一种不动杆菌及其用途.pdf

本发明公开了一种不动杆菌及其用途。本发明由生产菌株液体发酵培养后得到相应的制剂。生产菌株为不动杆菌(Acinetobacter sp.ND12)，该菌株已于2009年11月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3410。该菌株具有较强的尼古丁降解能力和尼古丁毒性抗性能力，可在高达3.5g/L尼古丁浓度下生长。通过大量培养该菌株，利用该菌株的完整细胞为生物催化剂可以降解纯的尼古丁，同时能降解烟叶中的尼古丁含量。本发明具有能调整烟叶原料的尼古丁含量，提高烟叶可用性，及可分解烟尘中的尼古丁，减少其对环境污染等优点。

1.  一种不动杆菌，其特征在于：该不动杆菌的分类命名为Acinetobacter sp.ND12；保藏编号为：CGMCC No.3410。

2.  权利要求1所述的不动杆菌的应用，其特征在于将该不动杆菌作为降低烟草中尼古丁含量的生物催化剂应用，其具体做法如下：
利用发酵培养基制备1000mL的发酵液，8000rpm离心15min收集菌体，把菌体用灭菌的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)进行悬浮洗涤，并用磷酸盐缓冲液调整菌体浓度OD值为0.5，该菌悬液即为用于降解尼古丁的菌制剂；称取2g烟叶，喷洒5ml菌制剂，置于28℃恒温恒湿培养箱中12-24小时，烟叶中的90％烟碱即可被有效降解。

一种不动杆菌及其用途
技术领域
本发明属于应用微生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种可降解尼古丁的不动杆菌。同时，还涉及所述的不动杆菌在烟草生产中的新用途。
背景技术
烟草是我国财政的重要支柱之一，随着我国卷烟和烟叶市场的国际化程度逐步加深，《烟草控制框架公约》对烟草制品的限制愈加严格，中国烟草面临着新的形势与挑战。为此，国家烟草专卖局制定了《中国卷烟科技发展纲要》，明确提出中国卷烟发展的方向是：以市场为导向，大力发展中式卷烟。而发展中式卷烟的关键技术就是要在保持高香气的前提下“减害降焦”，开发“低焦油、低危害、高香气”的中式卷烟品牌。因此，降低烟草中尼古丁等有害成分的含量，是促进卷烟工业健康发展的关键技术之一。
尼古丁是烟草生物碱中的主要成分，在烟草中，尼古丁大部分是以有机酸(如柠檬酸和苹果酸)盐的状态存在，也有少量的以自由状态存在。尼古丁进入人体内，90％被肺部吸收，进入血液后6秒钟即可到达大脑。尼古丁对人体最显著的作用是对交感神经产生影响，通常表现为短暂的兴奋，紧接着就是抑制。尼古丁的作用除了增加烟味和感受刺激外，主要还在于它所产生的生理强度，通常称为“劲头”。一般来讲，尼古丁含量高的烟叶，烟气劲头大，反之则小。因此，烟气中含有一定量的尼古丁是必要的，但尼古丁的含量也不能过高，否则不但会增加烟气的刺激性，影响卷烟吸味，而且从安全性的角度来讲也是一个非常不利的因素。
我国部分烟区的烟叶外观质量已接近国际水平，但就其内在质量而言还有一定差距，其中一个较普遍且较突出的问题就是尼古丁含量偏高。目前，我国烤烟尼古丁的平均含量为3％～4％，白肋烟平均高达6％，而美国烤烟的尼古丁含量在1.5％～3.5％之间；一般优质白肋烟的尼古丁含量在1.5％～4.0％之间，以3.0％为佳，美国白肋烟的尼古丁含量为2.9％左右。国内卷烟企业目前贮存的上部烟叶较多，一般因其尼古丁含量较高而难以较多用于叶组配方中，不仅占用了大量的仓储空间，而且也造成了大量的浪费。这个问题已引起有关方面的重视，如何降低这些烟叶中的尼古丁含量是各卷烟企业所面临的一个现实问题。同时由于烟草的连续栽培和大量废弃烟叶的存在使土壤中的尼古丁含量大大提高，对土壤环境和地下水质造成了较大的影响，如何有效的消除尼古丁对环境的污染也是当前人类发展所面临的关键问题。
目前，关于利用微生物降解尼古丁(烟碱)的研究已有报道。但经文献检索，尚未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的尼古丁降解微生物不动杆菌。本发明进一步的目的是提供一种所述微生物不动杆菌在烟草生产中的应用，即提供一种能有效降低烟草中尼古丁含量的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
A.本发明从云南省昆明市烟草栽培土壤中分离了一株具有降解尼古丁能力的细菌ND12，对其进行了形态学、生理生化性质和16S rRNA分析，鉴定结果表明该细菌属于不动杆菌属。其分类命名为Acinetobacter sp.ND12，保藏编号为CGMCC No.3410。
本发明所述的不动杆菌ND12菌株的主要形态特征和生理生化性质为：不动杆菌ND12菌株在显微镜下观察为棒状，无芽孢，不能运动。革兰氏染色阴性。硝酸盐还原和接触酶试验为阳性，能液化吲哚，不能液化明胶，不能水解淀粉，甲基红(MR)实验阳性，苯丙氨基酸脱氨酶和乙酰甲基甲醇(VP)实验均为阴性。本菌株对葡萄糖、D-木糖和乙醇发酵产酸；蔗糖、乳糖和甘露醇发酵不产酸。另外本菌株不能在45℃生长。ND12菌株在Luria-Bertani(LB)平板上于28℃下培养48小时的培养特征为圆形，不透明，中间突起，灰白色，中间略带橙色，边缘整齐。在以尼古丁为唯一碳氮源的培养基上培养48后不产生色素。
不动杆菌ND12(Acinetobacter sp.ND12)菌株的分子鉴定特征为：利用通用引物20F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1500R(5’-GGTTACCTTGTTACGA CT-3’)，以不动杆菌ND12的基因组DNA作为模板扩增得到1500bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的ND12菌株的部分16S rRNA基因序列1435bp，该序列已经递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列索引号为：GU176412。
本发明提供了一种不动杆菌的生物制剂，该制剂按常规方法制备，即将不动杆菌ND12(Acinetobacter sp.ND12)扩大发酵培养后得到。
B.本发明提供了一种所述微生物不动杆菌在烟草生产中的应用，即该不动杆菌作为降低烟草中尼古丁含量的生物催化剂应用。其具体作法如下：
利用发酵培养基制备1000mL的发酵液，8000rpm离心15min收集菌体，把菌体用灭菌的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)进行悬浮洗涤，并用磷酸盐缓冲液调整菌体浓度OD值为0.5，该菌悬液即为用于降解尼古丁的菌制剂。称取2g烟叶，喷洒5ml菌制剂，置于28℃恒温恒湿培养箱中12-24小时。烟叶中的90％烟碱即可被有效降解。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
1.试验数据表明，不动杆菌制剂能有效降低烟叶中尼古丁的含量。本发明成功地将生物技术引入烟草生产中，是烟草生产技术的一个重要突破；
2.通过调整烟叶原料的尼古丁含量，大大提高烟叶可用性；分解烟尘中的尼古丁，减少了对环境的污染；
3.工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，对促进卷烟工业健康发展具有积极意义。
附图说明
图1为不动杆菌ND12耐受尼古丁浓度试验结果；
图2为不动杆菌ND12降解尼古丁的生长曲线；
图3为不动杆菌ND12降解烟叶中尼古丁的降解曲线。
保藏生物材料的说明
本发明的菌株，已于2009年11月5日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCG)；该中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株分类命名为Acinetobacter sp.ND12，保藏编号为CGMCC No.3410。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
——不动杆菌ND12制剂的降解保山红大C3F烟叶中尼古丁试验
(一)不动杆菌ND12(Acinetobacter sp.ND12)的培养方法
1)试管斜面培养
采用Luria-Bertani(LB)培养基，配方为：10克蛋白胨，10克氯化钠，5克酵母提取物，20克琼脂，蒸馏水定容到1000毫升。121℃灭菌25分钟，摆成斜面。接种Acinetobacter sp.ND12，28℃培养24小时，获得试管种。
2)液体扩大培养
A.种子培养(LB培养基)，配方为(克/升，g/v)：10克蛋白胨，10克氯化钠，5克酵母提取物，蒸馏水定容到1000毫升。121℃灭菌25分钟。接种Acinetobacter sp.ND12试管种，28℃培养12小时，获得液体菌种。
B.发酵培养基，配方为(克/升，g/v)：1克尼古丁，0.26克磷酸氢二钾，0.8克磷酸二氢钾，0.41克硫酸镁，0.1克硫酸钙，0.0039克钼酸钠，0.005克硫酸亚铁，0.3克硫酸铵，蒸馏水定容到1000毫升，pH 7.0。培养基初始pH 7.0，接种量1％(体积百分比，v/v)，转速150rpm，温度28℃。发酵培养24小时。
(二)不动杆菌ND12(Acinetobacter sp.ND12)耐受尼古丁浓度试验
将培养12小时的液体菌种(OD600≈0.8)以1％(液体菌种体积百分比，v/v)的接种量接于尼古丁梯度的发酵培养基中，尼古丁的梯度为0g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L和4.5g/L，转速150rpm，温度28℃，培养48小时离心收集菌体，用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤三次后用等体积缓冲液重悬并测定菌体浓度(OD600)(图1)。
由图1的试验结果可见：不动杆菌ND12菌株在本试验条件下，最适生长的尼古丁浓度为2.5g/L，最高尼古丁耐受浓度为3.5g/L。
(三)不动杆菌ND12(Acinetobacter sp.ND12)的尼古丁降解曲线
将培养12小时的液体菌种(OD600≈0.8)以1％(液体菌种体积百分比，v/v)的接种量接于发酵培养基中，接种量1％，转速150rpm，温度28℃，每隔2小时取菌液，用高效液相测定尼古丁含量，并测定菌体的浓度(OD600)(图2)。
由图2的试验结果可见：随着不动杆菌ND12菌株在培养液中的OD值增加，尼古丁的浓度逐渐下降。当发酵时间为14小时，尼古丁基本被完全降解。在本试验条件下，尼古丁减少和菌体浓度的增加保持一致，0～6小时为其延滞期，6～14小时为指数生长期，到16小时尼古丁降解完毕细菌生长进入稳定期。
(四)不动杆菌ND12(Acinetobacter sp.ND12)降解尼古丁菌制剂的制备
利用发酵培养基制备1000mL的发酵液，8000rpm离心15min收集菌体，把菌体用灭菌的缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0)进行悬浮洗涤，8000rpm离心15min收集菌体，重复两次，菌体细胞最后用磷酸盐缓冲液进行悬浮，并调整菌体浓度OD值为0.5，该菌悬液即为用于降解尼古丁的菌制剂。
(五)不动杆菌ND12(Acinetobacter sp.ND12)制剂的降解烟叶中尼古丁试验
分别称取2g保山红大C3F烟叶，喷洒5ml菌制剂(OD为0.5)，三个重复，反应体系为30ml的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，以未喷洒菌制剂的烟叶作为对照，置于28℃、150rpm摇床培养，每隔2h小时取样一次，12000rpm离心5min，上清稀释2倍后用过滤器(45微米)过滤，最后用HPLC对烟碱进行定量检测，而后还原为未稀释时的烟碱浓度作出降解曲线(图3)。
由图3可得出结论：在本试验的条件下，ND12菌株降解烟叶中尼古丁的效果明显，可以在11h内在液体反应液中降解C3F烟叶中90％的烟碱。同时，对照组烟碱含量基本保持不变。因此，菌株ND12的菌制剂在烟草醇化，降解高浓度烟碱含量的烟草废弃物中都有潜在的应用价值。
实施例2
——不动杆菌制剂用于降低烟叶K326中尼古丁含量
1)不动杆菌制剂的制备：不动杆菌的液体和固体培养，降解尼古丁菌制剂的制备方法同实施例1.
2)不动杆菌制剂用于降低烟叶K326中尼古丁含量
称取2g烟叶K326，喷洒5ml菌制剂，置于28℃恒温恒湿培养箱中12-24小时。烟叶中的90％烟碱即可被有效降解。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。