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本发明涉及三嗪衍生化合物、其药用盐和包含它们的组合物。本发明的化合物或组合物可用于癌症治疗，特别是在乳腺癌治疗中具有优良的效果。

1.  式(I)三嗪衍生化合物或其药用盐，
(I)

其中，R₁是碳数为1～8的线性或支化烷基，R₂是选自由碳数为1～8的线性或支化的烷基、烯丙基、吡啶甲基、吡啶乙基和吡啶丙基组成的组中的任一基团，R₃是非取代的苯甲酰基或具有碳数为1～3的烷基取代基的苯甲酰基，n是1～3的整数。

2.  根据权利要求1所述的三嗪衍生化合物或其药用盐，其中，R₁是丁基，R₂是选自由烯丙基、1-乙基丙基和吡啶甲基组成的组中的任一基团，R₃是非取代的苯甲酰基，n是2。

3.  根据权利要求2所述的三嗪衍生化合物或其药用盐，其中，R₂是烯丙基。

4.  用于治疗癌症的组合物，该组合物包含权利要求1～3中任一项所述的三嗪衍生化合物或其药用盐。

5.  根据权利要求4所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述癌症选自由以下癌症组成的组：乳腺癌、结直肠癌、肾癌、脑癌、卵巢癌、胃癌、宫颈癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、肝癌和子宫癌。

6.  根据权利要求5所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述癌症是乳腺癌。

三嗪衍生化合物和包含该化合物的用于治疗癌症的组合物
技术领域
本发明涉及可用于治疗癌症特别是可用于治疗乳腺癌的新化合物和包含该化合物的组合物以及使用它们的治疗方法。
背景技术
根据近来的地方报告，他们分析，例如高血压、脑血管病、糖尿病等慢性疾病以及癌症的发病率正在持续上升，由此造成的经济损失已经达到约37万亿韩元。特别是，癌症在韩国的因病致死率中已成为排名第一的主要病因，癌症所带来的痛苦不仅造成相当大的经济损失，而且还带来精神上的损失。然而，随着癌症治疗的发展，癌症死亡人数正在不断下降，不过，癌症患者本身的数量却在不断增加，治疗药物的施用期也在延长。
同时，由于乳腺癌发于乳房，而且乳房中多种细胞都有可能发展成癌症，从而导致存在多种乳腺癌。然而，由于大多数乳腺癌同时发于乳管和乳叶中的细胞，尤其是发于乳管细胞，因此乳腺癌通常是指发于乳管和乳叶的上皮细胞的癌症。尽管乳腺癌是已被研究得最多的癌症之一，但乳腺癌的成因仍然未得到清楚的论证。
由于乳腺癌是韩国所有的癌症中排在胃癌、肺癌、肝癌和结直肠癌之后的第五大癌症，在2000年它的发生率占所有癌症的6.5％(5444例)，并在女性恶性肿瘤中继胃癌之后位列第二大常见癌症。然而，在2002年它的发生率是7.4％(7359例)，乳腺癌取代胃癌在女性恶性肿瘤中占第一位(16.8％)(韩国国家癌症中心2005年研究报告)。同时，乳腺癌多发于妇女；不过，它也有可能发于男性，据估计，男性发生率为女性的1/100。
在现有的抗癌疗法中，使用化学疗法的抗癌剂约占35％，作为实例，临床上使用了多于40至50种的抗癌剂，其中包括用于前列腺癌的醋酸亮丙瑞林(Lupron)；用于卵巢癌的紫杉醇；和用于乳腺癌的诺雷德(Zoladex)，其他化疗剂正在开发中。开发抗癌剂的目的在于，在有选择地从根本上战胜癌症的同时，克服毒性副作用、诱导耐受性和防止复发。特别是，由于常规治疗方法的乳腺癌死亡率非常高，乳腺癌治疗需求尤其迫切。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供可用于治疗癌症的新化合物、包含该化合物的组合物和使用它们的治疗方法。
为了实现以上目的，本发明提供了以下的式(I)三嗪衍生化合物、其药用盐、用于治疗癌症的包含所述化合物和/或其盐的组合物和治疗癌症的方法，

其中，在式(I)中，R₁是碳数为1～8的线性或支化烷基，R₂是选自由碳数为1～8的线性或支化的烷基、烯丙基、吡啶甲基、吡啶乙基和吡啶丙基组成的组中的任一基团，R₃是非取代的苯甲酰基或具有碳数为1～3的烷基取代基的苯甲酰基，n是1～3的整数。
优选的是，在式(I)中，R₁是丁基，R₂是选自由烯丙基、1-乙基丙基和吡啶甲基组成的组中的任一基团，R₃是非取代的苯甲酰基，n是2，更优选的是，在式(I)中，R₂是烯丙基。
附图说明
本申请包括以下用于更深入地理解本发明的附图，这些附图合并到本申请中而构成了本申请的一部分，它们阐述本发明的实施方式，并与说明书一起用于解释本发明的原理。在附图中：
图1是放大200倍的照片，其显示本发明的实施例所述的多种化合物均抑制了MCF-7乳腺癌细胞的生长；
图2是显示在用100μM的本发明的实施例所述的化合物处理MCF-7乳腺癌细胞后的生长抑制度的图表；
图3是作为阴性对照组的实验结果的照片，显示通过将MCF-7乳腺癌细胞注入作为阴性对照组的裸鼠而诱发的乳腺癌肿块；
图4照片分别显示在向通过将乳腺癌细胞注入裸鼠而诱发的乳腺癌肿块内施用本发明的实施例所述的Dan-BC1化合物后，肿块尺寸的变化；
图5照片分别显示在向通过将乳腺癌细胞注入裸鼠而诱发的乳腺癌肿块内施用本发明的实施例所述的Dan-BC2化合物后，肿块尺寸的变化；
图6照片分别显示在向通过将乳腺癌细胞注入裸鼠而诱发的乳腺癌肿块内施用本发明的实施例所述的Dan-BC3化合物后，肿块尺寸的变化；
图7是比较本发明的实施例所述的三嗪衍生化合物Dan-BC1、Dan-BC2和Dan-BC3在已被诱发乳腺癌的裸鼠中的肿瘤抑制效果的图表；
图8是显示在向于癌症形成转基因动物模型中自然诱发的乳腺癌肿块内施用本发明的实施例所述的Dan-BC1化合物后肿块尺寸变化的照片；
图9是显示在向于癌症形成转基因动物模型中自然诱发的乳腺癌肿块内施用本发明的实施例所述的Dan-BC2化合物后肿块尺寸变化的照片；
图10是显示在向于癌症形成转基因动物模型中自然诱发的乳腺癌肿块内施用本发明的实施例所述的Dan-BC3化合物后的肿块尺寸变化照片；
图11是比较本发明的实施例所述的三嗪衍生化合物Dan-BC1、Dan-BC2和Dan-BC3在癌症形成转基因动物模型中的肿瘤抑制效果的图表。
具体实施方式
以下将对有关本发明的新癌症治疗剂、含该治疗剂的组合物和使用它们来治疗癌症的方法的更详细的情况进行描述。
本发明基于以下事实：式(I)所示的三嗪衍生化合物在治疗癌症特别是乳腺癌时显示出极好的效果。三嗪衍生化合物库最初是为了开发肌割蛋白(myoseverin)假抗微管蛋白药物，从肌割蛋白衍生物出发，利用已知的结构活性关系(SAR)数据和计算机辅助建模而设计的(参见：Moon，H-S.，et al.，J.Am Chem Soc.，124(39)，11608-11609(2002))。通过在使用该三嗪衍生化合物库而培养的包括乳腺癌细胞在内的一系列癌细胞中检验所发现的抗癌化合物的效力，已确认三嗪衍生化合物及其药用盐在治疗癌症特别是乳腺癌方面显示出极好的效果。
此外，在式(I)所示的三嗪衍生化合物之中，以下式(II)所示的化合物Dan-BC1(C₃₁H₄₂N₈O₄，分子量：590.724)、以下式(III)所示的化合物Dan-BC2(C₃₄H₄₃N₉O₄，分子量：641.772)和以下式(IV)所示的化合物(C₃₃H₄₈N₈O₄，分子量：620.793)在治疗癌症时在例如癌症抑制效果等多个方面更为有效。

为了查明所发现的三嗪衍生化合物的抗癌效果，在乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、肾癌细胞、脑癌细胞等中进行了化学和基因筛选，并证实以上三嗪衍生物库中的式(I)化合物、更优选Dan-BC1、Dan-BC2和Dan-BC3这三种化合物在癌细胞抑制活性方面更有用。
更确切地说，本发明的化合物在MCF-7乳腺癌细胞系(ATCC号：HTB-22)中显示出最强的生长抑制效果，接着依次是MDA-MB-435(ATCC号：HTB-129)乳腺癌细胞系、MDA-N乳腺癌细胞系(Wang，J.J.，et al.，Anticancer Drugs，15(3)，277-286(2004))。这些化合物还在以下的癌细胞中显示出生长抑制效果：HCT15(ATCC号：CCL-225)结直肠癌细胞系、NCI/ADR-RES乳腺癌细胞系(Ehrlichova，M.，et al.，Anticancer Res.，25(6B)，4215-4224(2005))、CAKI-1(ATCC号：HTB-46)肾癌细胞系、ACHN(ATCC号：CRL-1611)肾癌细胞系、SF295脑癌细胞系(Rao，V.K.，et al.，Cancer GenetCytogenet，160(2)，126-133(2005))和UO-31肾癌细胞系(Jansen，A.P.，et al.，Mol，Cancer Ther.，3(2)，103-110(2004)；Chen，Y-L.，et al.，Eur J Med Chem.，40，928-934(2005))。
本发明的三嗪衍生化合物的IC₅₀值约为10μM，它们的活性浓度约为1～10μM，在高至约100μM时未观察到细胞毒性，这些数值可能随所用的细胞系和具体化合物的种类而有所不同。
本发明中的“药用盐”是指由无毒性或低毒性的酸或碱产生的盐。在本发明的化合物较酸性的情况下，可通过使该化合物的中性形式与足够的期望的碱和适当的惰性溶剂接触而获得碱加成盐。药用的碱加成盐包括但不限于：例如钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、镁盐或有机胺盐等盐。在本发明的化合物较碱性的情况下，可通过使该化合物的中性形式与足够的期望的酸和适当的惰性溶剂接触而获得酸加成盐。药用的酸加成盐包括但不限于：例如丙酸盐、异丁酸盐、草酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸(PTSA)盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、盐酸盐、溴酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氢碘酸盐、亚磷酸盐，但不限于此。此外，它还包括例如精氨酸盐等氨基酸盐和例如葡萄糖醛酸盐或半乳糖醛酸盐等有机酸类似物的盐。
本发明的一些化合物包括水合形式，并由此可同时以溶剂化态和非溶剂化态存在。本发明的一些化合物可同时以结晶态或非晶态存在。所有的这样的物理形式都包括在本发明的范围之内。而且，本发明的一些化合物可具有作为光学中心的不对称碳原子或双键，因此可存在外消旋体、对映异构体、非对映异构体和几何异构体等，它们也包括在本发明的范围之内。
本发明还提供了包含本发明的三嗪衍生化合物或其药用盐以及药用赋形剂或添加剂的药物组合物。本发明的三嗪衍生化合物或其药用盐可以独立施用，或与适宜的载体、赋形剂等组合施用。所述施用的剂量形式可以是单剂量形式或多剂量形式。
本发明的组合物可以是(但不限于)固体型或液体型制剂，而且固体型制剂可以是酸、颗粒剂、片剂、胶囊剂、栓剂等。固体型制剂可包含赋形剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂、填料等，但并不限于此。作为液体型制剂，它们可以是例如水溶液、丙二醇溶液等溶液剂、悬浮液剂、乳化剂等，但并不限于此，可以通过添加着色剂、调味剂、稳定化剂、增稠剂等而制得。
取决于所要治疗的疾病和患者状况，可以将本发明的组合物作为以下形式来进行施用：恩替卡韦(entecavir)、施用药剂(例如肌肉内施用、腹膜内施用、静脉内施用、输注、皮下施用、植入)、吸入器、鼻内施用药、阴道剂、直肠施用药、舌下制剂、透皮药、局部药等，但不限于此。根据施用途径，可以将该组合物配制成适当的剂量单位制剂形式，其中包含常用、无毒且可药用的载体、添加剂和赋形剂。可在一定时间内缓释药物的储存制剂形式也包括在本发明的范围之内。
本发明的三嗪衍生化合物或其药用盐可以以每日约0.04mg/kg至约20mg/kg进行施用，每日约0.4mg/kg至约2mg/kg的剂量是优选的。不过，该剂量可随患者的状况(年龄、性别、体重等)、所治疗的病症的严重程度、所用的化合物等而变化。为了便于施用，必要时可将每日的总剂量分开，在一天内进行多次施用。
为了更详细地描述本发明，下文将引用实施例。不过，本发明的实施例可被修改为不同的形式，而且本发明的范围不应被解释为局限于如下所述的实施例。本发明的实施例仅用于举例说明以帮助具体理解本发明。
实施例
[实施例1]三嗪衍生化合物库的设计和合成
根据由Khersonsky，S.M.等人公开的方法(J Am Chem Soc.，125，11804-11805(2003))进行基于三嗪结构的三嗪衍生化合物库的设计和合成。简而言之，为了产生三嗪衍生化合物库，使用固相法，分别单独制得三种构件单元(building block)，通过将它们正交结合产生了1536种纯三嗪衍生化合物。
更具体地说，如以下反应1所示，三种构件单元是(I)结合有伯胺的PAL树脂、(II)2位连接有胺、醇或硫醇的4，6-二氯-[1，3，5]三嗪和(III)一系列伯胺或仲胺。构件单元I是通过利用还原性氨基化反应将含有各种苄胺的伯胺连接至PAL醛树脂而产生的。同样，构件单元II是通过利用三氯化三嗪上的第一取代反应的高反应性而引入具有低亲核活性的烷基/芳基醇、位阻胺或苯胺而制得的。预先准备各种伯胺和仲胺而作为构件单元III。
通过使用预先制成的或市售的构件单元的简单合成过程，制得了本发明的三嗪衍生化合物，所有制得的化合物已由LC-MS(液相色谱-质谱联用)确认，其纯度均大于98％。
反应(I)

(a)R₁NH₂(5当量)，在THF中的2％乙酸，室温，1小时，之后，NaB(OAc)₃H(7当量)，室温，12小时。
(b)在THF中的R₂R₂′NH、R₂OH或R₂SH(1当量)，0℃，1小时。
(c)在THF中的构件单元II(4当量)，DIEA(4当量)，60℃，3小时。
(d)在NMP与正丁醇的1:1溶剂混合物中的R₃R₃′NH(4当量)，DIEA(4当量)，120℃，3小时。
(e)5％ TFA(三氟乙酸)的DCM溶液，10分钟。
[实施例2]细胞培养
在37℃的含5％ CO₂的培养箱内培养以下癌细胞：MCF-7乳腺癌细胞系(ATCC号：HTB-22)、MDA-MB-435(ATCC号：HTB-129)乳腺癌细胞系、MDA-N乳腺癌细胞系(Wang，J.J.，et al.，Anticancer Drugs，15(3)，277-286(2004))、HCT15(ATCC号：CCL-225)结直肠癌细胞系、NCI/ADR-RES乳腺癌细胞系(Ehrlichova，M.，et al.，Anticancer Res.，25(6B)，4215-4224(2005))、CAKI-1(ATCC号：HTB-46)肾癌细胞系、ACHN(ATCC号：CRL-1611)肾癌细胞系、SF295脑癌细胞系(Rao，V.K.，et al.，Cancer GenetCytogenet，160(2)，126-133(2005))和UO-31肾癌细胞系(Jansen，A.P.，et al.，Mol，Cancer Ther.，3(2)，103-110(2004)；Chen，Y-L.，et al.，Eur J Med Chem.，40，928-934(2005))。在培养和继代培养期间，癌细胞在含10％胎牛血清的DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)培养基中生长。
[实施例3-1]使用癌细胞筛选三嗪衍生化合物
通过用二甲基亚砜(DMSO)将冻干的库化合物再悬浮而将其重新悬浮至最终浓度为10mM。在添加库化合物的前一天将癌细胞放入24孔板中，以使每孔具有1ml培养基和5×10⁴个细胞。将每种化合物添加至指定的最终浓度。在每一实验中，使用DMSO作为阴性对照。除非另有说明，将细胞均培养72小时，使用CellTilter 96水溶液非放射性细胞增殖检测试剂盒(CellTilter 96 aqueous non-radioactive cell proliferation assay)(Promega，Madison，美国威斯康星州)来测定细胞的存活率。
CellTilter 96^TM水溶液非放射性细胞增殖检测是细胞毒性检测、细胞增殖检测或化学敏感性检测中的一种可测定存活细胞的数量的统一的非比色方法。CellTilter 96^TM水溶液检测试剂盒由四唑化合物((3-(4，5-二甲基唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基(caboximetoxipenyl))-2-(4-磺基苯基(sulpopenyl))-2H-四唑，内盐，MTS)和电子偶合指示剂(吩嗪硫酸甲酯，PMS)构成。MTS被细胞生物还原，溶于体系培养基，在该培养基中溶解了甲臜(formazan)产物。可在无额外步骤的情况下在96孔检测板上直接测得该甲臜产物在490nm处的吸光度。MTS向水性甲臜产物的转变是通过在代谢活性的细胞中发现的脱氢酶来进行的。根据490nm吸收强度值测得的水溶性甲臜产物的量与培养液中存活细胞的数量成正比。
[实施例3-2]评估化合物Dan-BC1、Dan-BC2或Dan-BC3对乳腺癌细胞系的活力的作用。
在向MCF-7乳腺癌细胞系施用多种浓度的各化合物后，观察乳腺癌细胞的活性。向各6孔板中各自分配2×10⁵个MCF-7细胞，使其生长。然后，将化合物Dan-BC1、Dan-BC2或Dan-BC3稀释至剂量浓度为10、50和100μM，根据浓度将它们处理癌两日后，通过测量细胞活力，将它们与未药物处理组的情况进行比较。结果显示在图1和图2中。
在图1所示的照片(放大200倍)中，所述的三种化合物抑制了MCF-7乳腺癌细胞的生长。如图1所示，Dan-BC1、Dan-BC2或Dan-BC3在10μM浓度时对细胞仅显示出弱生长抑制作用，甚至在50μM浓度时也未对细胞显示出显著的生长抑制作用，但在100μM浓度时，其对细胞的杀灭作用是肉眼显而易见的。因此，我们进行后续实验时使用的三嗪衍生化合物均为100μM施用浓度。
在图2中，显示了用各100μM的所述三种化合物处理MCF-7乳腺癌细胞后的生长抑制度。
测试了Dan-BC1、Dan-BC2或Dan-BC3对乳腺癌细胞的生长抑制作用，其结果显示，在施用100μM的Dan-BC3后12小时，与未施用药物制剂的乳腺癌细胞系的细胞相比，处理过的细胞存活约60％；与未施用药物制剂的乳腺癌细胞系的细胞相比，处理过的细胞在24小时后仅存活约37％；在36小时后，细胞存活约7％，在48小时后，所有的细胞都已被杀灭。
就Dan-BC1而言，与未施用药物制剂的乳腺癌细胞系的细胞相比，在施用100μM的该化合物后12小时，处理过的细胞存活约68％，处理过的细胞在24小时后仅存活约37％，在36小时后，细胞存活约27％，在48小时后，所有的细胞都已被杀灭。
就Dan-BC2而言，在施用100μM的该化合物后12小时，与未施用药物制剂的乳腺癌细胞系的细胞相比，处理过的细胞存活约75％；与未施用药物制剂的乳腺癌细胞系的细胞相比，处理过的细胞在24小时后仅存活约49％，在36小时后，存活约33％，在48小时后，仅存活20％。
[实施例4-1]裸鼠中乳腺癌肿块的形成和试验化合物的评估
为了测量MCF-7肿瘤细胞在裸鼠中形成肿瘤的能力，对出生后4～5周龄的30只雌性裸鼠皮下注射5×10⁶个MCF-7肿瘤细胞(在200μl PBS中)(BALB/c line athymic nu/nu)，根据台盼蓝染料排除检验，其具有大于95％的细胞活力，然后，在2周至2月后形成的肿瘤的直径大于10～25mm时，开始施用试验化合物。
每周在测定肿瘤尺寸后两日开始施用试验化合物。第一次施用的浓度均为500μM。尚未施用试验化合物的已形成癌症的裸鼠的照片显示于图3，其中，肿瘤尺寸的长轴为25mm，短轴为20mm，高15mm，重27g。
[实施例4-2]评估各化合物的活体内乳腺癌抑制效果
与实施例4-1相似，在裸鼠中形成乳腺癌后，在施用本发明的三嗪衍生化合物Dan-BC1、Dan-BC2和Dan-BC3后观察肿块尺寸的变化。
在施用两次500μM的Dan-BC1、Dan-BC2和Dan-BC3后，作为与前述实施例4-1的阴性对照组的乳腺癌肿块尺寸(长轴为25mm，短轴为20mm，高15mm)比较的结果，施用Dan-BC1、Dan-BC2和Dan-BC3后的肿块尺寸缩小至以下表1、2和3所述的程度，从而可确认本发明的三嗪衍生物对裸鼠中形成的乳腺癌具有很强的活体内抗癌效果。各照片显示于图4、5和6。
[表1]