鸡传染性支气管炎灭活疫苗及其制备方法.pdf

本发明涉及一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗及其制备方法，该灭活疫苗是吸附在壳聚糖微球上的灭活的鸡传染性支气管炎病毒，其制备方法主要包括以下步骤：病毒的繁殖及病毒液的收集；病毒液的浓缩、纯化、灭活；壳聚糖微球的制备；疫苗的配制。本发明的疫苗具有性能稳定、安全性好、动物免疫后产生免疫作用快、免疫力强、保护率高等特点。

1.  一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗，其特征在于：所述的疫苗包括吸附在佐剂上灭活的鸡传染性支气管炎病毒。

2.  根据权利要求1所述的一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗，其特征在于：所述佐剂为壳聚糖微球。

3.  根据权利要求2所述的一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗，其特征在于：所述的疫苗中，病毒液的浓度为1.08×10⁷EID₅₀/0.1ml，壳聚糖含量为500mg。

4.  根据权利要求1所述的一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗，其特征在于：所述的灭活是指使用灭活剂β丙内酯灭活病毒的过程，具体的灭活方法为用2％的HEPES1mol/L pH7.5和0.14g/l NaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.4～7.6，逐滴加入10％W/VBPL，使其最终浓度为0.025％。灭活24h后，将灭活的病毒液37℃水浴2小时即可。

5.  一种权利要求1所述的鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤
(1)病毒的繁殖及病毒液的收取；(2)病毒液的浓缩、纯化；(3)病毒的灭活；(4)佐剂的制备；(5)疫苗的配制。

6.  根据权利要求4所述的一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，病毒的繁殖温度为35-37℃；对收获的病毒液需进行检验，凡菌检为阴性，毒价≥10⁷EID₅₀/0.1mL，方可作为制备疫苗的抗原液。

7.  根据权利要求4所述的一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的浓缩是指用醋酸锌沉淀法浓缩病毒液，纯化是指用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化病毒液。

8.  根据权利要求4所述的一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的佐剂为壳聚糖微球，该壳聚糖微球的制备方法包括以下步骤
称取壳聚糖5g分散于188ml灭菌蒸馏水中，在磁力搅拌下，缓慢加入12ml 36％乙酸，继续搅拌10min，静置1h，用细铜纱网过滤除去不溶物待气泡消去即可用；在壳聚糖乙酸溶液中加入吐温-808ml，磁力搅拌下使其融解，再加入25％的戊二醛2.0ml，快速搅匀2min，反应温度为5～10℃，立即将壳聚糖溶液倒入高速搅拌的500ml液体石蜡中，经1.5h微球化后，倒人砂芯漏斗真空抽干，然后用石油醚洗涤3～5次，无菌蒸馏水洗涤3～5次，再次真空干燥得空白微球。

9.  根据权利要求4所述的一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(5)中疫苗配制时按1份壳聚糖微球中加入100ml制备好的灭活的鸡传染性支气管炎病毒，其中每份壳聚糖微球含壳聚糖500mg，病毒液的浓度为1.08×10⁷EID₅₀/0.1ml。

鸡传染性支气管炎灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗，同时还涉及该鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，属于禽类疫苗技术领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子带有囊膜和纤突，单股正链RNA病毒，病毒粒子形态为多形性，但大多数为球形，直径约为80～120nm。传染性支气管炎病毒接种鸡胚后，传至第十代左右的病毒可使80％的鸡胚死亡。
该病是目前严重危害世界养禽业的重大传染病之一，尚无特效疗法，所以采用接种疫苗是目前最有效的措施。由于传染性支气管炎病毒血清型复杂且相互之间交叉保护力弱，而且新的血清型和变异株不断出现，如果选择的疫苗不当，不但起不到预防的效果，而且还可能给当地增添新的病毒株。所以用疫苗前必须掌握当地疾病流行的病毒血清型，并使用与当地流行毒株抗原性一致的疫苗品系，这样才能达到有效的免疫预防目的。目前市场上还是主要以弱毒苗为主，但是弱毒苗存在一个最大的威胁就是容易产生散毒，且传染性支气管炎病毒容易发生变异，针对目前这种状况，研制出一种安全、有效、经济、稳定的疫苗就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗，解决毒苗散毒的问题，减小变异的几率。
本发明的目的还在于提供一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，同时还提供了一种疫苗用壳聚糖微球的制备方法。
为实现以上目的，本发明的技术方案在于采用了一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗，该疫苗是吸附在佐剂上灭活的鸡传染性支气管炎病毒，其中使用的佐剂是壳聚糖微球。本发明所使用的病毒株为来自中国兽医药品监察所的Massachusetts41病毒株，该病毒的灭活方法如下：用2％的HEPES1mol/LpH7.5和0.14g/l NaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.4～7.6，逐滴加入10％W/V BPL，使其最终浓度为0.025％，灭活24h，然后将灭活的病毒液再经37℃水浴2小时即可。
本发明的技术方案还在于采用了一种鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法，该制备方法包括以下步骤
(1)病毒的繁殖：Massachusetts41病毒株接种鸡胚，繁殖温度为35-37℃，每天照两次蛋，收获24-60小时死亡的鸡胚尿囊液；对于60小时的活胚需置2-8℃过夜，然后收获尿囊液，收获尿囊液时，需弃去24小时之前死亡的鸡胚；对收获的病毒尿囊液进行检验，凡菌检为阴性，毒价≥10⁷EID₅₀/0.1mL，方可作为制备疫苗的部分的抗原液。
(2)病毒液的浓缩、纯化：用醋酸锌沉淀法浓缩病毒液，Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化病毒液。
(3)病毒的灭活：采用BPL作为灭活剂，具体方法为用2％的HEPES 1mol/L pH7.5和0.14g/l NaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.4～7.6，逐滴加入10％W/V BPL，使其最终浓度为0.025％。灭活24h，然后将灭活的病毒液再经37℃水浴2小时即可。
(4)佐剂的制备：所使用的佐剂为壳聚糖微球，其制备方法包括以下步骤
称取壳聚糖5g分散于188ml灭菌蒸馏水中，在磁力搅拌下，缓慢加入12ml浓度为36％乙酸，继续搅拌10min，静置1h，用细铜纱网过滤除去不溶物待气泡消去即可用；在壳聚糖乙酸溶液中加入吐温-80 8ml，磁力搅拌下使其融解，再加入25％的戊二醛2.0ml，快速搅匀2min，反应温度为5～10℃，立即将壳聚糖溶液倒入高速搅拌的500ml液体石蜡中，经1.5h微球化后，倒人砂芯漏斗真空抽干，然后用石油醚洗涤3～5次，无菌蒸馏水洗涤3～5次，再次真空干燥得空白微球；分为10等份，每份样品含壳聚糖500mg。
(5)疫苗的配制：按1份(500mg)壳聚糖微球中加入入病毒液浓度为1.08×10⁷EID₅₀/0.1ml的灭活的鸡传染性支气管炎病毒液100ml。
所述疫苗按500羽份/瓶或1000羽份/瓶进行分装，每只鸡用量为0.2ml。
本发明所使用的病毒株还可以是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)SF毒株，由青岛易邦公司研发试验室保存。本发明所使用的接毒细胞还可以是非洲绿猴vero细胞。
本发明所使用的病毒株和接毒细胞也可以是上述毒株和接毒细胞中的任意一种，如满足要求，也可以是其他的病毒株或接毒细胞，以上给出的毒株和接毒细胞仅仅是为了示例说明本发明。
本发明的有益效果：本发明采用的是鸡传染性支气管炎灭活疫苗，解决了弱毒苗存在的毒苗散毒问题，同时减小了变异的几率。并且本发明使用壳聚糖微球吸附疫苗，由于壳聚糖可有效的诱导局部黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应，因此疫苗的免疫活性得到显著提高，对禽类的免疫保护力增强，在实际应用中将更有效的避免鸡传染性支气管炎病的发生和由此造成的禽类的死亡。
具体实施例
实施例1
壳聚糖微球的制备方法：称取壳聚糖5g分散于188ml灭菌蒸馏水中，在磁力搅拌下，缓慢加入12ml浓度为36％乙酸，继续搅拌10min，静置1h，用细铜纱网过滤除去不溶物待气泡消去即可用；在壳聚糖乙酸溶液中加入吐温-80 8ml，磁力搅拌下使其融解，再加入25％的戊二醛2.0ml，快速搅匀2min，反应温度为8℃，立即将壳聚糖溶液倒入高速搅拌的500ml液体石蜡中，经1.5h微球化后，倒人砂芯漏斗真空抽干，然后用石油醚洗涤4次，无菌蒸馏水洗涤4次，再次真空干燥得空白微球；分为10等份，每份样品含壳聚糖500mg。
实施例2
鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法：
(1)病毒的繁殖：病毒株接种鸡胚，繁殖温度为35℃，每天照两次蛋，收获24-60小时死亡的鸡胚尿囊液；对于60小时的活胚需置2℃过夜，然后收获尿囊液，收获尿囊液时，需弃去24小时之前死亡的鸡胚；对收获的病毒尿囊液进行检验，凡菌检为阴性，毒价≥10⁷EID₅₀/0.1mL，方可作为制备疫苗的部分的抗原液。
(2)病毒液的浓缩、纯化：用醋酸锌沉淀法浓缩病毒液，Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化病毒液。
(3)病毒的灭活：采用BPL作为灭活剂，具体方法为用2％的HEPES 1mol/L pH7.5和0.14g/l NaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.4，逐滴加入10％W/V BPL，使其最终浓度为0.025％。灭活24h，将灭活的病毒液再经37℃水浴2小时即可。
(4)佐剂的制备：所使用的佐剂为壳聚糖微球，其制备方法见实施例1。
(5)疫苗的配制：按1份壳聚糖微球(含壳聚糖500mg)中加入病毒液浓度为1.08×10⁷EID₅₀/0.1mL的灭活的鸡传染性支气管炎病毒液100ml。
实施例3
鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法：
(1)病毒的繁殖：病毒株接种鸡胚，繁殖温度为36℃，每天照两次蛋，收获24-60小时死亡的鸡胚尿囊液；对于60小时的活胚需置4℃过夜，然后收获尿囊液，收获尿囊液时，需弃去24小时之前死亡的鸡胚；对收获的病毒尿囊液进行检验，凡菌检为阴性，毒价≥10⁷EID₅₀/0.1ml，方可作为制备疫苗的部分的抗原液。
(2)病毒液的浓缩、纯化：用醋酸锌沉淀法浓缩病毒液，Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化病毒液。
(3)病毒的灭活：采用BPL作为灭活剂，具体方法为用2％的HEPES 1mol/L pH7.5和0.14g/l NaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.5，逐滴加入10％W/V BPL，使其最终浓度为0.025％。灭活24h，然后将灭活的病毒液再经37℃水浴2小时即可。
(4)佐剂的制备：所使用的佐剂为壳聚糖微球，其制备方法见实施例1。
(5)疫苗的配制：按1份壳聚糖微球(含壳聚糖500mg)中加入病毒液浓度为1.08×10⁷EID₅₀/0.1ml的灭活的鸡传染性支气管炎病毒液100ml。
实施例4
鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备方法：
(1)病毒的繁殖：病毒株接种鸡胚，繁殖温度为37℃，每天照两次蛋，收获24-60小时死亡的鸡胚尿囊液；对于60小时的活胚需置8℃过夜，然后收获尿囊液，收获尿囊液时，需弃去24小时之前死亡的鸡胚；对收获的病毒尿囊液进行检验，凡菌检为阴性，毒价≥10⁷EID₅₀/0.1ml，方可作为制备疫苗的部分的抗原液。
(2)病毒液的浓缩、纯化：用醋酸锌沉淀法浓缩病毒液，Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化病毒液。
(3)病毒的灭活：采用BPL作为灭活剂，具体方法为用2％的HEPES 1mol/L pH7.5和0.14g/l NaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.6，逐滴加入10％W/V BPL，使其最终浓度为0.025％。灭活24h，将灭活的病毒液再经37℃水浴2小时即可。
佐剂的制备：所使用的佐剂为壳聚糖微球，其制备方法见实施例1。
(5)疫苗的配制：按1份壳聚糖微球(含壳聚糖500mg)中加入病毒液浓度为1.08×10⁷EID₅₀/0.1ml的灭活的鸡传染性支气管炎病毒液100ml。
实施例5
壳聚糖免疫功能检测：
将制备的鸡传染性支气管炎壳聚糖微球疫苗(10μg/只，口服)、鸡传染性支气管炎活疫苗(1羽份，滴鼻、点眼)、鸡传染性支气管炎灭活疫苗(1羽份、肌肉注射)免疫30日龄SPF鸡各5只，同时设未免疫SPF鸡对照2只。MTT法检测淋巴细胞转化率，用酶标仪测OD560nm处的吸光值，用SPSS12.0 for Windows软件分析数据。
软件分析数据对比结果表明，微球疫苗组与其它各组的t值分别为：2.420、2.365和2.839＞t(0.05，7)＝2.357，有显著差异；鸡传染性支气管炎活疫苗组鸡传染性支气管炎灭活疫苗组及对照组的t值＜t(0.05，7)＝2.357，差异不显著，以上结果说明壳聚糖具有增强T淋巴细胞免疫功能的作用(表1)。
表1 不同疫苗免疫对SPF鸡淋巴细胞转化率的影响

实施例6
鸡血清IgG抗体检测：
将制备的鸡传染性支气管炎壳聚糖微球疫苗(10μg/只，口服)、鸡传染性支气管炎活疫苗(1羽份，滴鼻、点眼)、鸡传染性支气管炎灭活疫苗(1羽份、肌肉注射)免疫30日龄SPF鸡各5只。免疫后每周用常规HI方法检测血清中鸡传染性支气管炎病毒IgG抗体。
用SPSS12.0对以上数值进行成对比较，结果微球疫苗组与活疫苗组和灭活疫苗组t值分别为：6.39、3.16＞t(0.01，11)＝3.103，即P＜0.01，有极显著差异，说明微球疫苗的免疫效果显著好于活疫苗组和灭活疫苗组(表2)。
表2 疫苗免疫后各组IgG抗体结果

实施例7
免疫攻毒保护试验：
将制备的鸡传染性支气管炎壳聚糖微球疫苗(10μg/只，口服)、鸡传染性支气管炎活疫苗(1羽份，滴鼻、点眼)、鸡传染性支气管炎灭活疫苗(1羽份、肌肉注射)免疫30日龄SPF鸡各20只，同时设未免疫SPF鸡10只作为对照。
当各免疫组血清IgG抗体降至3log2时随机取11只鸡，同时取SPF鸡5只。用鸡传染性支气管炎强毒株H52进行攻毒试验，每只鸡口服0.2ml(抗原含量为1.08×10⁷EID₅₀/0.1ml)，观察14d。
结果显示，SPF鸡对照攻毒组在攻毒后5d内全部死亡，解剖学试验表明病鸡具有典型病症，活疫苗组和灭活疫苗组分别有3只和1只死亡，并各有2只剖检肠道出血严重；而接种鸡传染性支气管炎壳聚糖微球疫苗的鸡组在攻毒后无一死亡，采食、饮水及精神无异常，剖检气管、泄殖腔无出血，仅在十二指肠的肠道淋巴滤泡密集区、盲肠扁桃体等部位有轻微出血，说明口服免疫壳聚糖微球疫苗免疫后具有较强的保护力。