表达亚洲1型口蹄疫病毒VLP的重组腺病毒及其应用.pdf

表达亚洲1型口蹄疫病毒VLP的重组腺病毒及其应用
技术领域
本发明涉及一种重组腺病毒，尤其涉及一种表达亚洲1型口蹄疫病毒VLP的重组腺病毒，本发明还涉及该重组腺病毒的构建方法以及该重组腺病毒在预防口蹄疫中的应用，属于口蹄疫的预防领域。
背景技术
口蹄疫(FMD)是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其病原为口蹄疫病毒(FMDV)。鉴于口蹄疫对世界经济造成的严重危害，国际兽疫局(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其列为A类传染病之首，我国也将其列在一类动物传染病的第一位。疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段，安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。虽然OIE推荐的FMD灭活疫苗在消灭欧洲的口蹄疫以及控制世界其他国家的口蹄疫过程中发挥了重要作用，但是目前的口蹄疫疫苗主要存在如下一些致命性缺点，需要更新换代：1)生产疫苗用种毒均为强毒株：在欧洲曾经发生多起活病毒在生产中逃逸疫苗加工厂、病毒灭活不彻底导致FMD暴发的案例；2)在中国，制备FMD灭活疫苗的抗原未经提纯，因此免疫期较短、副作用较大、对于感染动物和免疫动物的鉴别诊断也存在干扰；3)制备疫苗的抗原需要提纯，会大幅提高疫苗的制作成本，这在发展中国家难以承受；4)由美国联合生物医学公司生产，2008年在中国上市的FMD合成肽疫苗，克服了FMD灭活疫苗的上述缺点，但短肽受MHC种属限制，目前只能用于猪而对牛无效，而且时刻面对因流行毒株发生抗原变异而失效或效力降低的危险。基于上述原因，目前国内外研究者都在寻求一种更加安全和有效的FMD疫苗，以克服常规疫苗和合成肽疫苗存在的缺点和不足，其中，利用缺损型腺病毒活载体构建的口蹄疫病毒样颗粒疫苗已成为研究的热点，最有希望成为第二代口蹄疫疫苗。
迄今为止，还没有Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒的报道。由于FMDV是高变异的病毒，不同血清型的病毒如O型和Asia1型口蹄疫的核苷酸序列差异在15％以上，另外，FMDV的基因组结构独特，正确地克隆和组装十分困难，因此构建正确表达的FMD病毒样颗粒并能够在动物体内诱导出高水平的中和抗体在技术上是十分困难的。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种由FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因和3C基因拼接在一起而得到的一种融合基因；
本发明的目的之二是提供一种能够高效表达亚洲1型口蹄疫病毒VLP的重组腺病毒；
本发明目的之三是将上述重组腺病毒应用于预防或治疗口蹄疫；
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种由口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和3C基因拼接在一起而得到的一种融合基因，其碱基序列为SEQ ID NO：1所示。
将SEQ ID NO：1所示的碱基序列与腺病毒穿梭载体相连接，得到重组腺病毒穿梭载体；将重组腺病毒穿梭载体重组进入人缺损腺病毒5型，筛选得到能够高效表达亚洲1型口蹄疫病毒VLP的重组腺病毒；
优选的，本发明所述的能够高效表达亚洲1型口蹄疫病毒VLP的重组腺病毒(rAdV-Asia1P12A3C)的微生物保藏号是：CGMCC No.3467；分类命名是：腺病毒；保藏时间是：2009年11月27日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
将本发明所构建的重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C在293细胞上培养，用FMDV共享表位单克隆抗体进行免疫荧光检测为阳性，而且培养上清用Western blot检测呈现中等强度的阳性反应，表明Asia1型口蹄疫VLP在哺乳类293细胞中实现了高效表达。一步生长曲线测定重组腺病毒在293细胞中的复制能力，表明在接种后60h，重组腺病毒的复制水平达到高峰；外源基因在病毒传代过程中稳定表达，并能够形成FMDV病毒样颗粒，当重组腺病毒传至第8代时毒价可达7.9×10⁸PFU/ml。rAdV-Asia1P12A3C接种小鼠在5周内产生口蹄疫特异性中和抗体，在首次免疫后9周(二免后3周)中和抗体达到峰值；而且二次免疫组诱导产生的中和抗体水平明显高于一次免疫组，由此诱导的具有保护水平的中和抗体可持续21周。试验结果表明，本发明所构建的用缺损腺病毒表达的亚洲1型口蹄疫病毒VLP，在小鼠体内可持续诱导高水平的中和抗体，可作为预防Asia1型口蹄疫的疫苗。
附图说明
图1重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C感染293细胞引起的细胞病变；(A)正常293细胞；(B)感染rAdV-Asia1P12A3C的293细胞。
图2重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C在293细胞中的PCR鉴定；
L：DL 15000DNA Ladder；1：H₂O；2：wtAdV；3-6：第2，4，6和8代rAdV-Asia1P12A3C。
图3用间接免疫荧光试验检测重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C感染的293细胞；(A)rAdV-Asia1P12A3C感染的293细胞；(B)wtAdV感染的293细胞。
图4用Western blot分析FMD病毒样颗粒在重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C感染细胞中的表达；1.野生型腺病毒感染的293细胞；2-4.rAdV-Asia1P12A3C感染的293细胞；5.预染的蛋白Marker；6.FMDV 146S蛋白。
图5重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C的一步生长曲线。
图6重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C接种BALB/c小鼠IgG抗体的动态变化；a.重组腺病毒一次免疫组小鼠IgG抗体的动态；b.重组腺病毒二次免疫组小鼠IgG抗体的动态。
图7重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C接种BALB/c小鼠中和抗体的动态变化；a：重组腺病毒一次免疫组小鼠中和抗体的动态；b：重组腺病毒二次免疫组小鼠中和抗体的动态。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
质粒、载体和生化试剂
腺病毒骨架载体pAdEasy-1、腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV、大肠杆菌BJ5183感受态菌以及AD-293细胞均购自Stratagene公司。大肠杆菌JM109、DH5α感受态细胞和pBluescript质粒由本试验室保存。PmeI和PacI均为NEBBioLabs产品。转染试剂Effectene Transfection Reagent购自QIAGEN公司。口蹄疫病毒VP2单克隆抗体4B2由微生物保藏号是CGMCC No.3103的杂交瘤细胞系所分泌；(中国发明专利申请号200910161346.9)。无外源基因表达的野生型腺病毒(wtAd)由本实验室构建并保存，wtAd的构建方法与本发明中重组腺病毒的构建方法相同。
实施例1重组腺病毒的构建、纯化和鉴定
1、Asia1型FMDV基因组P1、2A基因和3C基因的拼接
根据本发明人实验室成功拯救的Asia1型FMDV的感染性克隆(王海伟，涂亚斌，周国辉等.Asia1型口蹄疫病毒感染性克隆的建立[J].中国预防兽医学报，2008，30(12)：915-919)(于力等，Asia1型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法和应用，中国发明专利申请号200810171258.2)的Asia1/YS/CHA/05株基因组，分别设计上下游引物(表1)采用RT-PCR方法分别扩增P1-2A基因和3C基因，将pBluescript II SK(+)和P1-2A的PCR扩增产物分别进行KpnI和XhoI酶切，连接后转化并且筛选阳性克隆，酶切鉴定正确的重组质粒命名为pBlue-Asia1P12A。将pBlue-Asia1P12A与3C基因的PCR产物分别进行XhoI和SphI酶切，连接后转化并且筛选阳性克隆，进行酶切和测序鉴定，测序正确的重组质粒命名为pBlue-Asia1P12A3C。
表1用于Asia1型FMDVP1、2A基因和3C基因拼接的引物

  引物名称  引物序列  酶切位点  UP12A  5`TATGGATCCGGTACCATGGGAGCCGGGCAATCCAGT 3`  KpnI  LP12A  5`GAAACTCGAGGCGACTTTGACCAAC 3`  XhoI  U3C  5`CCACTCGAGTCGTCAGAAACCTCTGGAAGT3`  XhoI  L3C  5`TATGCATGCTCTAGACTACTCGTGGTGTGGTTCGGGATC-3`  SphI  P1  5`TCTGGTACCACCATGGGAGCCGGGCAATCCAGTCC3`  kpn1  P2  5`TCTGGTACCACCATGGGAGCCGGGCAATCCAGTCC3`  Not1
2、重组腺病毒穿梭载体的构建
根据质粒pBlue-Asia1P12A3C的基因序列设计引物P1和P2(表1)，用于扩增pBlue-Asia1P12A3C质粒上的P12A3C基因。P1含有kpn1酶切位点、kozke序列和起始密码子ATG，P2含有Not1酶切位点和终止密码子TAG。以质粒pBlue-Asia1P12A3C为模板，P1、P2为引物进行PCR扩增。将PCR产物胶回收，然后将回收的PCR产物和腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV进行KpnI和Not1双酶切，胶回收纯化酶切后的产物，与穿梭载体连接，并转化至JM109感受态菌，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落接种至5mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，进行PCR、酶切和测序鉴定。测序正确的质粒命名pShuttle-Asia1P12A3C。
3、重组腺病毒质粒的获得
将pShuttle-Asia1P12A3C用限制性内切酶PmeI线性化，电转化至含有腺病毒骨架载体AdEasy-1的BJ5183感受态菌(AdEasy-1-BJ5183)中。经卡那霉素抗性筛选，提取质粒，用PacI酶切鉴定，将阳性重组腺病毒质粒进行测序，正确的命名为pAdV-Asia1P12A3C。
4、转染
将质粒pAdV-Asia1P12A3C转化DH5α感受态菌，大量增殖重组质粒。用中量质粒提取试剂盒提取重组腺病毒质粒，用PacI酶切，乙醇沉淀灭菌，超净工作台无菌吹干，用无菌超纯水溶解沉淀，使质粒的终浓度为0.1-0.2g/L。用QIAGEN公司转染试剂Effectene Transfection Reagent进行转染，具体操作按说明书进行。
5、重组腺病毒的纯化与鉴定
将获得的初代重组腺病毒(命名为rAdV-Asia1P12A3C)反复冻融后，离心取上清，接种293细胞，连续传8代，观察细胞病变情况；取2、4、6和8代病毒，用蛋白酶K处理后，用PCR检测目的基因。同时取4、6和8代重组腺病毒感染的293细胞，用口蹄疫病毒VP2单抗4B2进行间接免疫荧光试验及Westernblot分析，以检测目的基因的表达情况。
转染后7天细胞开始出现病变，细胞变圆、变大、脱落。第9天收获病毒进行传代，传至第5代时，细胞于接种病毒后24-48h完全出现CPE(图1B)。取第2、4、6和8代重组腺病毒，用DNA提取试剂盒提取重组病毒DNA，PCR均能检出3.5kb的目的基因(图2)。
6、间接免疫荧光试验
将293细胞铺于96孔板中，当长到90％单层时，接种15MOI(Multiplicities of infection)rAdV-Asia1P12A3C，24h后弃去培养基，用PBS洗涤细胞3次，将rAdV-Asia1P12A3C感染的293细胞用预冷的无水乙醇固定15min，加入抗FMDV VP2的单克隆抗体4B2，37℃作用1h，用PBST洗涤后，加入荧光标记羊抗鼠IgG(Sigma)于37℃作用40min，PBST洗涤后自然干燥，加入缓冲甘油，于荧光显微镜下观察。
用针对FMDV VP2蛋白的单克隆抗体4B2进行IFA检测，结果发现重组腺病毒感染的细胞均出现明显的荧光，而对照组则检测不到荧光(图3)，表明rAdV-Asia1P12A3C能正确地表达FMDV-VP2蛋白。
7、Western blot试验
将感染rAdV-Asia1P12A3C的293细胞进行SDS-PAGE分析，同时设立口蹄疫全病毒蛋白作为阳性对照，野生型腺病毒感染的293细胞作为阴性对照，之后转印到硝酸纤维素膜上，用脱脂牛奶封闭后，加入抗VP2的单克隆抗体4B2(1∶1000稀释)，37℃作用1h，用PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG(Sigma，1∶10000稀释)，37℃作用1h，洗涤后加入DAB溶液显色。
对4、6、8代的重组腺病毒进行Western blot分析(图4)，结果表明，rAdV-Asia1P12A3C在感染的293细胞中复制、产生病毒样颗粒、并且稳定地表达。与单克隆抗体4B2发生免疫反应的条带与FMDV衣壳蛋白VP0、VP3的分子量大小相当，表明rAdV-Asia1P12A3C感染293细胞后形成FMDV多聚蛋白，并组装成FMDV病毒样颗粒。这与Mayr等的结果相似，他们构建了一株表达A型FMDV P1-2A-3C基因重组腺病毒，同时也将3C基因单点突变失活作为对照，发现失活的3C蛋白不能有效裂解FMDV多聚蛋白，从而使表达A型FMDVP1-2A-3C基因的重组腺病毒在293细胞中不能正确地组装完整的FMDV病毒样颗粒，在Western blot检测中也就没有VP0、VP3和VP1条带的形成。
8、重组腺病毒增殖滴度的测定
分别用10MOI剂量的第8代重组腺病毒(rAdV-Asia1P12A3C)和野生型腺病毒(wtAdV)接种293细胞，在接种后12、24、36、48、60和72h收取病毒并进行毒价测定(Kleina L G.，Grubman M J.1992.Antiviral Effectsof a Thiol Protease Inhibitor on Foot-and-Mouth Disease Virus.J.Virol.66：7168-7175.)，建立重组腺病毒与野生型腺病毒的一步生长曲线。分别用10MOI剂量的第4、6、8和10代重组腺病毒接种293细胞，在接种后60h收取病毒并进行毒价测定，检测不同代次重组病毒的病毒滴度。
随着病毒传代代次的升高，重组病毒的毒价也呈上升的趋势，第4、6、8、和10代的毒价分别为10⁴、10⁵、10⁸和10⁸PFU，说明重组病毒的复制水平和滴度在第6代以后趋于稳定，第8代达到峰值。
经病毒滴度测定，绘制出第8代重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C与其亲本病毒的一步生长曲线，即病毒增殖滴度与生长时间的相关性曲线，反映病毒生长繁殖的规律，结果见图5。结果表明，随着重组腺病毒感染293细胞时间的延长，病毒滴度逐渐升高，在60h时，病毒的滴度达到峰值，随后开始下降。
试验例1重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C的保护效力试验
1、BALB/c鼠的免疫接种
9周龄BALB/c鼠50只，购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，用免疫荧光方法检测人腺病毒5型抗体为阴性。实验动物随机分成9组，第1A、1B、1C和1D组为本发明实施例1所构建的重组腺病毒(rAdV-Asia1P12A3C)一次免疫组，每组5只，重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C免疫剂量分别为每只鼠1×10⁸、5×10⁷、5×10⁶和5×10⁵PFU；第2A、2B、2C和2D组为重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C两次免疫组，每组6只，免疫剂量分别为每只鼠1×10⁸、5×10⁷、5×10⁶和5×10⁵PFU，在第一次免疫后第6周以相同剂量加强免疫；第9组接种wtAdV。
重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C用PBS稀释，后腿肌肉注射。
2.间接ELISA检测
用包被液将FMDV 146S抗原稀释至20μg/mL，每孔100μL，加入酶标板，4℃过夜包被。用PBS洗3次，5％脱脂乳封闭，37℃孵育1h。PBS洗3次，加入待检小鼠血清，同时设立鼠阳性和阴性血清为对照。37℃孵育1h。洗涤后加入1∶5000稀释的HRP标记羊抗鼠二抗，OPD显色后于492nm处读取OD值。
3.微量细胞中和试验
(1)病毒毒价的测定：将重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变(CPE)达75％以上，收获病毒悬液冻融3次，以3 000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒对细胞有较稳定的致病力。取从-70℃冰箱保存的病毒一安瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10^-1，10^-2，10^-3……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5％CO2温箱37℃培养，从48-72h逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TTCID₅₀。(殷震，刘景华，动物病毒学[M].第2版，北京：科学出版社，1997，336～340.)
举例说明
TCID₅₀计算(接种剂量50μl)


1g TCID₅₀＝高于50％病毒稀释度的对数-距离比例×稀释系数的对数
高于50％病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为-1。
1gTCID₅₀＝-6+0.26×(-1)
        ＝-6.3
则TCID₅₀＝10^-6.3，50即病毒作10^-6.3稀释，每孔接种50μl，可使半数组织细胞管发生病变。
(2)中和试验：动物血清中含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清或腹水须经加热56℃、30min灭活处理。取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用不含血清的DMEM作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64等等，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。取-70℃冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作200TCID₅₀0稀释(与等量血清混合，其毒价为100TCID₅₀)。如病毒价为10^-6.3，50μl。所以应将病毒作2×10^-4.3稀释。每孔加入50μl病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和1h。在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。置5％CO₂37℃温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，120h终判。为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照。阳性和阴性(SP2/0)腹水与待检腹水进行平行试验，阳性腹水对照应不出现细胞病变，而阴性腹水对照应出现细胞病变。每次试验每一块板上都设立病毒对照，先将病毒作0.1、1、10、100、1000TCID₅₀稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50μl。然后每孔100μl细胞悬液。0.1TCID TCID₅₀应不引起细胞病变，而且100TCID₅₀必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。为检查被检腹水本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检腹水毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检腹水(相当于中和试验中被检腹水的最低稀释度)。即不接种病毒和待检腹水的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，赋税毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检腹水孔出现100％CPE判为阴性，50％以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释腹水中和试验的结果计算，是计算出能保护50％细胞孔不产生细胞病变的腹水稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果。
举例说明
固定病毒-稀释血清法中和抗体效价计算

用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果

1gPD50＝高于50％血清稀释度的对数-距离比例×稀释系数的对数
1gPD50＝-1.5-0.5×(-0.3)＝-1.35
则PD50＝10^-1.36，50μl
因10^-1.35＝1/22，即1∶22的血清可保护50％细胞不产生病变，1∶22就是该份血清的中和抗体效价。
试验结果
重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C一次免疫接种的4组BALB/c鼠(1A/1×10⁸PFU、1B/5×10⁷PFU、1C/5×10⁶PFU、和1D/5×10⁵PFU)和间隔6周同样剂量第二次免疫接种的4组BALB/c鼠(2A、2B、2C、和2D)，在接种后24周期间内采集血清，分别用ELISA和微量中和试验检测血清抗体的动态水平，野生型腺病毒wtAdV免疫组作为对照，结果见图6和图7。
从图6a可见，一次免疫组的小鼠，1A/1×10⁸PFU组和1B/5×10⁷PFU组在接种后3周已出现口蹄疫特异性IgG抗体，随后抗体水平逐渐升高，第8周1B/5×10⁷PFU组的IgG抗体达到高峰，而1A/1×10⁸PFU组在第9周IgG抗体达到峰值，之后抗体水平逐渐下降，到第24周这两组接种鼠的抗体水平接近阴性；1C/5×10⁶PFU组小鼠只产生很低水平的抗体，而1D/5×10⁵PFU组的小鼠与wtAdV对照组同样一直没有产生口蹄疫特异性抗体。两次免疫接种小鼠的免疫应答见图6b，与一次免疫组小鼠的共同点是，IgG抗体也在8-9周达到峰值、1D/5×10⁵PFU组在二次接种后同样没有产生抗体，可是两次免疫组具有如下明显特征：1)两次免疫的抗体水平要明显高于同剂量的一次免疫组，这种抗体水平的差别在免疫组1C(很低的免疫应答)和2C(免疫应答高于1A组)之间尤其明显；2A组比1A组的抗体水平也有明显提升；尤为重要的是，2B组不但比1B组的抗体水平明显提升，而且该剂量(5×10⁷)的二次接种可使免疫应答最大化至2A免疫组(1×10⁸)的水平，这更加显示出加强免疫的重要性；2)同时，抗体应答水平随着免疫剂量的升高而上升，一次免疫鼠和二次免疫鼠的最低剂量组(1D、2D)始终没有产生特异性IgG抗体；而在高剂量免疫组(1A、1B、2A、2B)，不但抗体水平高持续时间也长，直至实验结束仍能够检测到口蹄疫特异性抗体的存在。
用ELISA检测IgG抗体可以反映rAdV-Asia1P12A3C在免疫接种鼠体内诱导免疫应答的整体水平，而更直观的保护性免疫指标是中和抗体水平。因此，在检测血清IgG抗体的同时，本发明也测定了上述各实验组的中和抗体水平及其动态变化，结果见图7。一次免疫组的小鼠(图7a)，1A/1×10⁸PFU组和1B/5×10⁷PFU组在接种后3-5周出现口蹄疫特异性中和抗体，随后抗体水平逐渐升高，第5周1B/5×10⁷PFU组的中和抗体达到高峰(89)，而1A/1×10⁸PFU组在第9周中和抗体才达到峰值(89)，之后抗体水平逐渐下降，到第9、11周这两组接种鼠的中和抗体水平分别接近阴性；1C/5×10⁶PFU组和1D/5×10⁵PFU组的小鼠不能检出中和抗体。两次免疫接种小鼠产生的中和抗体，见图7b。2A和2B组的中和抗体水平(最高达178和251)比一次免疫的1A组和1B组(最高达89和89)明显升高，2C组也产生了较高水平的中和抗体(最高达126)，这些二次免疫鼠的中和抗体水平均在初次免疫后第9周、二次免疫后第3周达到峰值；1D/5×10⁵PFU组在二次接种后同样没有产生中和抗体。概括起来，重组腺病毒rAdV-Asia1P12A3C一次免疫小鼠以及两次免疫小鼠诱导中和抗体具有如下明显特征。其一，两次免疫产生的中和抗体水平要明显高于同剂量的一次免疫组，这种差别在免疫组1C(无中和抗体免疫应答)和2C(免疫应答明显高于1A、1B组)之间尤其明显，2A、2B组比1A、1B组中和抗体水平的提升更为明显。其二，从总体趋势看，中和抗体的应答水平随着免疫剂量的增加而上升，低剂量的1C、1D和2D组均不产生中和抗体，2C组产生中和抗体的水平比较高剂量的2A、2B组低；然而，在1A、2A组与较低剂量的1B、2B组，情形却有不同。在一次免疫鼠1B可诱导与1A同样水平的中和抗体，而且1B诱导中和抗体的高峰期(第5周)明显早于1A(第9周)；类似的情况也见于二次免疫鼠，较低剂量的2B组诱导的中和抗体不但早于2A组，而且诱导中和抗体的水平也明显高于2A组。这表明，经PBS稀释的病毒液1B/5×10⁷PFU组比未稀释的病毒液1A/1×10⁸PFU组更快速更有效地激发中和抗体的产生，其机理尚不清楚。其三，在小鼠模型的研究结果表明，在5×10⁷PFU剂量下两次免疫接种诱导中和抗体产生的滴度高(最高达251)、持续时间长(在一免后21周中和抗体滴度仍为63)，依据保护性中和抗体滴度(中和抗体滴度为55)确定的保护性免疫持续期为5个月，根据美国Moraes等的研究(Moraes M P，Mayr G A，Mason P W，et al.Earlyprotection against homologous challenge after a single dose ofreplication-defective human adenovirus type 5expressing capsidproteins of foot-and-mouth disease virus(FMDV)strain A24.Vaccine 2002；20：1631-9.)，结合其它免疫保护因素(细胞介导免疫、黏膜免疫和天然免疫)推断的完全保护性免疫的持续期为6个月，由此推断的临床保护性免疫的持续期为8个月。
序列表
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120>表达亚洲1型口蹄疫病毒VLP的重组腺病毒及其应用
<130>klpi00089
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3498
<212>DNA
<213>Artifical sequence
<400>1
atgggagccg ggcaatccag tccggcgacc gggtcgcaga accagtcagg caacactgga  60
agcatcatta acaactacta catgcagcag taccagaact ccatggacac gcaacttgga  120
gataacgcta tcagcggagg ctccaacgag ggttccacgg acaccacatc cacacacaca  180
aacaacaccc aaaacaatga ttggttctca cgcttggcca gctcggcctt tagcggactg  240
tttggtgctc ttttggctga caagaaaacg gaggagacaa ctctgcttga agaccgcatt  300
ctcaccacca gaaatggcca cacgacgtcg acgacacagt cgagtgttgg cgtaacatat  360
ggttacgctg tggctgagga cgcggtatct gggcctaaca cctcaggcct ggagacccgc  420
gtgacacagg ctgaacggtt cttcaagaaa cacctgtttg actggacgcc ggatttgtca  480
tttggacact gtcactactt ggaactcccc tctgaacaca agggcgtgtt tggcagcctc  540
atgagctctt atgcttacat gaggaacggg tgggacgttg aggtgaccgc tgttggaaat  600
cagttcaatg gtggttgtct cctcgtcgca ctcgtgccgg agctgaaaga gctcgacacg  660
cggcagaagt atcagttaac cctcttccca caccagttca ttaacccgcg cactaacatg  720
acggctcaca ttaacgtgcc gtacgtgggt gtcaacaggt acgaccagta cgagctccac  780
aaaccgtgga cgcttgtggt gatggtggtg gccccgctta ccgtcaaaac tggtggttct  840
gaacagatca aggtctacat gaatgcagcg ccgacctacg tgcacgtggc aggagaactg  900
ccctcgaaag aggggatagt tcctgtggcg tgtgtggacg gttacggcaa catggtaacc  960
acggacccga agacggctga ccccgtctac gggaaagtgt ctaacccccc cagaacaagc  1020
ttccctgggc gcttcacaaa cttccttgat gtagcggagg cgtgtccaac cttcctccgc  1080
ttcggagaag taccatttgt gaagacggtg aactctggtg accgcttgct tgccaagttt  1140
gacgtgtccc tcgctgcggg gcacatgtcc aacacctact tggcaggttt ggcacagtac  1200
tacacacagt acagcggcac tatgaatatc cacttcatgt tcaccggacc cacggatgcc    1260
aaagcccgct acatggtggc ttacatacct cctggtatga caccgccaac ggacccggag    1320
cgggctgcac actgcattca ttctgagtgg gacactggac tcaattctaa atttaccttt    1380
tctatccctt acctttctgc tgcagactat gcttacactg cttctgacgt ggctgagacc    1440
acgagtgtgc agggatgggt gtgtatttac cagatcaccc acggtaaagc tgaaggtgac    1500
gcgctggtcg tgtccgtcag cgctggcaag gactttgagt ttcgactacc ggtggatgcc    1560
cgccaacaga ctaccaccac tggcgagtcc gcggacccag tcaccaccac ggttgagaac    1620
tacggaggag agacccagac ggcccgacgg cttcacactg atgtcgcctt cgttctcgac    1680
aggttcgtga aactcaccca gcccaagagc acccaaaccc ttgatctcat gcagatcccc    1740
tcacacacac tggtcggggc gcttctccgg tctgcgacgt actacttctc agacctggag    1800
gttgcgctcg tccacacagg accggtcacg tgggtgccca atggtgcgcc taagaccgcc    1860
ttgaacaacc acaccaaccc gactgcctac cagaagcagc ctatcacccg cttggcactc    1920
ccctacaccg ctccccaccg tgtgctgtca acagtgtaca acgggaagac aacgtacgga    1980
gaagaatcct cgcggcgtgg tgatcttgcc gccctcgcac gcagagtgag caaccggctg    2040
cccacttcct tcaactacgg cgctgtgaag gccgacacca tcacggagct gttgatccgc    2100
atgaagcgtg cggaaacata ctgccccagg cccttgctgg ctcttgacac cacacaagac    2160
cgccgtaaac aggagatcat tgcacctgag aaacagactt tgaactttga cctactcaag    2220
ttggcaggag acgtggagtc caaccctggg cccttcttct tctctgatgt caggtcgaac    2280
ttcaccaagc tggtggacac cattaaccag atgcaagagg acatgtcaac aaaacacgga    2340
cccgacttta accggttggt gtccgcattt gaggaactgg ccactggagt gaaggctatc    2400
aggactggtc ttgacgaggc caaaccctgg tacaaactca tcaaactcct gagccgcttg    2460
tcatgcatgg ccgctgtagc agcacggtca aaggacccag tccttgtggc catcatgctg    2520
gctgacaccg gccttgagat tctggacagc acattcgtcg tgaagaagat ctccgactca    2580
ctctccagtc tctttcacgt gccggccccc gtcttcagtt tcggagcccc ggttctgttg    2640
gccgggttgg tcaaagtcgc ctcgagtcgt cagaaacctc tggaagtgag agccaagctc    2700
ccacagcaag agggacctta cgctggcccg atggagagac agaaaccact gaaagtgaaa    2760
gcaaaagccc cggtcgttaa ggaagggcct tacgaaggac cggtgaagaa acctgtcgct    2820
ttgaaagtga aagcaaagaa tttgattgtc actgagagtg gtgccccacc gactgacttg    2880
caaaagatgg tcatgggcaa caccaagcct gttgagctca tcctcgacgg caagacggta    2940
gccatctgct gcgctaccgg agtctttggt actgcctacc tcgtgcctcg tcaccttttc    3000
gcagagaagt acgacaagat catgctggac ggcagagcca tgacagacag tgactacaga    3060
gtgtttgagt ttgagattaa agtaaaagga caggacatgc tctcagacgc cgcactcatg    3120
gtgctccacc gtgggaatcg cgtgcgtgac atcacgaagc acttccgtga tgtagccaag    3180
atgaagaaag gaacccccgt cgttggtgtg attaacaacg ccgacgttgg gagactgatt    3240
ttctctggtg aggccctaac ctacaaagac attgtagtgt gcatggacgg agacaccatg    3300
cctggccttt ttgcctacaa ggccgtcacc agggcgggct actgtggagg agccgttctc    3360
gcgaaggacg gagccgagac tttcatcgtc ggcactcact ccgcaggcgg caacggagtt    3420
ggatactgct cgtgcgtttc caggtctatg ctgctcaaga tgaaggctca cattgatccc    3480
gaaccacacc acgagtag                                                  3498