一株植物乳杆菌及其应用 【技术领域】
本发明涉及一株植物乳杆菌及其应用。背景技术 乳酸菌细菌素 (Bacteriocins of LAB) 是指乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成 的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质类物质。 它们通常可以抑制一些常见的腐败菌和致病 菌， 如金黄色葡萄球菌、 藤黄微球菌、 枯草芽孢杆菌、 单核细胞增生李斯特氏菌等。 而且大部 分乳酸菌细菌素稳定性较好， 可与食品一起加热使用， 而且易被人体中的蛋白酶降解， 不会 在体内蓄积引起不良反应， 被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加 剂。
发明内容 本发明的目的是提供一株的产细菌素的植物乳杆菌及其应用， 该菌株生产的细菌 + 素抑制常见的 G 和 G 腐败菌和病原菌。
本发明提供的植物乳杆菌为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号， 其在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC № .3698。
上述植物乳杆菌是以一些最常见的 G+ 和 G+ 腐败菌和病原菌为指示菌， 筛选出产广 谱细菌素的乳酸菌菌株， 已于 2010 年 03 月 26 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生 物研究所 )， 保藏登记号为 CGMCC № .3698。
本 发 明 提 供 的 应 用， 即 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)3 号 CGMCC № .3698 在抑制细菌中的应用， 以及植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号 CGMCC № .3698 在生产细菌素中的应用。
所 述 细 菌 为 上 述 所 述 G+ 和 G- 腐 败 菌 和 病 原 菌， 具体可为藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus)、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、 沙门氏菌 (Salmonella enterica)、 铜绿假单孢杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)、大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)，优 选 为 藤 黄 微 球 菌 (Micrococcus luteus)28001、 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)26003、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)63501、 沙门氏菌 (Salmonella enterica)50094、 铜绿假单孢杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)10104、 大肠杆菌 (Escherichia coli)30105。
本发明的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号可以产生对多种病原菌和 腐败菌具有抑制作用的细菌素， 该细菌素对蛋白酶敏感， 并且该细菌素具有很好的酸稳定 性和热稳定性， 在 121℃高温下处理 30 分钟不影响其抑菌活性， 抑菌谱广等优点。 可以应用 为具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂。
附图说明 图 1 为细菌素对酶的敏感性检测结果 ；
图 2 为不同硫酸铵浓度下沉淀细菌素后， 活性检测的结果 ；
图 3 为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号产细菌素对藤黄微球菌生长 曲线的影响
具体实施方式
实施例 1、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的获得
一、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的获得
菌种来源 ： 分离自蒙古国发酵乳制品。本发明以一些最常见的 G+ 和 G- 腐败菌和 病原菌为指示菌， 筛选出产广谱细菌素的乳酸菌菌株， 具体方法为 ： 在无菌条件下， 取乳制 -1 品材料 5g， 加入到 45mL 无菌蒸馏水中， 充分震荡 5min， 以 10 倍系列稀释， 从 10 ～ 10-7 梯 度， 选合适的梯度， 取 100μL 分别涂布于装有 MRS 培养基 ( 购自上海沪峰生物科技有限公 司， 货号为 HB0384) 的培养皿， 30℃静置培养并计数。 其中， 含 MRS 培养基培养皿为厌氧培养 48h， 厌氧培养设备采用三菱株式化学社出品的厌氧包与厌氧培养盒。从含 MRS 培养基的培 养皿中挑取单菌落， 划线纯化 2 次， 并进行革兰氏染色试验， 镜检。利用牛津杯双层平板法 ： 含 1.5％琼脂的指示菌培养基冷却至 50℃左右， 按每平皿 15mL 倾倒在无菌培养皿中， 超净 工作台中冷却 ； 制备含 0.8％琼脂的指示菌培养基， 冷却至 50℃左右， 按 1％的接种量加入 指示菌菌悬液作为上层培养基， 倾倒 5mL 上层培养基于含 1.5％琼脂培养基的平板中冷却， 然后用无菌镊子将牛津杯轻轻放置于平板上， 将无细胞发酵上清液加入牛津杯中于超净工 作台上扩散 5h， 置于适宜的培养条件下培养 24h 后观察抑菌圈的出现， 选取牛津杯周围有 明显抑菌圈的菌株做复筛。结果获得一株广泛抑制指示菌的菌株， 命名为 3 号。 二、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的鉴定
3 号菌株生理生化实验结果如表 1 所示 ； 16S rRNA 基因序列如序列表中序列 1 所 示。根据细胞显微形态、 生理生化数据和 16S rRNA 基因序列数据， 将 3 号菌株鉴定为植物 乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)， 并于 2010 年 03 月 26 日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中 国科学院微生物研究所 )， 保藏登记号为 CGMCC № .3698。
表 1、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号理化实验结果
实验项目 革兰氏染色 细胞形态结果 阳性 杆状实验项目 碳水化合物产酸续 核糖结果+形成芽孢-海藻糖+4101974449 A CN 101974453说+ + +明书木糖 鼠李糖 麦芽糖 乳糖 棉籽糖 山梨醇 蜜二糖 半乳糖 甘露糖 + + + + + + + + + + +3/10 页接触酶 氧化酶 在空气中生长 45℃生长 15℃生长6.5％ NaCl 生长 pH9.6 生长 pH 4.5 生长 碳水化合物产酸 葡萄糖 甘露糖 松三塘 果糖 水杨苷 苦杏仁苷
++ + + + +阿拉伯糖 葡萄糖酸钠 蔗糖 纤维二糖 七叶灵实施例 2、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号抑菌效果鉴定
从实施例 1 看出本发明的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号对一些最 + 常见的 G 和 G- 腐败菌和病原菌具有抑菌性， 因此推测该菌株可以分泌细菌素， 通过以下方 法对植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的抑菌效果和其分泌的细菌素进行鉴定。
一、 排除因素干扰
1、 排除酸的干扰
抑制病原菌的试验方法为牛津杯双层平板法 ： 含 1.5％琼脂的指示菌培养基 NA 培 养基 ( 用于藤黄微球菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 铜绿假单孢杆菌、 短小芽孢杆菌、 沙门氏菌的培养 ) ： 牛肉膏 3g， 蛋白胨 10g， 氯化钠 5g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1.0L， pH7.0 ～ 7.2。 LB 培养基 ( 用于大肠杆菌的培养 ) ： 蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， 氯化钠 10g， 蒸馏水 1.0L，
pH7.0。PDA 培养基 ( 用于白色念珠菌 ) ： 马铃薯浸出粉 4.0g， 葡萄糖 20g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1.0L， pH5.6。冷却至 50℃左右， 按每平皿 15mL 倾倒在无菌培养皿中， 超净工作台中冷却 ； 制备含 0.8％琼脂的指示菌培养基 ( 同上 )， 冷却至 50℃左右， 按 1％ ( 体积百分含量 ) 的 接种量加入指示菌 ( 表 2 所示 ) 菌悬液 ( 用接种环挑取活化的指示菌一环接种于该菌适合 的培养基中， 37℃静置培养 24h。并调整菌液浓度为 107cfu/mL， 4℃冰箱保存备用 ) 混匀作 为上层培养基， 倾倒 5mL 上层培养基于上述制备的含 1.5％琼脂培养基的平板中冷却， 然后 用无菌镊子将牛津杯轻轻放置于平板上， 将上述待测液加入牛津杯中于超净工作台上扩散 5h， 置于适宜的培养条件下培养 24h 后观察抑菌圈。
用盐酸和乳酸分别调蒸馏水和 MRS 液体培养基的 pH 值为 pH3.0、 4.0、 5.0、 6.0， 为 对照 pH 值， 利用牛津杯双层平板法， 对上述各种 pH 值的蒸馏水和 MRS 液体培养基做抑菌试 验。 用乳酸和盐酸分别调蒸馏水和 MRS 液体培养基的 pH 值， 结果表明不同 pH 值对 6 种指示 菌的抑菌效果不同。用乳酸和盐酸调蒸馏水 pH 值在 3.0 ～ 6.0 对指示菌都没有抑菌效果 ； 乳酸和盐酸调 MRS 液体培养基在 pH3.0 以下都有抑菌效果， pH4.0 对大肠杆菌 (Escherichia coli)30105、 藤 黄 微 球 菌 (Micrococcus luteus)28001、 铜 绿 假 单 孢 杆 菌 (Pseudomonas aeruginosa)10104 都有抑菌效果， 而对金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)26003、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)63501 和沙门氏菌 (Salmonella enterica)50094 没有 抑菌效果， pH5.0 对藤黄微球菌和铜绿假单孢杆菌抑制作用较小， 对其它四种指示菌无抑制 作用， 而 pH6.0 对六种指示菌都没有抑菌效果， 选择 pH6.0 作为对照 pH。
挑取 MRS 培养基上培养 24 小时的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号， 接种于 MRS 液体培养基中， 30℃静置培养 24h， 12000rpm， 4℃离心 15min 后， 测上清液的 pH 值， 并用 1mol/L NaOH( 已灭菌 ) 和 1mol/L HCl 调离心发酵上清液至上述确定的对照 pH 值 6.0， 按照上述牛津杯双层平板法做抑菌试验。所用指示菌如表 2 所示， 所有指示菌均购于 河南省食品药品检验所。
MRS 液体培养基 ： MRS 培养基可购自上海沪峰生物科技有限公司， 货号为 HB0384， 其配方为每升由蛋白胨 10g， 酵母膏 5g， 牛肉膏 10g， 葡萄糖 20g， 磷酸氢二钾 2g， 柠檬酸 铵 2g， 乙酸钠 5g， 硫酸镁 0.58g， 硫酸锰 0.25g， 吐温 80 1mL， 琼脂 15g， 蒸馏水 1.0L 组成， pH6.5。
结果如表 2 所示， 结果表明 Lactobacillus plantarum 3 号不仅对藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001、 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)26003、 枯草芽孢 杆菌 (Bacillus subtilis)63501、 沙门氏菌 (Salmonella enterica)50094、 铜绿假单孢杆 菌 (Pseudomonas aeruginosa)10104、 大肠杆菌 (Escherichia coli)30105 有明显的抑制作 用， 该抑制作用不受 pH 的影响。
表 2. 排除酸抑制作用的试验结果
注： 抑菌圈直径包含牛津杯外径 (7.8mm)
2、 过氧化氢作用的排除
乳酸菌在代谢过程中可能产生过氧化氢抑制细菌的生长， 因此必须排除过氧化氢 的干扰。发酵上清液用过氧化氢酶处理， 以未经过氧化氢酶处理的 pH6.0 的无细胞发酵 上清液做对照， 以藤黄微球菌为指示菌进行抑菌试验， 乳酸菌的发酵上清液经过氧化氢酶 处理后， 抑菌圈直径和对照抑菌圈直径相比， 从而证明发酵液中主要抑菌物质是不是过氧 化氢。方法 ： 挑取 MRS 培养基上培养 24 小时的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号， 接种于 MRS 液体培养基中， 30℃静置培养 24h， 12000rpm， 4℃离心 15min 后， 获得发酵上 清液。过氧化氢酶溶解在 50mmol/L 的磷酸缓冲液 (pH 7.0) 中， 按照过氧化氢酶终浓度为 5.0mg/mL 加入到上述发酵上清液， 37℃水浴 2h， 检测过氧化氢酶处理后无细胞发酵上清液
的抑菌活性， 方法同步骤 1 的牛津杯双层平板法。结果表明过氧化氢酶不影响该菌对藤黄 微球菌 (Micrococcus luteus)28001 的抑制作用， 还有另外的抑菌物质对指示菌起抑制作 用。
3、 蛋白酶检测抑菌物质的蛋白质性质
先用 1mol/L NaOH( 已灭菌 ) 和 1mol/L HCI 分别调发酵上清液到胰蛋白酶 (SIGMA 公司， 货号 ： C9322) 最适作用 pH 值 8.1 和蛋白酶 K(MERCK 公司， 货号 ： WL558668.609) 的最 适作用 pH 值 8.0， 按 1.0mg/mL 加入胰蛋白酶和蛋白酶 K， 37 ℃水浴 2h， 再将 pH 调回对照 pH 值 6.0， 牛津杯法检测抑菌活性， 并用 pH6.0 无细胞发酵上清液作为对照， 检测胰蛋白酶 和蛋白酶 K 对乳酸菌无细胞发酵上清液抑菌活性的影响。方法同步骤 1 的牛津杯双层平 板法。结果表明如表 3 所示胰蛋白酶和蛋白酶 K 作用后， 该菌对藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 没有抑菌作用。 说明该菌抑制藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 的物 质为可被胰蛋白酶和蛋白酶 K 分解， 是蛋白质类物质。
表 3. 过 氧 化 氢 酶 和 蛋 白 酶 作 用 后 的 抑 制 藤 黄 微 球 菌 (Micrococcus luteus)28001 活性
上述步骤 1-3 的实验结果说明， 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号发酵 液中主要抑菌物质不是过氧化氢， 也不是因为酸的作用， 还有另外的抑菌物质对指示菌起 抑制作用。该抑菌物质可被胰蛋白酶和蛋白酶 K 的酶解， 说明它们是蛋白质类物质， 是一类 细菌素。
二、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号发酵条件的优化
优化植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号发酵条件方法 ： 按照实施例 1 中的牛津杯法方法测定不同浓度 ( 质量百分含量 ) 的葡萄糖， 胰蛋白胨， 蛋白胨， 酵母膏， 硫酸镁和吐温 80， 以及不同质量百分含量的接种量， 培养时间， 温度和起始 pH 值条件下 的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号培养液对抑制藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 的影响， 得到最佳条件。
通过对培养基碳源、 氮源、 培养时间、 温度、 接种量、 pH 值等条件的优化后， 培养基 ( 质量百分含量 ) ： 葡萄糖 3％， 胰蛋白胨 2％， 蛋白胨 1％， 酵母膏 1％， 硫酸镁 0.058％， 吐 6 温 80 0.2％。最佳培养温度为 30℃， 最佳起始 pH 值为 6.5， 最佳接种量为 10 cfu/ml。
效价标准方程的测定
效 价 检 测 平 板 中， 分 别 加 入 50IU/mL、 100IU/mL、 500IU/mL、 1000IU/mL、 1500IU/ mL、 2000IU/mL、 5000IU/mL 的 Nisin(SIGMA 公 司， 货号 ： N5764) 标 准 溶 液， 以藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 为指示菌， 30℃培养 24h， 以效价对数值为横坐标， 抑菌圈直径 为纵坐标， 添加直线渐近线， 获得效价测定标准方程。 然后对应标准曲线计算出植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 产细菌素的相对效价。 优 化 前 挑 取 MRS 培 养 基 上 培 养 24 小 时 的 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)3 号， 接种于 MRS 液体培养基中， 30℃静置培养 24h， 初始 pH 值 6.0。接种量为 6 10 cfu/ml。
结果如表 4 所示， 结果表明， 经过培养条件优化后植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号产细菌素的抑菌活性明显增加。
表 4 发酵条件优化结果
三、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素生物学特性的研究
1、 细菌素对热的稳定性
挑 取 活 化 的 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)3 号 单 菌 落 接 种 于 MRS 液体培养基中， 密封， 30 ℃静置培养 24h， 发酵液以 12000rpm， 4 ℃离心 15min， 收集上清 液， 上清液用 0.22μm 孔径的无菌滤膜过滤， 除去菌体及其它杂质。获得植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的无细胞发酵上清液。
将 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)3 号 的 pH6.0 无 细 胞 发 酵 上 清 液 分别放置在 60 ℃、 80 ℃、 100 ℃和 121 ℃处理 15min 和 30min， 按照步骤一所述的牛津杯
双层平板法， 在 30 ℃条件下做抑菌试验， 确定不同温度处理后对细菌素抑制藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 活性的影响。
结果如表 5 所示， 结果表明植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号对热稳 定， 在 121℃高温下处理 30 分钟， 仍然保持很高的抑菌活性， 可以应用于高温灭菌的食品或 饲料中。
表 5. 不同温度处理对细菌素抑制藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 活性 的影响
注： 抑菌圈直径包含牛津杯外径 (7.8mm)
2、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素对酸的稳定性
将植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号无细胞发酵上清液 ( 按照步骤 1 的 方法获得 ) 分别用 1mol/L HCL 和 1mol/L NaOH 调其 pH 值为 2.0 ～ 10.0， 37℃下温育 2h， 调 pH 值为 6.0， 然后按照步骤一所述的牛津杯双层平板法做抑菌试验测抑菌活性。同等条件 下， 分别用 1mol/L HCL 和 1mol/L NaOH 调整灭过菌的液体 MRS 培养基 pH 值为 2.0 ～ 10.0， 37℃下温育 2h， 调整 pH 值为 6.0， 同样按照步骤一所述的牛津杯双层平板法做对照。
表 6. 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号细菌素对酸的稳定性
注： 抑菌圈直径包含牛津杯外径 (7.8mm)， “-” 代表抑菌圈直径低于 8.0mm
3、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素对酶的敏感性
取等量的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号菌 pH6.0 无细胞发酵上清 液 ( 按照步骤 1 的方法获得 )， 用 1mol/L HCL 和 1mol/L NaOH 调节 pH 为以下各酶的最适 作用 pH 值， 按终浓度 1mg/mL 分别加入胃蛋白酶 ( 最适作用 pH 值 3， Amresco 公司， 货号 ： 0685)、 胰蛋白酶 ( 最适作用 pH 值 8.1， GLBCO 公司， 27250018)、 蛋白酶 K( 最适作用 pH 值 8.0， MERCK 公司， WL558668.609)、 木瓜蛋白酶 ( 最适作用 pH 值 6.0， MERCK 公司， 107147) 和 糜蛋白酶 ( 最适作用 pH 值 8.5， SIGMA 公司， C8660)， 37℃下温育 2h， 调整 pH 达到 6.0， 按 照实施例一所述的牛津杯双层平板法做抑菌实验， 重复 3 次， 同时以未经过蛋白酶处理的 pH6.0 无细胞发酵上清液做对照。
结 果 如 图 1 所 示， 5 种 蛋 白 酶 能 很 好 的 分 解 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素， 对藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 基本没有抑制 作用。图 1 中， 1 为胃蛋白酶 ； 2 为蛋白酶 K ； 3 为胰蛋白酶 ； 4 为木瓜蛋白酶 ； 5 为糜蛋白酶 ； CK 为未经过蛋白酶处理的 pH6.0 无细胞发酵上清液。
4、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素的抑菌谱的测定 取等量的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号菌 pH6.0 无细胞发酵上清 液 ( 按照步骤 1 的方法获得 )， 按照实施例 1 中的所述的牛津杯双层平板法对表 7 中的各 种指示菌做抑菌实验， 同时以 pH6.0 的液体 MRS 培养基为对照。结果如表 7 所示， 在所选的 指示菌范围内， 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素对藤黄微球菌 28001、 金黄色葡萄球菌 26003、 枯草芽孢杆菌 63501、 短小芽孢杆菌 63202、 铜绿假单孢杆菌 10104、 沙门氏菌 50094、 大肠杆菌 30105 有抑制作用， 对白色念珠菌 98001 和黑曲霉 98003 没有抑制作用。
表 7. 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素的抑菌谱
指示菌 ( 均购于河南省食品药品检验所 ) 藤黄微球菌 28001 金黄色葡萄球菌 26003 枯草芽孢杆菌 63501 短小芽孢杆菌 63202 铜绿假单孢杆菌 10104 沙门氏菌 50094抑菌圈直径 ( 单位 ： mm) Lactobacillus plantarum 3 号 19.28 17.39 16.76 15.99 16.68 15.7810101974449 A CN 101974453说明书15.76 -9/10 页大肠杆菌 30105 白色念珠菌 98001 黑曲霉 98003
注： 抑菌圈直径包含牛津杯外径 (7.8mm)， “-” 代表抑菌圈直径低于 8.0mm
四、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素的提取
1、 硫酸铵盐析法粗提细菌素
各取等量植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的无细胞发酵上清液 ( 按 照步骤三中步骤 1 的方法获得 )80℃下处理 10min 防止细菌素降解， 分别调整硫酸铵的饱和 度为 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％， 缓慢搅拌 1h 后， 放置 4℃冰箱中过夜。离心 弃上清 (10000rpm， 4℃， 30min)， 沉淀溶于 1mL 的磷酸盐缓冲液中 (pH6.0)， 检测各浓度沉淀 物溶液的抑菌活性， 指示菌为藤黄微球菌 28001， 同时以同样浓度处理过的 MRS 液体培养基 离心 (10000rpm， 4℃， 30min) 后弃上清， 溶于 1mL 的磷酸盐缓冲液中 (pH6.0) 做对照。
结果如图 2 所示。
2、 产细菌素最小抑菌浓度 (MIC)
用液体倍比稀释法确定乳酸菌素的最小抑菌浓度 (MIC)。以常见的腐败菌和致病 菌为指示菌 ： 藤黄微球菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 大肠杆菌、 铜绿假单孢杆菌和沙 门氏菌。方法如下 ：
(1) 将各乳酸菌细菌素粗提液加入到各指示菌培养液中， 用二倍稀释法稀释得到 6 各种浓度， 接入指示菌， 并调整菌浓为 10 cfu/mL， 最适温度培养过夜。 以不加细菌素粗提液 但接菌的试管作为阳性对照， 以加细菌素粗提液但不接种菌的试管作为阴性对照。
(2) 依次将未见菌生长的各管培养物分别吸取 100uL 注入指示菌平板培养基中， 30 ℃培养 24h， 试验组无菌生长组所对应的细菌素粗提液的最低浓度， 为最小抑菌浓度 (MIC)。
结果如表 8 所示， 结果表明， 藤黄微球菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 铜绿假 单孢杆菌和沙门氏菌在 176.88IU/mL 及其以上浓度的平板上完全不能生长， 大肠杆菌在 176.88IU/mL 浓度的平板上可见极其稀少的菌落， 在 353.75IU/mL 及其以上浓度的平板上 则完全不能生长， 因此 Lactobacillus plantarum 3 号产生的细菌素对藤黄微球菌、 金黄色 葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 铜绿假单孢杆菌和沙门氏菌的 MIC 为 176.88IU/mL， 对大肠杆菌 的 MIC 为 353.75IU/mL。
表 8.Lactobacillus plantarum 3 号产细菌素对几种指示菌最小抑菌浓度 (MIC)
注： “-” 对指示菌的抑制圈直径低于 8.0mm( 牛津杯的直径 7.8mm)
“+” 对指示菌的抑制圈直径大于 8.0mm。
3、 Lactobacillus plantarum 3 号产细菌素对指示菌 ( 藤黄微球菌 28001) 生长 曲线的影响
用接种环挑取藤黄微球菌 28001 接种于 NA 液体培养基 ( 牛肉膏 3g， 蛋白胨 10g， 氯化钠 5g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1.0L， pH7.0 ～ 7.2) 中， 分别取部分菌液， 然后用液体培养基稀 6 释成活菌数为 10 cfu/mL 的菌悬液， 继续培养， 每隔 2h 取样， 测 OD600nm 吸光值， 连续测定 48h， 制作出对照生长曲线。
取剩余的部分菌液， 向其中添加 MIC 和 1/2MIC 的 Lactobacillus plantarum 3 号 产细菌素粗提液， 使培养基中活菌数为 106cfu/mL， 继续培养并每隔 2h 取样， 测 OD600nm， 制作 出细菌素作用下的藤黄微球菌的生长曲线。
结果如图 3 所示， 结果表明和对照相比， MIC 含量的细菌素对藤黄微球菌 28001 完 全抑制， 而 1/2MIC 含量的细菌素也大大抑制了藤黄微球菌 28001 的生长， 其对数生长期出 现的时间延长， 生长的最大菌生物量也减少。
本发明涉及一株植物乳杆菌及其应用。背景技术 乳酸菌细菌素 (Bacteriocins of LAB) 是指乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成 的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质类物质。 它们通常可以抑制一些常见的腐败菌和致病 菌， 如金黄色葡萄球菌、 藤黄微球菌、 枯草芽孢杆菌、 单核细胞增生李斯特氏菌等。 而且大部 分乳酸菌细菌素稳定性较好， 可与食品一起加热使用， 而且易被人体中的蛋白酶降解， 不会 在体内蓄积引起不良反应， 被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加 剂。
发明内容 本发明的目的是提供一株的产细菌素的植物乳杆菌及其应用， 该菌株生产的细菌 + 素抑制常见的 G 和 G 腐败菌和病原菌。
本发明提供的植物乳杆菌为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号， 其在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC № .3698。
上述植物乳杆菌是以一些最常见的 G+ 和 G+ 腐败菌和病原菌为指示菌， 筛选出产广 谱细菌素的乳酸菌菌株， 已于 2010 年 03 月 26 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生 物研究所 )， 保藏登记号为 CGMCC № .3698。
本 发 明 提 供 的 应 用， 即 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)3 号 CGMCC № .3698 在抑制细菌中的应用， 以及植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号 CGMCC № .3698 在生产细菌素中的应用。
所 述 细 菌 为 上 述 所 述 G+ 和 G- 腐 败 菌 和 病 原 菌， 具体可为藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus)、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、 沙门氏菌 (Salmonella enterica)、 铜绿假单孢杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)、大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)，优 选 为 藤 黄 微 球 菌 (Micrococcus luteus)28001、 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)26003、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)63501、 沙门氏菌 (Salmonella enterica)50094、 铜绿假单孢杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)10104、 大肠杆菌 (Escherichia coli)30105。
本发明的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号可以产生对多种病原菌和 腐败菌具有抑制作用的细菌素， 该细菌素对蛋白酶敏感， 并且该细菌素具有很好的酸稳定 性和热稳定性， 在 121℃高温下处理 30 分钟不影响其抑菌活性， 抑菌谱广等优点。 可以应用 为具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂。
附图说明 图 1 为细菌素对酶的敏感性检测结果 ；
图 2 为不同硫酸铵浓度下沉淀细菌素后， 活性检测的结果 ；
图 3 为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号产细菌素对藤黄微球菌生长 曲线的影响
具体实施方式
实施例 1、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的获得
一、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的获得
菌种来源 ： 分离自蒙古国发酵乳制品。本发明以一些最常见的 G+ 和 G- 腐败菌和 病原菌为指示菌， 筛选出产广谱细菌素的乳酸菌菌株， 具体方法为 ： 在无菌条件下， 取乳制 -1 品材料 5g， 加入到 45mL 无菌蒸馏水中， 充分震荡 5min， 以 10 倍系列稀释， 从 10 ～ 10-7 梯 度， 选合适的梯度， 取 100μL 分别涂布于装有 MRS 培养基 ( 购自上海沪峰生物科技有限公 司， 货号为 HB0384) 的培养皿， 30℃静置培养并计数。 其中， 含 MRS 培养基培养皿为厌氧培养 48h， 厌氧培养设备采用三菱株式化学社出品的厌氧包与厌氧培养盒。从含 MRS 培养基的培 养皿中挑取单菌落， 划线纯化 2 次， 并进行革兰氏染色试验， 镜检。利用牛津杯双层平板法 ： 含 1.5％琼脂的指示菌培养基冷却至 50℃左右， 按每平皿 15mL 倾倒在无菌培养皿中， 超净 工作台中冷却 ； 制备含 0.8％琼脂的指示菌培养基， 冷却至 50℃左右， 按 1％的接种量加入 指示菌菌悬液作为上层培养基， 倾倒 5mL 上层培养基于含 1.5％琼脂培养基的平板中冷却， 然后用无菌镊子将牛津杯轻轻放置于平板上， 将无细胞发酵上清液加入牛津杯中于超净工 作台上扩散 5h， 置于适宜的培养条件下培养 24h 后观察抑菌圈的出现， 选取牛津杯周围有 明显抑菌圈的菌株做复筛。结果获得一株广泛抑制指示菌的菌株， 命名为 3 号。 二、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的鉴定
3 号菌株生理生化实验结果如表 1 所示 ； 16S rRNA 基因序列如序列表中序列 1 所 示。根据细胞显微形态、 生理生化数据和 16S rRNA 基因序列数据， 将 3 号菌株鉴定为植物 乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)， 并于 2010 年 03 月 26 日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中 国科学院微生物研究所 )， 保藏登记号为 CGMCC № .3698。
表 1、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号理化实验结果
实验项目 革兰氏染色 细胞形态结果 阳性 杆状实验项目 碳水化合物产酸续 核糖结果+形成芽孢-海藻糖+4101974449 A CN 101974453说+ + +明书木糖 鼠李糖 麦芽糖 乳糖 棉籽糖 山梨醇 蜜二糖 半乳糖 甘露糖 + + + + + + + + + + +3/10 页接触酶 氧化酶 在空气中生长 45℃生长 15℃生长6.5％ NaCl 生长 pH9.6 生长 pH 4.5 生长 碳水化合物产酸 葡萄糖 甘露糖 松三塘 果糖 水杨苷 苦杏仁苷
++ + + + +阿拉伯糖 葡萄糖酸钠 蔗糖 纤维二糖 七叶灵实施例 2、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号抑菌效果鉴定
从实施例 1 看出本发明的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号对一些最 + 常见的 G 和 G- 腐败菌和病原菌具有抑菌性， 因此推测该菌株可以分泌细菌素， 通过以下方 法对植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的抑菌效果和其分泌的细菌素进行鉴定。
一、 排除因素干扰
1、 排除酸的干扰
抑制病原菌的试验方法为牛津杯双层平板法 ： 含 1.5％琼脂的指示菌培养基 NA 培 养基 ( 用于藤黄微球菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 铜绿假单孢杆菌、 短小芽孢杆菌、 沙门氏菌的培养 ) ： 牛肉膏 3g， 蛋白胨 10g， 氯化钠 5g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1.0L， pH7.0 ～ 7.2。 LB 培养基 ( 用于大肠杆菌的培养 ) ： 蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， 氯化钠 10g， 蒸馏水 1.0L，
pH7.0。PDA 培养基 ( 用于白色念珠菌 ) ： 马铃薯浸出粉 4.0g， 葡萄糖 20g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1.0L， pH5.6。冷却至 50℃左右， 按每平皿 15mL 倾倒在无菌培养皿中， 超净工作台中冷却 ； 制备含 0.8％琼脂的指示菌培养基 ( 同上 )， 冷却至 50℃左右， 按 1％ ( 体积百分含量 ) 的 接种量加入指示菌 ( 表 2 所示 ) 菌悬液 ( 用接种环挑取活化的指示菌一环接种于该菌适合 的培养基中， 37℃静置培养 24h。并调整菌液浓度为 107cfu/mL， 4℃冰箱保存备用 ) 混匀作 为上层培养基， 倾倒 5mL 上层培养基于上述制备的含 1.5％琼脂培养基的平板中冷却， 然后 用无菌镊子将牛津杯轻轻放置于平板上， 将上述待测液加入牛津杯中于超净工作台上扩散 5h， 置于适宜的培养条件下培养 24h 后观察抑菌圈。
用盐酸和乳酸分别调蒸馏水和 MRS 液体培养基的 pH 值为 pH3.0、 4.0、 5.0、 6.0， 为 对照 pH 值， 利用牛津杯双层平板法， 对上述各种 pH 值的蒸馏水和 MRS 液体培养基做抑菌试 验。 用乳酸和盐酸分别调蒸馏水和 MRS 液体培养基的 pH 值， 结果表明不同 pH 值对 6 种指示 菌的抑菌效果不同。用乳酸和盐酸调蒸馏水 pH 值在 3.0 ～ 6.0 对指示菌都没有抑菌效果 ； 乳酸和盐酸调 MRS 液体培养基在 pH3.0 以下都有抑菌效果， pH4.0 对大肠杆菌 (Escherichia coli)30105、 藤 黄 微 球 菌 (Micrococcus luteus)28001、 铜 绿 假 单 孢 杆 菌 (Pseudomonas aeruginosa)10104 都有抑菌效果， 而对金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)26003、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)63501 和沙门氏菌 (Salmonella enterica)50094 没有 抑菌效果， pH5.0 对藤黄微球菌和铜绿假单孢杆菌抑制作用较小， 对其它四种指示菌无抑制 作用， 而 pH6.0 对六种指示菌都没有抑菌效果， 选择 pH6.0 作为对照 pH。
挑取 MRS 培养基上培养 24 小时的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号， 接种于 MRS 液体培养基中， 30℃静置培养 24h， 12000rpm， 4℃离心 15min 后， 测上清液的 pH 值， 并用 1mol/L NaOH( 已灭菌 ) 和 1mol/L HCl 调离心发酵上清液至上述确定的对照 pH 值 6.0， 按照上述牛津杯双层平板法做抑菌试验。所用指示菌如表 2 所示， 所有指示菌均购于 河南省食品药品检验所。
MRS 液体培养基 ： MRS 培养基可购自上海沪峰生物科技有限公司， 货号为 HB0384， 其配方为每升由蛋白胨 10g， 酵母膏 5g， 牛肉膏 10g， 葡萄糖 20g， 磷酸氢二钾 2g， 柠檬酸 铵 2g， 乙酸钠 5g， 硫酸镁 0.58g， 硫酸锰 0.25g， 吐温 80 1mL， 琼脂 15g， 蒸馏水 1.0L 组成， pH6.5。
结果如表 2 所示， 结果表明 Lactobacillus plantarum 3 号不仅对藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001、 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)26003、 枯草芽孢 杆菌 (Bacillus subtilis)63501、 沙门氏菌 (Salmonella enterica)50094、 铜绿假单孢杆 菌 (Pseudomonas aeruginosa)10104、 大肠杆菌 (Escherichia coli)30105 有明显的抑制作 用， 该抑制作用不受 pH 的影响。
表 2. 排除酸抑制作用的试验结果
注： 抑菌圈直径包含牛津杯外径 (7.8mm)
2、 过氧化氢作用的排除
乳酸菌在代谢过程中可能产生过氧化氢抑制细菌的生长， 因此必须排除过氧化氢 的干扰。发酵上清液用过氧化氢酶处理， 以未经过氧化氢酶处理的 pH6.0 的无细胞发酵 上清液做对照， 以藤黄微球菌为指示菌进行抑菌试验， 乳酸菌的发酵上清液经过氧化氢酶 处理后， 抑菌圈直径和对照抑菌圈直径相比， 从而证明发酵液中主要抑菌物质是不是过氧 化氢。方法 ： 挑取 MRS 培养基上培养 24 小时的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号， 接种于 MRS 液体培养基中， 30℃静置培养 24h， 12000rpm， 4℃离心 15min 后， 获得发酵上 清液。过氧化氢酶溶解在 50mmol/L 的磷酸缓冲液 (pH 7.0) 中， 按照过氧化氢酶终浓度为 5.0mg/mL 加入到上述发酵上清液， 37℃水浴 2h， 检测过氧化氢酶处理后无细胞发酵上清液
的抑菌活性， 方法同步骤 1 的牛津杯双层平板法。结果表明过氧化氢酶不影响该菌对藤黄 微球菌 (Micrococcus luteus)28001 的抑制作用， 还有另外的抑菌物质对指示菌起抑制作 用。
3、 蛋白酶检测抑菌物质的蛋白质性质
先用 1mol/L NaOH( 已灭菌 ) 和 1mol/L HCI 分别调发酵上清液到胰蛋白酶 (SIGMA 公司， 货号 ： C9322) 最适作用 pH 值 8.1 和蛋白酶 K(MERCK 公司， 货号 ： WL558668.609) 的最 适作用 pH 值 8.0， 按 1.0mg/mL 加入胰蛋白酶和蛋白酶 K， 37 ℃水浴 2h， 再将 pH 调回对照 pH 值 6.0， 牛津杯法检测抑菌活性， 并用 pH6.0 无细胞发酵上清液作为对照， 检测胰蛋白酶 和蛋白酶 K 对乳酸菌无细胞发酵上清液抑菌活性的影响。方法同步骤 1 的牛津杯双层平 板法。结果表明如表 3 所示胰蛋白酶和蛋白酶 K 作用后， 该菌对藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 没有抑菌作用。 说明该菌抑制藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 的物 质为可被胰蛋白酶和蛋白酶 K 分解， 是蛋白质类物质。
表 3. 过 氧 化 氢 酶 和 蛋 白 酶 作 用 后 的 抑 制 藤 黄 微 球 菌 (Micrococcus luteus)28001 活性
上述步骤 1-3 的实验结果说明， 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号发酵 液中主要抑菌物质不是过氧化氢， 也不是因为酸的作用， 还有另外的抑菌物质对指示菌起 抑制作用。该抑菌物质可被胰蛋白酶和蛋白酶 K 的酶解， 说明它们是蛋白质类物质， 是一类 细菌素。
二、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号发酵条件的优化
优化植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号发酵条件方法 ： 按照实施例 1 中的牛津杯法方法测定不同浓度 ( 质量百分含量 ) 的葡萄糖， 胰蛋白胨， 蛋白胨， 酵母膏， 硫酸镁和吐温 80， 以及不同质量百分含量的接种量， 培养时间， 温度和起始 pH 值条件下 的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号培养液对抑制藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 的影响， 得到最佳条件。
通过对培养基碳源、 氮源、 培养时间、 温度、 接种量、 pH 值等条件的优化后， 培养基 ( 质量百分含量 ) ： 葡萄糖 3％， 胰蛋白胨 2％， 蛋白胨 1％， 酵母膏 1％， 硫酸镁 0.058％， 吐 6 温 80 0.2％。最佳培养温度为 30℃， 最佳起始 pH 值为 6.5， 最佳接种量为 10 cfu/ml。
效价标准方程的测定
效 价 检 测 平 板 中， 分 别 加 入 50IU/mL、 100IU/mL、 500IU/mL、 1000IU/mL、 1500IU/ mL、 2000IU/mL、 5000IU/mL 的 Nisin(SIGMA 公 司， 货号 ： N5764) 标 准 溶 液， 以藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 为指示菌， 30℃培养 24h， 以效价对数值为横坐标， 抑菌圈直径 为纵坐标， 添加直线渐近线， 获得效价测定标准方程。 然后对应标准曲线计算出植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 产细菌素的相对效价。 优 化 前 挑 取 MRS 培 养 基 上 培 养 24 小 时 的 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)3 号， 接种于 MRS 液体培养基中， 30℃静置培养 24h， 初始 pH 值 6.0。接种量为 6 10 cfu/ml。
结果如表 4 所示， 结果表明， 经过培养条件优化后植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号产细菌素的抑菌活性明显增加。
表 4 发酵条件优化结果
三、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素生物学特性的研究
1、 细菌素对热的稳定性
挑 取 活 化 的 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)3 号 单 菌 落 接 种 于 MRS 液体培养基中， 密封， 30 ℃静置培养 24h， 发酵液以 12000rpm， 4 ℃离心 15min， 收集上清 液， 上清液用 0.22μm 孔径的无菌滤膜过滤， 除去菌体及其它杂质。获得植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的无细胞发酵上清液。
将 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)3 号 的 pH6.0 无 细 胞 发 酵 上 清 液 分别放置在 60 ℃、 80 ℃、 100 ℃和 121 ℃处理 15min 和 30min， 按照步骤一所述的牛津杯
双层平板法， 在 30 ℃条件下做抑菌试验， 确定不同温度处理后对细菌素抑制藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 活性的影响。
结果如表 5 所示， 结果表明植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号对热稳 定， 在 121℃高温下处理 30 分钟， 仍然保持很高的抑菌活性， 可以应用于高温灭菌的食品或 饲料中。
表 5. 不同温度处理对细菌素抑制藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 活性 的影响
注： 抑菌圈直径包含牛津杯外径 (7.8mm)
2、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素对酸的稳定性
将植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号无细胞发酵上清液 ( 按照步骤 1 的 方法获得 ) 分别用 1mol/L HCL 和 1mol/L NaOH 调其 pH 值为 2.0 ～ 10.0， 37℃下温育 2h， 调 pH 值为 6.0， 然后按照步骤一所述的牛津杯双层平板法做抑菌试验测抑菌活性。同等条件 下， 分别用 1mol/L HCL 和 1mol/L NaOH 调整灭过菌的液体 MRS 培养基 pH 值为 2.0 ～ 10.0， 37℃下温育 2h， 调整 pH 值为 6.0， 同样按照步骤一所述的牛津杯双层平板法做对照。
表 6. 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号细菌素对酸的稳定性
注： 抑菌圈直径包含牛津杯外径 (7.8mm)， “-” 代表抑菌圈直径低于 8.0mm
3、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素对酶的敏感性
取等量的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号菌 pH6.0 无细胞发酵上清 液 ( 按照步骤 1 的方法获得 )， 用 1mol/L HCL 和 1mol/L NaOH 调节 pH 为以下各酶的最适 作用 pH 值， 按终浓度 1mg/mL 分别加入胃蛋白酶 ( 最适作用 pH 值 3， Amresco 公司， 货号 ： 0685)、 胰蛋白酶 ( 最适作用 pH 值 8.1， GLBCO 公司， 27250018)、 蛋白酶 K( 最适作用 pH 值 8.0， MERCK 公司， WL558668.609)、 木瓜蛋白酶 ( 最适作用 pH 值 6.0， MERCK 公司， 107147) 和 糜蛋白酶 ( 最适作用 pH 值 8.5， SIGMA 公司， C8660)， 37℃下温育 2h， 调整 pH 达到 6.0， 按 照实施例一所述的牛津杯双层平板法做抑菌实验， 重复 3 次， 同时以未经过蛋白酶处理的 pH6.0 无细胞发酵上清液做对照。
结 果 如 图 1 所 示， 5 种 蛋 白 酶 能 很 好 的 分 解 植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素， 对藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)28001 基本没有抑制 作用。图 1 中， 1 为胃蛋白酶 ； 2 为蛋白酶 K ； 3 为胰蛋白酶 ； 4 为木瓜蛋白酶 ； 5 为糜蛋白酶 ； CK 为未经过蛋白酶处理的 pH6.0 无细胞发酵上清液。
4、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素的抑菌谱的测定 取等量的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号菌 pH6.0 无细胞发酵上清 液 ( 按照步骤 1 的方法获得 )， 按照实施例 1 中的所述的牛津杯双层平板法对表 7 中的各 种指示菌做抑菌实验， 同时以 pH6.0 的液体 MRS 培养基为对照。结果如表 7 所示， 在所选的 指示菌范围内， 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素对藤黄微球菌 28001、 金黄色葡萄球菌 26003、 枯草芽孢杆菌 63501、 短小芽孢杆菌 63202、 铜绿假单孢杆菌 10104、 沙门氏菌 50094、 大肠杆菌 30105 有抑制作用， 对白色念珠菌 98001 和黑曲霉 98003 没有抑制作用。
表 7. 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素的抑菌谱
指示菌 ( 均购于河南省食品药品检验所 ) 藤黄微球菌 28001 金黄色葡萄球菌 26003 枯草芽孢杆菌 63501 短小芽孢杆菌 63202 铜绿假单孢杆菌 10104 沙门氏菌 50094抑菌圈直径 ( 单位 ： mm) Lactobacillus plantarum 3 号 19.28 17.39 16.76 15.99 16.68 15.7810101974449 A CN 101974453说明书15.76 -9/10 页大肠杆菌 30105 白色念珠菌 98001 黑曲霉 98003
注： 抑菌圈直径包含牛津杯外径 (7.8mm)， “-” 代表抑菌圈直径低于 8.0mm
四、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号分泌的细菌素的提取
1、 硫酸铵盐析法粗提细菌素
各取等量植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)3 号的无细胞发酵上清液 ( 按 照步骤三中步骤 1 的方法获得 )80℃下处理 10min 防止细菌素降解， 分别调整硫酸铵的饱和 度为 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％， 缓慢搅拌 1h 后， 放置 4℃冰箱中过夜。离心 弃上清 (10000rpm， 4℃， 30min)， 沉淀溶于 1mL 的磷酸盐缓冲液中 (pH6.0)， 检测各浓度沉淀 物溶液的抑菌活性， 指示菌为藤黄微球菌 28001， 同时以同样浓度处理过的 MRS 液体培养基 离心 (10000rpm， 4℃， 30min) 后弃上清， 溶于 1mL 的磷酸盐缓冲液中 (pH6.0) 做对照。
结果如图 2 所示。
2、 产细菌素最小抑菌浓度 (MIC)
用液体倍比稀释法确定乳酸菌素的最小抑菌浓度 (MIC)。以常见的腐败菌和致病 菌为指示菌 ： 藤黄微球菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 大肠杆菌、 铜绿假单孢杆菌和沙 门氏菌。方法如下 ：
(1) 将各乳酸菌细菌素粗提液加入到各指示菌培养液中， 用二倍稀释法稀释得到 6 各种浓度， 接入指示菌， 并调整菌浓为 10 cfu/mL， 最适温度培养过夜。 以不加细菌素粗提液 但接菌的试管作为阳性对照， 以加细菌素粗提液但不接种菌的试管作为阴性对照。
(2) 依次将未见菌生长的各管培养物分别吸取 100uL 注入指示菌平板培养基中， 30 ℃培养 24h， 试验组无菌生长组所对应的细菌素粗提液的最低浓度， 为最小抑菌浓度 (MIC)。
结果如表 8 所示， 结果表明， 藤黄微球菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 铜绿假 单孢杆菌和沙门氏菌在 176.88IU/mL 及其以上浓度的平板上完全不能生长， 大肠杆菌在 176.88IU/mL 浓度的平板上可见极其稀少的菌落， 在 353.75IU/mL 及其以上浓度的平板上 则完全不能生长， 因此 Lactobacillus plantarum 3 号产生的细菌素对藤黄微球菌、 金黄色 葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 铜绿假单孢杆菌和沙门氏菌的 MIC 为 176.88IU/mL， 对大肠杆菌 的 MIC 为 353.75IU/mL。
表 8.Lactobacillus plantarum 3 号产细菌素对几种指示菌最小抑菌浓度 (MIC)
注： “-” 对指示菌的抑制圈直径低于 8.0mm( 牛津杯的直径 7.8mm)
“+” 对指示菌的抑制圈直径大于 8.0mm。
3、 Lactobacillus plantarum 3 号产细菌素对指示菌 ( 藤黄微球菌 28001) 生长 曲线的影响
用接种环挑取藤黄微球菌 28001 接种于 NA 液体培养基 ( 牛肉膏 3g， 蛋白胨 10g， 氯化钠 5g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1.0L， pH7.0 ～ 7.2) 中， 分别取部分菌液， 然后用液体培养基稀 6 释成活菌数为 10 cfu/mL 的菌悬液， 继续培养， 每隔 2h 取样， 测 OD600nm 吸光值， 连续测定 48h， 制作出对照生长曲线。
取剩余的部分菌液， 向其中添加 MIC 和 1/2MIC 的 Lactobacillus plantarum 3 号 产细菌素粗提液， 使培养基中活菌数为 106cfu/mL， 继续培养并每隔 2h 取样， 测 OD600nm， 制作 出细菌素作用下的藤黄微球菌的生长曲线。
结果如图 3 所示， 结果表明和对照相比， MIC 含量的细菌素对藤黄微球菌 28001 完 全抑制， 而 1/2MIC 含量的细菌素也大大抑制了藤黄微球菌 28001 的生长， 其对数生长期出 现的时间延长， 生长的最大菌生物量也减少。
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