家蚕抗菌肽及其cDNA序列与应用 【技术领域】
本发明涉及家蚕基因工程研究领域，具体涉及家蚕抗菌肽的研究，尤其涉及一种新的家蚕抗菌肽及其cDNA序列与应用。
背景技术
昆虫有极强的适应能力和防御能力，其中最重要的机制是对病原物质和有害侵染因素的非专一免疫体系，昆虫抗菌肽(Antibacterial peptides)，又称为昆虫抗微生物肽(Insect Antimicrobial Peptide，AMP)，作为昆虫体液非专一免疫反应机制的主要应答分子，显示对细菌、真菌具有广谱高效的杀灭作用，对病毒、原虫、非正常细胞(例如癌细胞)的抑制作用。
昆虫抗菌肽的杀菌机理主要通过对细胞膜的物理化学损伤、或对细胞膜电位的影响、或抑制细菌细胞壁的呼吸而达到抑菌效果，所以不易导致微生物产生耐药性，具有分子量小、热稳定、抗菌谱广、无免疫原性、对高等动物正常细胞无害等优点，可能成为替代抗生素的新型抗菌物质之一，所以近年来国内外对抗菌肽转基因抗病育种和生物制药(制剂)的应用研发非常活跃，迄今为止，已分离鉴定或发现了100多种具有免疫诱导活性的昆虫抗菌肽分子。
Cecropins族抗菌肽是一类研究比较深入的抗菌肽，从昆虫到脊椎动物均有文献报道，此族是目前已知天然抗菌肽中活性较强的一种，目前已从果蝇(Drosophila melanogaster)和疟蚊(Anopheles gambiae)等双翅目和鳞翅目的昆虫中分别发现了数目不等的Cecropins基因家族成员。
Cecropins族抗菌肽为一类分子量约为4kD，由40个氨基酸残基(aa)组成的碱性耐热短肽，有A、B、C、D、E、F和G等多种同系物类型，其中以惜古比天蚕的Cecropin A1-A3、B、D为典型代表。
2004年西南大学完成了对家蚕基因组的全测序和框图绘制工作(Xia etal.，2004.Science，306：1937-1940)，为家蚕抗菌肽基因的研究提供了9×基因组数据库和EST数据库(silkworm knowledgebase：http://silkworm.genomics.org.cn/)。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种新的来源于家蚕Cecropins家族的抗菌肽。
本发明的另一个目的在于提供上述抗菌肽的cDNA序列。
本发明的另一个目的在于提供上述家蚕抗菌肽的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
本发明人基于家蚕9×基因组数据库和EST数据库，通过SignalP在线(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)分析和DNAStar软件分析，发现了1个新的家蚕Cecropins族抗菌肽新成员，并将其命名为BmcecE，该抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，包含39个氨基酸，该抗菌肽的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
家蚕抗菌肽BmcecA2(成熟肽)分子、家蚕抗菌肽BmcecB1(成熟肽)分子和家蚕抗菌肽Cecropin D(成熟肽)分子，这三个是已经证实具有抗菌活性的。
本发明以家蚕抗菌肽BmcecA2(成熟肽)分子、家蚕抗菌肽BmcecB1(成熟肽)分子和家蚕抗菌肽Cecropin D(成熟肽)分子作为试验对照，对上述获得的家蚕抗菌肽BmcecE进行抗菌活性研究。
通过研究发现，本发明的家蚕抗菌肽BmcecE对苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、大肠杆菌K12D31(Escherichia coli K12D31)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、灵菌败血病菌(Seiiatio maicesceis)和青枯菌(Ralstonia dolaanacearum)均具有抗菌活性。
家蚕抗菌肽BmcecE对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的最小抑制浓度(MIC)为1.25μM，对大肠杆菌K12D31(Escherichia coli K12D31)的最小抑制浓度(MIC)为2.5μM，对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的最小抑制浓度(MIC)为2.5μM，对灵菌败血病菌(Seiiatio maicesceis)的最小抑制浓度(MIC)为2.5μM，对青枯菌(Ralstonia dolaanacearum)的最小抑制浓度(MIC)为2.5μM。
本发明的家蚕抗菌肽BmcecE可用于人、畜、禽的药物研发，预防和治疗由苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌感染引起人、畜、禽的致病；还可以用于生物产品添加剂的制备，防止由苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌引起的生物产品的腐败变质。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明获得一个新的家蚕抗菌肽，充实了现有的家蚕抗菌肽种类，为家蚕抗菌肽的研究提供了新的品种；
2.本发明的家蚕抗菌肽对革兰氏阳性菌(苏云金芽孢杆菌)，以及革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌)均具有抗菌活性，说明该抗菌肽抗菌谱广，具有比较广阔的应用前景；
3.本发明的家蚕抗菌肽可用于相关的药物研发以及生物制品添加剂的制备，采用基因工程方法生产该抗菌肽蛋白质，具有较高的商业价值。
【附图说明】
图1为实施例2中的Sephadex G-10层析脱盐纯化的电泳图；
其中，M为Marker，1为细菌裂解物，2为BmcecA2，3是BmcecE，4为BmcecB1，5为Cecropin D；
图2为实施例2中的单一蛋白质电泳图；
其中，M为Marker，1为BmcecA2，2是BmcecE，3为BmcecB1，4为Cecropin D。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1家蚕新多肽BmcecE的获得
本发明人基于家蚕9×基因组数据库和EST数据库，通过SignalP在线(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)分析和DNAStar软件分析，发现了1个新的家蚕多肽，并将其命名为BmcecE，该多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，包含39个氨基酸，该多肽地cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2重组表达载体质粒的构建、转化体菌株及蛋白表达
家蚕抗菌肽BmcecA2(成熟肽)分子、家蚕抗菌肽BmcecB1(成熟肽)分子和家蚕抗菌肽Cecropin D(成熟肽)分子，这三个是已经证实具有抗菌活性的，其中，家蚕抗菌肽BmcecA2基因的核苷酸序列，其GenBank登录号为NM_001043997，家蚕抗菌肽BmcecB1基因的核苷酸序列，其GenBank登录号为1703262B/AAC60501，家蚕抗菌肽Cecropin D基因的核苷酸序列，其GenBank登录号为BAA31507。
家蚕抗菌肽BmcecA2、家蚕抗菌肽BmcecB1、家蚕抗菌肽Cecropin D和实施例1所得家蚕多肽BmcecE，这四个成熟肽的氨基酸序列比对如下所示：
BmcecA2 RWKLFKKIEKVGRNVRDGLIKAGPAIAVIGQAKSL 35aa
BmcecB1 RWKIFKKIEKMGRNIRDGIVKAGPAIEVLGSAKAIGK 37aa
CecropinD GNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQG 37aa
BmcecE RWKIFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQAATIAHGK 39aa
* * ** * *** *
上述对比中，星号(*)分别代表N端碱性氨基酸、能形成β转折区的A-G-P氨基酸和C端可酰胺化的氨基酸位点。
从上述对比中可以看出，实施例1所得家蚕抗菌肽BmcecE在氨基酸序列上与现有的抗菌肽具有较高的相似度，尤其在一些可能与抗菌功能活性有关的位点上，也是保持相同的，因此本发明人预测实施例1所得家蚕多肽BmcecE应该也具有一定的抗菌活性。
本实施例以家蚕抗菌肽BmcecA2(成熟肽)分子、家蚕抗菌肽BmcecB1(成熟肽)分子和家蚕抗菌肽Cecropin D(成熟肽)分子作为试验对照，对上述实施例1获得的家蚕多肽BmcecE进行抗菌活性研究。
1、引物设计和cDNA序列的获得
根据家蚕抗菌肽BmcecA2基因、家蚕抗菌肽BmcecB1基因、家蚕抗菌肽Cecropin D基因和家蚕多肽BmcecE基因，分别设计相对应的扩增引物，送交生物公司合成。
以家蚕蛹脂肪体RNA作为模板，分别采用上述扩增引物，通过常规RT-PCR扩增操作，扩增获得上述四个基因编码成熟肽的cDNA序列。
本实施例的引物以及cDNA如下所示：
(1)家蚕抗菌肽BmcecA2基因
扩增引物：
BmcecA2-S，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
BmcecA2-A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
扩增所得家蚕抗菌肽BmcecA2基因编码成熟肽的cDNA长度为131bp。
(2)家蚕抗菌肽BmcecB1基因
扩增引物：
BmcecB1-S，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
BmcecB1-A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
扩增所得家蚕抗菌肽BmcecB1基因编码成熟肽的cDNA长度为130bp。
(3)家蚕抗菌肽Cecropin D基因
扩增引物：
Cecropin D-S，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
Cecropin D-A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
扩增所得家蚕抗菌肽Cecropin D基因编码成熟肽的cDNA长度为117bp。
(4)家蚕多肽BmcecE基因
扩增引物：
BmcecE-S，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
BmcecE-A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
扩增所得家蚕多肽BmcecE基因编码成熟肽的cDNA长度为130bp。
上述各引物中，CCATGG为Nco I酶切位点，CTCGAG为Xho I酶切位点，TCA为终止子。
2、重组表达载体质粒的构建，转化体菌株的获得
通过上述PCR引物上添加的两个限制性内切酶位点Nco I和Xho I，将上述扩增所得四个基因的cDNA片段分别连接到表达载体pET-32a(+)质粒中，构建得到重组表达载体质粒：质粒pET-32a(+)-BmcecA2、pET-32a(+)-BmcecB1、pET-32a(+)-Cecropin D和pET-32a(+)-BmcecE。
将上述重组表达载体质粒分别转化E.coli Rosetta TM(DE3)受体菌后，经过常规PCR鉴定和测序鉴定，获得含有重组表达载体质粒的转化体菌株pET-32a(+)-BmcecA2/E.coli Rosetta TM(DE3)、pET-32a(+)-BmcecB1/E.coliRosetta TM(DE3)、pET-32a(+)-Cecropin D/E.coli Rosetta TM(DE3)和pET-32a(+)-BmcecE/E.coli Rosetta TM(DE3)。
3、蛋白表达
将上述各含有重组表达载体质粒的转化体菌株分别进行靶蛋白BmcecA2(B1，E，D，D1)的诱导表达培养(起始菌液OD6000.8，IPTG浓度0.6mmol/L诱导4h)，对培养物经溶菌酶裂解、超声波破碎，离心收集含有主要以可溶性形式表达的家蚕抗菌肽BmcecA2(家蚕抗菌肽BmcecB1、家蚕抗菌肽Cecropin D或家蚕抗菌肽BmcecE)融和蛋白的上清。
在本实施例中，家蚕抗菌肽BmcecA2(家蚕抗菌肽BmcecB1、家蚕抗菌肽Cecropin D或家蚕抗菌肽BmcecE)的cDNA序列被插入表达载体pET-32a(+)的Nco I和Xho II之间，使其与硫氧还蛋白(Trx)基因融合表达，在其表达的融和蛋白中存在Trx-His·Tag-Thrombin-S·Tag-EK切割位点，所以，对含有家蚕抗菌肽BmcecA2(家蚕抗菌肽BmcecB1、家蚕抗菌肽Cecropin D或家蚕抗菌肽BmcecE)的融和蛋白上清，首先通过融和蛋白中的His·Tag(组氨酸标签)与Ni-NTA亲和层析柱的特异结合和Sephadex G-10层析脱盐处理的分离纯化，获得家蚕抗菌肽BmcecA2(家蚕抗菌肽BmcecB1、家蚕抗菌肽CecropinD或家蚕抗菌肽BmcecE)融和蛋白的纯化样品，Sephadex G-10层析脱盐纯化的电泳图如图1所示。
由肠激酶(EK)对上述家蚕抗菌肽BmcecA2(家蚕抗菌肽BmcecB1、家蚕抗菌肽Cecropin D或家蚕抗菌肽BmcecE)融和蛋白的纯化样品在EK切割位点进行切割，然后对切割产物分别进行2次分子超滤，即用截留分子量10.0kD的超滤管过柱除去10.0kD以上的硫氧还蛋白(Trx)，收集下部溶液，再用截留分子量为3kD的超滤管过柱获取分子量约为4.0kD的家蚕抗菌肽BmcecA2(家蚕抗菌肽BmcecB1、家蚕抗菌肽Cecropin D或家蚕抗菌肽BmcecE)的单一蛋白质，如图2所示。
从图1和图2可以看出，家蚕BmcecE基因表达的蛋白质，其大小和家蚕抗菌肽BmcecA2、家蚕抗菌肽BmcecB1以及家蚕抗菌肽Cecropin D相同。
实施例3抗菌活性
本实施例对实施例2中获得的家蚕抗菌肽BmcecA2(家蚕抗菌肽BmcecB1、家蚕抗菌肽Cecropin D或家蚕抗菌肽BmcecE)的单一蛋白质，采用常规的琼脂板孔穴扩散法(平板抑菌圈法)和常规的最小抑制浓度法(MIC)，以如下5种革兰氏阴性(G-)、阳性(G+)细菌作为受试菌，进行抗菌活性的试验，结果如表1和表2所示。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(G+)
大肠杆菌K12D31(Escherichia coli K12D31)(G-)
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(G-)
灵菌败血病菌(Seiiatio maicesceis)(G-)
青枯菌(Ralstonia dolaanacearum)(G-)
表1抑菌圈直径(mm)
供试菌 BmcecB1 Cecropin D BmcecA2 BmcecE CK 苏云金芽孢杆菌 5.167±0.153 4.000±0.265 3.033±0.208 6.033±0.153 - 大肠杆菌K12D31 8.600±0.200 5.100±0.173 3.967±0.208 4.033±0.252 - 灵菌败血病菌 5.267±0.153 3.133±0.208 - 3.067±0.153 - 绿脓杆菌 6.933±0.153 4.133±0.208 3.100±0.200 4.133±0.208 - 青枯菌 6.067±0.252 4.933±0.231 4.167±0.252 3.000±0.200 -
上述表1中，样品浓度为5μmol/L，CK是对照(灭菌双蒸水)，-表示没有抗菌活性，表中数值表示的是三次重复的平均数±标准误。
表2最小抑制浓度(MIC)(μM)
供试菌 BmcecB1 Cecropin D BmcecA2 BmcecE 苏云金芽孢杆菌 1.25 1.25 2.5 1.25 大肠杆菌K12D31 0.625 1.25 2.5 2.5
供试菌 BmcecB1 Cecropin D BmcecA2 BmcecE 灵菌败血病菌 0.625 2.5 - 2.5 绿脓杆菌 0.625 1.25 2.5 2.5 青枯菌 1.25 1.25 2.5 2.5
上述表2中，-表示没有进行MIC测定。
从表1和表2可以看出：在以10μL相同浓度(5μmol/L)抗菌肽的生测结果中，蚕抗菌肽BmcecA2、家蚕抗菌肽BmcecB1、家蚕抗菌肽Cecropin D4和家蚕多肽BmcecE对5种受试菌均显示明显的抗菌活性。
结合实施例2和实施例3的研究结果，实施例1的家蚕多肽BmcecE属于家蚕Cecropins家族，为新发现的一种抗菌肽。
家蚕抗菌肽及其cDNA序列与应用序列表
SEQUENCE LISTING
<110>暨南大学、西南大学、华南农业大学
<120>家蚕抗菌肽及其cDNA序列与应用
<130>
<160>11
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>120
<212>DNA
<213>家蚕(Bombyx mori)
<400>1
agatggaaga ttttcaagaa aatcgaaaag gtgggtcaga acattcgtga tgggataatc 60
aaggctggac cagctgtcgc ggtggtaggg caggcggcga ccatcgctca cgggaaataa 120
<210>2
<211>120
<212>DNA
<213>家蚕(Bombyx mori)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(117)
<400>2
aga tgg aag att ttc aag aaa atc gaa aag gtg ggt cag aac att cgt 48
Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg
1 5 10 15
gat ggg ata atc aag gct gga cca gct gtc gcg gtg gta ggg cag gcg 96
Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala
20 25 30
gcg acc atc gct cac ggg aaa taa 120
Ala Thr Ile Ala His Gly Lys
35
<210>3
<211>39
<212>PRT
<213>家蚕(Bombyx mori)
<400>3
Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg
1 5 10 15
Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala
20 25 30
Ala Thr Ile Ala His Gly Lys
35
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
catgccatgg ttaggtggaa actcttcaag 30
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gatatctcga gtcataagga tttcgcttgc cctatg 36
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
catgccatgg ttaggtggaa gatcttcaag 30
<210>7
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gaccctcgag tcagatagct ttagccgaac caagg 35
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cagtccatgg gcaacttctt caaggatc 28
<210>9
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ccgctcgagt cattgtccga gagcttttgc ttttg 35
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
catgccatgg ttagatggaa gattttcaag 30
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
atatctcgag tcagatggtc gccgcctgcc 30