日本血吸虫蛋白质及其应用 【技术领域】
本发明涉及生物工程技术领域， 尤其涉及一种日本血吸虫蛋白质及其应用。背景技术 血吸虫病是一种人和动物都会受传染的寄生虫病， 血吸虫发育的不同阶段， 尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵均可对宿主引起不同的损害和复杂的免疫病理反应， 流行范围广， 对人和 家畜均产生严重危害。目前， 主要采用药物， 例如吡喹酮， 对已经感染血吸虫病的人或动物 进行治疗， 但是这不能解决再次感染的问题。 要想更有效的防治血吸虫病， 比较可行的措施 是采用疫苗与药物治疗相结合的方式。因此， 寻找新的疫苗候选抗原仍是当今血吸虫疫苗 研究的重点之一。
UDP- 葡萄糖 -4- 差向异构酶 (UDP-glucose-4-epimerase， GALE) 主要参与半乳糖 代谢途径， 可以催化 UDP- 葡萄糖和 UDP- 半乳糖的可逆反应， 其重要性在于真核生物可以利 用 UDP- 葡萄糖来合成海藻糖、 蔗糖、 肝醣等多种糖类， 为生物体的生长代谢提供能量供应。
SjGALE 是日本血吸虫中编码 UDP- 葡萄糖 -4- 差向异构酶的基因， 目前尚没有关于 该基因及其表达的蛋白质作为日本血吸虫疫苗的相关报道。
发明内容 本发明要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫蛋白质， 该蛋白质包含 UDP- 葡 萄糖 -4- 差向异构酶的部分氨基酸序列， 具有免疫原性， 可作为抗血吸虫的疫苗候选抗原。
此外， 还需要提供一种日本血吸虫蛋白质在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的 应用。
为了解决上述技术问题， 本发明通过如下技术方案实现 ：
在本发明的一个方面， 提供了一种日本血吸虫蛋白质， 所述蛋白质具有免疫原性， 且包含 SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列。
在本发明的另一方面， 提供了一种编码上述日本血吸虫蛋白质的核苷酸序列。优 选的， 所述核苷酸序列为 SEQ ID NO ： 2 所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面， 还提供了一种抗血吸虫疫苗， 该疫苗包含上述日本血吸虫 蛋白质。
在本发明的另一方面， 还提供了一种能与上述日本血吸虫蛋白质特异性结合的抗 体。
在本发明的另一方面， 还提供了一种包含上述核苷酸序列的重组载体。
在本发明的另一方面， 还提供了一种宿主细胞， 包含上述重组载体， 或已用上述核 苷酸序列转化或转染。
在本发明的另一方面， 还提供了上述日本血吸虫蛋白质在制备预防或治疗血吸虫 病的疫苗中的应用。
在本发明的另一方面， 还提供了上述日本血吸虫蛋白质在制备诊断血吸虫病的产
品中的应用。
本发明具有免疫原性的日本血吸虫蛋白质可以作为诊断抗原对血吸虫病畜进行 诊断。
在本发明的另一方面， 还提供了上述日本血吸虫核苷酸序列在制备预防或治疗血 吸虫病的疫苗中的应用。
本发明日本血吸虫蛋白质， 在小鼠免疫保护性实验中， 使免疫组小鼠的减虫率与 肝脏减卵率分别达到 35.7％和 53％ ( 与佐剂对照组相比 )， 表明本发明具有免疫原性的日 本血吸虫蛋白质对血吸虫病有良好的免疫预防效果， 能有效降低宿主体内虫体数目， 更重 要的是肝脏内虫卵数目的减少可以大大降低宿主肝脏的病理反应。 附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图 1 是本发明实施例 1 重组蛋白质表达与纯化 SDS-PAGE 电泳图 ；
图 2 是本发明实施例 2 重组蛋白质免疫原性 Western blot 检测结果图 ；
图 3 是本发明实施例 4 免疫动物血清特异性抗体水平检测结果图 ；
图 4 是本发明实施例 5 产生保护性的免疫反应类型分析图。具体实施方式
下列实施例中， 未注明具体条件的实验方法， 通常按常规条件， 如 《分子克隆实验 指南》 (J. 萨姆布鲁克， D.W. 拉塞尔著， 黄培堂， 汪嘉玺， 朱厚础， 等译 . 第 3 版， 北京 ： 科学 出版社， 2002) 中所述的方法进行。
本发明对日本血吸虫 UDP- 葡萄糖 -4- 差向异构酶基因 (SjGALE) 编码的蛋白质进 行重组表达和纯化， 并将重组蛋白质进行免疫保护性实验， 验证其对宿主的免疫保护效果， 为开发抗血吸虫新疫苗和药物提供候选抗原分子。
实施例 1rSjGALE 重组蛋白质的表达和纯化
将日本血吸虫 UDP- 葡萄糖 -4- 差向异构酶基因 (SjGALE) 的编码序列 (SEQ ID NO ： 2) 插入原核表达载体 pET28a(+) 的多克隆酶切位点， 构建成 pET28a-SjGALE 重组表达载体， 该重组表达载体经测序鉴定正确后进行下面的表达和纯化步骤。
1. 重组蛋白质的原核表达
1) 取含有重组质粒单克隆菌落接种于含有相应抗生素的 LB 培养液中， 37℃振荡 培养过夜。
2)37℃振荡培养至 OD600 达 0.4-0.6， 加入 IPTG 至终浓度为 1mM 进行诱导表达。
3) 分别收集诱导前及诱导后的菌液， 用 SDS-PAGE 电泳分析验证， 结果如图 1 所 示， 在图 1 中， M： 蛋白质分子量标准 ； 1-5 标注的泳道依次分别是 ： 大肠杆菌诱导前裂解 物， IPTG 诱导蛋白表达后菌体裂解物， 诱导表达的菌体裂解后上清， 诱导表达的菌体裂解 后沉淀， 过柱纯化的融合蛋白。约 39KD 大小的条带为目的蛋白 ( 日本血吸虫 UDP- 葡萄 糖 -4- 差向异构酶基因所编码的蛋白质氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 重组载体表达出 的产物为包含部分载体序列 6 个组氨酸标签和 SEQ ID NO ： 1 所示氨基酸序列的重组蛋白质 rSjGALE)。2. 可溶性蛋白的纯化
1) 加有树脂的 His 结合层析柱， 依次用 3 倍柱床体积的无菌去离子水， 5 倍柱床体 积的 1× 离子化缓冲液 (Charge buffer)， 3 倍体积的 1× 结合缓冲液洗涤柱子。
2) 将蛋白上柱。
3) 用 10 倍柱床体积的 1× 结合缓冲液平衡柱子。
4) 用 6 倍柱床体积的 1× 冲洗缓冲液洗涤。
5) 用 6 倍柱床体积的 1× 洗提缓冲液洗脱目的蛋白。
6) 用 6 倍柱床体积的 1× 洗脱缓冲液洗涤柱子， 用 20％的酒精保存树脂。
7)SDS-PAGE 检测纯化的蛋白。
结果如图 1 所示， 表达的重组蛋白得到了纯化 ( 见图 1 第 “5” 泳道箭头所指的条 带 )， 且纯度较高。
实施例 2 重组蛋白质的免疫原性检测
1) 将表达纯化后的重组蛋白质跑 SDS-PAGE 电泳。
2) 剪与胶块同样大小硝酸纤维素膜和六层滤纸， 并将硝酸纤维素膜和滤纸放入缓 冲液中侵泡 ； 负极向正极依次放置三层滤纸、 凝胶、 硝酸纤维素膜、 三层滤纸 ； 在槽中加满 转移缓冲液和冰袋， 280mA， 转移 2h ；
3) 电泳转移结束后， 将转移好的硝酸纤维素膜放入 3％牛血清白蛋白中 4℃封闭 过夜 ；
4) 弃去封闭液， 用 TBST 洗三次， 每次 10min ；
5) 加入 1 ∶ 200 稀释的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原抗体 ( 实验室保存 ) 作为一 抗， 室温孵育 1h ；
6)TBST 洗三次， 每次 10min ；
7) 加入 1 ∶ 5000 稀释的 HRP 标记的羊抗兔抗体， 室温孵育 1h ；
8)TBST 洗三次， 每次 10min ；
9) 把滤膜放入增强型 DAB 底物显色液中显色， 室温下轻摇， 蛋白条带的颜色深度 达到要求后， 立即用水漂洗， 拍照、 记录实验结果。
Western blot 检测结果如图 2 所示， 在图 2 中， M： 蛋白质分子量标准 ； 1： rSjGALE 重组蛋白质。由图 2 可知， rSjGALE 重组蛋白质具有免疫原性。
实施例 3 免疫保护性实验
1. 动物免疫实验
1)BalB/C 鼠， 随机分为 2 组， 每组 10 只。
2) 用日本血吸虫 SjGALE 部分氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1) 的重组蛋白质 rSjGALE 进行免疫保护试验， 同时设佐剂对照组。
3) 实验每只小鼠注射 50μg 重组蛋白质与等体积的弗氏完全 / 不完全佐剂的混合 物， 佐剂对照组注射 PBS 与佐剂混合物。
每隔两周免疫一次， 共免疫三次， 免疫前和每次免疫两周后分别眼眶脉采血， 分离 血清 -20℃保存。
4) 三免后两周， 以每鼠 30 条尾蚴腹部皮肤贴片攻击感染。
5) 攻击 42d 后， 肝门静脉灌注冲虫， 计数虫体数目和肝脏虫卵数。2. 减虫率计算 统计各组虫体数目， 计算减虫率 ：3. 肝脏虫卵计数
1) 分别称取每组每只 BalB/C 鼠肝脏的重量 ；
2) 将每只肝脏加入 5mL PBS， 匀质机充分匀浆 ；
3) 再加入 5mL 10％ NaOH， 56℃消化 30min ；
4) 将消化好的肝脏匀浆充分混匀， 每组适度稀释充分混匀， 解剖镜下计数肝脏虫 卵数， 每只三次重复 ；
5) 计算肝脏平均卵荷数 (EPG)， 肝脏平均卵荷数 EPG ＝每次镜检体积的肝脏平均 虫卵数目 × 肝脏总体积 / 肝脏总重量， 并计算每组的肝脏减卵率，
减虫减卵效果如表 1 所示， 从表 1 的统计数据可知， 与对照组相比， rSjGALE 重组 蛋白质减虫率达到 35.7％， 肝脏减卵率达到 53％， 每条雌虫在肝脏得荷卵率降低 54.9％， 与对照组相比具有统计学上的显著差异。
表 1 免疫保护实验中各组的减虫率和肝脏减卵率
与佐剂对照组相比具有统计学差异 *(p ＜ 0.05)， **(p ＜ 0.01)
实施例 4 血清特异性抗体水平检测
将实施例 3 动物免疫实验中采集分离所得的血清进行特异性抗体水平检测， 具体 步骤如下 ：
1) 以 rSjGALE 蛋白质包被 ELISA 板， 4℃过夜 ；
2) 弃去包被液， TBST 清洗 3 次， 每次 5min ；
3) 以 PBS 配制 3％ BSA， 每孔 100μL 37℃封闭 1h ；
4) 弃去封闭液， TBST 清洗 3 次， 每次 5min ；
5) 将收集的血清用 TBS 以 1 ∶ 100 稀释， 每孔 100μL 37℃孵育 1h ；
6) 弃去一抗， TBST 清洗 3 次， 每次 5min ；
7) 将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗， 用 TBST 以 1 ∶ 2000 稀释， 充分混匀后， 每孔 100μL 37℃孵育 1h ；
8) 倾去二抗， TBST 清洗 3 次， 每次 5min ；
9) 每孔加入 100μL 可溶性 TMB 底物显色液 37℃显色 20min ；
10)2M H2SO4 50μL/ 孔终止 ；
11) 用酶标仪在 450nm 处读取吸光值。
结果如图 3 所示， 由图 3 可知， 小鼠在经重组 SjGALE 蛋白质一免后抗 rSjGALE 抗 体水平迅速升高， 三免后稳定在一个较高的水平， 与对照组相比， 具有显著差异。
实施例 5 产生保护作用的免疫类型分析
对实施例 3 免疫保护实验中产生的保护作用进行免疫类型分析。
1. 脾细胞培养
1) 取出三免 10 天后的小鼠脾脏， 并用无菌的 PBS 溶液清洗两次 ；
2) 洗净后脾脏放入尼龙网中剪碎， 放入约 10ml EZ-sep 小鼠 1× 淋巴细胞分离液 的培养皿中用注射器活塞进行研磨 ；
3) 收集分离液至离心管中， 加入 1ml 1640 培养液， 800g， 常温离心 30min。 4) 小心吸出悬浮在 1640 培养液和 EZ-Sep 分离液之间的淋巴细胞层， 加入 10mL 1640 培养基洗涤， 250g 离心 10min。
5) 倾倒上清液， 加入含 10％胎牛血清的 1640 培养液 10ml 悬浮淋巴细胞， 细胞计 数。
6) 在 1640 培养基中加入 10％的 FBS， 100U/ml 的青链霉素配置成完全培养基， 细 6 胞 1×10 / 孔养在完全培养基中， 然后用本发明重组蛋白质 10ug/ml 对细胞进行刺激， 另设 空白组刺激组， 置 37℃， 5％ CO2 培养箱中培养。
7) 培养 48h 后收集重组蛋白质刺激组的上清做 IL-4 和 TNF-α 细胞因子检测。培 养 72h 后刺激组的上清做 IL-10 和 IFN-γ 细胞因子检测。
2. 细胞因子检测
按照 Duoset ELISA kit(R&Diagnostic) 操作说明， 采用间接 ELISA 方法测定受 rSjGALE 重组蛋白质刺激后脾细胞分泌 IL-4、 TNF-α、 IL-10、 IFN-γ 各细胞因子水平。
结果如图 4 所示， 细胞因子 TNF-α， IFN-γ 和 IL-10 与空白组差异显著 ( 图 4A、 B、 C)(P ＜ 0.01， 用 * 表示 )， IL-4 与空白组相比没有显著性差异 ( 图 4D)。IFN-γ 是 Th1 型免疫反应的标志， 可以说明本发明 rSjGALE 重组蛋白质免疫动物后可以介导 Th1 免疫反 应， 而该免疫反应类型能够减少小鼠对血吸虫的感染， 并降低宿主肝脏的病理变化， 这一结 果与实施例 3 的免疫保护结果相吻合， 从而证明 rSjGALE 重组蛋白质具有保护性免疫效果 主要是由于其介导宿主产生了 Th1 型免疫反应。
从上述实验结果可以得出， rSjGALE 重组蛋白质具有很好的免疫原性， 该重组蛋白 包含日本血吸虫 UDP- 葡萄糖 -4- 差向异构酶基因蛋白编码序列的大部分氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1)、 以及 6 个组氨酸构成的载体序列， 由于该 rSjGALE 重组蛋白质含有的载体序列非 常小， 不会对整个重组蛋白质的免疫原性起作用， 也不会影响 SEQ ID NO ： 1 序列的免疫原 性， 该 6 个组氨酸的载体序列是便于表达产物的纯化。优选的， 编码该 SEQ ID NO ： 1 所示氨 基酸序列的核苷酸序列为 SEQ ID NO ： 2 所示序列， 该 SEQ ID NO ： 2 核苷酸序列为日本血吸
虫 SJCHGC06074 基因中的一段序列。用本发明 rSjGALE 重组蛋白质免疫小鼠后， 能够产生 高效价的 IgG， 并能介导宿主产生 Th1 型保护性免疫反应， 与对照组相比， 虫体数目和肝脏 虫卵数目分别减少了 35.7％和 53％， 尤其是肝脏虫卵数目减少明显， 减轻了宿主肝脏的病 变， 对宿主的免疫保护效果明显， 是一种很好的疫苗候选分子。
因此， 本发明克隆表达的 rSjGALE 重组蛋白质具有很好的免疫原性， 非常适于研 制抗血吸虫的新疫苗。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保护范 围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所
<120> 日本血吸虫蛋白质及其应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1 <211>344 <212>PRT <213>Schistosoma japonicum <400>1 Met Gln Lys Gly Asp Lys Gly 1 5 Phe Ile Gly Ser His Thr Ile 20 Val Ile Ile Leu Asp Asn Leu 35 Arg Ile Glu Glu Ile Ile Asn 50 55 Leu Leu Asp Ile Asn Ser Val 65 70 Asp Tyr Val Ile His Phe Ala 85 Gln His Pro Leu Asp Tyr Tyr 100 Leu Leu Lys Val Met Met Ala 115 Ser Ser Ala Thr Ile Tyr Gly 130 135 Lys His Pro Ile Gly Asn CysLeu Val Leu 10 Val Glu Leu 25 Ser Asn Ser 40 Gln Lys Leu Asn Asp Val Ala Leu Lys 90 Asn Asn Asn 105 His Asn Val 120 Glu Pro Gln Gln Asn Pro8Val Thr Gly Gly Ser 15 Val Asn Asp Gly Tyr 30 Asn Ile Lys Cys Ile 45 Leu Phe Tyr Glu Thr 60 Phe Ala Lys His Lys 75 Ser Val Ser Glu Ser 95 Val Leu Gly Ile Leu 110 Lys Asn Phe Val Leu 125 Phe Leu Pro Leu Thr 140 Tyr Gly Asn Thr LysGly Ser Glu Asn Phe 80 Thr Asn Ser Glu Leu102079783 A CN 102079786
说明书155 Leu Tyr Thr Ser Asp Pro 170 Asn Pro Val Gly Ala His 185 190 Gly Ile Pro Asn Asn Leu 205 Leu Arg Pro Tyr Val Asn 220 Gly Thr Gly Val Arg Asp 235 His Thr Lys Ser Leu Asp 250 Tyr Asn Leu Gly Thr Gly 265 270 Ala Met Glu Lys Ala Ser 285 Arg Arg Pro Gly Asp Cys 300 Glu Arg Glu Leu Gly Trp 315 Lys Asp Leu Trp Asn Trp 330 160 Thr Trp 175 Pro Ser Met Pro Val Tyr Tyr Ile 240 Lys Ile 255 Gln Gly Gly Lys Ala Thr Lys Ala 320 Gln Val 3357/8 页145 150 Cys Cys Glu Leu Ile Leu Lys Asp 165 Asn Ile Val Ser Leu Arg Tyr Phe 180 Gly Leu Ile Gly Glu Asp Pro Arg 195 200 Tyr Val Thr Gln Val Ala Ser Gly 210 215 Gly Asn Asp Tyr Gln Thr Val Asp 225 230 His Val Val Asp Leu Ala Glu Ala 245 Lys Glu Asn Cys Gly Phe Lys Val 260 Asn Ser Val Leu Gln Met Ile Leu 275 280 Thr Ile Pro Tyr Thr Ile Cys Pro 290 295 Val Tyr Ser Asp Ala Ser Leu Ala 305 310 Lys Tyr Asp Val Asp Lys Met Cys 325 Lys Asn Pro His Gly Tyr Leu Thr 340 <210>2 <211>1032 <212>DNA <213>Schistosoma japonicum <400>2 atgcagaaag gtgataaagg actcgtactg catacaatcg tagaactcgt caatgatggc aattcaaata taaaatgtat agaacgtatt tatgaaacaa acttgttgga tataaactct gattatgtta tacattttgc cgccttgaaa gattactata acaacaatgt tttgggtata aatgttaaaa attttgttct ctccagttct ccactcaccg aaaagcatcc cattggaaat tgttgtgaat taattctaaa ggatttatat9gtaaccggtg tattcagtta gaagaaatca gtgaatgatg tctgtatctg ctaaatttgt gctactatat tgtcaaaatc acatctgatcgctccggttt ttattctaga ttaatcaaaa tctttgcgaa agtcaacaca tgaaggtgat atggtgaacc cgtatggcaa ctacatggaatattggaagt taatttaagt attactcttc acataaattt acatcctctg gatggcacat acaatttttg tacaaaactt tattgtaagt60 120 180 240 300 360 420 480 ttacgatatt tcaatccagt ggaattccaa ataatttgat gtgaatgttt atggaaacga cacgttgttg atctggctga ggtttcaagg tttataattt gctatggaaa aagcaagtgg gattgtgcaa ctgtctattc aaatatgatg ttgacaaaat ggatatctta cttggtgcacat gccttatgta ttatcaaaca agcgcatact aggtacaggt taaaaccatt ggatgcatca gtgtaaagatcccagtggat taattggtga agatcctaga actcaggttg ccagtggttt gcggccttat gtggatggaa caggtgttcg agattatatt aagtcattgg ataaaatcaa agagaattgt caaggtaatt ctgtattaca aatgatccta ccttatacaa tttgcccaag acgacccggt ttggccgaac gagaattagg atggaaagcg ctatggaatt ggcaagtgaa aaatccccat600 660 720 780 840 900 960 1020 1032