯化DNA，消化该DNA使插入物游离，通过电泳从载体的其他成分中分离该插入物（在电泳图谱上插入物典型地形成清晰谱带）而克服了这些困难。在吸印步骤后将cDNA探针与含有克隆文库的滤膜进行鉴别性杂交。因此，本发明中使用的鉴别cDNA克隆的方法是独特的，该方法比以前的鉴别克隆的方法具有更显著的灵敏度
图1表示在分离CPGs方法中用于扣除和鉴别cDNA克隆的一般方法的方案;
图2表示筛选CPGs方法的方案;
图3表示从显示有cpg-1表达组织型的不同器官的RNA的Northern印迹;
图4表示cpg-1与大鼠脑切片的原位杂交;
图5表示全长的cpg-1 cDNA序列，包括编码区5′和3′两侧的序列（底下划成部分表示编码序列）。
图6表示cpg-1 cDNA核苷酸序列以及推测的所编码多肽的氨基酸序列;以及
图7表示推测的cpg-1产物的部分氨基酸序列与其他三种神经营养多肽的部分氨基酸序列的比较图。
根据本发明，已从红藻氨酸刺激的大鼠的海马状突起脑细胞中鉴定和分离了由候选的适应性相关基因cpg-1衍生的新的DNA序列。不容置疑，基于该新发现的序列，技术人员毫无困难地可获得编码具有相似生物学活性的肽的其它DNA分子。例如，可以用该新发现的序列或其部分从其他哺乳动物包括人类的脑中“找”出同源性DNA序列。而且，可以一定方式修饰上述鉴别的任何DNA序例，在该方式中，得到的DNA序例将编码与未修饰的DNA序例编码的肽具有相似生物学活性的一个多肽：例如，在该DNA序列的C末端或N末端或两末端加入一个或多个密码子;缺失或取代该序例中的特定的密码子等等。而且，基于遗传密码的简并特性，可以制备许多种类的编码相同多肽的DNA序列。
最后，可以制备所编码多肽的片段，以及这些片段的DNA编码序例，这些片段几乎基本上保留了整个多肽的生物学活性。
据认为cpg-1产物是一种神经多肽或神经营养因子或其中之一的前体或更小的神经肽的前体，因此具有治疗学，诊断学，以及科学意义。从已知与大脑的各种记忆功能相关的海马状突起的齿状脑回中分离cpg-1，因此，本发明的cpg-1产物在例如治疗各种痴呆，例如Alzheimer′s病，以及用于调解或预防癫痫以及谷氨酸过多产生的毒性中具有的潜在用途。
采用遗传工程方法，可用本发明的cpg-1 DNA序例制备cpg-1产物。为了该目的，采用本领域内已知的方法制备表达cpg-1 DNA和其他序例，例如用于启动原核或真核细胞中进行表达的序例，的合适表达载体。用上述重组载体转染包括细胞，昆虫及哺乳动物细胞的宿主细胞，并用于制备cpg-1产物。
cpg-1 DNA还具有作为鉴别细胞或组织培养物，组织学样品等中各种正常或疾病相关性现象的标记物的用途。
通过使用本文中使用的方法有利于检测和分离编码cpg-1的DNA序列，该方法比灵敏度受到限制的常规的cDNA文库筛选方法具有巨大的优势。
现在通过下面的实施例及附图对本发明作进一步描述。
实施例1-试验步骤
DG RNA
给8-10周龄（230-300gr体重）雄性大鼠（Wistar of The Weizmann Institute）腹膜内（IP）注射红藻氨酸（8mg/Kg体重）。原液为每ml磷酸盐水缓冲液中含5mg）。六小时后杀死动物，解剖出齿状脑回（DG）并贮存于液氮中。将约100头动物的DG收存起来，并采用经改变的硫氰酸胍（GTC）方法（Chomczynski and Sacchi，1987）制备RNA：在GTC中裂肿后用2份酚和1份氯伤进行抽提，测定RNA，重悬于水中。为了进行扣除法，文库构建，以及cDNA探测法，用DNase（Promega，无RNase）处理该RNA以消除污染的基因DNA。用寡聚（dT）纤维素柱（Clontech）筛选多聚（A）+RNA。用同样方法从对照的无活性DG或从其他组织中制备多聚（A）+RNA。
扣除活化的DG cDNA文库
1.第一链cDNA-在两种50μl反应液中从活化的DG多聚（A）+RNA含成第一链cDNA，每种反应液含有5μg RNA，30μl RT缓冲液（Gubler and Hoffman，1983），1μl RNase（4μ/μl，Promega），1μg寡聚（dT）Xbal引物接头（Promega），30μCi32P-＝dCTP（3，000Ci/mmole，Amersham）以及400μMLV克隆的逆转录酶（BRL）。在37℃保温60分钟后，加入10μl NaoH（IN），2μl EDTA（0.5M）和H2O至100μl，在68℃将RNA水解20分钟，重新移至冰上，然后用10μl 1MHCL进行中和。加入5μg转移RNA，将反应液在Sephadex G-50自旋柱上旋转流过。将柱洗脱液的放射性与使用的样品的放射性相比较测定回收的cDNA。通常，在该阶段从10μg DNA中回收1.5μg第一链cDNA。收集2份cDNA样品，用乙酸铵乙醇沉淀并重悬液于水中直至10ng/μl。
2.扣除法-用等体积的偶合至生物素上大鼠大脑总多聚（A）+RNA（1μg/μl）（已光生物素化2轮，Clontech as described[Sive and St.John，1988]）与cDNA混合，用乙酸铵乙醇沉淀。重悬（至100ng/μl cDNA：10μg/μl RNA）于甲酰胺缓冲液（40%甲酰胺，50mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸pH7.6，0.5M Nacl，2mM EDTA）后，将溶液分装于毛玻璃管中（各25μl），封好后把在68℃保温3分钟，然后在52℃放置2天。断开毛玻璃管，各加入180μl缓冲液（N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸pH7.650mM，Nacl 0.5M，EDTA 2mM）。以每μg生物素化RNA加1μg的浓度加入链霉抗生物素蛋白（载体），混合后在室温下保温10分钟。然后用2份酚/氯份（1∶1，体积∶体积）以及1份氯仿进行抽提。通常得到的水相中含有作为扣除的10-20%的cDNA。用乙醇沉淀cDNA并垂悬于16μl水中。
3.第二链的合成
向cDNA中加入1μl dATP（10mM），2μlMg2+缓冲液（对于TdT，IBI），在100℃保温3分钟后并在冰上冷却后，加入末端脱氧核苷酸转移酶（17μ，Kodak），在37℃保持2小时。加入2μg寡聚（dT）Xbal引物接头。将该混合物在60℃保温5分钟。在含有90mM Hepes缓冲液pH6.6，MgCl210mM，各为0.5mM的所有四种三磷酸脱氧核苷酸，DTT 10mM和10μ Klenow（Boehringer，测序级）的50μl体积中含成第二链。在室温下保持6小时后，加入另一等份的酶再保持3小时。用苯酚和氯份抽提而终止反应，加入5μg转移RNA，用醋酸铵乙醇沉淀。
4.克隆-将双链cDNA重悬于9.6μl H2O中，用10μ的限制酶Xbal（Boehringer）在37℃消化5小时，之后将其载体于薄的1%琼脂糖凝胶上，紧挨着DNA大小标记物。切下含有cDNA分子量大小＞550bp的凝胶片，用QIAEX（Qiagen）提取cDNA并通过计算放射性而测定回收率（约10%的扣除的cDNA）。将该cDNA连接至λZAP（Stratagene）臂上，该臂以前已用Xbal消化并用牛胃肠磷酸酶（Boehrrringer）处理。用1μg噬菌体臂以及各种浓度的cDNA（3-20ng）完成连接反应。将连接物包装（Gigapack，Stratagene）并测定噬菌体效价。
筛选扣除的活化DG文库
以低密度将该文库在平板培养基上培养，以便逐个地挑取单个噬菌斑并用于重新获得模本质粒（Short et al.，1988）。用Xbal消化2-4μg质粒的少批量的DNA制剂，并用Southern吸印法吸印至Hybond N+（Amersham）滤膜（Sambrook et al.，1989）上。将该滤膜分别与红藻氨酸激活的以及未活化的对照DG第一链cDNA探针杂交并进行比较。用800μl缓冲液中含有的12μl随机引物（Boehringer，90A260 U/ml），2mCi32p-αdCTP（3，000Ci/mmol，Amersham）0.6mM脱氧核糖核苷酸（除dCTP）以及40μl Klenow（Boehringer，2μ/μl）将100ng第一链cDNA（如上所述）标记至非常高的放射性比活性，其中的缓冲液用于合成第二链cDNA。在室温下保温（以2×400μl等分样品）过液;该反应产生1.2×109cpm（Cerenkoff）探针。在预杂交进行6小时以上之后，在含50%甲酰胺，5×SSCPE（Sambrook et al.，1989），10×Denhardt′s，0.5% SDS，0.5mg/ml鲱鱼精子载体DNA以及浓度为108cpm/ml cDNA探针的杂交溶液中，并于42℃摇床水浴中进行48小时的吸印杂交。用0.1×SSC，0.2% SDS，在68℃洗涤印迹3次共计1小时。以同样方法杂交Northern印迹并洗涤，不同之处是从琼脂糖凝胶的质粒DNA上分离单个的cDNA探针，并用随机引物标记（Sambrook et al.，1989）。杂交反应进行16-24小时，探针浓度是1-3×106cpm/ml。
MK-801处理
给大鼠腹膜注射5mg/kg体重的NMDA受体拮抗剂MK-801（Wong et al，1986;RBI，NatieR MA;在25%乙醇中含5mg/ml），在红藻氨酸注射前完成上述注射。在某些试验中，在注射红藻氨酸2小时后重复注射MK-801。
全长cDNA克隆
为了获得跨越全长cpg-1转录物的克隆，以类似于上面描述的方式从活化的DG RNA中构建另外的二个cDNA文库。除用寡聚（dT）Xbal外还用2个来源于原始克隆406的5′侧端的序列的内部引物制备一个文库，并选择其含有大小2kb的cDNAs。与上述相同的方法制备第二文库，不同的是仅用寡聚（dT）Notl引物接头（Promega）代替Xbal引物。由于存在内部Xbal位点故采取这种方法以便跨越克隆的人工末端。从新生大鼠大脑文库（P7）筛选cpg-1也可反映出cpg-1与活化的DG的强烈特异性，在筛选的500，000个重组体中仅产生1个阳性克隆。用406克隆筛选刚激活的并经过大小选择的DG文库得到179个阳性克隆。进一步用更多的5′探针分析这些克隆，直至分离到包含整个序列的克隆，并用测序酶（USB）对二条链进行DNA序列分析。大量的克隆的限制性图谱表明在其5′未转译区仅出现唯一的可选择的cpg-1拼接机会。
实施例2-cpg-1的分离
CPG诱导
通过将红藻氨酸注射到大鼠的腹膜中（这是一种已知产生能诱导癫痫和LTP样强化作用的电刺激的处理）而刺激大鼠海马状突起的齿状脑回（DG）。该处理比用能诱导LTP的破伤风性的刺激观察到的结果产生更高的兴奋度和毒性。因此似乎不仅诱导出LTP可诱导基因，而且诱导出能调解更严重并且可能更长久的强化作用如癫痫和激动的基因。
为了测定得到最大程度地CPG诱导所需的红藻氨酸浓度及其动力学，追踪ProenRephalin（PE）的行为，PE是一种已知由于DG受产生LTP（Morris et al.，1988）或癫痫（Gall，1988）的电激活而诱导出的一种基因。PE是一种CPGS合适标化物，是一种“第二信号”基因，其转录产物受前面诱导出的IEGS激活（Sonnenberg et al.，1989）。当用8mg/kg（体重）的红藻氨酸注射动物并在放射后6小时杀死（未显示）时可在DG中诱导出最大量的PE。
CPG CDNA克隆
在操作中将CPG cDNAS定义为在红藻氨酸注射后6小时在DG中诱导出的转录物的互补物。为于克隆这些物质，从红藻氨酸注射的大鼠的DG中构建一种扣除的CDNA文库（参见图1概述的方法），为了扣除，使用来自总大鼠大脑（而不是非活化的DG）的多聚（A）+RNA以便避免扣除在DG中存在但进一步由红藻氨酸处而诱导的CDNA。通过将用从红藻氨酸激活的DG的多聚（A）+RNA制备的cDNA探针而得到的杂交信号与用从未活化的DG制备的样针得到的信号进行比较而鉴别筛选CDNA文库中的红藻氨酸诱导的cDNAS（图1）。
由于常规文库筛选方法的灵敏度受限制，因而妨碍其检测该文库中的大多数cDNA克隆。为了克服该问题，使用新的筛选方法，图解说明于图2中。对文库中克隆逐个筛选，挑出原始（未扩增）文库中的个噬菌斑，并用M13作为辅助噬菌体从λZAP载体中重新获得（p Bluescript）质粒（图2）。用限制性酶Xbal（cDNA文库的克隆位点）消化这些质粒以释放出cDNA插入片段。制备二个重复的Soutbern印迹，其中每个泳道含有单个克隆的DNA，并鉴别筛选红藻氨酸的诱导作用（图2）。将一个印迹与活化的DG cDNA探针杂交（图中的左边印迹），将其重复印迹与未活化的探针杂交（右边印迹）。将在第一印迹上与后面印迹相比显示有更强信号的克隆作为潜在的CPGs。（该方法的灵敏性使其能检测约80%的所筛选的克隆）。
将在2个独立的筛选过程（用2套独立的DG cDNA探针制备）中受红藻氨酸激活的所有cDNA，从其两末端（200-300bp）开始测序，并将其用于在DNA序列数据库（Pearson and Lipman，1988）中研究同源性。
为了证实在Southern筛选过程中显示受红藻氨酸刺激的cDNA代表DG中可由红藻氨酸诱导的RNA，将这些克隆与含有来自整个大鼠大脑（T），未激活DG（D）以及红藻氨酸激活的DG（D+）（未显示）的多聚（A）+RNA的Nortbern印迹进行杂交。至目前为止用该方式从扣除的，红藻氨酸激活的DG文库中筛选1000个克隆。发现52（～5%）克隆是CPGs（根据上述定义）。其中有三分之一是已知基因，其余是新的。
实施例3-cpg-1-一种新的齿状脑回特异性CPG
cpg-1在组织中的分布
进一步分析本文中命名为cpg-1的从单拷贝基因转录的新CPG。由于其与活化DG的高度特异性，引起人们对该克隆产生兴趣。图3显示证明cpg-1基因表达对活化DG的特异性的Nortbern印迹结果。用cpg-1 cDNA探测，随后用G3PD探针（较低泳道）探测含有分别从未处理的总大鼠大脑（B），或红藻氨酸处理的动物（B+），未处理的对照DGs（D），红藻氨酸激活的DGs（D+），肾脏（K），心脏（H），肝脏（Li），脾脏（S），肺（Lu）以及睾丸（Ts）得到的5μg多聚（A）+RNA的Nortbern印迹。所有测试组织中都表达甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PD）基因，G3PD用于调节RNA含量达正常水平。
如从图3结果可看出，所有检测的其他组织包括未处理的或红藻氨酸激活的成年大脑没有cpg-1 RNA。如下文中描述，通过原位杂交显示它还严格地依赖于NMDA受体激活。
原位杂交
NMDA型谷氨酸受体比其他任何已知蛋白质与适应性变化的诱导更相关。为了测定cpg-1的诱导是否依赖于NMDA受体的激活，从大鼠大脑切片制备探针用于原位杂交。在注射后六小时杀死未处理大鼠（图4左边切片），用红藻氨酸处理的大鼠（中间切片7或用红藻氨酸以及NMDA受体阻剂MK-801处理的大鼠（右切片），将其大脑切片并加工以进行原位杂交。冷冻大脑，并从海马状突起制备冠状的低温恒温器切片（15μm）并加工。根据已知方法用32p标记的cpg-1 DNA探测切片。如图4所示，cpg-1基因的诱导作用完全受MK-801封阻。
cpg-1 cDNA序列
在Norrbern印迹上显示cpg-1转录物是约4.5K b RNA。分析大量的cpg-1 cDNA克隆的特征显示在293个核苷酸中其大多数的5′末端至少以4种方式有选择地拼接至mRNA支座上（未显示）。测定包括cpg-1转录物的整个大的（4，207bp）（图5）以及几个小变异体的cDNAs的DNA序列。大cpg-1 cDNA含有一个非常小的开放式阅读框架，该框架侧面两端为非常长的未转译序列（在5′末端为839bp，在3′末端为3086bp，未显示）。图6中显示了开放式阅读框架的序列以及预测的由该序列编码的小蛋白质。
实施例4 重组cpg-1蛋白的表示
并纯化至同质
以单字母氨基酸密码表示存在于已克隆的所有cpg-1 cDNAs中的小开放式阅读框架（图6）。底下划线部分表示在推测的蛋白质中存在的二对碱性氨基酸。底下打星呈的部分表示重复成分（PSVI〔R/H〕P）。另外（如在图7中看到的），推测的蛋白质在73和83位含有两个半胱氨酸残基（图6）。73位的半胱氨酸是由70-72位的三个氨基酸（ETK）引导的。将推测到的cpg-1产物的氨基酸序列与其他三个已知的神经营养素的氨基酸序列进行比较，结果显示于图7（NGF-神经生长因子;NT3-神经营养素-3;BDNF-大脑衍生的神经营养因子），从结果可看出，在cpg-1的73位以及83位存在的半胱氨酸残基以及在70-72位存在的三个氨基酸（ETK）也存在于神经营养素族的蛋白质中。因此，由该编码序列推测的小蛋白具有上述特征暗示着它可能是一种新的神经肽或神经营养因子或其中之一的前体。也存在其他的小开放式阅读框架，其或者不含有起始蛋氨酸，或者位于本文描述的框架的下游。是否这些框架用于其他转录物序列中尚未清楚。分析了30多个单独克隆的限制性图谱并进行了测序，没有一个显示发生了导致产生预测的开放式阅读框架的拼接事件。
在大肠杆菌细胞中表达出cpg-1产物。使用侧端为cpg-1编码区的PCR引物从cpg-1 cDNA克隆制备380bp片段的复制本。该5′线物掺入单一的BamHI和NdeI限制性位点。3′引物掺入单一的EcoRI位点。用BamHI和EcoRI位点将PCR片段克隆至模本SK质粒上，并随后用NdeI和EcoRI位点将其再克隆至细菌表达载体pCFM 1656（Amgen）。对该克隆（pCcpg-1）测序以证实发生了合适的插入并保留了阅读框架。
为了分离cpg-1蛋白质，将2升含有pCcpg-1的大肠杆菌细胞在30℃培养6-10小时，然后在42℃诱导过夜。由于表达了大量的蛋白质而导致形成了内含体，在光学显微镜下放大1000×可观察到内含体。用Maniatis的方法（Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning）将细胞裂解并分离内含体。
将分离出的内含体重悬于约5毫升的水中。用Bradford分析检测到蛋白质浓度为16mg/ml。将该样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色。结果显示有一条约11KDa的强谱带，它包含有约50%有存在的蛋白质（结果未表示）。
随后用大小筛析法和离子交换树脂纯化蛋白质。使用在变性条件（1% SDS）下工作的250ml大小筛析柱（Pharmacia 200 HR树脂），从较高分子量的细菌杂质中纯化出cpg-1产物。该柱以0.67ml分钟的流速运转。用阴离子交换树脂（PharmaciaSP Sepharose Fast Flow）完成其他的分离步骤。从1% SDS的大小筛析柱上获得的cpg-1蛋白质馏分在8M脲中渗析。用流速为2.5ml/分钟的25ml阳离子交换柱。在8M脲，50mM麦黄酮，pH8.1溶液中分析该样品。用0至0.5M Nacl范围内的盐梯度从流柱上洗脱蛋白质：在约0.3M时洗脱出cpg-1产物，从而较好地与其他蛋白质分离开。含有分馏物的cpg-1产物的考马斯亮兰染色的凝胶未显示有污染物的谱带。收集到的cpg-1产物馏分体积为12ml，其蛋白质浓度为0.34mg/ml，得到4.1mg，纯度＞99%的cpg-1产物。