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一类¹⁸F标记对硝基苯甲酰基氨基酸类化合物及其制备方法和应用 
    技术领域：

    本发明涉及一类新型¹⁸F标记对硝基苯甲酰基氨基酸类化合物及其化学制备方法和作为正电子发射断层显像(PET)的肿瘤(尤其是脑肿瘤)显像剂的应用。 

    背景技术：

    肿瘤的早期诊断是当今医学的一大热点，而正电子发射断层显像(PET)作为一种越来越普及的手段受到极大重视，因而肿瘤的早期诊断的突破有赖于PET肿瘤显像剂的开发。 

    放射性核素¹⁸F因为其优良的核素性质，非常适合作为PET的显像核素。 

    目前应用最广的发射正电子的放射性药物是¹⁸F‑脱氧葡萄糖(¹⁸F‑FDG)，已广泛应用于肿瘤、冠心病及神经精神疾病的研究和临床诊断。但由于正常脑组织对FDG的摄入量较大，非肿瘤组织及炎症细胞成分中也有较高的FDG吸收，致使FDG用于脑瘤显像时可能因为存在炎症而造成肿瘤诊断的假阳性结果。而氨基酸在正常脑组织的吸收很少，因此引起广泛兴趣。它作为肿瘤显像剂的依据是肿瘤增殖可能会引起氨基酸积累水平增高，以提供蛋白质生物合成的基本单元。另外，某些标记的氨基酸衍生物虽然并不参与蛋白质的合成，但是只要能被肿瘤组织的输运体系所输运，也是可以作为显像剂的，因此经放射性核素标记的某些氨基酸衍生物也有可能成为肿瘤显像剂。 

    目前，已经有一些¹⁸F标记的氨基酸被合成出来，并在生物学评价中显示出较好的结果，如O‑(2‑[¹⁸F]氟乙基)‑L‑酪氨酸([¹⁸F]FET)、O‑(3‑¹⁸F‑氟代丙基)‑L‑酪氨酸([¹⁸F]FPT)，显示了¹⁸F标记氨基酸衍生物作为PET肿瘤显像剂的潜力。 

    发明内容：

    第一、本发明提供了肿瘤摄取高、特异性好的放射性⁸F标记对硝基苯甲酰基氨基酸类化合物。 

    其特征在于：一端具有2‑氟18‑4‑硝基苯甲酰结构；另一端具有α‑氨基酸结构，有取代基R位于羧基α位上，为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苄基、2‑甲硫基乙基、羧乙基、羧丙基、苯基、咪唑甲基。两端结构通过酰胺键直接相连。其结构如式A： 

    

    式A

    其制备主要分为标记前体化合物的合成及前体化合物的¹⁸F标记和后处理两个部分。具体步骤如下： 

    一.标记前体化合物(式B)的合成 

    

    式B 

    合成路线如式C所示： 

    

    

    式C 

    1)2，4‑二硝基苯甲酸的合成(式D)

    在三颈烧瓶中，将2，4‑二硝基甲苯5.5克(0.03mol)加于吡啶30ml和水50mL中，加热，将温度维持在78‑83℃，分批加入高锰酸钾32克(0.202mol)，在6‑8h加完，再用水10ml将粘在冷凝管末端内壁的高锰酸钾冲入瓶中，继续反应3h，待高锰酸钾全部退色为止，趁热抽滤，用少量水洗涤，冷至室温，减压蒸馏，除去吡啶，至溶液不显碱性，冷却，抽滤，用35％的盐酸调节pH值至5，析出棕黄色固体为杂质，抽滤除去，再调节PH值至2，析出淡黄色固体，用水和乙醇得混合溶剂重结晶，得淡黄色针状晶体，产率31％。 

    

    式D 

    2)氨基酸羧基的甲酯化保护(式E) 

    氨基酸0.02mol加入到无水甲醇20mL中，冰浴冷却后，缓慢滴加SOCl₂2.1mL，滴加过程中保持反应体系的温度不超过10℃，滴加完成后低温保持反应30min后升温到室温反应过夜后，旋去过量的SOCl₂和甲醇，得到白色固体，以乙醚充分洗涤后晾干，并以无水乙醇或者无水乙醇和无水乙醚的混合溶剂重结晶，得到白色固体即为氨基酸甲酯盐酸盐。产率70‑80％。 

    

    式E 

    3)2，4‑二硝基苯甲酰氨基酸甲酯的合成(式F)

    氨基酸甲酯盐酸盐3mmol溶解到20mL二氯甲烷中后，一次性加入重蒸三乙胺0.42mL(3mmol)后搅拌反应5min，加入2，4‑二硝基苯甲酸2mmol和HOBt(1‑羟基苯并三氮唑)0.298克(2.2mmol)，反应混合物冷却到0℃后，滴加DCC0.46克(2.2mmol)的二氯甲烷溶液5mL，滴加完毕后继续低温反应0.5h后升 温至室温反应过夜，TLC显示反应结束后，抽滤除去生成的大量白色沉淀状态的副产物DCU，有机相以水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤后无水硫酸钠干燥，旋去溶剂后得到油状物，硅胶柱柱层析，洗脱剂(以酸乙酯:石油醚＝1:3)后得到黄色固体，用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂重结晶得淡黄色固体，产率约40％。 

    

    式F 

    二.前体化合物的放射性标记(式G)及水解(式H)

     ¹⁸F^‑被阴离子柱QMA捕获后，用含10mg K2.2.2和3mg K₂CO₃的1mL乙腈和0.5mL水的混合液将其冲洗到反应瓶中，向反应瓶中加入0.5mL的无水乙腈，加热到100℃，不断的通入氮气，利用乙腈和水共沸除水，待将溶剂吹干后，再分别加入0.5mL的无水乙腈，重复此操作两次，将5mg权利要求2所述的前体化合物溶于无水N，N‑二甲基甲酰胺溶液倒入反应瓶中，迅速升温至125℃，维持该温度反应30min左右，停止反应，加入大约10mL水将反应体系稀释，再通过Sep‑Pak C18柱，将滤液收集到1号瓶中(主要是没有参与反应的¹⁸F^‑)，然后再用10ml水洗涤柱子，将滤液收集到2号瓶中(确保将没有参与反应的¹⁸F彻底淋洗干净)，用氮气将Sep‑Pak C18柱吹干，用2ml乙腈洗涤C18柱，将滤液收集到3号瓶中，得到 ¹⁸F标记中间产物，经HPLC(带放射性探头)分离纯化，用氮气将溶液中的乙腈吹干后，在水和甲醇的混合溶液中用一定量的氢氧化锂水解，再用一定量的1mol/L的盐酸酸化，得到¹⁸F标记终产物，整个反应过程约需要60min。 

    

    式G

    

    式H 

    第二、本发明上述¹⁸F标记对硝基苯甲酰基氨基酸类化合物作为PET肿瘤显像剂的应用。 

    本发明具有以下优良特性： 

    1)本发明中用于进行¹⁸F标记前体化合物合成简便，原料廉价易得。标记总时间短，有效放射性损失少。 

    2)本发明的¹⁸F标记的化合物具有适宜肿瘤显像，特别是脑肿瘤显像的优良生物性能。主要有以下几点： 

    2.1本发明的化合物在血液、肌肉组织和脑内清除速率很快，在肿瘤中有较高初始摄取且清除相对较慢，在其它脏器中初始摄取低或清除很快，从而能在注射后较短时间达到一个肿瘤/背景高比值的时段，尤其是在半小时和一小时之间，肿瘤和相关组织的比值较大，显像效果属于最佳范围。有实验为证： 

    按实施例制得的¹⁸F标记化合物的乙腈溶液，用氮气吹干乙腈，再用生理盐水将产物稀释为8‑10μCi/0.1ml作为注射液。取出三份0.1ml的注射液，分别加入9.9ml生理盐水，混匀后，从每份中分别再取出0.1ml，作为标准溶液，待测定小鼠各组织和脏器的放射性计数的同时测定其放射性计数，取平均值即1％ID使用。 

    将昆明鼠随机分为五组，每组3只。从尾静脉注射¹⁸F标记产物的注射液0.1ml(8‑10μCi)，分别于注射后的5min、15min、30min、60min、120min将各组小鼠断头处死，将其迅速解剖，取脑、心、肝、肺、肾、后腿骨、肌肉、小肠、大肠、脾、血液、肿瘤等组织和脏器，擦干后称重，并测量其各自的放射性计数，计算出其各组织和脏器的放射性摄取量％ID/g，每次实验取三组平行数据。 

    R基取异丙基的化合物实验结果如表1所示： 

    表1 ¹⁸F标记产物(R为异丙基)的荷S180瘤小鼠的体内生物分布数据(％ID/g±SD，n＝3)

    

    

    从表1所列数据可以看出，肿瘤中的初始摄取量为1.37％ID/g，，在30min时保留了41％的放射性活度，在60min时有20％的放射性活度残留。同时，脑中的初始摄取量仅为0.15％ID/g，在30min、60min时分别有27％、20％的放射性活度残留。30min、60min时的肿瘤/脑的放射性活度摄取量比值分别为10.40、13.30。肿瘤/血比、肿瘤/肉比的峰值也出现在30min，分别为2.32和2.62。综上，该化合物具有较高的肿瘤/背景区分度，适合肿瘤显像。 

    此外，肿瘤/脑、肿瘤/血、肿瘤/肉的比值直到60min还能维持在较高水平分别为9.99、1.83和1.74，因此能提供充足的显像时间。如表2所示： 

    表2 ¹⁸F标记产物(R为异丙基)在荷S180瘤小鼠体内的T/B比值 

    

    2.2与目前技术相比，本发明的¹⁸F标记化合物具有创新性，体现在生物性能一些方面的明显的优势，举例如下： 

    2.2.1与目前临床上PET肿瘤显像应用最广泛的¹⁸F‑FDG相比，本发明的¹⁸F标记化合物在肿瘤与脑正常组织的区分上，有一些方面的优势。有实验为证： 

    按2.1相同实施方法进行¹⁸F‑FDG的荷瘤小鼠体内分布实验，整理数据后得到的¹⁸F‑FDG的肿瘤/脑比值如表3所示： 

    表3 ¹⁸F‑FDG在荷S180瘤小鼠体内的肿瘤/脑比值 

    

    对比表2可以看出，本发明的¹⁸F标记化合物比¹⁸F‑FDG的肿瘤/正常脑组织区分度好。这使得本发明的¹⁸F标记化合物进行脑肿瘤显像时可能得到比¹⁸F‑FDG更高质量的图像。 

    2.2.2与目前具有很大应用潜力的PET肿瘤显像剂¹⁸F‑FET相比，本发明的¹⁸F标记化合物在肿瘤与正常组织的区分上，也有明显优势。有实验为证： 

    按2.1相同实施方法进行¹⁸F‑FET的荷瘤小鼠体内分布实验，整理数据后得到的¹⁸F‑FDG的肿瘤/正常组织比值如表4所示：

    表4 ¹⁸F‑FET在荷S180瘤小鼠体内的T/B比值 

    

    对比表2可以看出，本发明的¹⁸F标记化合物在30‑60min区段各项T/B比值均高于¹⁸F‑FET相应值，特别是肿瘤/脑比值更是后者的3倍以上。虽然在60‑120min，¹⁸F‑FETT/B比值稳定在30‑60min水平甚至还有所增加，但考虑到全身分布速率、正常注射剂量的大小及放射性药物按放射性指数衰变规律损失的特性，最佳显像时间应在注射后30‑60min，而在此区间，本发明的¹⁸F标记化合物各项T/B比值对¹⁸F‑FET具有明显优势，这使得本发明的¹⁸F标记化合物进行肿瘤显像特别是脑肿瘤显像时可能得到比¹⁸F‑FDG更高质量的图像。 

    根据对荷S180瘤小鼠体内分布实验的研究，我们进一步进行了对荷荷神经胶质瘤小鼠体的内分布研究，结果与荷S180瘤小鼠体内的分布有许多近似性，其结果见表5和表6。 

    表5 ¹⁸F标记产物(R为异丙基)的荷神经胶质瘤小鼠的体内生物分布数据(％ID/g±SD，n＝3)

    

    表6 ¹⁸F标记产物(R为异丙基)在荷神经胶质瘤小鼠体内的T/B比值 

    

    表7 ¹⁸F‑FET的荷神经胶质瘤[glioma(9L)]小鼠的体内生物分布数据(％ID/g±SD，n＝4)

    Biodistribution data of[¹⁸F]ortho‑FET([¹⁸F]I)in rats bearing 9L turnor 

    

    (Number of rats/group：n＝4.Datar eprescnt as means±SD). 

    从表5、表6和表7的生物分布可以发现，在30min左右时本发明的¹⁸F标记对硝基苯甲酰基氨基酸类化合物各项T/B比值对¹⁸F‑FET优势明显，进一步证明它们将是非常有潜力的脑肿瘤显像剂。 

    综上所述，本发明所提供的¹⁸F标记对硝基苯甲酰基氨基酸类化合物与现有技术相比，既具有更优的生物分布区别度，具有作为肿瘤显像剂特别是脑肿瘤显像剂的潜力，又具有制备简单、标记率高的特点。 

    具体实施方式：

    以下通过具体实施方式可以使本发明得到更清楚的说明，但本发明并不局限于以下实施例。 

    实施例 

    按照以下步骤制备的是式A中R基为异丙基的化合物，包括标记前体(式B中R取异丙基的化合物)的合成和前体化合物的¹⁸F标记、水解两个部分。 

    1)标记前体(式B中R取异丙基的化合物)的合成 

    1.12，4‑二硝基苯甲酸的合成(式H)

    在三颈烧瓶中，将2，4‑二硝基甲苯5.5克(0.03mol)加于吡啶30mL和水50mL中，加热，将温度维持在78‑83℃，分批加入高锰酸钾32g(0.202mol)，在6‑8h加完，再用水10ml将粘在冷凝管末端内壁的高锰酸钾冲入瓶中，继续反应3h，待高锰酸钾全部退色为止，趁热抽滤，用少量水洗涤，冷至室温，减压蒸馏，除去吡啶，至溶液不显碱性，冷却，抽滤，用35％的盐酸调节PH值至5，析出棕黄色固体为杂质，抽滤除去，再调节pH值至2，析出淡黄色固体，用水和乙醇得混合溶剂重结晶，得淡黄色针状晶体，产率31％。m.p：177‑179℃；IR(KBr，cm^‑1)：v3443，3096，1674，1614，1602，1537，1354。 

    

    式I

    1.23‑甲基‑2‑氨基丁酸甲酯盐酸盐的合成(式J) 

    3‑甲基‑2‑氨基丁酸(缬氨酸)0.02mol加入到无水甲醇20mL中，冰浴冷却后，缓慢滴加SOCl₂2.1mL，滴加过程中保持反应体系的温度不超过10℃，滴加完成后低温保持反应30min后升温到室温反应过夜后，旋去过量的SOCl₂和甲醇，得到白色固体，以乙醚充分洗涤后晾干，并以无水乙醇或者无水乙醇和无水乙醚的混合溶剂重结晶，得到白色固体即为3‑甲基‑2‑氨基丁酸甲酯盐酸盐。产率70‑80％。m.p：156‑158℃；IR(KBr，cm^‑1)：v3432，1740，1265。 

    

    式J 

    1.32‑(2，4‑二硝基)苯甲酰胺基‑3‑甲基丁酸甲酯的合成(式K)

    3‑甲基‑2‑氨基丁酸甲酯盐酸盐0.504克(3mmol)溶解到20mL二氯甲烷中后，一次性加入重蒸三乙胺0.42mL(3mmol)后搅拌反应5min，加入2，4‑二硝基苯甲酸0.424克(2mmol)和HOBt(1‑羟基苯并三氮唑)0.298克(2.2mmol)，反应混合物冷却到0℃后，滴加DCC0.46克(2.2mmol)的二氯甲烷溶液5mL，滴加完毕后继续低温反应0.5h后升温至室温反应过夜，TLC显示反应结束后，抽滤除去生成的大量白色沉淀DCU，有机相以水，饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液洗涤后无水硫酸钠干燥，旋去溶剂后得到油状物，硅胶柱柱层析，洗脱剂(以酸乙酯:石油醚＝1:3)后得到黄色固体，用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂重结晶得淡黄色固体0.25克，产率38％。m.p：127‑128℃；IR(KBr，cm^‑1)：v3276，3108，2964，1747，1731，1679，1652，1605，1545，1348，1266；¹HNMR(500MHz，CDCl₃)；δ8.95(s，1H，Ar‑H)，8.56(d，2H，J＝8.3Hz，Ar‑H)，7.80(d，2H，J＝8.3Hz，Ar‑H)，6.54(m，1H，NH)，4.81(m，1H，NHCHCOOCH₃)，3.83(s，3H，OCH₃)，2.37(m，1H，CH(CH₃)₂)，1.05(m，6H，CH(CH₃)₂)；¹³CNMR(125MHz，CDCl₃)：δ171.83，164.11，148.49，146.91，137.62，130.31，128.08，120.19，57.90，52.54，33.91，31.43，18.83，17.80。 

    

    式K 

    2)前体的标记的¹⁸F标记(式L)和水解(式M)

     ¹⁸F^‑被阴离子柱QMA捕获后，用含10mg K2.2.2和3mg K₂CO₃的1mL乙腈和0.5mL水的混合液将其冲洗到反应瓶中，向反应瓶中加入0.5mL的无水乙腈，加热到100℃，不断的通入氮气，利用乙腈和水共沸除水，待将溶剂吹干后，再分别加入0.5mL的无水乙腈，重复此操作两次，将5mg2‑(2，4‑二硝基)苯甲酰胺 基‑3‑甲基丁酸甲酯溶于无水N，N‑二甲基甲酰胺溶液倒入反应瓶中，迅速升温至125℃，维持该温度反应30min左右，停止反应，加入大约10mL水将反应体系稀释，再通过Sep‑Pak C18柱，将滤液收集到1号瓶中(主要是没有参与反应的¹⁸F^‑)，然后再用10mL水洗涤柱子，将滤液收集到2号瓶中(确保将没有参与反应的¹⁸F^‑彻底淋洗干净)，用氮气将Sep‑Pak C18柱吹干，用2mL乙腈洗涤C18柱，将滤液收集到3号瓶中，得到2‑(2‑氟18‑4‑二硝基)苯甲酰胺基‑3‑甲基丁酸甲酯，经HPLC(带放射性探头)分离纯化(HPLC条件：流速1mL/min，流动相为乙腈：水＝70％：30％，保留时间为7.3min)，用氮气将溶液中的乙腈吹干后，在水和甲醇的混合溶液中用一定量的氢氧化锂水解，再用一定量的1mol/L的盐酸酸化，得到2‑(2‑氟18‑4‑二硝基)苯甲酰胺基‑3‑甲基丁酸，整个反应过程需要60‑80min。HPLC(带放射性探头)显示，放化纯度>99.5，可以直接进行生物分布实验(HPLC条件：流速1mL/min，流动相为乙腈：水＝70％：30％，保留时间为3.0min)。 

    

    式L 

    

    式M 

    脂水分配系数是生物活性化合物的一项重要理化参数，对2‑(2‑氟18‑4‑二硝基)苯甲酰胺基‑3‑甲基丁酸脂水分配系数测定实施如下： 

    在离心试管中依次加入2ml正辛醇和1.9mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，以及放射性活度约为8‑10μCi的2‑(2‑氟18‑4‑二硝基)苯甲酰胺基‑3‑甲基丁酸的0.1mL水溶液，充分振荡后离心分层5min，分别取有机相和水相各0.1mL于干净试管中，分别测定其放射性计数N，计算分配系数P＝N_有/N_水，重复本操作3次后取平均值，对P取对数，logP即为该¹⁸F标记产物的脂水分配系数。测得2‑(2‑氟18‑4‑二硝基)苯甲酰胺基‑3‑甲基丁酸的脂水分配系数为‑0.25。 

    异常毒性检查： 

    按中华人民共和国药典2005年版所述方法进行。将10只正常昆明小鼠(18‑20g)尾静脉注入0.5mL(37MBq)2‑(2‑氟18‑4‑二硝基)苯甲酰胺基‑3‑甲基丁酸注射液(相当于数百倍于成人用量)，观察48小时。小鼠生长正常，无死亡及不良反应现象发生。解剖后观察，未见任何器官损伤。异常毒性检查符合放射性药物质量要求。