猪用干扰素-胸腺肽广谱抗病毒药物制剂及制备方法 【技术领域】
本发明提供一种猪用新型广谱抗病毒生物制剂，本发明还提供了该生物制剂的合成方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
干扰素(IFN)是细胞分泌的小肽，具有抗病毒，抗增生和免疫调节等广泛的生物学活性。研究表明，干扰素在动物中是普遍存在的，不仅人和高等动物的细胞能够产生干扰素，甚至许多低等动物和细菌也能产生干扰素。干扰素诱生剂或病毒均可诱导动物机体或动物细胞产生干扰素。已研究的所有哺乳动物中，都含有IFN-α，IFN-β(I型)和IFN-γ(II型)基因。其中IFN-β和IFN-γ具有种属特异性，而IFN-α具有异种动物的抗病毒活性。正常细胞一般不自发产生干扰素，只存在合成干扰素的潜能，IFN基因处于被抑制状态。在有诱发剂的条件下，IFN基因解除抑制而获得表达。
胸腺中包含多种激素，归属于α、β、γ三类，共同诱导T细胞的成熟分化。胸腺肽主要活性成份是由28个氨基酸组成的胸腺肽α1(THYα1)，现已有化学合成的商品。近年来，由于胸腺肽在多种抗病毒免疫中的高效、低毒等特性，其应用也日趋广泛。
目前国内兽医临床上干扰素和胸腺肽应用很少，尤其二者融合蛋白的表达及其应用的研究至今尚无报道。
【发明内容】
本发明公开了猪用干扰素-胸腺肽广谱抗病毒药物制剂及制备方法，适用于工业化生产。
本发明这种猪用新型广谱抗病毒生物制剂的合成方法如下：
依据IFN-α1和THY-α1的分子结构特征及大肠杆菌密码子的偏爱性设计引物，采用PCR方法获得二者的融合基因。将该基因克隆至pGEX4T-2原核表达载体中，构建了pGEX4T-IFNα1-THYα1原核表达质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)受体菌中，经IPTG诱导、表达、纯化获得IFNα1-THYα1融合蛋白。通过细胞病变抑制实验和E玫瑰花环形成实验对蛋白进行生物活性检测。
上述引物序列如下：
IF1：5’-cgcggatcctgtgacctgcctcagac-3’(BamHI)；
IF2：5’-ccggaattccaggtttctggaggaaga-3’(EcoRI)
IT1：5’-atccaccgccgcatccgagccggctgcagcgcccaggtttctgga-3’；
IT2：5’-ttttagatctttggtggttatttccgacgaggtatccaccgccgcatc-3’；
IT3：5’-ccgctcgagtcaattttcggcttcttccaccacttcttttttttcttttagatctttggt-3’；
IT4：5’-ccgctcgagtcaattttcggcttcttc-3’(XhoI)
本发明这种猪用新型广谱抗病毒生物制剂的合成方法，包括以下步骤：
1、猪干扰素α1与胸腺肽α融合基因原核表达载体的构建
(1)从猪全血基因组中扩增干扰素α1基因；
(2)人工合成猪胸腺肽α1基因；
(3)通过linker(连接肽)将猪干扰素α1基因和胸腺肽α1基因连接起来形成融合基因；
(4)将融合基因克隆至pGEX 4T-2表达载体中，构建重组质粒；
(5)采用PCR、限制性酶酶切、序列测定等方法鉴定重组质粒。
2、融合蛋白的表达、纯化及活性分析
(1)将重组质粒转化至E.coli BL21宿主细胞感受态菌中，筛选阳性克隆菌；
(2)蛋白的诱导表达及鉴定；
(3)目的蛋白分离纯化；
(4)目的蛋白活性检测。
以下实验表明IFNα1-THYα1融合蛋白具有两种生物活性：
融合蛋白的生物活性检测：
1、细胞病变抑制实验：
IFN-α1可以使细胞建立抗病毒状态，使细胞免受病毒攻击的损害，据此可以判断融合蛋白是否具有干扰素的抗病毒活性。实验方法如下：
1.1猪肾上皮细胞PK15的复苏
(1)将培养液置于37℃水槽水浴加热，之后用70％酒精擦拭，移入无菌操作台内。
(2)自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水浴中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化，以70％酒精擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台内。
(3)取出0.9mL解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养液的细胞瓶内(稀释比例为1∶10-1∶15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
(4)解冻后，1000rpm离心5min，弃去上清，加入新鲜培养液，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
1.2细胞传代
(1)倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养液置37℃下预热。
(2)将培养液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁。
(3)倒掉培养细胞的旧培养液，用少量胰酶消化90s。
(4)每个大培养瓶加入2mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。
(5)加入少量的DMEM完全培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的DMEM完全培养液(7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。放回CO2培养箱培养。
1.3抗病毒活性测定
用DMEM完全培养液将细胞制成细胞悬液。将CRFK细胞悬液加入2块6孔细胞培养板上，每孔2mL。设第一组，第二组，第三组，第四组，共四组，每组三孔。放入CO2培养箱37℃孵育，至形成均匀的细胞单层。弃去6孔细胞培养板内的培养液。
将纯化并测定含量的重组IFN-α1，IFNα1-THYα1蛋白分别用DMEM完全培养液100倍稀释后再进行2倍系列稀释，按2mL/孔的量，将IFN-α1加入到第二组的三个孔中，将IFNα1-THYα1加入到第三组的三个孔中，将购买的人重组IFN-α2a加入到第四组三个孔中。放入CO2培养箱37℃孵育过夜。
用DMEM培养液10倍系列稀释猪瘟病毒(SFV)，重复接种6孔，每孔2mL。CO2培养箱37℃孵育20h后，观察并记录结果。
附图1为未接病毒时猪肾上皮细胞(PK15)的形态，图2为猪瘟病毒(SFV)接种20h后细胞的形态，其中，第一组为病毒对照组，第二组为接种SFV后加入IFN-α1的细胞，第三组为接种SFV后加入IFNα1-THYα1后细胞的形态，第四组为接种SFV后加入人重组IFN-α2a的对照，实结果表明融合蛋白的抗病毒活性与标准干扰素活性基本一致。
结果表明融合蛋白的抗病毒活性与标准干扰素活性基本一致。
2、玫瑰花结形成实验：
THY-α1具有促进细胞表面受体表达的活性，根据E玫瑰花结形成实验可以检测融合蛋白促进细胞表面受体表达的活性，据此判断融合蛋白中THY-α1的生物学活性。
样品活力＝样品管中E玫瑰花结百分率-对照管E玫瑰花结百分率。
实验过程如下：
2.1淋巴细胞悬液的制备
取1mL淋巴细胞分离液加1mL肝素抗凝血，使血液轻轻覆盖在分离液上面，并使血液与分离液之间保持清晰的界面，立即置水平式离心机中以2000rpm离心20min，离心后分为四层，最上面为血浆，中间层为分离液，上层和中间层之间的乳白色层含有大量淋巴细胞，最下层为红细胞。
小心吸取淋巴细胞于试管中，用Hank′s液洗涤，以1500rpm离心5min沉淀淋巴细胞，弃上清，加入适量Hank′s液，制成淋巴细胞悬液。置45℃恒温水浴保温30min，每5min摇动一次，取出后以1500rpm离心5min，弃去上清。用Hank′s液洗涤3次。细胞计数，用Hank′s液配成5×106/mL的细胞悬液。
2.2绵羊红细胞悬液的制备
取一定量阿氏液保存的绵羊血于离心管中，Hank′s液洗涤3次，取末次洗涤后的血球用Hank′s液调整细胞浓度为2×108/mL。
2.3活性测定
取融合蛋白样品用Hank′s液配制成1mg/mL浓度。取小管10支，其中5支各加Hank′s液0.1mL作为对照；另外5支各加样品溶液0.1mL作为测定管，每管中各加脱E受体的淋巴细胞悬液0.2mL，摇匀，37℃孵育1h，加入绵羊红细胞悬液0.2mL，500rpm离心3min，放入4℃冰箱过夜，次日取出，弃去上清，每管中加固定液一滴，轻轻摇匀，静置10min，加入染色液2滴并摇匀，静置15min后开始计数，视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大方格上所有淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的E玫瑰花结形成的细胞数(结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞)，计算花结形成百分率，取各管的平均值。
E玫瑰花环形成实验结果——各样品地玫瑰花结形成情况如下：
表达样品提高了玫瑰花结形成率，24～48h表达产物的玫瑰花结形成率均在10％以上，即表明表达产物均有胸腺肽活性。融合蛋白样品活力为23.12％-14.7％＝8.42％。
从以上体外实验结果表明IFNα1-THYα1融合蛋白具有IFNα1和THYα1双重生物活性，人医临床数据显示干扰素、胸腺肽联合应用可提高二者的抗病毒功效，因此，本研究所获得的IFNα1-THYα1融合蛋白在机体内能够发挥各自的生物活性，并具有协同作用。
本发明积极效果在于：利用基因工程的方法获得具有双重生物功效的IFNα1和THYα1融合蛋白，通过IFN和THY协同作用明显高于IFN和THY各自单独的抗病毒能力。二者融合蛋白生物制剂生产工艺简单，降低生产成本；另一方面IFN和THY融合蛋白的联合显提高了IFN和THY抗病毒的功效。
【附图说明】
图1为未接病毒细胞时细胞的形态图；
图2为SFV接种20h后细胞的形态图；
图3为猪IFNα1-THYα1融合蛋白表达产物的Western blot分析图。
【具体实施方式】
为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐述而非对本发明的任何形式的限制。
实施例1
1.猪IFN-α1基因序列扩增及克隆。
1.1从猪基因组中PCR扩增猪IFNα1目的基因。
利用Whole Blood Genomic DNA Mini-prep Kit提取猪血液基因组，以IF1和IF2引物进行PCR扩增，获得猪IFN-α1目的基因。
PCR扩增IFNα1基因，按表2-1一次加入各组分后进行PCR反应，反应条件如下：94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃30s，30个循环后延伸72℃，8min。
表1-1 猪IFNα1基因PCR反应体系
1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收。
1.2猪IFN-α1基因与pMD18-T载体的连接
通过PCR法扩展获得猪IFN-α1基因，将其连接到pMD18-T载体上。连接反应体系见表2-2，充分混匀，16℃水浴连接，反应过夜。
表1-2 猪IFN-α1基因与pMD18-T载体连接反应体系
1.3转化
取连接反应产物加入到适量大肠杆菌(DH5α)感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min，放入预加温至42℃的水浴中，热冲击90sec，然后立即转移至冰浴中，冷却1～2min。转移入800μL LB培养基中，于摇床上，37℃、200rpm培养45min。然后均匀涂布到LB-Amp(50μg/mL)琼脂平板上，晾干。倒置平皿，于37℃恒温培养箱中培养12～16h，观察单菌落生长情况。
1.4鉴定
分别挑取单菌落至LB-Amp(50μg/mL)培养基中，37℃、250rpm培养过夜，提取质粒进行BamHI、EcoRI双酶切鉴定并测序(T7通用引物测序)。选取序列正确的T-IFNα1菌液保存并提取质粒，取少量测定DNA含量，其余储存于-20℃。
2.pGEX4T-IFNα1-THYα1原核表达载体的构建
2.1猪IFNα1-THYα1全基因的获得
在IFN-α1和THY-α1中间设计了一个5肽的接头，氨基酸序列为Gly-Ala-Ala-Ala-Gly。Gly和Ala的侧链很小，因此该连接肽具有较高的柔性，可以减少对融合蛋白折叠的影响。根据THY-α1氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性设计4条引物分别与IF1配对分4次PCR反应扩增IFNα1-THYα1全基因序列，每次反应均以前一次反应的产物为模板。
分别按表2-1，2-2，2-3，2-4一次加入各组分后进行PCR反应，四次反应条件如下：第一次94℃预变性5min，94℃30s，68℃30s，72℃30s，7个循环后延伸72℃，8min；第二次94℃预变性5min，94℃30s，68℃30s，72℃30s，7个循环后延伸72℃，8min；第三次94℃预变性5min，94℃30s，64℃30s，72℃30s，7个循环后延伸72℃，8min；第四次94℃预变性5min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，25个循环后延伸72℃，8min；
表2-1 第一次PCR扩增IFNα1-THYα1全基因反应体系
PCR产物记为1-IFNα1-THYα1。
表2-2 第二次PCR扩增IFNα1-THYα1全基因反应体系
PCR产物记为2-IFNα1-THYα1。
表2-3 第三次PCR扩增IFNα1-THYα1全基因反应体系
PCR产物记为3-IFNα1-THYα1。
表2-4 第四次PCR扩增IFNα1-THYα1全基因反应体系
获得猪IFNα1-THYα1全基因，1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收。
2.2猪IFNα1-THYα1全基因酶切
体系如表2-5，37℃，酶切过夜。
表2-5 猪IFNα1-THYα1全基因酶切反应体系
1.5％琼脂糖凝胶电泳，博大泰克凝胶片断回收纯化试剂盒回收载体片段。
2.3pGEX4T-2原核表达载体酶切
体系如表2-6，37℃，酶切过夜。
表2-6 pGEX4T-2原核表达载体酶切反应体系
0.7％琼脂糖凝胶电泳，博大泰克凝胶片断回收纯化试剂盒回收载体片段。
2.4猪IFNα1-THYα1全基因与载体pGEX4T-2的连接
连接通过酶切获得的猪IFNα1-THYα1全基因与载体pGEX4T-2。连接反应体系见表2-7，充分混匀，16℃水浴连接，反应过夜。
表2-7 猪IFNα1-THYα1全基因与载体pGEX4T-2连接反应体系
2.5转化。
取连接反应产物(设阴性对照质粒pGEX4T-2)加入到适量大肠杆菌(DH5α)感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min，放入预加温至42℃的水浴中，热冲击90sec，然后立即转移至冰浴中，冷却1～2min。转移入800μL LB培养基中，于摇床上，37℃、200rpm培养45min。然后均匀涂布到LB-Amp(50μg/mL)琼脂平板上，晾干。倒置平皿，于37℃恒温培养箱中培养12～16h，观察单菌落生长情况。
2.6鉴定。
分别挑取单菌落至LB-Amp(50μg/mL)培养基中，37℃、250rpm培养过夜，提取质粒进行BamHI、XhoI双酶切鉴定并测序(T7通用引物测序)。选取序列正确的pGEX4T-IFNα1-THYα1菌液保存并提取质粒，取少量测定DNA含量，其余储存于一20℃。
3.原核表达载体pGEX4T-IFNα1-THYα1转化大肠杆菌BL21(DE3)。
取测序正确的载体pGEX4T-IFNα1-THYα1(设阴性对照质粒pGEX4T-2)加入到适量BL21(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min，放入预加温至42℃的水浴中，热冲击90sec，然后立即转移至冰浴中，冷却1～2min。转移入800μL LB培养基中，于摇床上，37℃、200rpm培养45min。然后均匀涂布到LB-Amp(50μg/mL)琼脂平板上，晾干。倒置平皿，于37℃恒温培养箱中培养12～16h，观察单菌落生长情况。
4.GST-IFNα1-THYα1目的蛋白诱导表达
将鉴定好的阳性转化菌单菌落接种于5mL含Amp的LB培养基中，37℃过夜培养；以1∶100的比例接种于含有Amp的新鲜LB液体培养基中(剩余的菌液置4℃暂时保存)；当OD600达0.6～1.0时，浓度为1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mmol/LIPTG于37℃诱导培养4～6h；取1mL上述培养液于4℃12000rpm离心30sec，沉淀加ddH2O 80μL，加入等体积的2×SDS上样Buffer，混匀，100℃加热5min，进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳。观察表达量最高时的IPTG浓度。
5.凝胶的染色与脱色。
用至少5倍体积的染色液浸泡凝胶，水平摇床室温染色4h以上；将凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4～8h，期间更换脱色液3～4次；脱色后将凝胶浸泡于水中。
6.Western blot检测。
6.1 SDS-PAGE。
a.装板，置于灌胶架上，确保不泄漏。
b.确定凝胶浓度、体积，按照《分子克隆》中配方配制分离胶。
c.加入TEMED后，立即注入玻璃板间隙中，并为浓缩胶留足够空间(梳齿长约1cm)。在分离胶顶层加入适量去离子水。
d.约15min聚合完成后，倒掉去离子水，用滤纸条尽量吸去凝胶顶端的残存液体。
e.配制浓缩胶，混匀后注入玻璃板间隙，插入梳齿，避免混入气泡，垂直放置于室温下15min。
f.在浓缩胶聚合的同时，将样品蛋白与加样缓冲液混匀，100℃，煮沸3min。
g.浓缩胶聚合后，拔出梳齿，用滤纸条吸去梳孔中的气泡。将凝胶放入电泳槽中，上下槽均加入电泳缓冲液，检查是否泄漏。按次序上样，加条带适宜的蛋白质分子量Marker。
h.电泳：以恒压80V电泳至蛋白样品进入分离胶，加大电压至160V，待指示剂染料抵达分离胶底部切断电源。取下凝胶，染色或进行Western Blot分析。
6.2电转移。
a.戴手套，剪6张滤纸和一张PVDF膜，大小要与凝胶完全吻合。切左上角作标记。
b.将PVDF膜浸入100％甲醇中10sec；浸入去离子水中5min；浸入电转液中10min以上，同时将滤纸和多孔垫片浸入电转液中。
c.安装电转移装置：从正极(红色)到负极(黑色)依次为：多孔垫片-3张滤纸-PVDF膜-凝胶-3张滤纸-多孔垫片。放于电转槽，浸入电转液中。
d.接通电源，条件为100V，150mA(结束时为100V，240mA)，1h；或者30V，40mA(结束时为30V，90mA)，过夜。
6.3 Western Blot。
a.取出PVDF膜，浸入10mL含5％脱脂奶粉的TBST中封闭，室温振荡1h，或4℃过夜。
b.将PVDF膜取出，浸入20mL TBST中，室温振荡漂洗。
c.将适量的GST单抗溶于10mLTBST中，将PVDF膜浸入其中，室温振荡至少2h。
d.20mL TBST室温振荡洗膜10min，重复三次。
e.将适量HRP标记的羊抗鼠IgG二抗溶于10mL TBST中，将PVDF膜浸入其中，室温振荡1h。
f.20mL TBST室温振荡洗膜10min，重复三次。
6.4显色(使用HRP-DAB底物显色试剂盒)
a.取出PVDF膜，将PVDF膜浸没于试剂A，B，C的等比混合液中。
b.避光放置10～30min。
7.GST-IFNα1-THYα1目的蛋白分离纯化。
猪IFNα1-THYα1融合蛋白表达产物的Western blot分析见图3。
7.1发酵
将含有pGEX4T-IFNα1-THYα1的大肠杆菌BL21(DE3)接种于5mL含Amp的LB培养基中，37℃过夜培养；以1∶100的比例接种于1L含有Amp的新鲜LB液体培养基中。当OD600达0.8时，以终浓度为1.0mmol/L的IPTG于37℃诱导培养4h。
7.2破菌收集包涵体
收集诱导表达后的菌液，8000rpm离心10min收集菌体，按10mL/g(V/W)将菌体细胞重悬于pH8.0的PBS缓冲液中，洗菌体一次，8000rpm离心10min收集菌体，按6mL/g(V/W)将菌体重悬于pH8.0的PBS缓冲液中，冰浴中超声破菌。超声条件为：功率200W，超声时间30sec，间隔时间60sec，全程工作时间为30min。超声裂解液在4℃12000rpm离心30min，收集包涵体。
7.3包涵体的处理：
7.3.1包涵体的洗涤
每克包涵体加入约10mL的洗涤缓冲液，而后4℃搅拌2h，12000r/min离心20min后取上清和沉淀，用12％SDS-PAGE检测洗涤效果。
7.3.2包涵体的溶解
沉淀重悬于2M10mL尿素中，于4℃12000rpm离心10min，收集沉淀，保留上清，用2M尿素再重悬沉淀于4℃12000rpm离心10min，收沉淀，此即包涵体，保留上清，8M尿素于4℃溶解包涵体，2.5h后，于4℃12000rpm离心20min，弃沉淀要上清，此即为溶解的包涵体，分装后置于-70℃冰箱备用。
7.3.3重组蛋白的复性
8M尿素溶解的包涵体离心上清按1∶9(体积比)加复性液放于4℃复性20h。4℃12000rpm离心20min收集上清加浓HCl调pH至5.3，4℃放置2h，再加4M NaOH调pH至7.5，用2000mL 10mM PBS(PH7.5)于4℃透析24h，中间更换两次透析液。上SDS-PAGE观察收率，-20℃冻存备用。
7.4GST-IFNα1-THYα1融合蛋白的纯化
GST亲和柱层析：采用Walterson GST-Resin Kit，型号HG3022A。
7.4.1装柱
将GST亲和层析填料悬液上柱，用重力沉降法，装柱前，安装好层析柱，使之与水平面垂直，然后在柱内加入蒸馏水或起始缓冲液，排出柱中“死体积”内的气泡，使柱内液体为柱的1/5～1/3高度。用玻璃棒将处理好的填料制成粘稠状的悬液，然后将其沿着玻璃棒或层析柱管壁倒入柱内，打开层析柱出口，控制流速10～15cm/h，约10倍床体积的冷PBS洗柱床。
7.4.2加样及洗脱
启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应＜床体积的2％，蛋白浓度以＜100mg/mL为宜)。松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口。样品过柱后，用20倍床体积的冷PBS洗柱床(加蛋白酶抑制剂)。洗柱后用20倍床体积的洗脱液洗脱，流速10～15cm/h。收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。
8IFNα1-THYα1目的蛋白纯化
8.1凝血酶酶切
取上步蛋白纯化液以5U/mL终浓度的凝血酶4℃酶切24h。
8.2IFNα1-THYα1目的蛋白精纯
按步骤2.5.4重复操作获得IFNα1-THYα1目的蛋白。
8.3精纯目的蛋白浓度测定：
以华特生Protein Assay试剂盒测定目的蛋白含量，方法如下：
(1)准备工作液。
取一干净的三角烧瓶，取一份5×浓缩液，加入4份蒸馏水(例如：4mL 5×浓缩液+16mL蒸馏水＝20mL 1×工作液)混匀，再用试剂盒里面的滤纸过滤。每个样需要5.0mL，故可以根据实际需要来配置工作液体积，所配置的工作液放室温一星期内可以保持稳定。
(2)按表8-1配备标准BSA溶液(2mg/mLBSA贮备液由华特生公司提供)。
表8-1 蛋白测定标准品溶液的配制
(3)取0.1mL标准BSA液(每个梯度一管)加入试管，同时以0.1mL生理盐水为空白对照。向每管中加入5.0mL工作液，混匀后2min既可测定。
(4)在595nm波长处比色测定，空白管调零，读取吸光值。
(5)绘制标准曲线。
(6)取0.1mL样品，按上述方法测出在595nm处的吸光值，对照标准曲线回归方程，计算其浓度为0.98mg/ml
8.4目的蛋白浓缩：
将收集的目的蛋白洗脱液以PEG(MW6000)洗缩至所需体积，加入0.02％NaN3防腐剂，于4℃保存备用。
【序列表】
个人申请
--------------------
街道：西安大路
城市：长春
省份：吉林
国别：中国
<110>姓氏：刘
<110>名字：松材
-------------------
<120>名称：THY-α1
<130>参考文献：THY-α1标准序列
序列
--------
<213>生物类型：人工合成
<212>类型：DNA
<211>长度：84THY-α1
<400>1
TCGGATGCGG CGGTGGATAC CTCGTCGGAA ATAACCACCA AAGATCTAAA AGAAAAAAAA 60
GAAGTGGTGG AAGAAGCCGA AAAT 84
<210>2
<211>45
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物
<222>(1)..(45)
<400>2
atccaccgcc gcatccgagc cggctgcagc gcccaggttt ctgga 45
<210>3
<211>48
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物
<222>(1)..(48)
<400>3
ttttagatct ttggtggtta tttccgacga ggtatccacc gccgcatc 48
<210>4
<211>60
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物
<222>(1)..(60)
<400>4
ccgctcgagt caattttcgg cttcttccac cacttctttt ttttctttta gatctttggt 60
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物
<222>(1)..(27)
<400>5
ccgctcgagt caattttcgg cttcttc 27