凤阳产气霉制剂.pdf

本发明公开了一种凤阳产气霉制剂，凤阳产气霉制剂为凤阳产气霉的固体发酵产物；固体发酵产物的制备方法为：将凤阳产气霉的一级发酵种子接种于发酵基质上进行发酵，得固体发酵产物。或者凤阳产气霉制剂为将固体发酵产物进行营养液包衣并风干后的所得物；制备方法为：将固体发酵产物按照1g:0.9～1.1ml的固液比浸泡于灭菌后营养液中，浸泡时间为10～12小时；将浸泡后所得的固体发酵产物风干至含水率为6％～10％。本发明的凤阳产气霉制剂实际使用时，在每10升容器内放置30～80克的凤阳产气霉制剂，就能对容器内的物质产生保鲜防腐杀菌的作用。

1.  凤阳产气霉制剂，其特征是：凤阳产气霉制剂为凤阳产气霉的固体发酵产物；所述凤 阳产气霉固体发酵产物的制备方法为包括以下步骤：
将凤阳产气霉的一级发酵种子按照10～20ml:100g的用量比接种于发酵基质上进行发酵， 发酵工艺为：于24.5～25.5℃黑暗静培养，培养时间为8～10天；得固体发酵产物。

2.  根据权利要求1所述的凤阳产气霉制剂，其特征是：所述凤阳产气霉制剂为将固体发 酵产物进行营养液包衣并风干后的所得物；制备方法为：
配制营养液，所述营养液为以下任意一种：3％～5％的海藻糖水溶液、3％～5％的海藻 酸钠水溶液、0.1％～0.2％黄原胶水溶液、水，上述％均为质量％；
将固体发酵产物按照1g:0.9～1.1ml的固液比浸泡于灭菌后营养液中，浸泡时间为10～12 小时；
将浸泡后所得的固体发酵产物风干至含水率为6％～10％；风干后产物为凤阳产气霉制 剂。

3.  根据权利要求2所述的凤阳产气霉制剂，其特征是：将凤阳产气霉制剂进行包装处理； 所述包装处理包括抽真空和塑封处理。

4.  根据权利要求1、2或3所述的凤阳产气霉制剂，其特征是：所述发酵基质为麦粒固 体发酵培养基或低成本发酵培养基；
所述麦粒固体发酵培养基的制备方法为：将麦粒放入水中浸泡7～9h，将浸泡后所得的麦 粒进行灭菌；
所述低成本发酵培养基的制备方法为：配制原料，所述原料由以下重量含量的成分组成： 40％麸皮、20％豆饼、30％玉米粒和10％米糠；将原料与去离子水按照1g：1ml的比例混合后 进行灭菌。

5.  根据权利要求4所述的凤阳产气霉制剂，其特征是：
凤阳产气霉的一级发酵种子的制备方法为：将ZJL024菌于PDB培养液中，200r/min、 黑暗25℃培养6天，得一级发酵种子。

6.  根据权利要求5所述的凤阳产气霉制剂，其特征是：所述凤阳产气霉制剂的保存温度 为4℃。

凤阳产气霉制剂
技术领域
本发明涉及生物农药领域，尤其是提供一种内生真菌制剂，更确切的说，是能够产生抑 菌活性气体的凤阳产气霉制剂。
背景技术
产气霉(Muscodor spp.)(现在也称麝香霉)是一类属于炭角菌科的内生真菌，最早由 Worapong等(2001)从肉桂树分离所得，其显著特征是能产生挥发性有机化合物(volatile  organic compounds，简称VOCs)，这些VOCs具有广泛的生物活性，能抑制或杀死许多病原 真菌、病原细菌和一些昆虫。而后，人们利用其特有的形态学、生理学、生物化学方面的特 征及核糖体RNA的序列来寻找和鉴定新的产气霉属内生真菌，越来越多的产气霉种被发现。 由于产气霉能产生有广泛抑菌活性的VOCs，科学家们利用GC-MS等化学分析手段分离鉴定 了产气霉产生的VOCs成分，发现不同菌株产生的VOCs成分不尽相同。
生物制剂的开发中非常重要的环节是通过发酵规模化生产。发酵分为固体发酵和液体发 酵。固体发酵(solid-state fermentation，SSF)是在指不存在或几乎没有自由水(基质必须具 有足够的湿度支持微生物的生长和代谢)的条件下进行发酵。(Pandey等，1992；1994；2000； 2001)。从生物反应过程的角度考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程，我们可以 认为固体发酵是一种在培养基为固体载体的基础上进行利用的一种发酵手段(Mitchell等， 2000)。
固体发酵与液体发酵相比有许多显著的优点：发酵原料成本低(经常是农业废弃物)，能 源消耗低，操作简单，较少的废水产生；对无菌要求相对较低，不易发生大面积的污染；单 位体积的产量高，能用较小的反应器进行发酵；并且对环境友好，因为此技术解决了固体废 弃物的处置问题(Pandey等，2008；Matthew等，2009)。SSF由于发酵环境类似于微生物 的自然习惯，对于微生物来说，SSF十分适合其生长并且能产生有价值的副产品。固体发酵 已经成为一种应用于生产微生物产品如饲料、燃料、工业化学品和医药产品的有潜力的技术。
关于固体发酵的发展可追溯至20世纪50年代。利用真菌培养转化类固醇，利用SSF生 产出霉菌毒素产物，固体发酵生产富含蛋白质的牛饲料(此过程中包括了农用工业废渣的利 用，因此提供了对低成本废渣增值的独特工艺开发，Singhania等，2009)；这一系列固体发 酵的成果引起了研究者们对SSF的兴趣，SSF取得了空前的发展(Singhania等，2009)。关 于SSF的基础研究、生物反应器的发展、建模和生产不同的微生物产品(如食物、饲料、不 同的基础和次级代谢产物以及如生物浸出、生物制浆、生物修复、生物选矿的生物过程)等 方面产生了大量研究。
至今，有许多人研究影响固体发酵进程的生物化学和工程学的因素(Mitchell等，2000a， 2000b；Pandey，2003)，虽然SSF中的许多技术细节仍未得到解决(等，2004)，但SSF 在生物技术中的运用仍十分广泛(Raimbault等，1998；Pandey等，2000a，2001b)。毒素、细 菌内毒素、植物生长因子、抗生素、免疫抑制药物、生物碱，这些重要的生物活性物质已经 被广泛报道通过SSF生产。工业酶，如淀粉酶，纤维素酶，木聚糖酶，蛋白酶，植酸酶，脂 肪酶等，有机酸如柠檬酸和乳酸等也已通过SSF大量生产(Krishna等，2005)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种凤阳产气霉制剂。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种凤阳产气霉制剂，该凤阳产气霉制剂为凤阳产气 霉的固体发酵产物；所述凤阳产气霉固体发酵产物的制备方法为包括以下步骤：
将凤阳产气霉的一级发酵种子(即液体发酵种子)按照10～20ml:100g(较佳为20ml:100g) 的用量比接种于发酵基质上进行发酵，发酵工艺为：于24.5～25.5℃(较佳为25℃)黑暗静培 养，培养时间为8～10天；得固体发酵产物。该固体发酵产物能直接作为凤阳产气霉制剂。
作为本发明的凤阳产气霉制剂的改进：所述凤阳产气霉制剂为将固体发酵产物进行营养 液包衣并风干后的所得物；制备方法为：
配制营养液，所述营养液为以下任意一种：3％～5％的海藻糖水溶液、3％～5％的海藻 酸钠水溶液、0.1％～0.2％黄原胶水溶液、水(较佳)，上述％均为质量％；
将固体发酵产物按照1g:0.9～1.1ml(较佳为1g:1ml)的固液比浸泡于灭菌后营养液中， 浸泡时间为10～12小时(较佳为10小时)；
备注说明：将营养液经常规灭菌(于121℃、1.1个大气压灭菌20min)，得灭菌后营养液；
将浸泡后所得的固体发酵产物风干(超净工作台风干)至含水率为6％～10％(较佳为 8％，％为质量％)；风干后产物为凤阳产气霉制剂。
作为本发明的凤阳产气霉制剂的进一步改进：将凤阳产气霉制剂进行包装处理；所述包 装处理包括抽真空和塑封处理。
作为本发明的凤阳产气霉制剂的进一步改进：所述发酵基质为麦粒固体发酵培养基或低 成本发酵培养基；
所述麦粒固体发酵培养基的制备方法为：将麦粒放入水中浸泡7～9h，将浸泡后所得的麦 粒进行灭菌(常规方式灭菌2次，即，具体为：于121℃、1.1个大气压灭菌40min)；
所述低成本发酵培养基的制备方法为：配制原料，所述原料由以下重量含量的成分组成： 40％麸皮、20％豆饼、30％玉米粒和10％米糠；将原料与去离子水按照1g：1ml的比例混合后 进行灭菌(常规方式灭菌2次，即，具体为：于121℃、1.1个大气压灭菌40min)。
作为本发明的凤阳产气霉制剂的进一步改进：凤阳产气霉的一级发酵种子(即液体发酵种 子)的制备方法为：将ZJL024菌于PDB培养液中，200r/min、黑暗25℃培养6天，得一级 发酵种子。
作为本发明的凤阳产气霉制剂的制备方法的进一步改进：所述凤阳产气霉制剂的保存温度 为4℃。
本发明所述的凤阳产气霉为Muscodor sp.ZJLQ024(亦名：Muscodor.fengyangensis  ZJLQ024)，在专利号为200910153512.0的发明《Muscodorsp.属植物内生真菌ZJLQ024及其 用途和杀菌剂》中有明确告知，保藏号为CGMCC No.2863。
产气霉因其产生的VOCs对多数细菌、真菌及昆虫具有抑制甚至杀死作用，其作为生物 防治制剂具有很大的应用潜力，目前在农业、医药及工业应用上受到越来越多科技工作者的 重视。
本发明所得的固体发酵产物，可直接使用；本发明所得的固体发酵产物仅仅用灭菌后营 养液浸泡后，也可直接使用。灭菌后营养液浸泡并风干后的凤阳产气霉制剂，使用前需：将 无菌棉花铺在无菌塑料瓶底部，加无菌水浸湿，加入上述凤阳产气霉制剂(灭菌后营养液浸 泡并风干后的凤阳产气霉制剂)，再用水喷洒润湿表面，盖盖。于4℃保存，使用时，即开 即用。
本发明的凤阳产气霉制剂实际使用时，在每10升容器内放置30～80克的凤阳产气霉制剂， 就能对容器内的物质产生保鲜防腐杀菌的作用。
本发明的凤阳产气霉制剂采用固体发酵方式制备而得，具有成本较低、工艺简洁、保鲜 防腐杀菌好的优点。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1：凤阳产气霉ZJLQ024随PDB摇床培养时间变化的生物量；
图2：凤阳产气霉ZJLQ024不同初始接种量发酵不同时间的生物量；
图3：凤阳产气霉ZJLQ024初始接种量为20ml的发酵成品图；
图4：产气霉ZJLQ024固体发酵产物和菌株在PDA上的抑菌活性；
图4中，从左至右的每列分别代表ck、5mm凤阳产气霉菌饼、以及一粒生长了凤阳产气 霉的麦粒对不同病原菌的对峙生长照片；
图5：在不同基质的培养基上培养凤阳产气霉ZJLQ0246d的核酸A值；
图6：各因素水平对核酸A值的影响；
图7：凤阳产气霉ZJLQ024生物制剂保存方案；
图8：初始含水量(含水率)8％各处理4℃保存不同时间的存活率；
图9：初始含水量8％各处理10℃保存不同时间的存活率；
图10：初始含水量8％各处理25℃保存不同时间的存活率；
图11：初始含水量6％各处理25℃保存不同时间的存活率；
图12：初始含水量10％各处理25℃保存不同时间的存活率；
图13：初始含水量6％4℃保存不同时间的存活率；
图14：初始含水量10％4℃保存不同时间的存活率；
图15：保存3个月的制剂有效成分含量；
图15中，每组从左至右依次为：0.1％黄原胶水溶液、0.2％黄原胶水溶液、3％海藻酸 钠水溶液、5％海藻酸钠水溶液、3％海藻糖水溶液、5％海藻糖水溶液、水；
图16：凤阳产气霉ZJLQ024熏蒸防治苹果青霉病。
具体实施方式
材料：
供试菌株为凤阳产气霉Muscodor.fengyangensis ZJLQ024。凤阳产气霉Muscodor. fengyangensis ZJLQ024在专利号为200910153512.0的发明《Muscodorsp.属植物内生真菌 ZJLQ024及其用途和杀菌剂》中有明确告知，保藏号为CGMCC No.2863。
病原指示菌包括：KH8青霉菌Penicillium expansum；MH10草莓炭疽菌Colletotrichum  fragariae；TZ01桃子褐腐菌Monilinia fructicola；WJ0101灰霉菌Botrytis cinerea；ZAU05立 枯丝核菌Rhizoctonia solani；ZAU22终极腐霉菌Pythium ultimum。
试剂包括海藻糖、海藻酸钠、、黄原胶、5％三氯乙酸等。
本发明所涉及的仪器包括超净工作台、恒温培养箱、电子天平、pH计、烘箱、电磁炉、 微波炉、冰箱、真空干燥箱、GRT-20D型50L固体发酵罐、超声波仪、Agilent 6890N-5975B 型GC-MS仪、MLS3750型高压灭菌锅、BS233S型分析天平、顶空固相微萃取装置等。
本发明涉及五种培养基，分别为PDA培养基、PDB培养基、察氏培养基、冷冻保存培养 基和麦粒固体发酵培养基，其配制方法分别如下：
PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：土豆200g，葡萄糖20g，1.5％的琼脂(即， 琼脂15g)，自来水1000mL。取定量土豆切成均匀小块，加水煮沸至土豆用玻璃棒一戳击破， 8层纱布过滤，加入20g葡萄糖，冷却，加自来水定容至1000mL，三角瓶装1.5％的琼脂， 加入液体，封装，121℃、15min高压灭菌。
PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养基)：土豆200g，葡萄糖20g，自来水1000mL。取定 量土豆切成均匀小块，加水煮沸至土豆用玻璃棒一戳击破，8层纱布过滤，加入20g葡萄糖， 冷却，加自来水定容至1000mL，封装，121℃、15min高压灭菌。
察氏培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫 酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。将离子化合物硝酸钠、磷酸氢二钾、硫 酸镁、氯化钾及硫酸亚铁加离子水配成母液，用无菌过滤器过滤液体。其余如蔗糖，琼脂， 蒸馏水按比例装瓶，121℃、15min高压灭菌。将其溶解后倒在培养皿前，将无机离子化合物 混合液按比例与培养基混合。
冷冻保存培养基(液体)：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酸水解酪蛋白0.5g，丙三醇(甘 油)180mL。用蒸馏水将葡萄糖、酵母提取物、酸水解酪蛋白溶解后，再加入甘油、最后用 蒸馏水定容至1000mL，121℃、灭菌20min。
麦粒固体发酵培养基：取一定量麦粒加自来水浸泡过夜，浸泡时间7-9h左右。倒掉麦粒 多余的水分，100g麦粒装至1L的三角瓶，于121℃、1.1个大气压连续高压灭菌40min。
实施例1、菌株的保存和活化培养(属于常规技术)
1、菌株的常温或低温保存
在超净工作台，于2ml无菌冷冻保存管加入不超过1.5ml融化的PDA培养基，盖盖，倾 斜放置。待凝固后，将保存的菌株(凤阳产气霉Muscodor.fengyangensis ZJLQ024)接种到斜 面培养基，数天后，菌丝成功定殖于斜面，可见新鲜的菌丝长出，加入经3次高压灭菌的石 蜡将菌丝淹没，盖盖，于常温下或10℃冰箱保存。使用时，用无菌牙签挑取菌组织，接种于 平板PDA培养基上进行活化。
2、菌株的冷冻保存
于超净工作台，在PDA上的菌落挖取4-5块菌块，置于2ml无菌冷冻保存管，加入高压 灭菌的冷冻保存液，将菌块淹没。盖盖，将冷冻保存管依次于4℃和-20℃下放置1h后，转移 至-80℃超低温冰箱中进行长期保存。使用时，于室温中自然解冻，挑取其中的菌块接种于平 板PDA培养基上进行活化。
3、菌株的活化
用牙签从保存菌株的冷冻保存管中取得菌块，将其接种到PDA培养基，封口膜封口于 25℃，黑暗培养箱培养。
实施例2、制剂发酵工艺优化
1、一级发酵种子接种种龄优化
本发明采用一级发酵种子用于发酵接种，优选摇瓶发酵接种，而接种种龄一定程度决定 了发酵效率的高低，本发明先优化接种种龄：3块5mm的ZJL024菌饼于100ml PDB培养液中， 200r/min，黑暗25℃培养。定时间取发酵培养的菌丝液过滤，于烘箱(60℃)烘至恒重，称 重量记录数据，绘制生长曲线。发现在摇床200r/min液体发酵凤阳产气霉ZJLQ 024，培养6d 发酵种子活性最强(图1)。6d后菌丝量缓慢增加至第7d达到平台期。
因此，以ZJL024菌饼于PDB培养液中，200r/min，黑暗25℃培养6天所得，作为一级发酵 种子。
2、接种体积和发酵时间优化
分别接种5ml，6ml，8ml，10ml，15ml，20ml，25ml一级发酵种子到装有100g灭菌后 的麦粒(即，麦粒固体发酵培养基)三角瓶(容量1L)中，定时间观察结果，测菌落形成单 位(CFU，Colony-Forming Units)，选取最佳的接种体积。
菌落形成单位(CFU，Colony-Forming Units)指单位体积中的活菌个数。在活菌培养计数 时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形 成单位，以其表达活菌的数量。
测CFU：将不同体积接种液的固体发酵产物在超净工作台取20粒(大小均匀)于已灭菌 的研钵加20ml无菌水，研棒研磨成均匀溶液，取100ul溶液加900ul水，混合均匀后取100ul 涂PDA平板，双层Parafilm封口膜封口，25℃黑暗静止培养，待菌落长出计数。
无论是菌株平皿培养还是发酵培养，菌株都会达到老龄化的阶段，而本发明需要发酵产 物用于后续实验，更倾向于选择活菌数量最多的发酵产物。最佳的培养时间即为得到的发酵 产物活性强、数量多。本实施例通过CFU来得到最佳的优化时间。
先分别接种5ml、6ml、8ml、10ml一级发酵种子到100g麦粒固体发酵培养基(1L三 角瓶)，每隔两天观察发酵进程。其中10ml一级发酵种子能看到菌成功定殖。进一步扩大接 种体积至10ml、15ml、20ml、25ml一级种子发酵筛选最佳的接种体积，发酵过程中每隔 两天观察。结果发现10ml、15ml和20ml接种的菌3-4d成功定殖麦粒，然而25ml的菌需 要5-6d才能定殖。通过每隔两天取0.2g的10ml、15ml、和20ml所对应的发酵产物进行 CFU测定，发现到产气霉菌株的生长平衡期，约8天，接种20ml的培养基中菌落数最多(CFU 含量最高)，因此，接种体积为20ml(图2，图3)，即液体发酵种子的接种量为发酵基质的 20％最为理想；同时通过不同接种量发酵产物，记录不同时期的CFU，绘制生长曲线，从图 2的生长曲线中可明显看出，在8-10d之间，能达到单个接种量在不同生长时期的最高值， 故可确定最佳的发酵培养时间是8-10d(如图2所示)。
3、固体发酵产物/菌株平皿活性测定
取上述最佳培养条件(20％的接种量(即接种20ml一级种子)、25℃黑暗静培养8天)所 得的固体发酵产物(包括麦粒培养物)1粒/凤阳产气霉菌株5mm(实施例1所得)到二格PDA 平皿培养基的其中一格，用双层Parafilm封口膜封住培养皿，25℃黑暗静止培养。4天后将5mm 大小指示菌(ZAU 05立枯丝核菌R.solani，ZAU22终极腐霉菌P.ultimum，KH8青霉菌P. expansum，TZ01桃子褐腐菌M.fructicola，MH10草莓炭疽菌C.fragariae，WJ0101灰霉菌B. cinerea)菌饼接入二格PDA平皿培养基中另一格。以不接ZJLQ024为对照，3次重复，25℃黑 暗静培养，待对照组即将长满平皿的一半时拍照和记录处理组的菌落直径，其中，ZAU 05立 枯丝核菌R.solani对峙生长1天，ZAU22终极腐霉菌P.ultimum对峙生长1天，KH8青霉菌P. expansum对峙生长3天，TZ01桃子褐腐菌M.fructicola对峙生长3天，MH10草莓炭疽菌 C.fragariae对峙生长3天，WJ0101灰霉菌B.cinerea对峙生长2天。
备注说明：图4中，左到右分别是CK，5mm菌饼接种的凤阳产气霉，麦粒培养物(已生 长了凤阳产气霉)一粒，看不同培养条件下的凤阳产气霉的抑菌活性是不是一样，结论是无 论生长在哪里的凤阳产气霉，抑菌效果都是很好的，对所有的病原菌都抑制生长。
具体如下：
褐腐病菌(TZ01)、灰霉病菌(WJ0101)、炭疽病菌(MH10)、终极腐霉(ZAU22)、立枯 丝核菌(ZAU05)和青霉病菌(KH8)在不含产气霉菌的PDA平皿正常生长，而在含产气霉 菌(包括5mm菌饼接种的和源于固体发酵产物的麦粒接种的凤阳产气霉)的PDA平皿均不 生长(图4)，因此产气霉菌对褐腐病菌、灰霉病菌、炭疽病菌、终极腐霉、立枯丝核菌和青 霉病菌的抑菌率均为100％。结果表明，本发明所得的产气霉菌麦粒培养物(固体发酵产物) 具有强烈的抗菌生物活性，与其有效成分菌株ZJLQ024抑菌活性一致。
实施例3、低成本发酵培养基优化
1)培养基基质单因素试验
培养基配方：5g培养基基质(麸皮、玉米粒、豆饼和米糠)，5ml去离子水；封装，121℃ 40min高压灭菌。冷却至室温，接种1ml菌丝液(即，为上述实施例2步骤1所得的一级发 酵种子)于培养基，25℃黑暗静培养。6d后测核酸。
取培养6d的不同培养基基质进行核酸测定，结果显示含有麸皮的培养基基质含核酸A 值最高，与米糠、玉米和豆饼等相比更适合ZJLQ 024的生长(图5)。
2)培养基基质最佳组合的筛选
以麸皮为主基质，玉米粒，豆饼和米糠为因素，设置正交设计表。按照正交设计表的组 合配制10g(5g培养基基质+5ml去离子水)体系培养基，121℃40min高压灭菌，冷却至 室温。接种菌丝液(即，为上述实施例2步骤1所得的一级发酵种子)1ml于培养基，25℃ 黑暗静培养。10d后烘干至恒重，测核酸含量评估发酵效率。
以麸皮为主基质，根据4因素3水平正交设计表(表1)进行培养基基质豆饼、玉米粒、米 糠和麸皮的组合配制培养基加入接种的菌丝液，发酵培养10d，测定核酸A值。将所有得到 的A值进行极差分析，得到因素影响的高低顺序为豆饼＞米糠＞玉米粒，且优选的组合为： 20％豆饼，30％玉米粒，10％米糠。因此10g体系中1g豆饼、1.5g玉米粒、0.5g米糠、2g 麸皮是最佳的培养基基质组合。方差分析结果发现三因素影响均不显著，仅豆饼贡献率为 15.55％，其余两因素为负值，总误差为0.96。具体如表2～表4所述。
表1、L9(3^4)因素水平表