一种蛹虫草菌种的培养方法 【技术领域】
本发明属于蛹虫草栽培技术领域，涉及一种蛹虫草菌种筛选和复壮的方法。背景技术 蛹虫草 Cordyceps militaris(L.ex Fr)Link，又名北冬虫夏草、北虫草，寄生在鳞 翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫蛹体上。 生长在低海拔的平原地域，主要分布在东北、华 北、西北等地。 现代研究表明，蛹虫草含有虫草素 (3’ - 脱氧腺苷 )、虫草酸 (D- 甘露 醇 )、腺苷、虫草多糖、麦角甾醇、超氧化物歧化酶 (SOD)、硒 (Se) 等化学成分。 具有 提高人体免疫功能、抗癌、抗菌、抗疲劳、抗衰老、抗惊厥、耐缺氧、镇静、壮阳固肾 等作用。 同时还具有减肥、瘦身、美容等功效。
蛹虫草与冬虫夏草 Cordyceps sicinese 为同属真菌，其化学成分和药理作用基本 相同，临床上常将蛹虫草作为冬虫夏草的替代品入药。 随着对虫草认识不断深入，不仅 国内市场对虫草的需求日趋扩大，而且东南亚、日本、美国等国际市场的需求量也在增 加。
由于自然资源的限制，市场上冬虫夏草供不应求，而且冬虫夏草已列入国家一 级保护，禁止采挖。 蛹虫草虽然在自然界的分布区域较广，但数量稀少，自然资源非常 匮乏，远不能满足人们的需求。
在实际的蛹虫草规模化生产的菌种分离和筛选过程中，最常采用的是组织分离 法。 组织分离法就是指通过子实体组织分离获得纯菌丝的方法。 食用菌的子实体实际上 就是菌丝体的纽结物，它具有很强的再生能力。 因此，只要切取一小块子实体组织，把 它移植到培养基上，就能获取纯粹的菌丝体。
组织分离培养，从生物学的角度来看，乃是一种无性繁殖，是从组织 - 菌丝 - 组 织 - 菌丝周而复始的循环过程，遗传变异小，但在无性繁殖过程中可能产生自然变异和 突变，但组织分离产生的变异不很大，是一种累积、渐进的过程，变异是绝对的，稳定 是相对的。
孢子分离法是利用食用菌成熟的有性孢子即担孢子、子囊孢子，无性孢子即厚 垣孢子、节孢子、粉孢子等萌发成菌丝，来获得纯菌种的一种方法。 由于孢子的数量 大，变异的机会多，因此采用孢子分离法，可以有更多选择优良菌株的机会，而且孢子 的生活力强，所得菌种菌龄小，生活力旺盛。 但是有些食用菌的担孢子不易萌发成菌 丝，还有些食用菌的孢子有两种或四种极性，单孢分离的菌株有时不产生子实体，必须 经过交配，得到结实性的双核菌丝，才能用于产生。 故孢子分离法又有单孢分离法和多 孢分离法两种。
多孢分离法就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发，自由交配来获 得食用菌纯菌种一种方法。 多孢分离实际上是多孢子间布朗运动、随机重组的结果，孢 子是食用菌生活史中最年轻的起点。 因此既可能孕育高产基因，也可能产生劣质组合。
因孢子在形成时，经减数分裂后，会发生基因的分离和重组，孢子基因类型众
多。 孢子萌发后，各种能亲和的菌丝发生交配，形成多种有差异的双核菌丝类型，在遗 传特性上与原来母体不相同。 因此，多孢分离得到的菌丝体是杂混的基因群体，不同于 亲本，并有多种基因类型，从而不是一种纯菌种，多孢分离种可能产生生产性能最好的 新组合。 发明内容 本发明的目的是提供一种蛹虫草菌种的培养方法，该方法采用多孢子分离法， 周期短、操作简单可获得优良重组菌株。
本发明是利用多孢子分离法通过液体摇瓶震荡增殖过程中进行菌丝交配，然后 进行静止培养获得生产性能好的高产子实体，并通过组织分离法保留高产菌种的优良生 产性状。
为了实现本发明目的，本发明的一种蛹虫草菌种的培养方法，其包括如下步 骤：
1) 多孢的获得
将蛹虫草无性阶段的分生孢子和 / 或蛹虫草有性阶段子实体形成的子囊孢子作 为培养的蛹虫草多孢 ；
2) 多孢的增殖培养
采 用 PDA 液 体 培 养 基 对 多 孢 进 行 震 荡 培 养， 培 养 温 度 16-25 ℃， 转 速 100-140rpm，避光培养 120-240 小时，得多孢菌丝球 ；
3) 菌丝球的破碎
将多孢菌丝球在均质机中转速 1000-20000rpm 下粉碎处理 5-20min ；
4) 静止液体培养
然后将粉碎后的菌种接入到静止液体培养基中，摇匀后静止培养 20-45 天 ；
5) 优良菌种的获得
当液体培养基表面出现子实体时，通过组织分离的方式获得优良菌株。
其中，步骤 1) 中，所述蛹虫草无性阶段的分生孢子的获得 ：采用退化或新分离 获得的蛹虫草斜面或平板，光照培养，使斜面或平板菌落形成大量分生孢子。
获得的分生孢子可用无菌水洗涤，并进行收集。
光照采用自然光和日光灯照射均可，光照强度必须超过 300 勒克司，温度保持 在 16-25℃，照射时间以表面气生菌丝塌陷，大量形成分生孢子为准。
步骤 1) 中，所述蛹虫草有性阶段子实体形成子囊孢子的过程 ：在无菌下，将成 熟的子实体中子囊果丰富的部分切割，然后在室温的条件下放置 10-15 天，收集弹射出 的成熟的子囊孢子。
为了获得新的株系，无论是分生孢子或者是子囊孢子，不但可以通过同一来源 的多孢进行培养，也可以通过不同来源的多孢混合进行联合培养，即可将不同来源的分 生孢子或不同株系子实体形成的子囊孢子进行混合培养。
步骤 3) 中菌丝球的破碎可采用内切式均质机，需在 121℃，灭菌 20-30min，然 后将均质头插入 PDA 液体培养基内进行旋转破碎。
步骤 4) 中所述静止液体培养采用暗培养和光培养两个阶段进行。 一般是先进行
暗培养，再进行光培养。
所述暗培养的条件为避光培养，温度为 16-22℃，培养 4-6 天。
所述光培养的条件为光照强度为 50-300 勒克司，培养温度为 16-25 ℃，培养 35-45 天。
所述静止液体培养基由如下方法制成 ：由黄豆 2-5 ％、葡萄糖 1-2 ％、奶粉 2-8％、磷酸二氢钾 0.01-0.02％、硫酸镁 0.01-0.015％、维生素 B10.001-0.002％配成营养 液，调整 pH 在 5.6-7.2，然后培养液与大米按照 1-3 ∶ 1 的重量比混合，浸泡 20-30min 后打浆，再按照 1 ∶ 5-10 比例加水稀释，灭菌。
所述灭菌可采用在 121℃，灭菌 20min。
由于本发明的子实体生产阶段中的主要原料是大米，大米不但起了栽培支撑物 的作用，而且大米淀粉是子实体生产过程中最主要的碳源。 氮源的选择要按照子实体 培养基中氮源的种类进行选择。 本发明利用大米淀粉作为液体培养基碳源，在摇瓶阶段 诱导出利用大米淀粉的酶系，从而提高菌种的适应性，缩短了栽培周期，提高了生产效 率。
本发明利用蛹虫草分离物平板培养过程中形成的无性分生孢子或子实体上的子 囊孢子，在液体摇瓶培养基进行震荡培养，无性孢子萌发，菌丝增殖过程中可进行自由 交配，当菌丝球数量增殖到一定量时，破碎菌丝球并补充营养，然后静止培养，从静止 的液体摇瓶培养基表面形成的菌膜中形成的表现优良的子实体中进行组织分离，获得生 产性能优良的蛹虫草菌株。
对于多孢分离实际上是多孢子间布朗运动、随机重组的结果，多孢液体摇瓶培 养创造了这样的随机重组机会，菌丝球的破碎、增殖过程又一次增加的随机重组的机 会，本发明的方法能够在最短的时间内获得优良重组菌株，其具有周期短、操作简单， 重组获得生产性能最好的新组合的几率高等优点。 具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例 1
实验菌株 ：采用蛹虫草菌株 ( 购自中科院微生物所 )。
(1) 多孢的来源及获得方法 ：
采用新分离获得的蛹虫草斜平板，在光照强度超过 300 勒克司下，温度保持在 23℃，照射时间以表面气生菌丝塌陷，大量形成分生孢子为准。 然后用无菌水洗涤，合 并收集到灭菌过的容器内获得混合分生孢子。
(2) 多孢的摇瓶增殖培养 ：
将上述步骤获得的多孢分离物采用 PDA 液体培养基在三角瓶中对多孢进行增殖 培养，培养温度 22℃，转速 140rpm，避光培养。 当经过 120 小时的震荡培养，菌丝球充 满整个液体培养基，停止培养。
(3) 菌丝球的破碎 ：
将内切式均质机的均质头 121℃，20min 灭菌。 将内切式均质机放置在超净工作 台中，在超净工作台中将灭菌后的均质头安装好，在超净工作台中打开三角摇瓶的棉塞或封口膜，将均质头插入液体培养基内，转速 15000rpm，处理 5min。
(4) 静止液体培养 ：
静止液体培养基的制备 ：营养液 ( 黄豆 20g、葡萄糖 10g、奶粉 20g、磷酸二氢 钾 0.2g、硫酸镁 0.1g、维生素 B110mg 1000ml 的比例配成营养液，调整 pH 在 5.8) 与大米 按照 1.8 ∶ 1 的重量比与大米混合，浸泡 20min 后用打浆机打浆，然后按照 1 ∶ 5 比例加 水稀释，分装到 500ml 三角瓶，每瓶装量 200ml，然后 121℃，20min 灭菌。
将粉碎后的菌种 20ml 接入到灭菌冷却后的静止液体培养基中，摇匀后静止培 养。
静止液体培养 ：同样模拟蛹虫草子实体生产的过程分为暗培养和光培养两个阶 段。 暗培养条件 ：避光培养，温度为 18℃，5 天。 光培养条件 ：光照强度为 50-300 勒 克司。 温度为 22℃，40 天。
(5) 优良菌种的获得 ：
通过 40 天的静止培养，当液体培养基表面出现子实体时，从中选择条形整齐、 颜色橙黄或橙红、个体高大粗壮的子实体进行组织分离即可获得新菌株。
实施例 2 实验菌株 ：采用蛹虫草菌株 ( 购自中科院微生物所 )。
(1) 多孢的来源及获得方法 ：
蛹虫草有性阶段子实体形成的子囊孢子 ：选取成熟的子实体经过无菌操作将子 囊果丰富的部分用剪刀切割后放入灭菌过的培养皿中，大约收集 5-10 条后，用大头针将 其固定在灭过菌的三角瓶的棉塞上，最后将固定了子实体的棉塞仍然塞入三角瓶中。 在 室温的条件下放置 10-15 天，成熟的子囊孢子弹射在空的三角瓶内。
(2) 多孢的摇瓶增殖培养 ：
将上述步骤获得的子囊孢子采用 PDA 液体培养基在三角瓶中对多孢进行增殖培 养，培养温度 16℃，转速 100rpm，避光培养。 当经过 240 小时的震荡培养，菌丝球充满 整个液体培养基，停止培养。
(3) 菌丝球的破碎 ：
将内切式均质机的均质头 121℃，20min 灭菌。 将内切式均质机放置在超净工作 台中，在超净工作台中将灭菌后的均质头安装好，在超净工作台中打开三角摇瓶的棉塞 或封口膜，将均质头插入液体培养基内，转速 1000rpm，处理 20min。
(4) 静止液体培养 ：
静止液体培养基的制备 ：营养液 ( 黄豆 50g、葡萄糖 15g、奶粉 80g、磷酸二氢 钾 0.1g、硫酸镁 0.15g、维生素 B115mg 1000ml 的比例配成营养液，调整 pH 在 7.2) 与大 米按照 3 ∶ 1 的重量比与大米混合，浸泡 30min 后用打浆机打浆，然后按照 1 ∶ 8 比例加 水稀释，分装到 500ml 三角瓶，每瓶装量 200ml，然后 121℃，20min 灭菌。
将粉碎后的菌种 20ml 接入到灭菌冷却后的静止液体培养基中，摇匀后静止培 养。
静止液体培养 ：同样模拟蛹虫草子实体生产的过程分为暗培养和光培养两个阶 段。 暗培养条件 ：避光培养，温度为 16℃，6 天。 光培养条件 ：光照强度为 50-300 勒 克司。 温度为 25℃。 45 天。
(5) 优良菌种的获得 ：
通过 45 天的静止培养，当液体培养基表面出现子实体时，从中选择条形整齐、 颜色橙黄或橙红、个体高大粗壮的子实体进行组织分离即可获得新菌株。
实施例 3
实验菌株 ：采用蛹虫草菌株 ( 购自中科院微生物所 )。
(1) 多孢的来源及获得方法 ：
采用新分离获得的蛹虫草斜平板，在光照强度超过 300 勒克司下，温度保持在 25℃，照射时间以表面气生菌丝塌陷，大量形成分生孢子为准。 然后用无菌水洗涤，合 并收集到灭菌过的容器内获得混合分生孢子。
(2) 多孢的摇瓶增殖培养 ：
将上述步骤获得的多孢分离物采用 PDA 液体培养基在三角瓶中对多孢进行增殖 培养，培养温度 25℃，转速 120rpm，避光培养。 当经过 160 小时的震荡培养，菌丝球充 满整个液体培养基，停止培养。
(3) 菌丝球的破碎 ：
将内切式均质机的均质头 121℃，20min 灭菌。 将内切式均质机放置在超净工作 台中，在超净工作台中将灭菌后的均质头安装好，在超净工作台中打开三角摇瓶的棉塞 或封口膜，将均质头插入液体培养基内，转速 20000rpm，处理 5min。 (4) 静止液体培养 ：
静止液体培养基的制备 ：营养液 ( 黄豆 40g、葡萄糖 20g、奶粉 20g、磷酸二氢 钾 0.15g、硫酸镁 0.1g、维生素 B120mg 1000ml 的比例配成营养液，调整 pH 在 5.6) 与大 米按照 1 ∶ 1 的重量比与大米混合，浸泡 25min 后用打浆机打浆，然后按照 1 ∶ 10 比例 加水稀释，分装到 500ml 三角瓶，每瓶装量 200ml，然后 121℃，20min 灭菌。
将粉碎后的菌种 20ml 接入到灭菌冷却后的静止液体培养基中，摇匀后静止培 养。
静止液体培养 ：同样模拟蛹虫草子实体生产的过程分为暗培养和光培养两个阶 段。 暗培养条件 ：避光培养，温度为 22℃，4 天。 光培养条件 ：光照强度为 50-300 勒 克司。 温度为 16℃。 40 天。
(5) 优良菌种的获得 ：
通过 44 天的静止培养，当液体培养基表面出现子实体时，从中选择条形整齐、 颜色橙黄或橙红、个体高大粗壮的子实体进行组织分离即可获得新菌株。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但 在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。 因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保 护的范围。
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