抑制PLK1表达的SIRNA及其应用.pdf

抑制 Plk1 表达的 siRNA 及其应用
    【技术领域】
     本发明涉及四种抑制 Plk1 表达的 siRNA 及其应用。背景技术 Plk1(Polo-like kinase 1) 是一个从酵母到人类高度保守的真核生物丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶家族成员。Plk1 不仅参与参与细胞有丝分裂过程中多个步骤的调节， 而且 与各种类型肿瘤的发生发展关系密切。大量研究结果表明 ： Plk1 在各种类型肿瘤中均呈现 过表达， 且其表达水平具有重要预后价值 ； 将 Plk1 基因通过转染导入 NIH3T3 成纤维细胞表 达后， 可引起 NIH3T3 细胞的恶性转化， 恶性转化细胞能在软琼脂上快速生长， 并在裸鼠体 内形成肿瘤 ； 抑制肿瘤细胞中 Plk1 的表达后， 可导致肿瘤细胞生长的显著抑制和大规模细 胞凋亡 ； 但 Plk1 表达的抑制却对正常细胞如乳腺上皮细胞的生长影响极小 ； 最近的一项研 究结果还表明， Plk1 还可通过调节细胞外基质而参与肿瘤的侵袭与转移。这些研究结果不 仅表明 Plk1 是一个新的促进肿瘤发生发展的癌基因， 而且也毫无疑问地将 Plk1 确立为一 个有良好应用前景的恶性肿瘤治疗新靶点。目前， 以 Plk1 为靶点开发的多个新的抗肿瘤治 疗药物已经在实验室和临床试验中显示了很强的抗肿瘤效应。
     以 Plk1 为靶点的抗肿瘤药物开发目前主要有两种策略 ： (1) 传统策略， 即设计抑 制 Plk1 酶活性的传统小分子化合物抑制剂， 该策略的主要缺点是特异性较差 ； (2) 新策略， 即采用 RNA 干扰 (RNA interference， RNAi) 技术设计抑制 Plk1 基因表达的基因治疗药物， 该策略的最大优势是高效和特异性强。
     通过 RNA i 技术来研究开发新的以 Plk1 为靶点的抗肿瘤药物又有两个主要实现 途径 ：
     (1) 化学合成 Plk1 siRNA ； (2) 载体介导的 Plk1 siRNA 表达。但这两种途径都需 要首先获得有效的能抑制 Plk1 表达的 siRNA 序列， 因此， 发现新的有效 Plk1 siRNA 序列可 直接用于制备新的抗肿瘤治疗药物。
     发明内容
     本发明的目的在于提供抑制 Plk1 表达的 siRNA 序列， 以及进一步提供该 siRNA 在 制备抗肿瘤药物中的应用。
     为达上述目的， 本发明的四种抑制 Plk1 表达的 siRNA 序列分别为 ：
     Plk1-siRNA-607 的序列 ：
     正义链 ： 5′ -AUGAAGAUCUGGAGGUGAATT-3′，
     反义链 ： 5′ -UUCACCUCCAGAUCUUCAUTT-3′ ；
     Plk1-siRNA-778 的序列 ：
     正义链 ： 5′ -AUACCUUGUUAGUGGGCAATT-3′，
     反义链 ： 5′ -UUGCCCACUAACAAGGUAUTT-3′ ；
     Plk1-siRNA-838 的序列 ：正义链 ： 5′ -GGAUCAAGAAGAAUGAAUATT-3′，
     反义链 ： 5′ -UAUUCAUUCUUCUUGAUCCTT-3′ ；
     Plk1-siRNA-484 的序列 ：
     正义链 ： 5′ -GGAGGAAAGCCCUGACUGATT-3′，
     反义链 ： 5′ -UCAGUCAGGGCUUUCCUCCTT-3′。
     上述四种 siRNA 序列可用于制备抗肿瘤药物。
     本发明首先根据公认的 siRNA 序列设计原则从 Plk1 的 cDNA 序列中选取候选 siRNA 序列， 再通过 BLAST 同源比对排除一些特异性差的候选 siRNA 序列， 最后选定 4 种新 的 Plk1siRNA 序列， 并采用体外化学合成法合成各组 Plk1 siRNA。 然后， 将各组 Plk1 siRNA 和阴性对照 siRNA 同时分别转染 HeLa 细胞， 采用 RT-PCR 和 Western 印迹方法分别检测各 组 Plk1siRNA 在 mRNA 和蛋白质水平上对 Plk1 的表达抑制效果， 同时通过倒置生物显微镜 观察各组 Plk1 siRNA 对肿瘤细胞生长增殖的抑制效应。RT-PCR 分析结果表明， 在转染后 48h， 与对照组相比， Plk1 siRNA 转染组的 Plk1 mRNA 水平显著降低， 而 GAPDH 内参对照基 因的表达则没有变化 ； 蛋白质免疫印迹实验表明， 瞬时转染后 48h， Plk1 的表达几乎 100％ 完全受到抑制， 而对照组无明显效应， 同时 Actin 内参对照基因的表达没有变化， 说明本发 明提供的各组 Plk1siRNA 能够特异性的有效抑制 Plk1 的表达。倒置生物显微镜观察发现， 在转染后 24h， 对照 siRNA 转染组中的肿瘤细胞仍为正常的贴壁生长， 而各 Plk1 siRNA 转 染组中大量细胞呈现规则的圆形， 并脱离培养皿底壁， 漂浮于培养液中。这表明， Plk1 的表 达被有效抑制后， 肿瘤细胞的正常生长分裂受到显著抑制， 被有效阻滞于有丝分裂期。 在转 染后 48 和 72h， 对照 siRNA 转染组中的细胞仍为正常的贴壁生长， 并表现为密集汇合的生长 特点， 而各 Plk1 siRNA 转染组中大量细胞开始死亡、 裂解， 在显微镜下可观察到大量死亡的 细胞碎片。说明各组 Plk1siRNA 能有效抑制肿瘤细胞的生长增殖， 可直接用于制备新的以 Plk1 为靶点抗肿瘤治疗药物。 附图说明
     图 1 为 RT-PCR 方法检测各组 siRNA 在 mRNA 水平上对 Plk1 表达的抑制效果图
     图 2 为 Western 印迹方法检测各组 siRNA 在蛋白质水平上对 Plk1 表达的抑制效 果图
     图 3 为倒置生物显微镜观察各组 Plk1 siRNA 对肿瘤细胞生长增殖抑制的结果图
     具体实施说明
     实施例 1 ： Plk1 siRNA 的合成
     从公共免费基因数据库 GenBank 获取 Plk1 的 eDNA 序列， 然后根据公认的 siRNA 序列设计原则从 Plk1 的 cDNA 序列中选取候选 siRNA 序列， 再通过 BLAST 同源比对排除一 些特异性差的候选 siRNA 序列， 最后选定四种 Plk1 siRNA 序列， 序列分别为 ：
     Plk1-siRNA-607 的序列 ：
     正义链 ： 5′ -AUGAAGAUCUGGAGGUGAATT-3′，
     反义链 ： 5′ -UUCACCUCCAGAUCUUCAUTT-3′ ；
     Plk1-siRNA-778 的序列 ：
     正义链 ： 5′ -AUACCUUGUUAGUGGGCAATT-3′，反义链 ： 5′ -UUGCCCACUAACAAGGUAUTT-3′ ；
     Plk1-siRNA-838 的序列 ：
     正义链 ： 5′ -GGAUCAAGAAGAAUGAAUATT-3′，
     反义链 ： 5′ -UAUUCAUUCUUCUUGAUCCTT-3′ ；
     Plk1-siRNA-484 的序列 ：
     正义链 ： 5′ -GGAGGAAAGCCCUGACUGATT-3′，
     反义链 ： 5′ -UCAGUCAGGGCUUUCCUCCTT-3′。
     委托上海吉玛制药技术有限公司以化学合成法体外合成上述 siRNA 序列。
     实施例 2 ： RT-PCR 方法检测各组 siRNA 在 mRNA 水平上对 Plk1 表达的抑制效果
     1、 转染实验 ： 收集对数生长期的 HeLa 或 Hep-2 细胞， 以合适的密度接种至 6 孔 培养板， 分别设置空白对照组、 阴性对照 siRNA 转染组、 Plk1 siRNA 转染组， 置于 CO2 培 养箱培养。培养 24h 后， 细胞密度达到约 60％， 开始进行 siRNA 转染实验。转染实验采用 Invitrogen 公司的 Lipofectamine RNAiMax 试剂， 具体方法参照试剂使用说明书进行。
     2、 总 RNA 提取 ： 转染后 48h， 收集各组细胞。使用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂 提取细胞总 RNA， 具体方法参照试剂使用说明书进行， 各组总 RNA 样品利用紫外分光光度计 定量和变性琼脂糖凝胶电泳检测以确保总 RNA 的质量和完整性。
     3、 RT-PCR ： (1) 反 转 录 ： 采 用 TAKARA 公 司 的 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试 剂 盒， 具 体 方 法 参 照 试 剂 盒 使 用 说 明 书 进 行。(2)PCR ： 以 GAPDH 作 为 内 参 对 照， 检 测 Plk1 基 因 的 mRNA 表 达 水 平变 化。Plk1 的 上 下 游 引 物 分 别 为， 上游 引物： 5 ′ -GGCAACCTTTTCCTGAATGA-3 ′， 下游引物： 5 ′ -AATGGACCACACATCCACCT-3 ′。 GAPDH 的 上 下 游 引 物 分 别 为， 上游引物 ： 5 ′ -ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3 ′， 下游引物 ： 5 ′ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ′。PCR 扩增反应体系组成为 1μL 10×PCR 缓冲液、 1μL 2.5mmol/L dNTPs、 20×cDNA 模板 1μL、 0.1μL Taq 酶 (5U/μl)、 10μmol/L 上下游引物混 合液 1μL， 双蒸水补足至 10μL。 扩增程序为 ： 95℃变性 2min， 然后用逐步程序 95℃ 15sec、 60℃ 15sec、 72℃ 20sec 完成 19 ～ 35 个循环， 最后于 72℃延伸 7min。2％琼脂糖凝胶电泳 检测 PCR 扩增产物， EB 染色， 凝胶成像系统照相。
     4、 结果 ： 见图 1， RT-PCR 分析结果表明， 在转染后 48h， 与对照组相比， 各 Plk1 siRNA 转染组的 Plk1 mRNA 水平显著降低， 而 GAPDH 内参对照基因的表达则没有变化， 说明 各组 siRNA 均能有效抑制 Plk1 在 mRNA 水平上的表达。
     实施例 3 ： Western 印迹方法检测各组 siRNA 在蛋白质水平上对 Plk1 表达的抑制 效果
     1、 转染实验 ： 参见实施例 2。
     2、 细胞蛋白质裂解液制备 ： 吸去培养皿中的培养基， 用 1×PBS 将细胞洗涤 2 次， 用 细胞刮收集细胞， 混悬于 RACK1 裂解缓冲液 (25mM Tris-HCl， pH8.0， 137mM NaCl， 2.7mMKCl， 1％ Triton X-100， 使用前临时添加适量蛋白酶抑制剂 )， 冰上放置 30min， 超声处理进一步 破碎细胞和 DNA。4℃ 14000rpm 离心 10min， 收集上清作为细胞裂解液。采用 Bradford 法 检测细胞裂解液中的蛋白质浓度， 具体方法参见 Bio-Rad 公司的 Bio-Rad ProteinAssay 试 剂盒使用说明。
     3、 Western 印迹 ： 取适量细胞裂解液， 加入 SDS 上样缓冲液 (62.5mM Tris-HCl，pH6.8， 2％ β- 巯基乙醇， 0.01％溴酚蓝 ) 于 100℃加热变性处理 5min。 10％ SDS-PAGE 分离 样品中各蛋白质。采用 Tank 法进行转膜， 具体方法参见 Millipore 公司的 ImmobilonTM-P 膜使用说明。 用封阻液 ( 含 5％牛奶的 TBS-T) 将转印后的蛋白膜于室温封阻 1h 或 4℃封阻 过夜。TBS-T 洗膜三次， 每次 5min ； 加入适量稀释的一抗 (Plk1 抗体购自 Zymed 公司， Actin 抗体购自 Sigma 公司 )， 室温温育 1h ； TBS-T 洗膜三次 ； 加入 1 ∶ 2000 稀释的偶联辣根过 氧化物酶的二抗 ( 购自 Cell Signaling 公司 )， 室温温育 1h ； TBS-T 洗膜三次。最后采用 化学发光法进行检测， 具体操作参见 Amersham 公司的 ECL Western blotting detection reagents and analysissystem 试剂盒说明， KODAK 显像系统进行显影。
     4、 结果 ： 见图 2， Western 印迹分析结果表明， 在转染后 48h， 各 Plk1 siRNA 转染组 的 Plk1 蛋白质表达几乎 100％完全受到抑制， 而对照组无明显效应， 同时 Actin 内参对照基 因的表达没有变化， 说明各组 siRNA 均能有效抑制 Plk1 在蛋白质水平上的表达。
     实施例 4 ： 倒置生物显微镜观察各组 Plk1 siRNA 对肿瘤细胞生长增殖的抑制效应
     1、 转染实验 ： 参见实施例 2。
     2、 细胞生长增殖观察 ： 使用尼康公司的倒置生物显微镜， 分别在转染后的 24h、 48h 和 72h 观察 Plk1 表达抑制后对肿瘤细胞生长分裂和细胞形态的影响。 3、 结果 ： 见图 3， 在转染后 24h， 对照 siRNA 转染组中的肿瘤细胞仍为正常的贴壁生 长， 而各 Plk1 siRNA 转染组中大量细胞呈现规则的圆形， 并脱离培养皿底壁， 漂浮于培养液 中。这表明， Plk1 的表达被有效抑制后， 肿瘤细胞的正常生长分裂受到显著抑制， 被有效阻 滞于有丝分裂期。 在转染后 48 和 72h， 对照 siRNA 转染组中的细胞仍为正常的贴壁生长， 并 表现为密集汇合的生长特点， 而各 Plk1 siRNA 转染组中大量细胞开始死亡、 裂解， 在显微镜 下可观察到大量死亡的细胞碎片。说明各组 Plk1 siRNA 能有效抑制肿瘤细胞的生长增殖 并诱发细胞死亡和 / 或凋亡。
     实施例 5 ： Plk1 siRNA 在制备抗肿瘤治疗药物中的应用
     本发明所得的四组 Plk1 siRNA 序列的可用于设计和制备抗肿瘤治疗药物。 用于人 类体内给药， 可单独使用或与其它药物联合使用。 在具体实施时， 可以参照目前通用的 RNAi 基因治疗方案进行设计和实施。目前主要有两种设计和制备策略， 简述如下 ：
     第一种， 直接合成法。即根据本发明提供的 Plk1 siRNA 序列， 直接采用化学合成 的方法合成相应的 Plk1 siRNA 双链分子。其中正义链和反义链自 5′端开始的 19 个核苷 酸为靶向 Plk1mRNA 的序列， 必须使用 ； 而正义链和反义链自 3′末端的游离的两个连续的 脱氧核苷酸 (TT) 悬垂修饰则可以替换为两个连续的尿嘧啶核苷酸 (UU)。另外， 为了增加 Plk1 siRNA 双链分子在细胞内和体内的稳定性， 可进一步使用常用的 siRNA 修饰方法对其 进行修饰。
     第二种， 载体介导法。即根据本发明提供的 Plk1 siRNA 序列的正义链和反义链自 5′端开始的 19 个核苷酸序列 ( 注 ： 该序列即靶向 Plk1 mRNA 的序列 )， 进一步设计相应的 短发夹样核苷酸序列， 插入相应的各种基因治疗载体， 制备能表达 Plk1 shRNA 的基因治疗 药物。