超声雾化法制备载骨生长因子微球技术.pdf

本发明涉及一种超声雾化法制备载骨生长因子微球技术，该技术运用“a(aggregate)/o/w”法结合超声雾化系统，使药物聚集物的形成和乳化成球同时进行，采用生物可降解高分子聚乳酸或聚乙醇酸或乳酸-乙醇酸共聚物作为微球的起始原料，包埋BMP-2、BMP-7、BMP-1等骨形态发生蛋白，在制备过程中，主要通过控制喷嘴型式和超声雾化频率、原料的成份和浓度等参数，达到调控微球尺寸和释放周期的目的。骨生长因子在被包埋和释放的过程中，由于存在可逆的“聚集-解离”平衡，因子在微球中具有储藏式保存作用，使其保持良好的活性，释放较为完全，体外磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡45天后的释放量达78.1～92.4％。

1.  一种载骨生长因子微球的制备方法，采用a/o/w法和超声雾化系统结合的方法制备微球，其特征在于，将微球原料和骨生长因子配成溶液，通过雾化器雾化产生微球液滴，挥发干燥得到固态微球，其中，微球原料选自：聚乳酸、聚乙醇酸或乳酸-乙醇酸共聚物，其分子量范围为5～100KDa，溶剂选自：二氯甲烷或三氯甲烷，骨生长因子选自BMP-2、BMP-7或BMP-1，溶剂为磷酸缓冲盐溶液。

2.  根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤为：
(1).溶液的配制：配制微球原料溶液和骨生长因子溶液；
(2).加料：把微球原料溶液和骨生长因子溶液通过注射器泵分别以恒定的流速加入超声雾化发生器；
(3).雾化：以恒定的雾化振动频率产生微液滴；
(4).溶剂的挥发：用表面活性剂收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌；
(5).洗涤并冷冻干燥。

3.  根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中步骤(1)配制后得到的原料溶液的浓度在2～15％(w/v)之间，骨生长因子溶液的浓度在5～25ug/ml之间；步骤(2)中原料溶液和因子溶液的流速分别为0.2～0.4mL/分钟、1～3mL/分钟，雾化振动频率为25～60kHz；步骤(3)中表面活性剂为低分子量的聚乙烯醇(PVA)，其在外水相的浓度范围为0.1～1％(w/v)。

4.  根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中步骤(4)中搅拌时间为3-4小时。

5.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤为：
(1).溶液的配制：配制2％的PLA的二氯甲烷溶液的和5ug/ml的BMP-2的PBS溶液；
(2).加料：把(1)配制的PLA溶液和BMP-2的溶液通过注射器泵分别以0.2mL/分钟、lmL/分钟的流速加入超声雾化发生器；
(3).雾化：用60kHz的雾化振动频率产生微液滴；
(4).溶剂的挥发：用0.1％的PVA水溶液收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌4小时，使二氯甲烷挥发；
(5).洗涤并冷冻干燥。

6.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤为：
(1).溶液的配制：配制15％的PLGA的二氯甲烷溶液和10ug/ml的BMP-2的PBS溶液
(2)把(1)配制得到的PLGA和BMP-2的溶液通过注射器泵分别以0.1mL/分钟、lmL/分钟的流速加入超声雾化发生器；
(3).雾化：用40kHz的雾化振动频率产生微液滴。
(4).溶剂的挥发：用0.5％的PVA水溶液收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌3小时，使二氯甲烷挥发。
(5).洗涤并冷冻干燥。

7.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤为：
(1).溶液的配制：配制5％的PLGA的二氯甲烷溶液和10ug/ml的BMP-7的PBS溶液；
(2).加料：把(1)配制的PLGA溶液和BMP-7的溶液通过注射器泵分别以0.4mL/分钟、3mL/分钟的流速加入超声雾化发生器；
(3).雾化：用25kHz的雾化振动频率产生微液滴；
(4).溶剂的挥发：用0.5％的PVA水溶液收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌4小时，使二氯甲烷挥发；
(5).洗涤并冷冻干燥。

8.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤为：
(1).溶液的配制：配制10％的PGA的二氯甲烷溶液和20ug/ml的BMP-2的PBS溶液；
(2).加料：把(1)配制的PGA溶液和BMP-2的溶液通过注射器泵分别以0.4mL/分钟、3mL/分钟的流速加入超声雾化发生器；
(3).雾化：用40kHz的雾化振动频率产生微液滴；
(4).溶剂的挥发：用1％的PVA水溶液收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌3小时，使二氯甲烷挥发；
(5).洗涤并冷冻干燥。

9.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤为：
(1).溶液的配制：配制10％的PLA的三氯甲烷溶液的和25ug/ml的BMP-2的PBS溶液；
(2).加料：把(1)配制的PLA溶液和BMP-2的溶液通过注射器泵分别以0.3mL/分钟、2mL/分钟的流速加入超声雾化发生器；
(3).雾化：用60kHz的雾化振动频率产生微液滴；
(4).溶剂的挥发：用0.1％的PVA水溶液收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌4小时，使三氯甲烷挥发；
(5).洗涤并冷冻干燥。

10.  根据权利要求2所述的制备方法，得到的微球平均粒径大小为15.5～31.4微米。

超声雾化法制备载骨生长因子微球技术
技术领域
本发明属于医疗器械领域，更确切地说，本发明涉及一种载骨生长因子微球的制备方法。
技术背景
载药微球是随着生物材料科学、临床医学及药物学的发展而逐渐兴起的一种医用生物材料制品，是一种用可降解高分子材料为载体，包裹或吸附药物而制成的球形或类球形的微粒，悬浮于惰性亲水性溶液中。注射用微球直径一般在几十微米左右，其本质特征是作为药物的承载者进入人体，药物释放的部位、速度、方式等具有可选择性和可控制性，能更好地发挥药物的效力。作为载体材料，可降解高分子微球有其独特的优势，比如良好的生物相容性、亲水性和生物可降解性。载药微球中药物的释放具有可缓释特性，能增长药物的半衰期，延长给药时间；在同等剂量的情况下，提高了药物的生物可用度。
研究证明，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)又名：骨生长因子，能够增加成骨细胞分化的标志酶——碱性磷酸酶和骨钙蛋白等基因的表达，促进新骨形成及骨的层次化，在成骨细胞分化过程中起着关键作用。2002年美国FDA批准了OP-1(BMP-7)用于长骨缺损的临床治疗以及胶原载体微粒携带重组人类BMP-2在前部腰椎间融合中的应用。目前国内外对BMP，尤其是BMP-2和BMP-7在临床中的骨诱导作用给予了很高的评价。然而，BMP应用到临床的困难主要是易在体内扩散稀释，其生物利用度极低。因此，需要合适的载体以使BMP得到缓慢释放，而载药微球是一个较佳的选择，尤其是尺寸均匀、有高的载药率、能保持高的药物活性的微球。
在乳化法“w/o/w”、“s(solid)/o/w”等制备载骨生长因子微球中，药物的活性保持不良致使释放不完全是一个常见的问题。本发明目的，利用超声雾化系统提供的轻柔、低流速、低流量的优点，发明一种先进的载骨生长因子微球的制备方法。
发明内容：
本发明提供一种载骨生长因子微球的制备方法。
本发明的采用“a(aggregate)/o/w”法和超声雾化系统结合的方法制备微球。
本发明的制备方法包括以下步骤：
将微球原料和骨生长因子配成溶液，通过雾化器雾化产生微球液滴，挥发干燥得到固态微球。
其中，微球原料选自：生物可降解高分子聚乳酸(PLA)或聚乙醇酸(PGA)或乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，其分子量范围为5～100KDa，溶剂选自：二氯甲烷或三氯甲烷。
骨生长因子选自BMP-2、BMP-7或BMP-1等骨形态发生蛋白，其溶剂采用磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
具体制备方法：
(1).溶液的配制：配制微球原料溶液的和骨生长因子溶液；
(2).加料：把微球原料溶液(有机相)和骨生长因子溶液(水相)通过注射器泵分别以恒定的流速加入超声雾化发生器；
(3).雾化：以恒定的雾化振动频率产生微液滴；
(4).溶剂的挥发：用表面活性剂收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌，使二氯甲烷或三氯甲烷挥发；
(5).洗涤并冷冻干燥。
步骤(1)配制后得到的原料溶液的浓度在2～15％(w/v)之间，骨生长因子溶液的浓度在5～25ug/ml之间。
步骤(2)中原料溶液和因子溶液的流速分别为0.2～0.4mL/分钟、1～3mL/分钟，雾化振动频率为25～60kHz，；
步骤(3)中表面活性剂为低分子量的聚乙烯醇(PVA)，其在外水相的浓度范围为0.1～1％(w/v)。
步骤(4)中搅拌时间为3～4小时。
本发明最优选的制备方法在实施例中。
本发明制备的缓释微球粒径均匀，平均粒径大小为15.5～31.4微米，可根据需要改变制备参数(主要是喷嘴型式和超声雾化频率)进行控制。
本发明制备的缓释微球中，其骨生长因子的释放具有可调的缓释周期，体外磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡45天后的释放量达78.1～92.4％。
本发明中微球的制备方法简单，采用“a(aggregate)/o/w”法结合超声雾化系统，使药物聚集物的形成和乳化成球同时进行。因子在被包埋和释放的过程中，由于存在可逆的“聚集-解离”平衡，因子在其中具有储藏式保存作用，使其保持良好的活性，释放较为完全，另外本发明制备得到的微球稳定性好，安全性高，保质期长，缓释周期可控，成本低廉，适合大规模生产。
具体实施方式
下面将结合实施例更加详细的说明本发明，但不起到限制作用。
实施例1、载BMP-2的PLA(5KDa)微球的制备步骤如下：
(1).溶液的配制：配制2％的PLA的二氯甲烷溶液的和5ug/ml的BMP-2的PBS溶液。
(2).加料：把(1)配制的PLA溶液和BMP-2溶液通过注射器泵分别以0.2mL/分钟、1mL/分钟的流速加入超声雾化发生器。
(3).雾化：用60kHz的雾化振动频率产生微液滴。
(4).溶剂的挥发：用0.1％的PVA水溶液收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌4小时，使二氯甲烷挥发。
(5).洗涤并冷冻干燥。
本例制备的载BMP-2的PLA微球具有均匀的粒径，平均粒径大小为15.5微米，体外PBS浸泡45天后BMP-2的释放量达92.4％。
实施例2、载BMP-1的PLGA(20KDa)微球的制备步骤如下：
(1).溶液的配制：配制15％的PLGA的二氯甲烷溶液和10ug/ml溶液，
(2)把(1)配制的PLGA和BMP-1的溶液通过注射器泵分别以0.1mL/分钟、1mL/分钟的流速加入超声雾化发生器，
(3).雾化：用40kHz的雾化振动频率产生微液滴，
(4).溶剂的挥发：用0.5％的PVA水溶液收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌3小时，使二氯甲烷挥发，
(5).洗涤并冷冻干燥。
本例制备的载BMP-1的PLGA微球平均粒径大小为26.8微米，体外PBS浸泡45天后BMP-1的释放量达85％。
实施例3、载BMP-7的PLGA(50KDa)微球的制备步骤如下：
(1).溶液的配制：配制5％的PLGA的二氯甲烷溶液和10ug/ml的BMP-7的PBS溶液。
(2).加料：把(1)配制的PLGA溶液和BMP-7的溶液通过注射器泵分别以0.4mL/分钟、3mL/分钟的流速加入超声雾化发生器。
(3).雾化：用25kHz的雾化振动频率产生微液滴。
(4).溶剂的挥发：用0.5％的PVA水溶液收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌4小时，使二氯甲烷挥发。
(5).洗涤并冷冻干燥。
本例制备的载BMP-7的PLGA微球的平均粒径大小为31.4微米，体外PBS浸泡45天后BMP-2的释放量达89.2％。
实施例4、载BMP-2的PGA(10KDa)微球的制备步骤如下：
(1).溶液的配制：配制10％的PGA的二氯甲烷溶液的和20ug/ml的BMP-2的PBS溶液。
(2).加料：把(1)配制的PGA溶液和BMP-2的溶液通过注射器泵分别以0.4mL/分钟、3mL/分钟的流速加入超声雾化发生器。
(3).雾化：用40kHz的雾化振动频率产生微液滴。
(4).溶剂的挥发：用1％的PVA水溶液收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌3小时，使二氯甲烷挥发。
(5).洗涤并冷冻干燥。
本例制备的缓释微球具有均匀的粒径，平均粒径大小为23.7微米，体外PBS浸泡45天后BMP-2的释放量达80.3％。
实施例5、载BMP-2的PLA(100KDa)微球的制备步骤如下：
(1).溶液的配制：配制10％的PLA的三氯甲烷溶液的和25ug/ml的BMP-2的PBS溶液。
(2).加料：把(1)配制的PLA溶液和BMP-2的溶液通过注射器泵分别以0.3mL/分钟、2mL/分钟的流速加入超声雾化发生器。
(3).雾化：用60kHz的雾化振动频率产生微液滴。
(4).溶剂的挥发：用0.1％的PVA水溶液收集(3)所产生的微液滴，并继续机械搅拌4小时，使三氯甲烷挥发。
(5).洗涤并冷冻干燥。
本例制备的载BMP-2的PLA(100KDa)微球具有均匀的粒径，其平均粒径大小为28.4微米，体外PBS浸泡45天后BMP-2的释放量达78.1％。