本发明涉及类毒素的制备。更具体地说，本发明涉及一种化学灭活，特别是用过氧化氢灭活毒素，并由此制备非细胞的解毒疫苗的新方法。 百日咳是一种由百日咳杆菌引起的传染病。通过免疫接种可有效地控制这一疾病的发病率。当前国家和世界卫生组织建议婴儿应进行免疫接种，以预防百日咳的发病和蔓延。
三种类型的疫苗已用于抗百日咳杆菌的免疫接种。最为广泛使用的疫苗系由全部已不再存活的百日咳杆菌体组成。这种疫苗虽对预防疫病是有效的，但存在下列几个问题：1）施用后引起局部红斑，2）疫苗的施用伴随着诱发高热、全身性烦躁和不适，3）据称在某些情况下可引起严重的神经病学后遗症。另一种疫苗是将百日咳组分制备成尿素浸出物的形式。这种制品大约在1969年至1974年期间使用过，但后来已从市场上消失了。在日本，正在使用的一种新的百日咳疫苗系从百日咳杆菌的培养物上清液中制得。这种物质包含所有的培养物上清液蛋白质，由于生物体培养的变异性，最终组成可能不尽相同。此外，使用戊二醛或甲醛作为灭活剂有时会产生易于回复成活性毒素的聚集物。人们认为这些醛导致了席夫碱的生成，后者是化学不稳定物质，因此使类毒素易于回复成活性毒素。用迄今为止所知的方法制备诸如破伤风、白喉、和霍乱毒素之类的其他毒素亦具有类似的弊端。因此，对于一种用来制备基本上无不良组分和效应的既安全又稳定的非细胞性毒素之改进方法地需求是十分明显的。
因此，本发明的目的在于制备一种用化学方法对其毒素已不可逆地灭活的类毒素。
本发明的另一目的是制备一种无内毒素或其他常易产生有害副作用的毒性物质之类杂质的百日咳疫苗。
本发明的又一目的是提供一种保护易感宿主免遭百日咳侵袭的方法，该法系通过向所述宿主施用按照本发明所制备的致免疫量的抗原而达到上述的保护作用。
随着以下对本发明的详细描述，本发明之其他目的和优点将是显而易见的。
当结合附图阅读下述详细说明时，将能更好地理解本发明的上述和其他目的、特点以及许多附带的优点，其中：
图1表示用过氧化氢灭活百日咳毒素的动力学，在方法章节中所述的标准条件下，用过氧化氢处理百日咳毒素。按图中所指明的时间取出反应混合物（△，□，○）的试样，并用酶结合免疫吸附剂测定法分析其血细胞凝集活性（△，▲），转导子腺苷二磷酸-核糖基化活性（□，■）和抗原活性（用ELISA测定法）（○，●）。对于用同样方法但不用过氧化氢处理的百日咳毒素也进行这些测试（▲，■，●）。通过添加过氧化氢酶使反应终止。
图2是前类毒素和PTH-06类毒素的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，图中自左至右的线条（lanes）表明：1-蛋白质标准物;2，3，4-PTH-06的两倍稀释液;5-蛋白质标准物;6，7，8-前类毒素的两倍稀释液;9-蛋白质标准物。
图3表示百日咳类毒素的稳定性。用批号为PTH-04的吸附百日咳类毒素，以图中所示剂量对小鼠进行免疫接种。免疫接种所用的PTH-04是在两周内配制的（●，■），在4℃下保存了6个月（○，□），在免疫接种后2周（○，●），和4周（□，■），用酶结合免疫吸附剂测定法、CHO细胞抑制、和防御百日咳杆菌体对大脑内的侵袭来测定血清抗体。
本发明的上述和其他目的系通过一种制备类毒素及其疫苗的方法而实现的，其中类毒素的具体制备方法如下：用足以化学灭活其毒素，但保留其致免疫性质量的氧化剂处理至少部分提纯或分离的毒素，然后分离出完整的类毒素或其部分。
此处所用的术语“氧化剂”意指能氧化肽链某些特定位置上之毒素的任何试剂，而在这些特定位置上产生半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸和/或酪氨酸之类的氨基酸残基。这类氧化剂可以是有机物或金属。较佳的氧化剂可列举如下：过氧化氢、过氧化钠、N-氯-4-甲基-苯磺酰胺钠盐（氯胺-T）、过甲酸、过氧化二噁烷、过碘酸、高锰酸钠、次氯酸钠、以及该技术领域中所熟知的其他类似物质。其中尤以过氧化氢为更佳，因其操作容易、价格低、且易于得到。
除特别另行定义外，本文所用的全部科学或技术术语均具有如本发明所属技术领域中普通熟练人员通常所理解的同样意义。以下引用的所有参考资料均列在文内，以供参考。虽然文内所述的类似或等同的方法和物质均可用于本发明的实施或文内所提到的试验，但以下将对较佳的方法和物质进行描述。
本文所用的术语“基本上”提纯或分离系指毒素至少已被分离和/或提纯至这样一种程度，以至在类毒素施用到宿主中后无这类可能引起有害反应的微粒状或可溶性细菌污染物或杂质。
应当注意，起始物质不必是提纯的细菌制剂。仅部分分离或提纯的制剂也可用于本文所述的方法。除用氧化剂处理外，此法的主要步骤与Sekura等在Journal of Biol.Chem.258：14647-14651 1983中业已描述的方法相似（上述文献列于此处仅供参考），以下将以百日咳毒素作为说明性例子进行概要描述。
物料-Affi一凝胶蓝（100-200目）系从Biorad得到，溴化氰活化的琼脂糖4 B从Pharmacia购得，而由Spiro法制备的胎球蛋白则从Gibco得到。丝状血凝素和百日咳毒素来自Tohama菌株，以及对付这些蛋白质的抗体均按“Cowell et al.，Seminar in Infectious Diseases Vol.IV：Bacterial Vaccines，4：371-379（1982）所述的方法制备。百日咳杆菌菌株系来自保存在“Pertussis Branch，Office of Biologics，Bethesda，MD.”中的收集品。该研究中所用的其他物料均为试剂级，并从普通供应厂商购得。
胎球蛋白亲和树脂系按照制造厂商所推荐的方法将200毫克胎球蛋白与25克溴化氰活化的琼脂糖4 B相结合而予以制备。
生物培养物-在37℃温度下，将冻干的百日咳杆菌敞开在Bordet-Gemgou血琼脂板上，并繁殖二代。然后使这两个板的生长物分别用来接种起始培养物[置于500毫升烧瓶中的200毫升Stainer-Scholte介质（Hewlett et al.，J.Bacteriol.127：890-898，1976）]，并让其在37℃下培养过夜，同时加以搅拌。盛有1.3升Stainer-Scholte介质的Fernback烧瓶（2.8升）用起始培养物中的生长物接种，直至初始A650在0.05-0.1之间。接着在36℃温度下，使细菌在转速为120转/分的回转摇动器中培养约40至60小时，直至A650达到2.5-2.8。当然，细菌可在该技术领域内熟知的其他条件下生长，而且容积可按需要适当进行调节。此外，也可使用其他的百日咳杆菌菌株。
百日咳毒素的测定-可使用该技术领域内熟知的几种方法来测定该毒素。对于提纯过程中所用的常规快速测定法，系按“Irons et al.，Biochim.Biophys.Acta 580：175-185（1979）中所述的方法，用鹅的红细胞测定百日咳毒素的血细胞凝集活性。促进淋巴细胞增多的活性系按“Sato et al.，Infect.Immun.6：899-904（1972）中所述的方法进行测定。注射后三天，血中白细胞比本底增加10，000白细胞/升时的物料量，定义为一个单位促进淋巴细胞增多的活性。高纯百日咳毒素制剂的血细胞凝集活性和促进淋巴细胞增多的活性分别约为150，000单位/毫克和30，000单位/毫克。毒素也可用常规酶结合免疫吸附剂测定法（ELTSA）确定。提纯后的山羊抗百日咳毒素用于覆盖固定相。固定相与含有抗原的制剂反应后，再使其与抗体-碱性磷酸酶加合物反应，并按标准方法用所产生的碱性磷酸酶活性测定百日咳毒素。一种类似的方法用于测定丝状血凝素。
其他方法-按照“Reisfield et al.，Nature 195：281-283（1962）”的方法在酸性凝胶体系中进行电泳测定。十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶电泳系按Laemmli，Nat.New Biol.227：680-685（1970）中所述的方法进行。SDS-凝胶电泳的试样系按下述方法制备：在有或没有2%β-巯基乙醇的情况下，用1%SDS处理最终体积为100微升的10-50微克蛋白质，并在100℃温度下加热2分钟左右。对于二维电泳，先用Laemmli凝胶对未还原试样进行处理。然后从这些凝胶中切下几条，并使其在含有1%β-巯基乙醇的流动缓冲液中浸泡1小时。经流动缓冲液充分洗涤后，使流动凝胶沿着凝胶带（条）浇注，并在第二维进行电泳。凝胶用考马斯蓝染色（Oak-ley et al.Anal.Biochem.105：361-363，1980）。Kodak KAR-2胶片用于经过标记的蛋白质的放射自显技术中。密度测定法采用Biomed密度计在633毫微米下进行。
氨基酸分析系按照“Oliveira et al.，J.Biol.Chem.254：489-502（1979）”中所述的方法进行。在还原和未还原试样（按上述对SDS复合体所述的方法制备）用标准碘乙酰胺反应后，对羧甲基半胱氨酸进行测定。
蛋白质系用牛的血清白蛋白作为标准样，按“Lowry et al.，J.Biol.Chem.193：265-275（1951）”中所述的方法测定。鉴于许多试样含有对该测定方法有干涉的物质，所以采用由5%三氯乙酸处理蛋白质试样后所得的沉淀物进行测定。
百日咳毒素的提纯一通过将菌株165的培养物在6000×g和4℃温度下离心分离30分钟，以得到其上清液。用盐酸将上清液的PH值调节到6.0，并添加Affi-凝胶盐（每升上清液中含有10毫升填充树脂）。所产生的悬浮液在4℃下搅拌48小时。使树脂沉降2小时左右后，将上清液虹吸出来。其后的提纯步骤系在25℃左右的温度下进行。然后将树脂充填到柱（6×7厘米）中，并以约250毫升/小时的流量，用450毫升PH为6.0的0.25M磷酸钠、450毫升PH为7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷-盐酸（缓冲液A）和450毫升含有0.75M氯化镁的缓冲液A进行洗提。汇集具有活性的级分，用等体积的水稀释后，将其加到胎球蛋白-琼脂糖柱（2.5×7厘米），再用下述溶液以40毫升/时左右的流量洗提：40毫升缓冲液A、40毫升含有1M氯化钠的缓冲液A、以及40毫升含有4M氯化镁的缓冲液A。汇集含有百日咳毒素的级分，并使之通过（流量为30毫升/时）与含有0.5M氯化钠的缓冲液A达到平衡的Sephadex G-25（2.5×35厘米）柱。然后通过添加硫酸铵固体（0.65克/毫升），并在4℃下搅拌过夜，以使蛋白质沉淀析出。将在20.000×g和4℃下离心分离30分钟而收集得到的沉淀物再悬浮在缓冲液A中，并在溶液中加入硫酸铵固体（0.65克/毫升）。在这种4℃缓冲液中，毒素可稳定地保存几个月。
由上述方法制备的百日咳毒素是由不完全相同的亚单元所组成的简单蛋白质，经在15% SDS凝胶上的电泳所测得的分子量约为31.000，26.000，25.000和11.500。
用过氧化氢灭活百日咳毒素
为准备与过氧化氢的反应，使按上述方法制备的百日咳毒素转移到蛋白质浓度约为0.1-0.5毫克/毫升的合适缓冲液中。诸如硼酸盐、碳酸盐、三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐、高氯酸盐、以及该技术领域中熟知的类似盐类均为合适的缓冲剂，而反应的PH值可在约3.5至8.5或更大的范围内变化，所以反应的PH值本身不是一个重要因素这一点是明白的。当灭活在较佳的PH值-8.5下进行时，则较佳反应混合物含有PH为8.5的0.1M硼酸钓;PH为8.5的0.001M的二胺四乙酸钠;0.0001M硫酸铁或其他金属盐，如氯化铁、硫酸亚铁或硫酸铁、以及诸如氯化钴、氯化铬之类的其他金属盐;1.2%过氧化氢;以及直至10%饱和浓度的硫酸铵溶液、反应速率取决于过氧化氢、硫酸铁和乙二胺四乙酸钠（EDTA）浓度。由于灭活作用能被EDTA之类的螯合剂中断或控制，因此铁离子或诸如以上提到的其他微量金属盐或离子是必不可少的。反应一般约在37℃下进行，通过测定转导子（transducin）的百日咳毒素催化腺苷二磷酸-核糖基化和鹅的红细胞百日咳毒素催化的凝集作用而监测反应进行的程度。对于用过氧化氢灭活的时间相关性示于图1。此外，还示出了表示所生成的类毒素在百日咳毒素ELISA中作为抗原的反应性的数据。适合用作百日咳疫苗的百日咳类毒素制剂系用这一方法得到，反应时间约为2小时。通过添加EDTA或其他螯合剂，或者添加过氧化氢酶和/或在诸如Sephadex G25之类介质上的凝胶过滤可抑制与过氧化氢的反应。
百日咳类毒素的特性
对于由上述方法制备的类毒素制剂中的各种生物活性进行了监测，结果归纳在表1和图1中。名称PTH-04 PTH-05和PTH-06系指所制备的具体批量制剂。名词“类毒素”和“前类毒素”分别指用氧化剂处理前、后的毒素制剂。这些数据表明，用过氧化氢处理百日咳毒素所产生的制剂的无毒性的，但仍具有与专门对付天然毒素的抗体进行交叉反应的免疫决定子，由此表明由过氧化氢处理过的毒素保留着有效的抗原性能。
表1
三批前类毒素和百日咳类毒素的残余生物活性
PTH-04
测试体系 前类毒素 类毒素
蛋白质（μg/ml） 454 220
HAa28，000 ＜230
LPAb25，000 ＜23
HSAc1.3×10-62.9×10-2
TDd未测出 8.6×103
CHO细胞（ng/ml）e未测出 未测出
PTH-05 PTH-06
前类毒素 类毒素 前类毒素 类毒素
566 173 256 173
159，000 ＜578 50，000 462
11,000 ＜29 5700 ＜29
6.7×10-6＞3.5×10-26.5×10-5＞3.5×10-2
1.2×1064.2×1035.8×1053.8×103
0.31 ＞1040.31 ＞3.4×103
a 血凝反应以单位/毫克蛋白质表示;
b 促进淋巴细胞增多的活性以单位/毫克蛋白质表示;
c 组胺敏化活性-半致死量（LD50）所需的毫克数;
d 转导子活性的腺苷二磷酸-核糖基化，以毫微克活性百日咳毒素/毫克蛋白质表示;
e 诱发细胞聚集所需的最终蛋白质浓度。
在硫酸铁存在下，用过氧化氢处理所制备的百日咳类毒素制剂的氨基酸分析证明了在其组成中的一些重要变化。如表2中所示，用硫酸铁处理导致半胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸的减少。可能相应于磺基丙氨酸或者蛋氨酸亚砜或砜的早期洗脱氨基酸的出现是与蛋氨酸和半胱氨酸残基的氧化相一致的。在微量金属存在下，通过氧化氢处理所达到化学改性的性质是不易回复变异（逆转）的，这表明由些产生的类毒素抗御向活性毒素回复变异的稳定性。
虽然最好用微量金属来催化反应，但对于本发明范围内所考虑的各种毒素的氧化剂处理并非必不可少的。
表2
PTH-04及其前类毒素的选择氨基酸组成
氨基酸 前类毒素 类毒素
磺基丙氨酸和蛋氨酸（0） ＜0.01 0.18
半脱氨酸 0.13 ＜0.06
蛋氨酸 0.15 ＜0.02
酪氨酸 0.72 0.31
氨基酸含量用相对于丙氨酸的摩尔比表示。
磺基丙氨酸和蛋氨酸（0）的茚三酮色值是丙氨酸和蛋氨酸的平均值。
过氧化氢灭活的百日咳毒素之SDS-凝胶电泳相对于未处理的毒素来说有一些变化（图2）。S1亚单元（Mr＝31，000）有移向较高分子量的明显移动，而蛋白质带则较为弥散。与未处理的毒素相比较，S2（Mr＝26，000）和S3（Mr＝25，000）亚单元的分辨率减少。在11，000和25，000之间的分子量区间可看到微量可染色物质。类毒素和百日咳毒素的S4，5（Mr＝11，000）组分是相似的。这些变化与过氧化氢对蛋白质的化学改性是相一致的。下述观点是一种假设而未与任何理论相联系：在S3和S4，5带之间观察到的弥散物质可能是这些多肽有限分裂的结果。
吸附的百日咳类毒素之制备
为了将百日咳类毒素用作百日咳疫苗，将其吸附在铝佐剂之类的合适佐剂上。为此，使用了Alhydrogel（Superfos Kemi a/s），但其他吸附剂，如磷酸铝或氢氧化铝，或其盐也同样可以使用。若每毫克铝吸附20-200微克百日咳类毒素，则给出的最终蛋白质浓度为20-200微克/毫升。通常，吸附过程系在PH为7.4，温度为4℃的普通磷酸盐缓冲盐水中进行24-28小时，同时伴有搅拌。就在吸附之前，使类毒素溶液通过0.22微米过滤器进行过滤，以予以灭菌，并加入乙基汞硫代水杨酸钠（重量与体积之比为1∶10000）作为防腐剂。当然也可使用该技术领域中熟知的其他吸附剂、佐剂、防腐剂或添加剂。此外，百日咳类毒素本身是致免疫的。
对百日咳类毒素的血清应答
如酶结合免疫吸附剂测定法所表明的那样，用吸附的百日咳类毒素对小鼠进行免疫接种所产生的免疫应答与剂量和时间有关（表3，图3）。从中可以看出百日咳类毒素使用量在3至75微克范围内的剂量应答，其中75微克的剂量在2周和4周均给出最高应答。在所有类毒素剂量下，免疫接种后4周所产生的抗体量都比免疫接种后两周的高。通过监测血清抗体抑制活性百日咳类毒素对CHO细胞作用的能力而测得的血清应答显现出类似的特性（表4，图3）。这种应答与剂量和时间有关。在免疫接种后二周，未观察到显著量的百日咳毒素抑制抗体，但4周后，抑制效价增加，在75微克剂量下具有最大应答。
表3
用吸附的百日咳类毒素和US-8标准细胞百日咳疫苗免疫接种的小鼠中的百日咳毒素抗体（抗体采用酶结合免疫吸附剂测定法测定）
PTH-06 US-8 标准
（μg） 2周 4周 Dil. 2周 4周
75A59 118 1/10 16 25
50A41 71 1/50 7 23
10A17 34 1/250 7 6
50B48 80 PHS 7 6
10C35 41
PBS 8 4
PTH-04 PTH-05
（μg） 2周 4周 （μg） 2周 4周
75 123 431 75 101 352
25 65 163 25 64 174
8 40 96 8 22 60
3 7 31 3 8 19
PBS 7 6 PBS 7 6
a 小鼠用整批号为PTH-06-75的类毒素进行免疫接种;
b 小鼠用整批号为PTH-06-50的类毒素进行免疫接种;
c 小鼠用整批号为PTH-06-10的类毒素进行免疫接种。
用PTH-04、PTH-05和PTH-06中任一种百日咳类毒素，或美国标准细胞百日咳疫苗，即US-8对小鼠进行腹膜内注射，注射量为0.5毫升。2或4周后对小鼠抽血化验，由酶结合免疫吸附剂法测得的这些小鼠的百日咳毒素抗体以平均值表示。
表4
用吸附的百日咳类毒素和US-8标准细胞百日咳疫苗进行免疫接种的小鼠之血清抑制活性（活性采用CHO细胞测定法测定）（平均值为10～11只/每组）。
PTH-04 PTH-05
（μg） 2周 4周 （μg） 2周 4周
75 ＜5 85 75 ＜5 12
25 ＜5 25 25 ＜5 ＜5
8 ＜5 10 8 ＜5 10
3 ＜5 ＜5 3 ＜5 ＜5
PBS ＜5 ＜5 PBS ＜5 ＜5
PTH-06＊US-8 标准
（μg） 2周 4周 Dil. 2周 4周
75a＜5 91 1/10 ＜5 ＜5
50a＜5 43 1/50 ＜5 ＜5
10a＜5 9.4 1/250 ＜5 ＜5
50b＜5 38 PBS ＜5 ＜5
10c＜5 41
PBS ＜5 ＜5
a 小鼠用整批号为PTH-06-75的类毒素进行免疫接种;
b 小鼠用整批号为PTH-06-50的类毒素进行免疫接种;
c 小鼠用整批号为PTH-06-10的类毒素进行免疫接种。
用PTH-04、PTH-05、PTH-06中任一种百日咳类毒素，或美国标准细胞百日咳疫苗，即US-8对小鼠进行腹膜内的注射，注射量为0.5毫升。2或4周后对小鼠抽血化验，应用方法章节（Methods Section）中所述的CHO细胞测定法测出这些小鼠的血清对百日咳毒素的抑制活性。
吸附百日咳类毒素也被证明在罗猴中能产生免疫应答（表5和表6）。用酶结合免疫吸附剂法测得的百日咳毒素特效抗体所产生的应答与从百日咳痊愈病人所取血清中观察到的应答现象相类似，其中在相同参照血清的条件下，病人ELISA应答的平均数值为115。免疫应答也导致生成能抑制在CHO细胞测定法中百日咳毒素的抗体。ELISA应答和在CHO细胞测定法中的抑制效价发现都与剂量有关，在施用加强剂量后，上述相应数值也随之增大。
表5
吸附的百日咳类毒素（PTH-05）注射入幼罗猴后，
用ELISA确定的百日咳毒素抗体
ELISA单位（应答者）
类毒素（微克） n- 0天 21天
100 9 1.8 42（7）
50 9 2.2 29（6）
10 9 2.4 11（3）
PBS 3 2.3 2.3（0）
ELISA单位（应答者）
28天 42天 71天 92天
95（9） 58（9） 29（7） 85（9）
65（9） 27（6） 25（8） 59（8）
28（7） 18（6） 20（5） 29（7）
2.6（0） 3.3（0） 5.4（0） 2.8（0）
按上表所示的剂量，在0天、21天和71天用吸附的百日咳类毒素PTH-05对幼罗猴进行免疫接种。这些试样的百日咳毒素抗体系用几体平均数表示，上表括弧内的数字是较免疫接种前抗体水平升高4倍或4倍以上的猴子应答者的数目。
表6
用吸附的百日咳类毒素（PTH-05）进行注射的幼罗猴的百日咳抑制抗体（CHO细胞测定法）
抑制效价的倒数和
类毒素（μg） n＝ 0天 21天
100 9 ＜5（9） 16（7）
50 9 ＜5（0） 7（6）
10 9 ＜5（0） 12（3）
PBSa2 ＜5（0） ＜5（0）
（应答者数目）
28天 42天 71天 92天
23（9） 44（9） 6（4） 20（8）
17（9） 22（6） ＜5（0） 10（7）
17（7） 14（6） 6（3） 9（6）
＜5（0） ＜5（0） ＜5（0） ＜5（0）
a 因一只罗猴的初始CHO细胞效价的测定值为10，故将其从该组中排除。测定结果用几何平均数和应答者的数目表示，此处应答者指定为抑制效价等于或大于10的猴子（示于上表括弧内）。
百日咳类毒素的效能
对百日咳类毒素是否具有保护小鼠免遭百日咳杆菌体对大脑内侵袭的能力进行了检验（表7，图3）。采用3批百日咳类毒素疫苗进行试验，在第二周末计算得到的半数有效量（ED-50）（蛋白质微克数）的数值如下：对PTH-04为44微克（将8微克的数据点排除）对PTH-05为51微克，对PTH-06-75为30微克。虽然百日咳类毒素表现出能保护小鼠免遭病菌对大脑的侵袭，但其效能不足以符合目前联邦法规（FDA）的规定。吸附百日咳类毒素给出下述数值：小于10个小鼠保护单位/毫克蛋白质。所推荐的10-75微克的类毒素剂量将产生不足0.4小鼠保护单位/人的剂量。
百日咳类毒素疫苗的效能是通过向小鼠施用致死剂量的百日咳类毒素而进行评价的（表8）。计算得到的半数有效量的蛋白质量如下：对PTH-04为5.2微克，对PTH-05为41微克，而对PTH-06-50为4.9微克。在这一测定中，PTH-05的低效能反映了这批疫苗在标准CHO-细胞抑制测定中诱发抑制抗体的低效能（表4）。
表7
用吸附的百日咳类毒素US-8标准细胞百日咳疫苗保护小鼠遭百日咳杆菌对大脑内的侵袭（幸存者数目/总数）
PTH-06 US-8 标准疫苗
（μg） 2周 4周 Dil. 2周 4周
75A7/11 6/8 1/10 6/10 6/11
50A4/10 5/11 1/50 2/10 2/11
10A2/11 2/11 1/250 0/11 0/11
50B5/11 7/11 PBS 0/11 0/11
10C5/11 7/11
PBS 0/11 0/10
PTH-04 PTH-05
（μg） 2周 4周 （μg） 2周 4周
75 4/9 11/11 75 3/11 2/11
25 2/11 5/11 25 0/11 1/11
8 4/10 3/11 8 0/11 0/11
3 0/11 2/11 3 0/11 0/11
PBS 0/11 0/11 PBS 0/11 0/11
a 小鼠用整批的PTH-06-75进行免疫接种;
b 小鼠用整批的PTH-06-50进行免疫接种;
c 小鼠用整批的PTH-06-10进行免疫接种。
向小鼠腹膜内注射0.5毫升的PTH-04、PTH-05-05或PTH-06这三种百日咳类毒素中的任一种，或者美国标准细胞百日咳疫苗-US-8，2或4周后，按方法章节（Methods Section）所述的那样，向小鼠大脑内注射百日咳杆菌体，使其感染。感染后14天（按联邦法规的规定），记录幸存者的数目。
表8
用百日咳类毒素和美国标准百日咳疫苗-US-8保护小鼠免遭百日咳毒素的侵袭
注射剂量 幸存数目/受侵袭的总数
（μg蛋白质） PTH-04 PTH-05 PTH-06-50 US-8a
50 10/12 8/10 9/10 0/10
10 10/12 0/10 9/10 0/10
2 0/12 0/10 0/10 0/10
PBS 0/12 0/10 0/10 0/10
a US-8标准疫苗的施用量为0.05微升、0.01微升或0.02微升，其中所含百日咳类毒素的剂量分别为50、10和2微克。
向小鼠注射0.5毫升上表所示的各种百日咳类毒素，或者美国标准百日咳疫苗-US-8稀释剂，然后再给予这些小鼠下述剂量的百日咳毒素：对于用PTH-04注射的小鼠，所给剂量为5.2×LD50;对于用PTH-05、PTH-06和US-8注射的小鼠，所给剂量为15.4×LD50。结果表明，PTH-04、PTH-05和PTH-06的半数有效量（ED50）分别为5.2、41.0和4.9微克。
活性百日咳毒素的效用
若在小鼠用吸附的百日咳类毒素进行免疫接种前一小时，接受非致死、非致免疫剂量的活性百日咳毒素，则根据小鼠大脑内感染模式进行判断，可以看出在效能方面的显著变化（表9）。活性百日咳毒素半数有效量从51微克降低至12.5微克。根据酶结合免疫吸附剂测定或CHO-细胞抑制效价判断，疫苗效能的这种增加仿佛并非由增强免疫应答所致。应当注意，这是目前用来使全部细胞百日咳疫苗标准化的试验。鉴于活性百日咳毒素可能产生有害反应，此处用于产生非细胞百日咳疫苗的方法目的是使活性百日咳毒素减少至最低水平。
表9
同时注射百日咳类毒素PTH-05和亚致死的非致免疫剂量的百日咳毒素（0.1微克）时，对抗毒素水平和保护小鼠遭百日咳杆菌对大脑内侵袭的影响
注射的类毒素 对大脑内的侵袭（存活数/总数）
毒素- 毒素+ 毒素-
（μg） 2周 4周 2周 4周 2周
75 3/11 2/11 9/11 8/11 101±25
25 0/11 1/11 5/10 5/11 64±31
8 0/11 0/11 3/11 4/11 22±10
3 0/11 0/11 1/10 7/11 8±3
ELISA测定 CHO细胞测定
毒素+ 毒素- 毒素+
4周 2周 4周 2周 4周 2周 4周
352±173 80±24 252±80 ＜5 12 ＜5 12
174±72 44±22 138±92 ＜5 4 ＜5 4
60±27 36±17 106±50 ＜5 ＜5 ＜5 ＜5
19±11 27±12 70±20 ＜5 ＜5 ＜5 ＜5
小鼠单用吸附的PTH-05免疫接种，或免疫接种前1小时在静脉内注射0.1微克百日咳毒素。对小鼠抽血化验血清，在第二天，按本文所述的方法在大脑内注射百日咳杆菌体。由酶结合免疫吸附剂测定法所测得的百日咳毒素抗体以平均值±标准偏差表示;而用CHO细胞测定法所测得的百日咳毒素抗体则用几何平均数表示。
佐剂含量对百日咳类毒素效能的影响
使批号为PTH-06的百日咳类毒素以不同的佐剂/蛋白质比（表10）配制后，用酶结合免疫吸附剂测定法（表3）、CHO细胞抑制效价（表4）和小鼠抵抗力（表7）来监测其效能。这些判据一致表明，疫苗的效能随着铝与蛋白质之比的增加而增强。由10微克批号为PTH-06-10的类毒素所诱发的应答与50微克批号为PTH-06-75的类毒素所诱发的相同。
表10
批号PTH-04、PTH-05、PTH-06-75，PTH-06-50以及PTH-06-10中的蛋白质和铝含量
蛋白质 Alhydrogel
批号 （μg/mL） （mg Al+++/mL）
PTH-04 190 0.95
PTH-05 140 0.75
PTH-06-75 150 1.0
PTH-06-50 100 1.0
PTH-06-10 20 1.0
在4℃下使类毒素吸附在Alhydrogel上48小时，同时缓缓地进行搅拌。然后将盛有整批PTH-06类毒素的瓶送到药剂部门（Pharmacy Section）;CC，NIH，以转入5.0毫升小瓶中，每只瓶的盛装量为2.2毫升。
吸附百日咳类毒素的毒性稳定性
吸附的百日咳类毒素在4℃下存放直至6个月后，根据酶结合免疫吸附剂测定法，在CHO细胞测定中百日咳毒素抑制抗体的诱发，以及小鼠保护来判断，其效能无明显变化。腹膜注射吸附的百日咳类毒素的小鼠，经3周的观察，根据白细胞计数和对组胺的敏化作用判断，无毒性显现（表11）。将非吸附的百日咳类毒素在37℃下保存3周以上，由转导子的腺苷二磷酸-核糖基化作用的测定表明，未产生向活性毒素的回复变异（逆转）（表12）。
表11批号为PTH-05的吸附百日咳类毒素的促进淋巴细胞增多活性和组胺敏化活性
免疫接种 白细胞数目
后天数 百日咳毒素Alhydrogel PTH-05
3 34，200 4，300 3，400
7 23，600 4，300 5，600
14 9，600 3，300 5，700
21 4，100 4，000 3，900
组胺侵袭（幸存者数目/总数）
侵袭后天数百日咳毒素Alhydrogel PTH-05
4 0/5 5/5 5/5
8 0/4 5/5 5/5
15 0/5 4/5 4/5
22 0/4 3/5 3/5
以5只小鼠为一组，向各组小鼠腹膜内注射下述任一制剂：10毫升PTH-05，1.0毫升含有0.75毫克以Alhydrogel形式存在的铝的PBS，1.0毫升含有百日咳毒素的PBS。在免疫接种后第3、第7、第14和第21天对小鼠进行抽血检查，并将它们的平均白细胞计数列入表内。第二天从腹膜内向小鼠注射剂量为10微克/克体重的盐酸组胺，这一剂量较之规定值大10倍。各组（每组包括5只小鼠）的幸存者数目示于表中。
表12
在37℃下经长时间保存后的百日咳类毒素制剂的转导子腺苷二磷酸-核糖基化作用活性
保存在37℃ 腺苷二磷酸-核糖基化作用活性
（单位/毫升）
下的天数 PTH-04 PTH-05
0 ＜30 270
8 ＜30 ＜30
14 ＜30 52
25 ＜30 37
将过氧化氢灭活的百日咳毒素制剂保存表中所指明的天数后，用转导子作为受体测定其腺苷二磷酸-核糖基转移酶活性。数据系以标准百日咳毒素制剂为基准而进行计算，并以毫微克毒素/毫升为单位表示。
由本文所列数据可以清楚地看出，如上所述用过氧化氢处理百日咳毒素能产生化学不可逆的抗原，这种抗原是安全（无毒）的，并无通常在已有技术制剂中所遇到的有害影响。而且制剂是稳定的，具有致免疫性和预防百日咳感染的能力。当然，文内通过百日咳毒素的具体例子所阐明的新方法并不仅仅限于百日咳毒素。该法是普遍适用的，同样可用于破伤风、白喉、霍乱等其他毒素的制备。
显然，本发明的毒素也可用于包含致免疫量的类毒素和药学上可接受的载体的药剂，而所说载体可以是诸如消毒生理盐水、无毒生理缓冲剂、或该技术领域中熟知的类似物质。当然，消毒剂、添加剂和佐剂，如铝化合物以及该技术领域中熟知的一类物质均可用于这类制剂中。
应该明白，本文所述的例子和实施例仅用于说明的目的，根据本发明所作的各种变换和变化对该技术领域的熟练人员将是显而易见的，因而包括在本申请文件的原理和范围内，以及所附权利要求书的范围内。