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1、10申请公布号CN102144600A43申请公布日20110810CN102144600ACN102144600A21申请号201110133361X22申请日20110523A01K61/0020060171申请人浙江省海洋水产研究所地址316100浙江省舟山市同济路小西湖弄25号72发明人徐冬冬尤锋楼宝辛俭李军74专利代理机构青岛联智专利商标事务所有限公司37101代理人崔滨生54发明名称一种利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法57摘要本发明提供了一种利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法，它包括对褐牙鲆雌鱼和夏牙鲆雄鱼进行营养调控和光温调控，促进其性腺同步成熟；采集卵子和精子进行。
2、人工受精；受精后3分钟冲洗受精卵，放入网袋中扎紧，受精后5分钟将网袋放入02海水中，放置45分钟后取出，受精卵取出后进行孵化；鉴定鱼苗的染色体倍数；将三倍体牙鲆受精卵进行孵化；培育鱼苗采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料。本发明培育出的鱼苗具有成活率高、抗逆性强、育性低等特点，具有便于现场操作、安全可靠、简单易行等优点，在海水鱼类多倍体诱导和不育鱼苗生产中具有重要应用价值，也在其养殖和育种上具有广阔的推广应用前景。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书5页附图1页CN102144601A1/2页21一种利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法。
3、，其特征在于所述方法包括以下步骤1分别对褐牙鲆雌鱼和夏牙鲆雄鱼进行营养调控和光温调控，促进其性腺同步成熟；2人工杂交选择性腺同步成熟的褐牙鲆雌鱼和夏牙鲆雄鱼，分别采集卵子和精子进行人工受精形成受精卵，受精后开始计时；3冷休克法诱导所述步骤2受精后3分钟用海水冲洗受精卵，然后放入网袋中扎紧，受精后5分钟将网袋放入02海水中，冷休克抑制第二极体排放，放置45分钟后取出，受精卵取出后首先经78海水过渡1015分钟，然后放入1516海水中准备进行孵化；4鉴定将所述步骤3诱导得到的鱼苗利用细胞流式仪法和/或染色体核型分析法抽样检测所述鱼苗的染色体倍数，确定诱导得到的鱼苗是否为异源三倍体鱼苗；5三倍体牙鲆。
4、受精卵的孵化将步骤3诱导的三倍体牙鲆受精卵进行孵化，水温为1516，盐度2832，PH8082，静水微充气；6三倍体牙鲆鱼苗的培育将步骤5孵化后的鱼苗进行培育，培育密度为053万尾/M3，水温为16200，盐度为2832，PH8082；培育过程分为仔鱼前期110日龄、仔鱼后期1115日龄和稚鱼期1635日龄，所述仔鱼前期和仔鱼后期主要以轮虫为饵料，所述稚鱼期以轮虫、卤虫无节幼体和配合饲料为饵料。2根据权利要求1所述的一种利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法，其特征在于所述步骤1中所述褐牙鲆的营养调控是指以冰鲜小黄鱼和鱿鱼为饵料，添加饵料重量的35的维生素C和12维生素E，日投喂2次，所述夏。
5、牙鲆的营养调控是指以沙丁鱼、小黄鱼和鱿鱼为饵料，添加占饵料重量2的康宝A亲鱼营养强化剂，日投喂2次；所述褐牙鲆的光温调控是指光照强度为60650LUX，光照时间由12小时过渡到16小时长光照，水温为14518；所述夏牙鲆的光温调控是指光照强度为60550LUX，光照时间由12小时过渡至8小时短光照，水温为1620；褐牙鲆和夏牙鲆每天上、下午各换水1次，日换水量为200300。3根据权利要求1所述的一种利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法，其特征在于所述步骤2中采用人工挤压腹部法采集卵子和精子。4根据权利要求1所述的一种利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法，其特征在于所述步骤2中人工受精。
6、采用干法受精。5根据权利要求1所述的一种利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法，其特征在于所述步骤3中网袋采用80目160网袋。6根据权利要求1所述的一种利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法，其特征在于所述步骤6中仔鱼前期采用加水培育，每天加水为池水的1020，培育密度23万尾/M3，微弱充气，水温保持在16180；仔鱼后期每天换水两次，每次换水量为池水的3050，逐渐加大充气量，培育密度12万尾/M3，每天吸污一次，培育池水温17190；稚鱼期每天换水两次，每次换水量为池水的50100，培育密度051万尾/M3，每天吸污两次，培育池水温190200。7根据权利要求6所述的一种利用物理方。
7、法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法，其特征权利要求书CN102144600ACN102144601A2/2页3在于所述步骤6中鱼苗12日龄不投饵，314日龄投喂轮虫，1525日龄投喂轮虫和卤虫无节幼体，2630日龄投喂卤虫无节幼体和配合饲料，3135日龄投喂配合饲料，所述轮虫的投喂密度为2040个/ML，所述卤虫无节幼体的投喂密度为515个/ML。8根据权利要求7所述的一种利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法，其特征在于所述步骤6中鱼苗325日龄投喂的轮虫为褶皱臂尾轮虫，投喂前用高浓度小球藻强化12小时20小时。权利要求书CN102144600ACN102144601A1/5页4一种利用物理方。
8、法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法0001技术领域0002本发明涉及一种海水鱼类异源三倍体的育种方法，具体说是利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体并进行人工培育的方法。0003三倍体鱼类，因具有不育性、生长快、抗逆性强和饲养管理容易等优点，因此受到国内外水产工作者的普遍重视。目前国外已经先后在鲑鳟类、鲆鲽类等海水鱼类中诱导出三倍体。国内也成功诱导出了三倍体真鲷PAGROSOMUSMAJOR、黑鲷SPARUSMACROCEPHALUS和大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA等。0004远缘杂交可以把不同种、属的特征和特性结合起来，显著地扩大和丰富鱼类育种的基因库，促进种间基因的交流，引入异种的有利基。
9、因，因而能够创造出前所未有的新变异种类，甚至形成新的物种。因此是鱼类育种中常用的手段之一，广泛应用于养殖的生产实践中。0005褐牙鲆为我国重要的海水养殖鱼类品种之一，但由于种质的退化和养殖环境的恶化等原因，使其病害频发、死亡严重、养殖效益明显下降，因此迫切需要进行品种改良。夏牙鲆（PARALICHTHYSDENTATUS）与褐牙鲆同属不同种，原分布于美国的东部，也是一种重要的经济鱼类。2002年自美国引入我国进行养殖，其适温范围和生长速度较本地褐牙鲆均具有明显优势。为了改变我国养殖褐牙鲆品种单一和种质退化的局面，国内一些学者包括我们开展了褐牙鲆和夏牙鲆的杂交育种研究，获得的杂交F1代表现出生长。
10、速度快、成活率高、抗逆性强、对环境适应性强等特点。将杂交育种和多倍体育种两种方法的优点结合起来，培育异源三倍体鱼苗不仅能够扩大杂交优势，而且生产出不育或育性低的鱼苗可以避免遗传污染问题。目前，关于鲆鲽类的异源三倍体的诱导研究，国内外尚无报道。0006发明内容0007针对上述牙鲆传统育种存在的缺陷，本发明的目的是利用三倍体育种和杂交育种两种方法的优点，提供了一种利用物理方法诱导牙鲆异源三倍体的育种方法，它具有诱导率和孵化率高的优点，培育出具有杂交优势且不育的异源三倍体鱼苗，而且还具有便于现场操作、安全可靠、简单易行等优点。0008为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现一种利用物理方法。
11、诱导牙鲆异源三倍体的育种方法，其特征在于所述方法包括以下步骤1分别对褐牙鲆雌鱼和夏牙鲆雄鱼进行营养调控和光温调控，促进其性腺同步成熟；说明书背景技术CN102144600ACN102144601A2/5页52人工杂交选择性腺同步成熟的褐牙鲆雌鱼和夏牙鲆雄鱼，分别采集卵子和精子进行人工受精形成受精卵，受精后开始计时；3冷休克法诱导所述步骤2受精后3分钟用海水冲洗受精卵，然后放入网袋中扎紧，受精后5分钟将网袋放入02海水中，冷休克抑制第二极体排放，放置45分钟后取出，受精卵取出后首先经78海水过渡1015分钟，然后放入1516海水中准备进行孵化；4鉴定将所述步骤3诱导得到的鱼苗利用细胞流式仪法和/。
12、或染色体核型分析法抽样检测所述鱼苗的染色体倍数，确定诱导得到的鱼苗是否为异源三倍体鱼苗；5三倍体牙鲆受精卵的孵化将步骤3诱导的三倍体牙鲆受精卵进行孵化，水温为1516，盐度2832，PH8082，静水微充气；6三倍体牙鲆鱼苗的培育将步骤5孵化后的鱼苗进行培育，培育密度为053万尾/M3，水温为16200，盐度为2832，PH8082；培育过程分为仔鱼前期110日龄、仔鱼后期1115日龄和稚鱼期1635日龄，所述仔鱼前期和仔鱼后期主要以轮虫为饵料，所述稚鱼期以轮虫、卤虫无节幼体和配合饲料为饵料。0009对技术方案的进一步改进所述步骤1中所述褐牙鲆的营养调控是指以冰鲜小黄鱼和鱿鱼为饵料，添加饵料重。
13、量的35的维生素C和12维生素E，日投喂2次，所述夏牙鲆的营养调控是指以沙丁鱼、小黄鱼和鱿鱼为饵料，添加占饵料重量2的康宝A亲鱼营养强化剂，日投喂2次；所述褐牙鲆的光温调控是指光照强度为60650LUX，光照时间由12小时过渡到16小时长光照，水温为14518；所述夏牙鲆的光温调控是指光照强度为60550LUX，光照时间由12小时过渡至8小时短光照，水温为1620；所有褐牙鲆和夏牙鲆每天上、下午各换水1次，日换水量为200300。0010对技术方案的进一步改进所述步骤2中采用人工挤压腹部法采集卵子和精子。0011对技术方案的进一步改进所述步骤2中人工受精采用干法受精。0012对技术方案的进一步。
14、改进所述步骤3中网袋采用80160目网袋。0013对技术方案的进一步改进所述步骤6中仔鱼前期采用加水培育，每天加水为池水的1020，培育密度23万尾/M3，微弱充气，水温保持在16180；仔鱼后期每天换水两次，每次换水量为池水的3050，逐渐加大充气量，培育密度12万尾/M3，每天吸污一次，培育池水温17190；稚鱼期每天换水两次，每次换水量为池水的50100，培育密度051万尾/M3，每天吸污两次，培育池水温190200。0014对技术方案的进一步改进所述步骤6中鱼苗12日龄不投饵，314日龄投喂轮虫，1525日龄投喂轮虫和卤虫无节幼体，2630日龄投喂卤虫无节幼体和配合饲料，3135日龄投。
15、喂配合饲料，所述轮虫的投喂密度为2040个/ML，所述卤虫无节幼体的投喂密度为515个/ML。0015对技术方案的进一步改进所述步骤6中鱼苗325日龄投喂的轮虫为褶皱臂尾轮虫，投喂前用高浓度小球藻强化12小时20小时。0016与现有技术相比，本发明的优点和积极效果如下1、本发明操作简便，易于掌握；整个诱导过程费时较短，也无须昂贵的试剂和特殊的仪器，不需要其他过多的投资，成本低，适用于牙鲆异源三倍体鱼苗的批量生产。说明书CN102144600ACN102144601A3/5页600172、本发明采用物理方法进行诱导，可以获得很高的诱导率，反复重复试验证明诱导率在95以上，而且增加了操作的安全性和。
16、对环境的安全性。00183、本发明诱导的牙鲆异源三倍体鱼苗是不育的，较杂交二倍体不会对环境造成潜在的危害；而且通过养殖试验证明采用该方法诱导的三倍体鱼苗的成活、生长、抗逆等经济性状均优于褐牙鲆和杂交鲆二倍体，杂交优势更加显著，具有很好的养殖潜力。00194、本发明不仅能够批量大规模生产三倍体鱼苗，而且杂交鲆三倍体具有很好的养殖前景，为其产业化奠定了坚实的基础。0020结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。0021附图说明0022图1是本发明中牙鲆杂交二倍体和牙鲆杂交三倍体鱼苗的细胞DNA相对含量流仪图，图中A为杂交二倍体牙鲆鱼苗的细胞DNA相对含量流仪图；B。
17、为杂交三倍体牙鲆鱼苗的细胞DNA相对含量流仪图。0023图2是本发明中牙鲆杂交二倍体和牙鲆杂交三倍体鱼苗染色体中期分裂相图谱，图中A为杂交二倍体鱼苗的染色体中期分裂相；图中B为杂交三倍体鱼苗的染色体中期分裂相。0024具体实施方式0025下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。0026实施例1一、材料与方法1、亲本培育褐牙鲆亲鱼群体为从黄海海域捕捞的野生褐牙鲆经人工驯化而成，选择46龄、全长5065CM，体重25003500G的雌性褐牙鲆作为母本。夏牙鲆亲鱼群体为2002年从美国引进的幼鱼，经3年左右的人工养成培育而成。亲鱼培育池为5M5M1M方形切角的水泥池，池底部向。
18、中央倾斜5，排水口设置于池底部中央，池内配有上水、充气、控光、调温等设施，对褐牙鲆雌鱼和夏牙鲆雄鱼进行营养调控和光温调控等。0027所述褐牙鲆的营养调控是指以冰鲜小黄鱼和鱿鱼为饵料，添加饵料重量的35的维生素C、12维生素E，日投喂2次；所述褐牙鲆的光温调控是采用65W白炽灯控制亲鱼池表面光照，光照强度为60650LUX，光照时间由12小时过渡到16小时长光照，水温为14518。所述夏牙鲆的营养调控是指以沙丁鱼、小黄鱼和鱿鱼为饵料，添加占饵料重量2的康宝A亲鱼营养强化剂，日投喂2次；所述夏牙鲆的光温调控是指采用65W白炽灯控制亲鱼池表面光照，光照强度为60550LUX，光照时间由12小时过渡至。
19、8小时短光照，水温为1620。所有褐牙鲆和夏牙鲆亲鱼每天上、下午各换水1次，日换水量为200300。00282、褐牙鲆雌鱼和夏牙鲆雄鱼的人工杂交授精说明书CN102144600ACN102144601A4/5页7控制所述营养、光、温、水、气调控即可以控制母本和父本同步性成熟，人工生殖调控进行约23个月左右，待雌鱼性腺发育至V期，选择腹部膨胀、泻殖孔发红的褐牙鲆雌鱼作为杂交母本，选择体形正常、活力良好的夏牙鲆雄鱼作为杂交父本。0029选择性成熟的褐牙鲆雌鱼，采用人工挤压腹部法采卵，具体操作为用海水浸湿的大毛巾包裹鱼体，露出腹部生殖孔位置并用脱脂棉将生殖孔及周围擦拭干净，固定好亲鱼后，双手在鱼腹部。
20、两侧同时均匀用力，自后而前徐徐挤压腹部，即有卵子流出，使用1000ML玻璃烧杯接取卵子，将卵放入干燥的烧杯中（卵量约3040ML）。0030采用同样的人工挤压腹部法采集夏牙鲆精液，用经消毒的干燥玻璃滴管吸取干净精液，室温下保存于5ML离心管中，将精液加入未受精卵中（精液约12ML），干法受精，轻轻将两者摇动混匀，然后加入2倍于卵量体积的海水完成受精过程，受精后开始计时。00313、冷休克诱导牙鲆异源三倍体褐牙鲆夏牙鲆受精后3分钟用海水清洗受精卵，然后放入80目网袋中扎紧，受精后5分钟将网袋放入02海水中，放置45分钟后取出，冷休克抑制第二极体排放，诱导牙鲆异源三倍体完成。受精卵取出后，首先经7。
21、8海水过渡1015分钟，然后放入1516海水中进行孵化；受精后12小时统计受精率，孵化后8小时统计孵化率。00324、牙鲆异源三倍体的鉴定牙鲆异源三倍体的鉴定方法包括A流式细胞仪法鉴定三倍体鱼苗；B染色体核型分析法鉴定三倍体鱼苗。0033A流式细胞仪法鉴定异源三倍体鱼苗每次三倍体诱导试验后，抽检杂交牙鲆二倍体鱼苗和三倍体鱼苗的初孵仔鱼各1020尾，具体步骤如下1取杂交牙鲆二倍体鱼苗和三倍体鱼苗的初孵仔鱼，每条初孵仔鱼用09的生理盐水洗涤后，捣碎后加入2ML细胞分散液（2柠檬酸、05TWEEN20）制成单细胞悬液。00342所述单细胞悬液用260目筛绢过滤后转移到流式细胞仪专用样品管中，加入1M。
22、LDAPI荧光染料染色（146MMNACL,10MMTRISBASE,PH74,2MMCACL2,22MMMGCL2,01BSA,20G/MLDAPI,10DMSO）。00353用PARTECCELLCOUNTERANALYSERCCA细胞计数仪分析检测DNA相对含量，以二倍体杂交牙鲆鱼苗对照组个体的DNA相对含量设为100，其在200处有一个分裂峰，测定三倍体杂交牙鲆鱼苗的DNA相对含量，如此测定的三倍体鱼苗的DNA相对含量在150处有一峰值，其在300处有一分裂峰，这表明冷休克诱导的鱼苗为三倍体，如图1所示。0036B染色体核型分析法鉴定异源三倍体鱼苗采集褐牙鲆和夏牙鲆的杂交二倍体和三倍体。
23、的胚胎，具体步骤如下1取100200粒处于原肠中期的受精卵胚胎，用生理盐水洗涤23次，在研钵中敲碎，经260目筛绢过滤后取上清至10ML离心管中，用09生理盐水补至45ML。00372加入05ML0025的秋水仙碱溶液，处理1小时。003831500转/分离心10分钟，倒掉上清后加入0075MKCL溶液，静置45分钟。00394加入115ML卡诺氏液（体积比，甲醇冰醋酸31），静置10分钟。004051500转/分离心10分钟，弃上清后加入4ML卡诺式液，静置45分钟。004161500转/分离心10分钟，弃上清后加入4ML卡诺式液，静置45分钟。004271500转/分离心10分钟，弃上清后。
24、加入05ML卡诺式液，然后滴片。说明书CN102144600ACN102144601A5/5页800438滴片在空气中自然晾干，然后用15GIEMSA（体积比）染液染色，并在显微镜下观察和计数。0044染色体统计结果表明冷休克诱导后的受精卵的染色体众数2N72，核型为2N72T，而褐牙鲆、夏牙鲆及杂交二倍体牙鲆的核型均为2N48T，这表明冷休克诱导的鱼苗的为三倍体，如图2所示。00455、受精卵孵化将冷休克诱导的受精卵放入105M孵化网箱，孵化90小时左右，水温为1516，盐度2832，PH8082，静水微充气。00466、三倍体牙鲆鱼苗的培育所述三倍体牙鲆的培育过程分为仔鱼前期110日龄、仔。
25、鱼后期1115日龄和稚鱼期1635日龄。0047所述仔鱼前期（110日龄）采用加水培育，每天加水为池水的1020，培育密度23万尾/M3，微弱充气，水温保持在16180。0048所述仔鱼后期（1115日龄）每天换水两次，每次换水量为池水的3050，逐渐加大充气量，培育密度12万尾/M3，每天吸污一次，培育池水温17190。0049所述稚鱼期（1635日龄）每天换水两次，每次换水量为池水的50100，培育密度051万尾/M3，每天吸污两次，培育池水温190200。0050仔鱼前期、仔鱼后期和稚鱼期培育的盐度均为2832，PH8082。0051鱼苗培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料。。
26、投喂方法为鱼苗12日龄不投饵，314日龄投喂轮虫，初孵仔鱼3日龄开口摄食，开口饵料为褶皱臂尾轮虫，投喂前用高浓度小球藻强化12小时以上；1525日龄投喂轮虫和卤虫无节幼体，2630日龄投喂卤虫无节幼体和配合饲料，所述轮虫的投喂密度为2040个/ML，所述卤虫无节幼体的投喂密度为515个/ML，；26日龄即开始驯化投喂配合饲料，31日龄完全投喂配合饲料，驯化期采用少量多次的投喂方法，驯化成功后配合饲料的投喂量视鱼苗的消化道饱满程度和观察池底残饵情况决定。0052二、结果采用本发明所述的方法于2006年4月5日至2006年4月15日共进行3次牙鲆异源三倍体的诱导试验，三次诱导后的孵化率分别为8576、8074、7056，分别孵出仔鱼约2万尾、15万尾、15万尾，获得鱼苗的三倍体比例为100，在培育过程中三倍体鱼苗生长快、成活率高，共培育3CM以上鱼苗约25万尾。0053以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。说明书CN102144600ACN102144601A1/1页9图1图2说明书附图CN102144600A。