一种组织工程骨软骨复合体及其制备方法 【技术领域】
本发明属于软骨组织修复和组织工程领域。本发明提供了一种构建组织工程骨软骨复合体的方法。具体而言，首先利用分层脱钙技术，制备以松质骨柱为主体、上层完全脱钙、下层仅表面脱钙的组织工程骨软骨支架，然后借助上层完全脱钙松质骨基质框架结构，以纤维蛋白原凝胶或藻酸凝胶作为软骨种子细胞的二级支架和分布载体，构建组织工程骨软骨复合体。
背景技术
关节软骨的损伤及病变是常见疾患，且难以自身修复。组织工程软骨是最有希望的修复方法。但目前关节软骨组织工程研究中存在以下问题亟待解决：(1)修复关节软骨的同时往往还需修复软骨下骨。临床上单纯关节软骨的损伤比较少见，更多的是伴随软骨下骨的病变，包括创伤引起的软骨下骨的缺损，骨软骨炎病变中软骨下骨的坏死，软骨退变后软骨下骨的硬化、脂肪变等。因此在多数情况下，修复软骨的同时还需修复软骨下骨。(2)组织工程关节软骨产品的固定问题未能有效解决。组织工程软骨的即时固定非常重要，如果不能很好的固定，在关节应力(特别是剪力)的作用下，移植组织和早期修复组织与软骨下骨出现相对位移，造成再生组织与周围正常软骨、软骨下骨交界区的应力集中，导致再生软骨交界区整合不良，另外过度的剪切应力也可能会影响修复组织的质量。因此，需要即时固定组织工程关节软骨，保护组织工程关节软骨免受有害应力，防止其出现脱落、撕裂。(3)现有的组织工程软骨存在生物力学缺陷。大量研究表明，虽然以天然生物材料(如胶原、透明质酸、藻酸、纤维蛋白胶等)为支架的工程软骨，修复效果优于化学合成支架，但是多数天然材料支架生物力学性能差，不能提供工程软骨移植后的即时应力支撑，造成移植组织的有害应力损害和周围软骨的异常应力集中，影响修复效果，引起周围软骨的退变。这一点在修复负重区软骨缺损时尤为明显，这也是交界区整合不良的主要原因之一。(4)组织工程软骨与软骨下骨间的整合较差。上述这些问题都会导致再生组织与周围软骨和软骨下骨的交界区整合不良。
随着软骨组织工程研究的深入，上述问题逐渐被人们重视。由于骨愈合的速度比关节软骨要容易得多，愈合的质量也好，因此，如果能构建一体化的工程骨软骨，早期依靠骨内支架提供稳定性，从而解决工程软骨的固定问题，骨愈合后依靠软骨下骨的牢固愈合，提供并保持其上面再生软骨的力学稳定性，获得更好的交界区整合，防止远期退变；而且结合Mosaicplasty技术(关节骨软骨移植技术，用取自自体或异体的多个骨软骨塞，移植到关节软骨缺损或病变区，以修复关节软骨)，则既有利于关节镜下操作，又可以获得更大面积的修复。因此研究能同时修复关节软骨和软骨下骨的一体化的组织工程——骨软骨组织工程，是软骨组织工程研究发展的必然趋势，也是目前研究的重点。
目前的组织工程骨软骨的支架一般由上、下两层组成，上层为软骨支架，下层为骨支架。其双层支架构建方法主要是两类，下层一般为适于骨组织工程的支架材料如生物玻璃、硫酸钙、羟基磷灰石、聚乳酸/羟基乙酸类或复合材料如聚醚醚酮/羟基磷灰石、胶原、羟基磷灰石等，上层软骨支架材料一类是凝胶类，如藻酸钙凝胶、纤维蛋白胶、透明质酸凝胶等，或符合天然材料如胶原/壳聚糖等，利用渗透作用与下层支架进行粘接，或利用冷冻干燥法将上层软骨支架材料成分固定在下层成骨支架上；另一类表层支架则为聚乳酸/羟基乙酸类，通过溶媒熔接或缝合的方法与下层支架连接。还有一类是利用胶原、壳聚糖、羟基磷灰石等材料，通过三维打印的方式合成梯度材料，形成所谓功能性界面。
以上述天然凝胶样材料为上层软骨支架的复合骨软骨支架存在以下问题：①上层材料力学性能差；②界面之间有力学缺陷，容易撕脱，抗剪力能力差；③凝胶类支架植入体内后吸水变形，重新变成了凝胶样，软骨层力学性能进一步减弱；④操作相对复杂；⑤下层羟基磷灰石降解慢，影响与周围骨的愈合。
上层为聚乳酸/羟基乙酸类物质的复合支架，由于聚乳酸类等化学合成材料降解易导致酸性产物堆积，引起关节炎症反应，且其在生产过程中可能出现毒性有机物的残留，由于滑膜关节的代谢缓慢，因此此类材料可能并不适于用于关节软骨组织工程支架。
利用复合材料三维打印形成的骨软骨复合支架，形成的是梯度支架，即从软骨层逐渐过渡到成骨层，软骨层可能含有一定的钙离子，会影响软骨形成，甚至导致软骨钙化，而且上层准确添加能形成软骨的种子细胞也比较困难，即使形成材料的骨‑软骨界面，也很难形成软骨支架/软骨种子细胞‑骨支架/骨种子细胞的生物界面。
理想的骨软骨组织工程支架应该满足下列要求：①一体化，骨与软骨界面没有明显力学缺陷；②力学仿生，上层构建的工程软骨其力学性能应接近正常关节软骨，下层则应与软骨下骨的机械强度接近，有较强的支撑强度；③上下孔径不一致，软骨层孔径小，乏氧，利于成软骨，下层孔径大，利于血管长入；④上层能促进软骨生成，下层能促进骨生成(骨传导、骨诱导)；⑤支架内部，特别是软骨支架内，细胞分布均匀，能提供良好的营养，及时带走代谢产物；⑥材料易于获得，制作简便，便于临床操作。
近年来的大量研究证实，脱钙骨基质(DBM)是较好的软骨组织工程的支架材料。其优越性在于：①DBM是细胞外基质，主要成分是I型胶原；②具有天然孔隙结构，孔隙大小为100um‑800um，交通性好，提供了足够的内表面积和空间，利于细胞吸附、增殖、分泌的细胞外基质沉积、营养物质和代谢产物交换，为组织工程的种子细胞提供较为良好的生长环境并利于种子细胞的接种；③制备过程中除去了骨形成蛋白(BMP)之外的非胶原性蛋白和有阻滞作用的脂类，抗原性显著降低，BMP的纯度也相应提高；④具有良好的软骨诱导活性。DBM中含有的BMP，有较强的软骨诱导活性，在关节特定的微环境条件下，可促进软骨祖细胞聚集及向软骨细胞分化，促进关节软骨细胞的生长和特异性细胞外基质合成。⑤降解时间合理：DBM在体内4周时部分降解，8‑12周时完全降解，软骨形成需6‑8周时间，此时DBM已趋于大部或全部吸收，与软骨形成几乎同步，不影响新的软骨组织形成；⑥力学强度合适：松质骨以最合理、最节约的材料，获得最大的力学支撑。因此DBM这种天然交联的I型胶原，较之合成的胶原、透明质酸或者藻酸等生物材料，有更好的力学支撑强度，而力学支撑强度对关节软骨组织工程材料是非常重要的性能指标。
应用脱钙骨基质作为软骨组织工程支架的研究和专利较多，但都是仅用于软骨组织工程，植入体内仍然存在前述的固定问题。因此，本发明人设计了一种新的思路，即通过松质骨分层脱钙技术，制备出完全一体化的组织工程骨软骨支架。
所述组织工程骨软骨支架已经可以直接用于关节软骨的修复或者关节软骨及骨下骨的同时修复，但是为了进一步减少加载了种子细胞后的组织工程骨软骨支架内的无细胞生长空间，更加有利于软骨修复，本发明人在此基础上以纤维蛋白原凝胶或藻酸凝胶作为软骨种子细胞的二级支架和分布载体，进一步构建了组织工程骨软骨复合体。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种组织工程骨软骨复合体及其制备方法。具体而言，以通过分层脱钙制备的组织工程骨软骨支架为主体支架，以纤维蛋白原凝胶或藻酸凝胶作为软骨种子细胞的二级支架和分布载体，进一步构建组织工程骨软骨复合体。
一个方面，一种制备组织工程骨软骨复合体的方法，该方法包括：
1)以动物骨或者深低温冷冻人骨为原料制备松质骨柱；
2)将步骤1)制得的松质骨柱进行分层脱钙，得到上层完全脱钙，下层仅表面脱钙的组织工程骨软骨支架，以该支架作为制备组织工程骨软骨复合体的主体支架；
3)将培养扩增后的软骨种子细胞收集后稀释于纤维蛋白原溶液或藻酸钠溶液中；
4)将步骤3)得到的含软骨种子细胞的纤维蛋白原溶液或藻酸钠溶液置于培养皿或培养板中；
5)将主体支架倒立，让支架上层(即完全脱钙部分)且仅让上层沉浸于上述培养皿或培养板内的溶液中，支架下层(即仅表面脱钙部分)曝露于溶液外；
6)调整溶液量，添加0.1ml 2％(w/v)凝血酶溶液或CaCl
2溶液，使上述溶液形成凝胶，凝胶的表面与主体支架上、下层的界面基本重合；
7)培养板放入4℃冰箱10分钟，取出培养板，吸出孔中多余液体，切除支架外多余凝胶，即获得所述的组织工程骨软骨复合体。
在本发明所述方法中，其中所述的动物骨优选从市场采购的新鲜动物骨。
本发明中，制备松质骨柱的方法是在常规方法基础上略作改进，简而言之为，取新鲜动物骨或者深低温冷冻人骨，剔除其上附着的肌肉及韧带组织，锯成2cm厚的骨片，然后将骨片用高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚脱脂，风干。然后用0.4‑4cm直径环钻，将上述处理过的动物骨制成直径为0.4‑4cm的松质骨柱。
本发明中，所述的分层脱钙技术是指，将制备得到的松质骨柱按所需比例划分为上、下两部分，下面的部分用石蜡包埋，然后将该松质骨柱整体置于EDTA溶液中脱钙，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓冲液浸泡1周，再冷冻干燥。该技术中，经脱钙处理后，上层完全脱钙，下层由于在脱钙过程中有石蜡包埋保护，因此仅表面脱钙。其中所述所需比例通常为1∶1～1∶2，优选为1∶2，即石蜡包埋的下层(即不完全脱钙部分)的长度占松质骨柱全长的2/3，上面不包埋部分(即完全脱钙部分)占松质骨柱全长的1/3。
本发明中，所述的软骨种子细胞为软骨细胞或骨髓干细胞。
本发明的一个优选实施方案中，所述的软骨种子细胞以4×10
7/ml稀释于纤维蛋白原溶液或藻酸钠溶液。
本发明的一个优选实施方案中，所述的纤维蛋白原溶液或藻酸钠溶液的浓度为1.2％(v/w)。
在本发明的具体实施方案中，本发明所述的制备组织工程骨软骨复合体的方法包括：
1)取新鲜牛股骨髁，剔除其上附着的肌肉及韧带组织，锯成2cm厚的骨片后，将骨片用高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚脱脂，风干。然后用1cm直径环钻，将上述处理过的牛股骨髁制成直径为1cm的松质骨柱。将松质骨柱下2/3部分用石蜡包埋。将下2/3部分包埋石蜡后的松质骨柱置于10％(w/v)EDTA溶液中脱钙2周，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓冲液浸泡1周以上，再冷冻干燥，即得本发明所述的组织工程骨软骨支架。
2)收集常规方法培养扩增的兔2代软骨细胞，以1.2％(v/w)藻酸钠溶液稀释成4×10
7/ml，取0.5ml上述细胞悬液加入到48孔培养板的孔中。
3)将步骤1)制得的分层组织工程骨软骨支架倒立，让支架上层(即支架上1/3完全脱钙部分)且仅让上层沉浸于上述培养皿或培养板内的溶液中，支架下层(即支架的下2/3仅表面脱钙的部分)曝露于溶液外，液面距支架的脱钙界面(即支架上、下层界面)5mm处，加入0.1ml 2％(w/v)CaCl
2溶液，培养板放入4℃冰箱10分钟，取出培养板，吸出孔中多余液体，手术刀片切除支架外多余凝胶，即获得本发明所述的组织工程骨软骨复合体。
另一个具体实施方案中，用1.2％(w/v)纤维蛋白原溶液替代1.2％(v/w)藻酸钠溶液，用0.1ml 2％凝血酶溶液替代2％(w/v)CaCl
2溶液，其他步骤相同。
另一方面，本发明提供了一种用上述方法制备的组织工程骨软骨复合体，所述组织工程骨软骨复合体包括作为主体支架的组织工程骨软骨支架，以及作为二级支架和分布载体的凝胶类物质。
本发明所述的组织工程骨软骨支架是通过对松质骨分层脱钙制备而成，是一种以松质骨为主体的组织工程支架。本发明所述组织工程骨软骨支架由于采用了基于松质骨的分层脱钙技术，因此该组织工程骨软骨支架上层完全脱钙，可作为工程软骨支架或工程软骨支架的框架部分；下层表面脱钙，可作为工程骨支架或骨形成材料，同时起到工程软骨的固定支点的作用。
本发明所述的凝胶类物质优选为纤维蛋白原或藻酸盐凝胶类物质。
【附图说明】
图1图示的是分层脱钙组织工程骨软骨支架树脂包埋硬组织切片HE染色大体显微镜下拍摄的图片，如图所示，支架的上1/3部分(即→指向部分)及支架下2/3部分(即
![]()
指向部分)的外周表面染浅红色，表明该区域已完全脱钙脱细胞；支架的下2/3部分的中心区域染紫蓝色，表明该区域未脱钙。
本发明的优点在于：
1.完全天然生物材料。目前同种异体冷冻干燥骨和纤维蛋白胶在临床已经广泛应用，藻酸作为组织工程软骨支架材料已经临床使用；
2.上层脱钙骨基质均匀复合凝胶后形成一体化的结构，DBM起到支架的力学支撑框架结构作用、与下层骨支架完全天然有机结合一体化作用、增加支架柔韧性和BMP载体的作用，凝胶作为种子细胞的分布载体，可使软骨种子细胞在工程软骨层均匀分布，增加上层软骨支架的硬度，能获得更接近于软骨组织的力学性能，同时凝胶类物质能较好的促进种子细胞向软骨细胞分化；
3.支架完全一体化，可构建出完全一体化的组织工程骨软骨；
4.可根据需要，在上下两层分别添加不同的种子细胞；
5.凝胶封闭了上层DBM与下方脱细胞松质骨支架交界区的空隙，这样在交界区就形成了两种界面，即DBM/松质骨界面、凝胶/松质骨界面，有效的防止了下方血管长入造成软骨修复组织的骨化可能，同时提供软骨种子细胞的乏氧环境。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件，或按照制造厂商所建议的方法。
实施例
实施例1用新鲜牛股骨髁为原料制备组织工程骨软骨支架
从市场采购新鲜牛股骨髁，剔除其上附着的肌肉及韧带组织，锯成2cm厚的骨片后，将骨片用高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚脱脂，风干。然后用1cm直径环钻，将上述处理过的牛股骨髁制成直径为1cm的松质骨柱。将松质骨柱下2/3部分用石蜡包埋。将下2/3部分包埋石蜡后的松质骨柱置于10％(w/v)EDTA溶液中脱钙2周，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓冲液浸泡1周以上，再冷冻干燥，即得本发明所述的组织工程骨软骨支架，将所述组织工程骨软骨支架钴
60消毒备用。
实施例2HE染色鉴定组织工程骨软骨支架的脱钙效果
将实施例1中制得的组织工程骨软骨支架分别进行树脂包埋，硬组织切片，HE染色后，置于大体显微镜下拍照观察，如图1所示。结果显示：支架的上层(即支架的上1/3部分)支架的下层(即支架的下2/3石蜡包埋部分)的外周染浅红色，支架的下层(即支架的下2/3石蜡包埋部分)的中央区域染紫蓝色，上、下层之间的界面非常清晰。
由此可见，通过本发明所述的分层脱钙处理，制得的组织工程骨软骨支架的上层(即上1/3部分)脱钙、脱细胞完全，支架的下层(即下1/3石蜡包埋部分)仅表面脱钙，中心区域未脱钙。
实施例3藻酸钠凝胶为二级支架构建组织工程骨软骨复合体
收集常规方法培养扩增的兔2代软骨细胞，以1.2％(v/w)藻酸钠溶液稀释成4×10
7/ml，取0.5ml上述细胞悬液加入到48孔培养板的孔中，将实施例1制备的分层组织工程骨软骨支架倒立，让支架上层(即支架完全脱钙部分)且仅让上层沉浸于上述培养皿或培养板内的溶液中，支架下层(即支架的仅表面脱钙的部分)曝露于溶液外，液面距支架的脱钙界面(即支架上、下层界面)5mm处，加入0.1ml 2％(w/v)CaCl
2溶液，培养板放入4℃冰箱10分钟，取出培养板，吸出孔中多余液体，手术刀片切除支架外多余凝胶，即获得本发明所述的组织工程骨软骨复合体。
实施例4纤维蛋白原凝胶为二级支架构建组织工程骨软骨复合体
收集常规方法培养扩增的兔2代软骨细胞，以1.2％(w/v)纤维蛋白原溶液稀释成4×10
7/ml，取0.5ml上述细胞悬液加入到48孔培养板的孔中，将实施例1制备的分层组织工程骨软骨支架倒立，让支架上层(即支架完全脱钙部分)且仅让上层沉浸于上述培养皿或培养板内的溶液中，支架下层(即支架的仅表面脱钙的部分)曝露于溶液外，液面距支架的脱钙界面(即支架上、下层界面)5mm处，加入0.1ml 2％(w/v)凝血酶溶液，培养板放入4℃冰箱10分钟，取出培养板，吸出孔中多余液体，手术刀片切除支架外多余凝胶，即获得本发明所述的组织工程骨软骨复合体。