一种诱导捕食线虫真菌同步产生捕食器官的方法 技术领域：
本发明涉及一种诱导捕食线虫真菌同步产生捕食器官的方法，属于应用微生物学领域。
背景技术：
植物寄生线虫是植物的重要病害之一，全世界每年由于植物寄生线虫所引起的农作物经济损失达到780亿美元(Barker，1998)。在我国，线虫危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、小麦、水稻、林木、中药材等几乎所有的经济作物，成为农业生产中重要的限制因子之一。目前对线虫病害的防治仍然以化学防治为主，但由于化学农药对生态环境的影响以及寄生线虫抗药性的增加，使其应用逐步受到限制，因此采用线虫天敌进行生物防治已日益受到研究人员的关注(Siddiqui and Mahmood，1996；刘杏忠等，2004)。对线虫真菌天敌的研究已经有160多年的历史，其中捕食线虫真菌(Nematode-trapping fungi)是自然界中控制线虫种群数量的一类重要的真菌生物因子。捕食线虫真菌根据形态学特征划分为节丛孢属(Arthrobotrys)、单顶孢属(Monacrosporium)和隔指孢属(Dactylella)(Subramanian，1963)，它们利用营养菌丝特化形成的捕食器官，如收缩环、非收缩环、粘性菌丝、粘性分枝、粘性网等完成对植物寄生线虫的捕捉和侵染过程(张克勤等，2006)。捕食线虫真菌的捕食器官的形态结构十分稳定，不但在捕食线虫的功能方面有重要意义，而且也是鉴定和分类的重要依据之一。目前，捕食线虫真菌作为一种有效的生物防治资源已经广泛应用于植物寄生线虫的生物防治(刘杏忠等，2004)。然而，人们对捕食线虫真菌的侵染机制和分子背景的了解还非常有限，限制了高效线虫生防制剂的研发和应用。
捕食线虫真菌的捕食器官是其侵染植物寄生线虫的必要条件之一，捕食器官在营养贫瘠的培养基上可以自发产生，也可以通过环境因子(氨基酸和多肽等)的诱导产生(Friman et al.，1985)。目前所正式报道的捕食线虫真菌捕食器官的诱导方法主要包括：饥饿法，在营养贫瘠的培养基上如玉米粉培养基上培养产生；诱导法，在固体或液体培养基中加入特定的氨基酸或多肽等诱导物质诱导捕食器官产生；小室法(挖块法)：在固体培养基(平板内)中挖出一块(0.5x1cm)，并在其中加入新鲜线虫，诱导捕食器官产生。以上几种捕食器官的诱导方法存在产生的捕食器官数量有限、捕食器官产生不同步和可控制性不强等缺点。
经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
发明内容：
本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种快速诱导捕食线虫真菌同步产生捕食器官的方法，迅速获得大量同步的捕食器官，为进一步研究捕食线虫真菌捕食器官形成的分子机制提供了良好的实验材料。
本发明涉及的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为实验室常规实验用线虫，能从国内外的线虫保藏机构购买得到。
本发明在常规方法基础上改进而成。本发明实现的步骤如下：
1.培养基和线虫的培养
1)燕麦培养基：用于培养线虫。在250mL三角瓶中加入10g燕麦片(超市购买)加入30mL去离子水将燕麦片浸润，121℃灭菌20分钟。
2)秀丽隐杆线虫的培养：在灭菌的燕麦培养基中加入1mL的线虫悬液，21-26℃培养6-7天。培养好的线虫在4℃保存1周。
2.线虫提取物的制备
1)用3层擦镜纸将含有秀丽隐杆线虫的燕麦培养基包好，用贝氏漏斗法过夜收集燕麦培养基培养的线虫；
2)将收集到的线虫用M9缓冲液(磷酸氢二钠6g；磷酸二氢钾3g；氯化钠5g；硫酸镁0.25g，水1000mL)清洗，去除残留的培养基；
3)离心收集线虫，4℃，8,000g，离心20分钟；
4)用无菌去离子水悬浮线虫，离心收集线虫，4℃，8,000g，离心20分钟；重复3次；最后用无菌去离子水悬浮线虫，10g(湿重)线虫加入30mL无菌去离子水；
5)将线虫悬浮液置于冰水混合物上超声：50％强度，6s ON，3s OFF，10分钟；放置30分钟后，再次超声，6s ON，3s OFF，5分钟；
6)12,000g，30分钟，离心收集上清；
7)用0.22μm的滤膜过滤上清液，过滤后的上清液即为线虫提取物，分装后存于-80℃待用。
3.捕食线虫真菌的培养(以捕食线虫真菌的模式菌株寡孢节丛孢A.oligospora为例)
1)培养基：PDA培养基和CMA培养基的组成和配制方法如下：
CMA培养基：称取20g玉米粉，加入1000mL去离子水，煮沸(100℃)20分钟，用6层纱布过滤收集液体，加入20g琼脂，121℃灭菌20分钟。
PDA培养基：去皮马铃薯200g，切块、煮沸30分钟，6层纱布过滤收集上清液，加入葡萄糖20g，加水补充体积到1000mL，121℃灭菌20分钟。
2)寡孢节丛孢的活化和孢子培养：在CMA固体培养基上接种寡孢节丛孢，26℃恒温培养箱内培养10天，以得到大量的孢子。用无菌水冲洗CMA平板上的寡孢节丛孢菌丝；用移液器将平板上的液体转移至装有无菌擦镜纸的漏斗内过滤，收集孢子；用血球计数板计数并计算孢子的浓度。
3)寡孢节丛孢的液体发酵及新鲜菌丝地收集
制备PDA液体培养基，分装于500mL的三角瓶内，200mL培养基/瓶。在液体培养基内接种孢子，100个孢子/mL液体培养基，摇床培养：26℃，160rpm，5-6天。用无菌的6层纱布过滤收集菌丝，并用无菌去离子水冲洗菌丝3-4遍，去除培养基成份，用40mL无菌去离子水悬浮菌丝，用于三维菌网的液体诱导。
4.捕食线虫真菌捕食器官的诱导(以捕食线虫真菌的模式菌株寡孢节丛孢A.oligospora为例)
将收集得到的寡孢节丛孢新鲜菌丝用无菌去离子水悬浮后，实验组(三维菌网诱导组)内加入线虫提取物(1∶10，v/v)；对照组(营养菌丝组)内加入等量无菌去离子水；将平皿静置于26℃恒温培养箱内孵育24-48h，大量的捕食器官(三维菌网)产生。诱导结束后，用无菌的6层纱布分别过滤收集对照组和实验组的菌丝，并用无菌去离子水冲洗菌丝3-4遍；用无菌滤纸去除菌丝内的水分；菌丝用液氮冻干后，存于-80℃待用。
5.捕食线虫真菌对秀丽隐杆线虫的捕捉观察(以捕食线虫真菌的模式菌株寡孢节丛孢A.oligospora为例)
1)用1％的次氯酸钠对秀丽隐杆线虫进行消毒处理后，用无菌去离子水反复冲洗虫体3-4次。将液体诱导产生的三维菌网铺在水琼脂平板上，加入100条/皿消毒后的秀丽隐杆线虫。
2)用光学显微镜(Olympus，Japan)观察液体诱导产生的三维菌网的形态和对线虫的捕捉。
与以往的报道相比，本发明有以下几个特征：1)线虫提取物能够有效诱导捕食线虫真菌产生大量同步的捕食器官(106捕食器官/mg菌丝)；2)线虫提取物为水溶性物质，诱导实验结束后，通过过滤、无菌去离子水冲洗的方法即可将线虫提取物去除，对后续实验没有影响；3)线虫提取物的制备方法和三维菌网诱导方法简单易行，重复性好，可控性强。4)本发明为进一步研究捕食线虫真菌捕食器官形成的分子机制提供了良好的实验材料。
具体实施方式：
以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：捕食线虫真菌寡孢节丛孢菌丝捕食器官的诱导
按照上面所描述的方法制备线虫提取物，寡孢节丛孢接种PDA液体培养基，26℃，160rpm培养5或6天，过滤收集菌丝。并用无菌去离子水冲洗菌丝3或4遍，去除培养基成份，用适量无菌无菌去离子水悬浮菌丝，用于三维菌网的诱导。
将收集得到的寡孢节丛孢新鲜菌丝用无菌去离子水悬浮后，置于玻璃平皿内，40mL/皿：实验组(三维菌网诱导组)内加入线虫提取物(1∶10，v/v)；对照组(营养菌丝组)内加入等量无菌去离子水；将平皿静置于26℃恒温培养箱内孵育24或36或48h。寡孢节丛孢的菌丝诱导15h后即可观察到三维菌网产生，在20或24h时，大量的捕食器官(三维菌网)产生。不同批次的线虫提取物对捕食器官的诱导能力差异较小。
实施例二：捕食线虫真菌寡孢节丛孢分生孢子形成捕食器官的诱导
按照上面所描述的方法制备线虫提取物，寡孢节丛孢接种CMA固体培养基，26℃恒温培养箱内培养10天，以得到大量的孢子。用无菌水冲洗CMA平板上的寡孢节丛孢菌丝，用移液器将平板上的液体转移至装有无菌擦镜纸的漏斗内过滤，收集孢子。
将收集得到的寡孢节丛孢孢子用无菌去离子水悬浮后，置于玻璃平皿内，20mL/皿：实验组(三维菌网诱导组)内加入线虫提取物(1∶10，v/v)；对照组(营养菌丝组)内加入等量无菌去离子水；将平皿静置于26℃恒温培养箱内孵育24或36或48h。寡孢节丛孢的菌丝诱导12-15h后即可观察到三维菌网产生，在20或24h时，大量的捕食器官(三维菌网)产生。