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低饱和脂肪向日葵及相关方法
    优先权要求
     本申请要求 2007 年 12 月 20 日提交的美国临时专利申请流水号 61/015,591 的申 请日的权益。
     技术领域
     本发明涉及新的且独特的向日葵以及相关方法， 所述向日葵产生低饱和脂肪和任 选地高亚油酸的种子。本发明进一步涉及具有草甘膦 (glyphosate) 抗性的非遗传修饰的、 非诱变的向日葵及相关方法。
     发明背景
     栽培的向日葵 (Helianthus annuus L.) 是植物油的全球主要来源。在美国， 每年 种植约四百万英亩向日葵， 主要在达科他州 (Dakotas) 和明尼苏达州 (Minnesota)。
     在过去十年里美国的向日葵种植面积非常快速的扩张部分是由于向日葵育种和 品种改良领域中的数项重要的发展。 一个重大的发展是胞质雄性不育和育性恢复基因的发 现， 即一项容许产生杂种向日葵的发现。在上世纪 70 年代早期期间引入了如此产生的杂 种。
     Fick， “Breeding and Genetics， ” 于 Sunflower Science and Technology279-338(J.F.Carter 编 1978) 提出了向日葵中胞质雄性不育 (CMS) 和遗传育性 恢复的描述。
     向日葵油主要包含棕榈酸 (16:0)、 硬脂酸 (18:0)、 油酸 (18:1)、 亚油酸 (18:2) 和 亚麻酸 (1 8:3)。 虽然植物中存在其它不常见的脂肪酸， 但是棕榈酸、 硬脂酸、 油酸、 亚油酸、 和亚麻酸构成植物油的世界产量中存在的脂肪酸的约 88％。(J.L.Harwood， Plant Acyl Lipids ： Structure， Distribution and Analysis， 4Lipids ： Structure and Function， P.K.Stumpf 和 E.E.Conn 编 (1988)。 ) 棕榈酸和硬脂酸是饱和脂肪酸， 在某些研究中已经证 明了它们促成血浆胆固醇水平升高， 这种升高是冠心病 (coronary heart disease) 的一项 因素。根据最近的研究， 不饱和脂肪酸诸如油酸和亚油酸高的植物油可具有降低血浆胆固 醇的能力。 一般而言， 饱和脂肪酸还具有比碳数目相同的不饱和脂肪酸高的熔点， 这促成食 品中的低温耐受性问题， 而且能促成摄入过程中的蜡质 (waxy) 或油腻口感 (feel in the mouth)。还知道的是， 由具有小于约 3％饱和脂肪酸的脂肪和油制成的食物产品通常每客 (serving) 会含有小于 0.5 克的饱和脂肪， 并且因此可以在目前的标签规定下标记为含有 “零饱和脂肪” 。如此， 就许多原因而言， 生产具有低水平棕榈酸和硬脂酸且有高水平油酸或 亚油酸的向日葵油是理想的。
     任何新的、 理想的植物种质的开发都有许多步骤。植物育种开始于分析和定义当 前种质的问题和弱点、 建立项目目的、 和定义具体的育种目标。 下一步是选择拥有满足项目 目的的性状的种质。目的是在单一品种中组合来自亲本种质的期望性状的改良组合。这些 重要的性状可以包括较高的种子产率 (yield)、 对疾病和昆虫的抗性、 较好的茎和根、 对干 旱和热的耐受性、 和较好的农艺学质量。育种或选择方法的选择取决于植物繁殖的模式、 所改良性状的遗传力、 和商业上 使用的栽培种类型 ( 例如， F1 杂种栽培种、 纯系栽培种等 )。对于高度可遗传的性状， 选择 在单个位置评估的卓越植物个体会是有效的， 而对于具有低遗传力的性状， 选择应当基于 自重复评估相关植物的家族所获得的平均值。流行的选择方法通常包括谱系选择、 改良的 谱系选择、 混合选择 (mass selection)、 和轮回选择。
     遗传的复杂性影响育种方法的选择。 使用回交育种来将一种或少数几种对于高度 可遗传的性状有利的基因转移入想要的栽培种中。 此办法已经广泛地用于育种疾病抗性栽 培种。使用多种轮回选择技术来改善受多个基因控制的数量遗传性状。轮回选择在自花传 粉作物中的使用依赖于传粉容易、 来自每次传粉的成功杂种的频率、 和来自每次成功杂交 的杂种后代的数目。
     每个育种项目应当包括对育种方法效率的周期性客观评估。 评估标准随着目的和 目标而变化， 但是应当包括基于与合适的标准品比较得到的每年来自选择的收益 (gain)、 高级育种系 (advanced breeding line) 的总价值、 和每单位投入 ( 例如每年、 花费的每一 笔美元等 ) 产生的成功栽培种的数目。
     对有希望的高级育种系进行彻底地测试， 并与代表商业目标区的环境中的合适标 准品进行比较达三年或更多年。最好的品系是新商业栽培种的候选 ； 那些在少数几个性状 方面仍有缺陷的品系可以作为亲本使用以产生供进一步选择用的新种群。 这些过程 ( 它们通向上市 (marketing) 和销售 (distribution) 的最终步骤 ) 从 进行第一次杂交的时间起通常花费 8 至 12 年。因此， 新栽培种的开发是耗时的过程， 其需 要精确的预先计划、 资源的有效使用、 和最低限度的方向变化。
     最困难的任务是鉴定遗传上卓越的个体， 因为对于大多数性状， 真实基因型的值 被其它混杂的植物性状或环境因素掩盖。 一种鉴定卓越植物的方法是相对于其它实验植物 和广泛种植的标准栽培种观察其性能 (performance)。 如果单次观察没有结论， 则重复观察 可提供对其遗传价值的更好评估。
     植物育种的目的是开发新的、 独特的且卓越的向日葵栽培种和杂种。育种人员最 初选择并杂交两种或更多种亲本品系， 接着进行重复的自交和选择， 产生许多新的遗传组 合。理论上育种人员可以经由杂交、 自交和突变产生几十亿不同的遗传组合。育种人员在 细胞水平上没有直接对照 (no direct control)。 因此， 两名育种人员绝不会开发出具有相 同向日葵性状的相同品系， 或者甚至非常类似的品系。
     每年， 植物育种人员选择种质来推进到下一世代。这种种质在独特的且不同的地 理学、 气候和土壤条件下种植， 然后在生长期期间和结束时进行进一步选择。 开发的栽培种 是不可预测的。这种不可预测性是由于育种人员的选择， 其发生在独特的环境中， 在 DNA 水 平上没有对照 ( 使用常规的育种方法 )， 而且产生几百万不同的可能的遗传组合。 具有本领 域普通技术的育种人员不能预测他开发的最终所得品系， 只是可能以非常粗略且大体的方 式。 同一育种人员不能通过使用完全相同的初始亲本和相同的选择技术来产生相同的栽培 种两次。这种不可预测性导致花费大量的研究资金来开发卓越的新型向日葵栽培种。
     新的向日葵栽培种的开发要求开发和选择向日葵品种、 杂交这些品种、 和选择卓 越的杂种杂交。 通过在选定的雄性能育亲本之间手工杂交或者通过使用雄性不育系统来产 生杂种种子。 针对某些单基因性状来选择这些杂种， 诸如荚果颜色 (pod color)、 花的颜色、
     短柔毛 (pubescence) 颜色、 或除草剂抗性， 它们指明种子确实是杂种。关于亲本品系， 以及 杂种表型的别的数据影响育种人员决定是否继续特定的杂种杂交。
     使用谱系育种和轮回选择育种方法来从育种群体开发栽培种。育种项目将来自 两种或更多种栽培种或多种运用广泛的 (broad-based) 来源的期望性状组合成育种集合 (breeding pool)， 通过自交和选择期望的表型从所述育种集合开发栽培种。 评估新的栽培 种以确定哪些具有商业潜力。
     谱系育种通常用于改良自花传粉的作物。将两种拥有有利的、 互补性状的亲本杂 交以产生 F1。通过使一个或数个 F1 自交来产生 F2 群体。最好个体的选择可以在 F2 群体中 开始 ； 然后在 F3 中开始选择最好家族中的最好个体。 对家族的重复测试可以在 F4 代中开始 以改善选择具有低遗传力的性状的效率。在育种的高级阶段 ( 即 F6 和 F7)， 对最好的品系 或表型上类似的品系的混合物测试作为新栽培种的推广 (release) 潜力。
     可以使用混合和轮回选择来改善自花传粉或异花传粉作物的群体。 通过使数种不 同亲本互交来鉴定或创建杂合个体的遗传可变群体。 基于个体优越性、 杰出的子代、 或卓越 的组合能力来选择最好的植物。使选定的植物互交以产生新群体， 在其中继续进一步的选 择循环。 回交育种已经用于将简单遗传的、 高度可遗传的性状的基因转移到作为回归亲本 的期望的纯合栽培种或近交系中。要转移的性状来源称作供体亲本。预期所得的植物具有 回归亲本 ( 例如栽培种 ) 的属性和自供体亲本转移的期望性状。初始杂交后， 选择拥有供 体亲本表型的个体， 并与回归亲本重复杂交 ( 回交 )。 预期所得的植物具有回归亲本 ( 例如 栽培种 ) 的属性和自供体亲本转移的期望性状。
     严格意义上的单种子遗传 (single-seed descent) 方法指种植分离群， 每株植物 收获一粒种子样品， 并使用这一粒种子样品来种植下一世代。当群体已经从 F2 推进至期望 的育种水平时， 衍生出品系的植物会各自上溯至不同的 F2 个体。群体中植物的数目每代都 下降， 这是由于一些种子不能萌发或者一些植物不能产生哪怕一粒种子。 因此， 当完成世代 进度时， 并不是所有最初在群体中取样的 F2 植物都会由子代代表。
     在多种子方法中， 向日葵育种人员通常从群体中的每株植物收获种子， 并使它们 脱粒在一起以形成整体 (bulk)。使用整体的一部分来种植下一世代， 而一部分进行保存。 该方法已经被称为改良的单种子遗传。
     已经使用多种子方法来在收获时节约劳动力。 用机器取下种子比单种子方法中用 手自每株取下一粒种子快得多。 多种子方法还使得有可能每个近交世代种植相同数目的群 体种子。收获足够的种子来补偿那些不萌发或不产生种子的植物。
     关于通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可以参见数本参考书之一 ( 例如 Allard， 1960 ； Simmonds， 1979 ； Sneep 等， 1979 ； Fehr， 1987)。
     合适的测试应当检测任何主要的不足， 并建立高于当前栽培种的优越性或改进水 平。除显示卓越的性能外， 必须需要与工业标准相容或者产生新市场的新栽培种。新栽培 种的引入可能由于专门的广告和行销、 改变的种子和商业生产实践、 和新产品利用而使种 子生产者、 种植者、 加工者和消费者承受额外的成本。 推广新栽培种前的测试应当考虑研究 和开发成本以及最终栽培种的技术优越性。对于种子繁殖的栽培种， 容易且经济地产生种 子必须是可行的。
     向日葵是一种重要且有价值的大田作物。如此， 植物育种人员的持续目的是开发 稳定的、 高产率的农艺学上是可靠的 (sound) 向日葵栽培种。当前的目的是使所用土地上 生产的谷粒量最大化， 并为动物和人类供应食物。 为了实现此目的， 向日葵育种人员必须选 择和开发具有产生卓越栽培种的性状的向日葵植物。
     相关领域的上述例子及其相关限制意图是例示性的而非排他性的。 在阅读说明书 后， 相关领域的其它限制对于本领域技术人员会是显而易见的。
     发明概述
     结合系统、 工具和方法来描述以下实施方案， 所述系统、 工具和方法意欲为例示性 和说明性的， 而并不限制范围。 在多个实施方案中， 一个或多个上述问题已经得到减少或消 除， 而其它实施方案涉及其它改进。
     根据本发明， 提供了一种新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂肪含量的种子。 本 发明部分涉及具有低饱和脂肪含量的向日葵种子、 产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日 葵植物的植株或植株部分、 及用于产生通过将产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵植 物与其自身或另一向日葵栽培种杂交来产生的向日葵植物的方法和通过诱变或转化产生 具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。 本发明的各方面提供了新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸 含量的种子。本发明部分涉及具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的向日葵种子、 产生具 有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物的植株或植株部分、 及用于产生通 过将产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物与其自身或另一向日 葵栽培种杂交来产生的向日葵植物的方法和通过诱变或转化产生具有低饱和脂肪含量和 高亚油酸含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。
     具有低饱和脂肪含量的种子的例子包括但不限于如下的种子， 其具有总计约 2.8％或更少、 约 2.9％或更少、 约 3％或更少、 约 3.1％或更少、 约 3.2％或更少、 或约 3.3％ 或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂酸 (18:0) 含量。
     具有低饱和脂肪含量和高亚油酸 (18:2) 含量的种子的例子包括但不限于如下的 种子， 其具有总计约 4.1％或更少、 约 5％或更少、 约 6％或更少、 约 7％或更少、 约 8％或更 少、 约 9％或更少、 约 10％或更少、 约 11％或更少、 或约 12％或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂 酸 (18:0) 含量， 而且具有约 15％、 约 20％、 约 25％、 约 30％、 约 35％、 约 40％、 约 45％、 约 50％、 约 55％、 约 60％、 约 65％、 约 70％、 或约 74％或更多的亚油酸 (18:2)。
     如此， 使用产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物进行 的任何此类方法是本发明的一部分 ( 例如自交、 回交、 杂种生成、 与群体杂交等 )。 使用产生 具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物作为亲本产生的所有植物在 本发明的范围内。有利地， 可以在与其它不同向日葵植物的杂交中使用所述向日葵植物以 产生具有卓越特征的第一代 (F1) 向日葵杂种种子和植物。
     在另一方面， 本发明提供了单基因或多基因转变的向日葵植物， 其产生具有低饱 和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 优选地， 转移的基因可以是显性或隐性等位基因。 转 移的基因可以赋予性状， 诸如除草剂抗性、 抗虫性 (insect resistance)、 对细菌、 真菌或病 毒疾病的抗性、 雄性能育、 雄性不育、 提高的营养质量、 和工业用途。 基因可以是天然存在的 向日葵基因或经由基因工程技术引入的转基因。
     在另一方面， 本发明提供了可再生细胞， 其用于组织培养产生具有低饱和脂肪和 任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。 组织培养能够再生具有上述产生具有低饱和脂 肪和任选地高亚油酸含量之种子的向日葵植物的生理学和形态学特征的植物， 而且能够再 生与上述向日葵植物具有基本上相同基因型的植物。 此类组织培养物中的可再生细胞可以 是胚、 原生质体、 分生细胞、 愈伤组织、 花粉、 叶、 花药、 根、 根尖、 花、 种子、 荚果或茎。更进一 步， 本发明提供了自本发明的组织培养物再生的向日葵植物。
     在另一方面， 本发明提供了一种将期望的性状引入产生具有低饱和脂肪和任选地 高亚油酸含量的种子的向日葵植物中的方法， 其中所述方法包括 ： 将产生具有低饱和脂肪 和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物与包含期望性状的另一向日葵栽培种的植物 杂交以产生 F1 子代植物， 其中所述期望的性状选自下组 ： 雄性不育、 除草剂抗性、 抗虫性、 和对细菌疾病、 真菌疾病或病毒疾病的抗性 ； 选择一株或多株具有期望性状的子代植物以 产生选定的子代植物 ； 将所述选定的子代植物与产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含 量的种子的向日葵植物杂交以产生回交子代植物 ； 选择具有所述期望的性状和产生具有低 饱和脂肪和任选地高亚油酸含量之种子的向日葵植物的生理学和形态学特征的回交子代 植物， 以产生选定的回交子代植物 ； 并重复这些步骤来产生选定的第一或更高 (first or higher) 的回交子代植物， 其包含所述期望的性状和产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油 酸含量之种子的向日葵植物的所有生理学和形态学特征。
     除了上文所描述的例示性方面和实施方案外， 通过研究以下描述， 另外的方面和 实施方案会变得显而易见。
     附图简述
     图 1 显示了低硬脂酸 QTL 在 LG17 的 HA1875-HA1865 区间中的精细定位 ( 小图 A ： 具有新标志物 ( 为蓝色 ) 的 LG 17 的图和小图 B ： 低硬脂酸 QTL 相对于 HA1875-ORS565 区 间的精细定位 ) ；
     图 2 显 示 了 来 自 两 个 亲 本 品 系 的 KASII-2 基 因 的 序 列 比 对， 显 示 了 SNP 和 indel(ID 号 333.1(SEQ ID NO ： 38) 和 333.2(SEQ ID NO ： 39) 代表来自 OND163R 扩增子的 克隆， 而 332.4(SEQ ID NO ： 40) 和 332.5(SEQ ID NO ： 41) 代表来自 H280R[1]/687R-1-8-1 扩增子的克隆 ) ；
     图 3 显示了低棕榈酸 QTL( 小图 A) 和脂肪酸基因 KASIII-2( 小图 B) 在 LG 5 上的 共定位。
     发明的实施方式
     在以下描述和表格中， 使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书 ( 包括 此类术语要给予的范围 ) 的清楚而一致的理解， 提供了下列定义 ：
     等位基因。等位基因指基因的一种或多种可选形式之任一种， 所有该等位基因涉 及一种性状或特征。在双倍体细胞或生物体中， 给定基因的两个等位基因占据一对同源染 色体上的相应基因座。
     回交。 回交指育种人员重复地将杂种子代往回与亲本之一 ( 例如第一代杂种 F1 与 F1 杂种的亲本基因型之一 ) 杂交的过程。
     良种向日葵。已经在某些商业上重要的农艺学性状方面稳定化的向日葵栽培种， 其相对于在同一生长位置、 同时并且在相同条件下生长的验证品种的产率包含约 100％或更大的稳定化产率。在一个实施方案中， “良种向日葵” 意指在某些商业上重要的农艺学性 状方面稳定化的向日葵栽培种， 其相对于在同一生长位置、 同时并且在相同条件下生长的 验证品种的产率包含 110％或更大的稳定化产率。 在另一个实施方案中， “良种向日葵” 意指 在某些商业上重要的农艺学性状方面稳定化的向日葵栽培种， 其相对于在同一生长位置、 同时并且在相同条件下生长的验证品种的产率包含 115％或更大的稳定化产率。
     胚。胚指成熟种子内含有的小植株。
     FAME 分析。脂肪酸甲酯分析是容许精确量化构成复合脂种类的脂肪酸的方法。
     咪唑啉酮 (Imidazolinone) 抗性 (Imi)。抗性和 / 或耐受性是由一种或多种改变 乙酰乳酸合酶 (ALS)( 又称为乙酰羟酸合酶 (AHAS)) 的基因赋予的， 所述基因容许所述酶对 抗咪唑啉酮的作用。
     诱变。诱变指用诱变剂 ( 例如提高突变在靶标植物或植物部分中的频率的化学剂 或物理因素 ) 诱变植物或植物部分。作为非限制性例子， 可以使用 Konzak 的双重化学诱变 技术 ( 如记载于美国专利号 6,696,294) 来在内源植物基因中诱导突变等位基因。
     含油量。 含油量按照占完整干燥种子的百分比来测量， 而且是不同品种的特征。 它 可以使用多种分析技术诸如 NMR、 NIR、 和 Soxhlet 提取来测定。 总脂肪酸百分比。 这通过如下测定， 即从种子提取油样品， 生成所述油样品中存在 的脂肪酸的甲酯， 并使用气相层析来分析各种脂肪酸在样品中的比例。脂肪酸组成也可以 是品种的区别性特征。
     单基因转变的 ( 转变 )。单基因转变的 ( 转变 ) 植物指通过称作回交的植物育种 技术， 或者经由基因工程开发的植物， 其中除了经由回交技术或经由基因工程转移到品种 中的单基因外， 该品种的基本上所有期望的形态学和生理学特征也均得到复原。
     稳定化的。从一个世代能通过繁殖传递到同一品种的近交植物的下一世代。
     总饱和的 (TOTSAT)。油中的饱和脂肪 ( 包括 C12:0、 C14:0、 C16:0、 C18:0、 C20:0、 C22:0 和 C24.0) 占种子油的总百分比。
     根据本发明的具体实施方案， 提供了一种新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂 肪含量的种子。此实施方案涉及具有低饱和脂肪含量的向日葵种子、 产生具有低饱和脂肪 含量的种子的向日葵植物的植株或植株部分、 及用于生产通过将产生具有低饱和脂肪含量 的种子的向日葵植物与其自身或另一向日葵栽培种杂交而产生的向日葵植物的方法和通 过诱变或转化产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。
     本发明的其它方面提供了新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂肪含量和高亚油 酸含量的种子。此实施方案涉及具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的向日葵种子、 产生 具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物的植株或植株部分、 及用于生产 通过将产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物与其自身或另一向 日葵栽培种杂交而产生的向日葵植物的方法和通过诱变或转化产生具有低饱和脂肪含量 和高亚油酸含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。
     具有低饱和脂肪含量的种子的例子包括但不限于如下的种子， 其具有总计约 2.8％或更少、 约 2.9％或更少、 约 3％或更少、 约 3.1％或更少、 约 3.2％或更少、 或约 3.3％ 或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂酸 (18:0) 含量。
     具有低饱和脂肪含量和高亚油酸 (18:2) 含量的种子的例子包括但不限于如下的
     种子， 其具有总计约 6％或更少、 约 4.1％或更少、 约 5％或更少、 约 6％或更少、 约 7％或更 少、 约 8％或更少、 约 9％或更少、 约 10％或更少、 约 11％或更少、 或约 12％或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂酸 (18:0) 含量， 而且具有约 15％、 约 20％、 约 25％、 约 30％、 约 35％、 约 40％、 约 45％、 约 50％、 约 55％、 约 60％、 约 65％、 约 70％、 或约 74％或更多的亚油酸 (18:2)。
     如此， 使用产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物进行 的任何此类方法是本发明的一部分 ( 例如自交、 回交、 杂种生成、 与群体杂交等 )。 使用产生 具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物作为亲本产生的所有植物在 本发明的范围内。有利地， 可以在与其它不同向日葵植物的杂交中使用所述向日葵植物以 产生具有卓越特征的第一代 (F1) 向日葵杂种种子和植物。
     在另一方面， 本发明提供了单基因或多基因转变的向日葵植物， 其产生具有低饱 和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 优选地， 转移的基因可以是显性或隐性等位基因。 优 选地， 转移的基因会赋予性状， 诸如除草剂抗性、 抗虫性、 细菌抗性、 真菌抗性、 病毒疾病抗 性、 雄性能育、 雄性不育、 提高的营养质量、 和工业用途。 基因可以是天然存在的向日葵基因 或经由基因工程技术引入的转基因。
     在另一方面， 本发明提供了可再生细胞， 其用于组织培养产生具有低饱和脂肪和 任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。优选地， 组织培养会能够再生具有上述产生具 有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量之种子向日葵植物的生理学和形态学特征的植物， 而 且能够再生与上述向日葵植物具有基本上相同基因型的植物。此类组织培养物中的可再 生细胞可以是胚、 原生质体、 分生细胞、 愈伤组织、 花粉、 叶、 花药、 根、 根尖、 花、 种子、 荚果或 茎。更进一步， 本发明的实施方案提供了自本发明的组织培养物再生的向日葵植物。 在另一方面， 本发明提供了一种将期望的性状引入产生具有低饱和脂肪和任选地 高亚油酸含量的种子的向日葵植物中的方法， 其中所述方法包括 ： 将产生具有低饱和脂肪 和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物与包含期望性状的另一向日葵栽培种的植物 杂交以产生 F1 子代植物， 其中所述期望的性状选自下组 ： 雄性不育、 除草剂抗性、 抗虫性、 和 对细菌疾病、 真菌疾病或病毒疾病的抗性 ； 选择一株或多株具有期望性状的子代植物以产 生选定的子代植物 ； 将所述选定的子代植物与产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量 的种子的向日葵植物杂交以产生回交子代植物 ； 选择具有所述期望的性状和产生具有低饱 和脂肪和任选地高亚油酸含量之种子的向日葵植物的生理学和形态学特征的回交子代植 物， 以产生选定的回交子代植物 ； 并重复这些步骤来产生选定的第一或更高的回交子代植 物， 其包含所述期望的性状和产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵 植物的所有生理学和形态学特征。
     有用的方法包括但不限于使用直接基因转移方法诸如微粒介导的投递、 DNA 注射、 电穿孔等导入植物组织中的表达载体。 可以使用微粒介质投递用生物射弹装置或使用土壤 杆菌属 (Agrobacterium) 介导的转化将表达载体导入植物组织中。用本发明的原生质获得 的转化体植物意图在本发明的范围内。
     随着使分离和表征编码特定蛋白质产物的基因成为可能的分子生物学技术的出 现， 植物生物学领域的科学家对以下方面形成了强烈的兴趣， 即工程化改造植物的基因组 以含有外来基因， 或者另外的或经修饰型式的天然或内源基因 ( 可能由不同启动子驱动 )， 并进行表达以便以特定的方式改变植物的性状。此类外来的另外的和 / 或经修饰的基因在
     本文中统称为 “转基因” 。在过去 15 至 20 年里， 已经开发了数种用于产生转基因植物的方 法， 并且在具体的实施方案中， 本发明也涉及要求保护的品种或栽培种的转化型式。
     植物转化牵涉构建会在植物细胞中发挥功能的表达载体。 此类载体包含包括在调 节元件 ( 例如启动子 ) 控制下的或者与调节元件 ( 例如启动子 ) 可操作连接的基因的 DNA。 表达载体可以含有一种或多种此类可操作连接的基因 / 调控元件组合。载体可以是质粒形 式， 而且可以单独或者与其它质粒联合使用， 以如下文所描述的那样使用转化方法提供经 转化的向日葵植物， 从而将转基因掺入向日葵植物的遗传物质中。
     供向日葵转化用的表达载体 ： 标志物基因
     表达载体包括至少一种与调节元件 ( 例如启动子 ) 可操作连接的遗传标志， 其容 许通过负选择 ( 即抑制不含该选择标志基因的细胞生长 ) 或者通过正向选择 ( 即筛选由该 遗传标志编码的产物 ) 回收含有所述标志的经转化细胞。许多通常用于植物转化的选择标 志基因是转化领域中公知的， 包括例如编码在代谢上使可以作为抗生素或除草剂的选择性 化学剂解毒的酶的基因， 或者编码对抑制剂不敏感的改变了的靶物的基因。几种正向选择 方法也是本领域中已知的。
     一种通常用于植物转化的选择标志基因是在植物调节信号控制下的新霉素磷酸 转移酶 II(nptII) 基因， 其赋予对卡那霉素的抗性。参见例如 Fraley 等， Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.， 80 ： 4803(1983)。另一种常用的选择标志基因是潮霉素磷酸转移酶基因， 其赋 予对抗生素潮霉素的抗性。参见例如 Vanden Elzen 等， Plant Mol.Biol.， 5： 299(1985)。 赋予对抗生素抗性的细菌起源的另外的选择标志基因包括庆大霉素乙酰转移酶、 链霉素磷酸转移酶、 氨基糖苷 -3’ - 腺嘌呤转移酶 (adenyl transferase) 和博来霉素抗性 决 定 子。 参 见 Hayford 等， Plant Physiol.86 ： 1216(1988) ； Jones 等， Mol.Gen.Genet.， 210 ： 86(1987) ； Svab 等， Plant Mol.Biol.14 ： 197(1990) ； Hille 等， Plant Mol.Biol.7 ： 171(1986)。其它选择标志基因赋予对除草剂诸如草甘膦、 草铵膦 (glufosinate) 或溴苯腈 (bromoxynil) 的抗性。 参见 Comai 等， Nature 317 ： 741-744(1985) ； Gordon-Kamm 等， Plant Cell 2 ： 603-618(1990) ； 和 Stalker 等， Science 242 ： 419-423(1988)。
     其它供植物转化用的选择标志基因不是细菌起源的。 这些基因包括例如小鼠二氢 叶酸还原酶、 植物 5- 烯醇丙酮酰莽草酸 (enolpyruvylshikimate)-3- 磷酸合酶和植物乙酰 乳酸合酶。参见 Eichholtz 等， Somatic Cell Mol.Genet.13 ： 67(1987) ； Shah 等， Science 233 ： 478(1986) ； Charest 等， Plant Cell Rep.8 ： 643(1990)。
     另一类供植物转化用的标志基因需要筛选据推测经转化的植物细胞， 而不对经转 化的细胞直接遗传选择对毒性物质诸如抗生素的抗性。 这些基因特别可用于量化或显现基 因在特定组织中表达的空间样式， 并且通常称为报告基因， 因为它们可以与基因或基因调 节序列融合以调查基因表达。通常用于筛选据推测经转化的细胞的基因包括 β- 葡糖醛酸 糖苷酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶。 参见 R.A.Jefferson， Plant Mol.Biol.Rep.5 ： 387(1987) ； Teeri 等， EMBO J.8 ： 343(1989) ； Koncz 等， Proc.Natl.Acad. SciU.S.A.84 ： 131(1987) ； DeBlock 等， EMBO J.3 ： 1681(1984)。
     最 近， 已 经 可 获 得 用 于 显 现 GUS 活 性 的 体 内 方 法， 其 不 需 要 破 坏 植 物 组 织。 Molecular Probes publication 2908， Imagene， T.M.Green， 第 1 页 - 第 4 页 (1993) ； 和 Naleway 等， J.Cell Biol.115 ： 151a(1991)。然而， 还没有证明这些用于显现 GUS 活性的体
     内方法对于回收经转化的细胞是有用的， 这是由于低灵敏度、 高荧光背景和与使用萤光素 酶基因作为选择标志有关的限制。
     新近， 已经利用编码绿色荧光蛋白 (GFP) 的基因作为原核和真核细胞中基因表达 的标志物。参见 Chalfie 等， Science 263 ： 802(1994)。GFP 和 GFP 突变体可以作为可筛选 标志物使用。
     供向日葵转化用的表达载体 ： 启动子
     表达载体中包含的基因必须由包含调节元件 ( 例如启动子 ) 的核苷酸序列驱动。 数种类型的启动子现在是转化领域中公知的， 可以单独使用或者与启动子联合使用的其它 调节元件也是如此。
     如本文中所使用的， “启动子” 包括提及如下的 DNA 区域， 其在转录起始的上游， 而 且牵涉识别和结合 RNA 聚合酶和其它蛋白质以启动转录。 “植物启动子” 是能够在植物细 胞中启动转录的启动子。 在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织诸如叶、 根、 种 子、 纤维、 木质部导管、 管胞、 或厚壁组织中启动转录的启动子。此类启动子称为 “组织优选 性的” 。仅在某些组织中启动转录的启动子称为 “组织特异性的” 。 “细胞类型” 特异性启动 子主要在一种或多种器官中的某些细胞类型 ( 例如根或叶中的维管细胞 ) 中驱动表达。 “诱 导型” 启动子是在环境控制下的启动子。可招致诱导型启动子转录的环境条件的例子包括 缺氧条件或光的存在。组织特异性的、 组织优选性的、 细胞类型特异性的、 和诱导型启动子 构成 “非组成性” 启动子类。 “组成性” 启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。
     A. 诱导型启动子
     将诱导型启动子与向日葵中表达的基因可操作连接。任选地， 将诱导型启动子与 编码信号序列的核苷酸序列可操作连接， 所述核苷酸序列与向日葵中表达的基因可操作连 接。通过诱导型启动子， 转录速率响应诱导剂而升高。
     可以在本发明中使用任何诱导型启动子。参见 Ward 等， Plant Mol.Biol.22 ： 361-366(1993)。例示性诱导型启动子包括但不限于 ： 那些响应铜的 ACEI 系统的启动 子 (Mett 等， PNAS 90 ： 4567-4571(1993)) ； 响应苯磺酰胺除草剂安全剂的玉米的 In2 基 因 (Hershey 等， Mol.Gen.Genetics 227 ： 229-237(1991) ； 和 Gatz 等， Mol.Gen.Genetics 243 ： 32-38(1994)) ；和 来 自 Tn10 的 Tet 阻 抑 物 (Gatz 等， Mol.Gen.Genetics 227 ： 229-237(1991))。特别优选的诱导型启动子是响应植物正常不响应的诱导剂的启动子。例 示性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子， 其转录活性受糖皮质激素诱 导。Schena 等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88 ： 0421(1991)。
     B. 组成性启动子
     将组成性启动子与向日葵中表达的基因可操作连接， 或者将组成性启动子与编码 信号序列的核苷酸序列可操作连接， 所述编码信号序列的核苷酸序列与向日葵中表达的基 因可操作连接。
     可 以 在 本 发 明 中 利 用 不 同 的 组 成 性 启 动 子。 例 示 性 的 组 成 性 启 动 子 包 括但不限于： 来 自 植 物 病 毒 的 启 动 子， 诸 如 来 自 CaMV 的 35S 启 动 子 (Odell 等， Nature 313 ： 810-812(1985)) ； 来 自 稻 肌 动 蛋 白 基 因 的 启 动 子 (McElroy 等， Plant Cell 2 ： 163-171(1990)) ； 来 自 泛 素 的 启 动 子 (Christensen 等， Plant Mol.Biol.12 ： 619-632(1989)， 和 Christensen 等， Plant Mol.Biol.18 ： 675-689(1992)) ； 来 自 pEMU 的启 动 子 (Last 等， Theor.Appl.Genet.81 ： 581-588(1991)) ； 来 自 MAS 的 启 动 子 (Velten 等， EMBOJ.3 ： 2723-2730(1984)) ； 和来自玉米 H3 组蛋白的启动子 (Lepetit 等， Mol.Gen. Genetics 231 ： 276-285(1992)， 和 Atanassova 等， Plant Journal 2(3) ： 291-300(1992))。 ALS 启动子， 即欧洲油菜 (Brassica napus)ALS3 结构基因 5’ 的 Xba1/NcoI 片段 ( 或与该 Xba1/NcoI 片段相似的核苷酸序列 ) 代表一种特别有用的组成性启动子。参见 PCT 申请 WO 96/30530。
     C. 组织特异性或组织优选性启动子
     将组织特异性启动子与向日葵中表达的基因可操作连接。任选地， 将组织特异性 启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接， 所述编码信号序列的核苷酸序列与向日 葵中表达的基因可操作连接。 用与组织特异性启动子可操作连接的感兴趣基因转化的植物 可以专门或优先在特定组织中生成转基因的蛋白质产物。
     可以在本发明中利用任何组织特异性或组织优选性启动子。例示性组织特异性 或组织优选性启动子包括但不限于 ： 根优选性启动子， 诸如来自菜豆蛋白基因的启动子 (Murai 等， Science 23 ： 476-482(1983)， 和 Sengupta-Gopalan 等， Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.82 ： 3320-3324(1985)) ； 叶特异性和光诱导型启动子， 诸如来自 cab 或核酮糖二磷 酸羧化酶 - 加氧酶 (rubisco) 的启动子 (Simpson 等， EMBO J.4(11) ： 2723-2729(1985)， 和 Timko 等， Nature 318 ： 579-582(1985)) ； 花药特异性启动子， 诸如来自 LAT52 的启动子 (Twell 等， Mol.Gen.Genetics217 ： 240-245(1989)) ； 花粉特异性启动子， 诸如来自 Zm13 的 启动子 (Guerrero 等， Mol.Gen.Genetics 244 ： 161-168(1993)) 或小孢子优选性启动子， 诸 如来自 apg 的启动子 (Twell 等， Sex.Plant Reprod.6 ： 217-224(1993))。
     可以通过将编码信号序列的核苷酸序列可操作连接至编码感兴趣蛋白质的基因 的 5’ 和 / 或 3’ 区域的手段来实现由转基因生成的蛋白质向亚细胞区室诸如叶绿体、 液泡、 过氧化物酶体、 乙醛酸循环体、 细胞壁或线粒体的转运或者分泌入质外体中。 可以在蛋白质 合成和加工过程中测定在结构基因的 5’ 和 / 或 3’ 端的靶向序列， 其中编码的蛋白质最后 被区室化 (compartmentalized)。
     信号序列的存在将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室， 或者分泌至质外体。 许多信号序列是本领域中已知的。参见例如 Becker 等， Plant Mol.Biol.20 ： 49(1992) ； P.S.Close， Master’ s Thesis， Iowa State University(1993) ； C.Knox 等， “Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes from Barley， ” Plant Mol. Biol.9 ： 3-17(1987) ； Lerner 等， Plant Physiol.91 ： 124-129(1989) ； Fontes 等， Plant Cell 3 ： 483-496(1991) ； Matsuoka 等， Proc.Natl Acad.Sci.88 ： 834(1991) ； Gould 等， J.Cell.Biol.108 ： 1657(1989) ； Creissen 等， Plant J.2 ： 129(1991) ； Kalderon 等， A short amino acid sequence able to specify nuclear location， Cell 39 ： 499-509(1984) ； Steifel 等， Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation， Plant Cell 2 ： 785-793(1990)。
     外来蛋白质基因和农艺学基因
     通过根据本发明的转基因植物， 可以以商业量生产外来蛋白质。 如此， 用于选择和 繁殖经转化植物的技术 ( 它们是本领域中充分了解的 ) 产生多种转基因植物， 它们以常规 方式收获， 然后可以从感兴趣的组织或总生物量提取外来蛋白质。可以通过由例如 Heney和 Orr， Anal.Biochem.114 ： 92-6(1981) 所讨论的已知方法来实现从植物生物量的蛋白质 提取。
     在本发明的各方面， 为商业生产外来蛋白质提供的转基因植物是向日葵植物。在 其它方面， 感兴趣的生物量是种子。 对于相对少量的显示较高表达水平的转基因植物， 可以 主要经由常规的 RFLP、 PCR 和 SSR 分析 ( 其鉴定整合 DNA 分子的近似染色体位置 ) 来产生遗 传图谱。 关于这方面的例示性方法， 参见 Glick 和 Thompson， Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology， CRC Press， Boca Raton 269 ： 284(1993)。关于染色体位置 的图谱信息对于主题转基因植物的所有权保护是有用的。 如果进行未经授权的繁殖和与其 它种质进行杂交， 则可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱进行比较以确定后者是 否与主题植物具有共同来源 (parentage)。图谱比较会牵涉杂交、 RFLP、 PCR、 SSR 和测序， 它们都是常规技术。
     同样地， 可以在经转化的植物中表达农艺学基因。 更具体地， 可以对植物进行遗传 工程化改造以表达农艺学感兴趣的各种表型。 可以在这方面使用的例示性基因包括但不限 于下文进行归类的基因。
     1. 赋予对害虫或疾病的抗性并编码下列各项的基因 ： A) 植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因 (R) 产物与病原 体中相应无毒性 (Avr) 基因产物之间的特异性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因转化 植物品种以工程化改造对特定病原体株有抗性的植物。参见例如 Jones 等， Science 266 ： 789(1994)( 克隆对黄枝孢霉 (Cladosporium fulvum) 有抗性的番茄 Cf-9 基因 ) ； Martin 等， Science 262 ： 1432(1993)( 对丁香假单胞菌番茄致病变种 (Pseudomonas syringae pv.tomato) 有抗性的番茄 Pto 基因编码蛋白质激酶 ) ； Mindrinos 等， Cell 78 ： 1089(1994) ( 对丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae) 有抗性的拟南芥 (Arabidopsis)RSP2 基因 )。
     B) 赋予对害虫诸如大豆胞囊线虫有抗性的基因。参见例如 PCT 申请 WO96/30517 ； PCT 申请 WO 93/19181。
     C) 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis) 蛋白、 其衍生物或模仿其的合成 多肽。参见例如 Geiser 等， Gene 48 ： 109(1986)， 其披露了 Bt δ- 内毒素基因的克隆和 核苷酸序列。此外， 编码 δ- 内毒素基因的 DNA 分子可以购自美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection)， Manassas， Va.， 例如以 ATCC 保藏号 40098、 67136、 31995 和 31998 购得。
     D) 凝集素。参见例如 Van Damme 等， Plant Molec.Biol.24 ： 25(1994) 的公开内 容， 其披露了数种君子兰 (Clivia miniata) 甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。
     E) 维生素结合蛋白诸如抗生物素蛋白。参见 PCT 申请 US93/06487。该申请教导 了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对虫害的杀幼虫剂的用途。
     F) 酶抑制剂， 例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见例如 Abe 等， J.Biol.Chem.262 ： 16793(1987)( 稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂的核苷酸序列 ) ； Huub 等， Plant Molec.Biol.2l ： 985(1993)( 编码烟草蛋白水解酶抑制剂 I 的 cDNA 的核苷酸序 列)； Sumitani 等， Biosci.Biotech.Biochem.57 ： 1243(1993)( 硝孢链霉菌 (Streptomyces nitrosporeus)α- 淀粉酶抑制剂的核苷酸序列 ) ； 和美国专利号 5,494,813(Hepher 和 Atkinson， 1996 年 2 月 27 日公开 )。
     G) 昆虫特异性激素或信息素， 诸如蜕皮类固醇或保幼激素， 其变体、 基于其的模拟 物、 或其拮抗剂或激动剂。参见例如 Hammock 等， Nature344 ： 458(1990) 披露的克隆的保幼 激素酯酶 ( 即一种保幼激素灭活剂 ) 的杆状病毒表达的内容。
     H) 昆虫特异性肽或神经肽， 其在表达后破坏受到影响的害虫的生理学。例如参 见 Regan， J.Biol.Chem.269 ： 9(1994)( 表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的 DNA) 和 Pratt 等， Biochem.Biophys.Res.Comm.163 ： 1243(1989)( 在 太 平 洋 折 翅 蠊 (Diploptera puntata) 中鉴定出咽侧体抑制素 (allostatin)) 的公开内容。还可参见 Tomalski 等的美 国专利号 5,266,317， 其披露了编码昆虫特异性、 麻痹性神经毒素的基因。
     I) 在自然界由蛇、 黄蜂 (wasp) 等生成的昆虫特异性毒液。 例如参见 Pang 等， Gene 116 ： 165(1992)， 是关于编码蝎昆虫毒性肽的基因在植物中的异源表达的公开内容。
     J) 酶， 其负责超积累单萜、 倍半萜、 类固醇、 异羟肟酸、 类苯丙烷衍生物或另一具有 杀昆虫活性的非蛋白质分子。
     K) 牵涉对生物学活性分子的修饰 ( 包括翻译后修饰 ) 的酶 ； 例如， 糖酵解酶、 蛋白 水解酶、 脂肪分解酶、 核酸酶、 环化酶、 转氨酶、 酯酶、 水解酶、 磷酸酶、 激酶、 磷酸化酶、 聚合 酶、 弹性蛋白酶、 几丁质酶 (chitinase) 和葡聚糖酶 ( 不管是天然的还是合成的 )。参见以 Scott 等名义的 PCT 申请 WO93/02197， 其披露了 callase 基因的核苷酸序列。含有几丁质 酶编码序列的 DNA 分子可以例如从 ATCC 以保藏号 39637 和 67152 获得。还可参见 Kramer 等， Insect Biochem.Molec.Biol.23 ： 691(1993)( 其教导了编码烟草天蛾几丁质酶的 cDNA 的核苷酸序列 ) 和 Kawalleck 等， Plant Molec.Biol.21 ： 673(1993)( 其提供了欧芹 ubi4-2 多聚泛素基因的核苷酸序列 )。
     L) 刺激信号转导的分子。 例如参见 Botella 等， Plant Molec.Biol.24 ： 757(1994) ( 关 于 绿 豆 钙 调 蛋 白 cDNA 克 隆 的 核 苷 酸 序 列 ) 和 Griess 等， Plant Physiol.104 ： 1467(1994)( 其提供了玉米钙调蛋白 cDNA 克隆的核苷酸序列 ) 的公开内容。
     M) 疏水矩肽 (hydrophobic moment peptide)。参见 PCT 申请 WO 95/16776( 抑 制真菌植物病原体的鲎抗菌肽 (Tachyplesin) 的肽衍生物的公开内容 ) 和 PCT 申请 WO 95/18855( 教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽 )。
     N) 膜通透酶、 通道形成剂或通道阻断剂。例如参见 Jaynes 等， Plant Sci.89 ： 43(1993) 公开的杀菌肽 -β 溶胞肽类似物 (cecropin-β lytic peptide analog) 的异源 表达以使转基因烟草植物对青枯假单胞菌 (Pseudomonas solanacearum) 有抗性。
     O) 病毒侵入蛋白或自其衍生的复合毒素。例如， 病毒外壳蛋白在经转化植物细胞 中的积累赋予对由衍生出该外壳蛋白基因的病毒及相关病毒招致的病毒感染和 / 或疾病 形成的抗性。参见 Beachy 等， Ann.Rev.Phytopathol.28 ： 45l(1990)。已经对经转化的植物 赋予了针对苜蓿花叶病毒、 黄瓜花叶病毒、 烟草线条病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 烟 草蚀刻病毒、 烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。
     P) 昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素。如此， 靶向昆虫肠中的重要代谢功 能的抗体会使受影响的酶失活， 这杀死昆虫。参见 Taylor 等， 摘要号 497， Seventh Int’ l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions(Edinburgh， Scotland)(1994)( 经 由生成单链抗体片段进行的转基因烟草中的酶促失活 )。
     Q) 病毒特异性抗体。参见例如 Tavladoraki 等， Nature 366 ： 469(1993)， 其显示了表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击。
     R) 在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白 (developmental-arrestive protein)。如此， 真菌内 α-l， 4-D- 多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同 -α-1， 4-D- 半乳糖醛酸酶 (galacturonase) 来促进真菌定殖 (colonization) 和植物营养物释放。 参见 Lamb 等， Bio/Technology 10 ： 1436(1992)。 编码豆内多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基 因的克隆和表征由 Toubart 等， Plant J.2 ： 367(1992) 描述。
     S) 在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白。 例如 Logemann 等， Bio/Technology 10 ： 305(1992) 显示了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌疾病具有升高的抗性。
     2. 赋予对除草剂的抗性的基因 ：
     A) 抑制生长点或分生组织的除草剂， 诸如咪唑啉酮或磺酰脲。在这类中的例示性 基因编码突变的 ALS 和 AHAS 酶， 如分别由例如 Lee 等， EMBO J.7 ： 1241(1988) 和 Miki 等， Theor.Appl.Genet.80 ： 449(1990) 所描述的。
     B) 抑制光合作用的除草剂， 诸如三嗪 (psbA 和 gs+ 基因 ) 或苯基氰 ( 腈水解酶 基因 )。Przibila 等， Plant Cell 3 ： 169(1991) 描述了用编码突变的 psbA 基因的质粒转 化衣滴虫 (Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于 Stalker 的美国专利号 4,810,648， 并且含有这些基因的 DNA 分子可以以 ATCC 保藏号 53435、 67441、 和 67442 获得。 编码谷胱甘肽 S- 转移酶的 DNA 的克隆和表达由 Hayes 等， Biochem.J.285 ： 173(1992) 描述。
     3. 赋予或促成如下增值 (value-added) 性状的基因， 诸如 ：
     A) 经修饰的脂肪酸代谢， 例如通过用硬脂酰 -ACP 去饱和酶的反义基因转化 植 物 以 提 高 植 物 的 硬 脂 酸 含 量。 参 见 Knultzon 等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89 ： 2624(1992)。
     B) 降低的肌醇六磷酸盐含量—— 1) 肌醇六磷酸酶编码基因的导入会增强肌醇六 磷酸盐的分解， 向经转化的植物添加更多游离的磷酸盐。 例如， 参见 Van Hartingsveldt 等， Gene 127 ： 87(1993)， 关于黑曲霉 (Aspergillus niger) 肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列 的公开内容。 2) 可以导入降低肌醇六磷酸盐含量的基因。 例如在玉米中， 这可以如下实现， 即克隆与单一等位基因有关的 DNA， 然后再次导入， 所述单一等位基因负责特征为低水平肌 醇六磷酸的玉米突变体。参见 Raboy 等， Maydica 35 ： 383(1990)。
     C) 例如通过用编码改变淀粉分支样式的酶的基因转化植物来实现的经修饰的碳 水化合物组成。参见 Shiroza 等， J.Bacteol.170 ： 810(1988)( 链球菌 (Streptococcus) 突 变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列 )， Steinmetz 等， Mol.Gen.Genet.20 ： 220(1985)( 枯 草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 果聚糖蔗糖酶 (levansucrase) 基因的核苷酸序列 ) ； Pen 等， Bio/Technology 10 ： 292(1992)( 表达地衣芽胞杆菌 (Bacillus lichenifonnis)α- 淀 粉酶的转基因植物的生成 ) ； Elliot 等， Plant Molec.Biol.21 ： 515(1993)( 番茄转化酶基 因的核苷酸序列 ) ； Sogaard 等， J.Biol.Chem.268 ： 22480(1993)( 大麦 α- 淀粉酶基因的定 点诱变 ) ； 和 Fisher 等， Plant Physiol.102 ： 1045(1993)( 玉米胚乳淀粉分支酶 II)。
     用于向日葵转化的方法
     已经开发了许多用于植物转化的方法， 包括生物学和物理植物转化方案。参见 例 如 Miki 等， “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”于 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology， B.R.Glick 和 J.E.Thompson 编 (CRCPress， Inc.， Boca Raton， 1993) 第 67 页 - 第 88 页。另外， 可获得用于植物细胞或组织 转化及植物再生的表达载体和体外培养方法。参见例如 Gruber 等， “Vectors for Plant Transformation” 于 Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology， B.R.Glick 和 J.E.Thompson 编 (CRCPress， Inc.， Boca Raton， 1993) 第 89 页 - 第 119 页。
     A) 土壤杆菌介导的转化——一种用于将表达载体导入植物中的方法是基于土壤 杆菌属的天然转化系统。参见例如 Horsch 等， Science 227 ： 1229(1985). 根癌土壤杆菌 (A.tumefaciens) 和发根土壤杆菌 (A.rhizogenes) 是在遗传上转化植物细胞的植物病原 性土壤细菌。根癌土壤杆菌 (A.tumefaciens) 的 Ti 质粒和发根土壤杆菌 (A.rhizogenes) 的 Ri 质粒携带负责植物的遗传转化的基因。 参见例如 C.I.Kado， Crit.Rev.Plant Sci.10 ： 1(1991)。土壤杆菌属载体系统和土壤杆菌介导的基因转移方法的描述由 Gruber 等， 见上 文， Miki 等， 见上文， 及 Moloney 等， Plant Cell Reports 8 ： 238(1989) 提供。还可参见美 国专利号 5,563,055(Townsend 和 Thomas)， 1996 年 10 月 8 日公开。
     B) 直接基因转移——已经开发了数种植物转化方法 ( 统称为直接基因转移 ) 作为 土壤杆菌介导的转化的备选。植物转化普遍可适用的方法是微粒介导的转化， 其中在测量 为 1 至 4μm 的微粒的表面上携带 DNA。 用生物射弹装置将表达载体导入植物组织中， 所述生 物射弹装置将微粒加速到 300 至 600m/s 的速度， 其足以穿透植物细胞壁和细胞膜。 Sanford 等， Part.Sci.Technol.5 ： 27(1987) ； J.C.Sanford， Trends Biotech.6 ： 299(1988) ； Klein 等， Bio/Technology 6 ： 559-563(1988) ； J.C.Sanford， Physiol.Plant7 ： 206(1990) ； Klein 等， Biotechnology 10 ： 268(1992)。还可参见美国专利号 5,015,580(Christou 等 )， 1991 年 5 月 14 日公开 ； 美国专利号 5,322,783(Tomes 等 )， 1994 年 6 月 21 日公开。
     另一种用于将 DNA 物理投递至植物的方法是对靶细胞的超声处理。 Zhang 等， Bio/ Technology 9 ： 996(1991)。或者， 已经使用脂质体和原生质球融合来将表达载体导入植物 中。Deshayes 等， EMBO J， 4： 2731(1985) ； Christou 等， Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.84 ： 3962(1987)。还已经报道了使用 CaCl2 沉淀、 聚乙烯醇或多 -L- 鸟氨酸来将 DNA 直接摄 取 到 原 生 质 体 中。Hain 等， Mol.Gen.Genet.199 ： 161(1985)， 和 Draper 等， Plant Cell Physiol.23 ： 451(1982)。还已经描述了原生质体和全细胞和组织的电穿孔。Donn 等， 于 Abstracts of VIIthInternational Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC， A2-38， 第 53 页 (1990) ； D’ Halluin 等， Plant Cell 4 ： 1495-1505(1992)， 和 Spencer 等， Plant Mol.Biol.24 ： 51-61(1994)。
     转化向日葵靶标组织后， 上述选择性标志物基因的表达容许优先选择经转化的细 胞、 组织和 / 或植物， 其中使用本领域中公知的再生和选择方法来实现。
     前述转化方法通常会用于产生转基因品种。然后可以将转基因品种与另一 ( 非转 化的或经转化的 ) 品种杂交， 以产生新转基因品种。或者， 可以使用植物育种领域中公知的 传统回交技术将遗传性状移入另一栽培种中， 所述遗传性状已经使用前述转化技术工程化 改造入特定的向日葵栽培种中。 例如， 可以使用回交方法来将工程化改造的性状从公共的、 非良种品种移入良种品种中， 或者从在其基因组中含有外来基因的品种移入不含所述基因 的一种或多种品种中。如本文中所使用的， “杂交” 可以指简单的 XxY 杂交， 或回交过程， 这 取决于上下文。
     向日葵的组织培养可以通过自花传粉或者通过组织培养和再生来进行向日葵植物的进一步生成， 所 述向日葵植物产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 向日葵的各种组织的组 织培养和自其再生植物是已知的。例如， 通过组织培养繁殖向日葵栽培种记载于美国专利 6,998,516。
     可以通过组织培养和再生来进行品种的进一步繁殖。 大豆的各种组织的组织培养 和自其再生植物是公知且广泛公布的。例如， 可以参照美国专利 6,998,516。如此， 本发明 的另一方面是提供如下的细胞， 其在生长和分化后产生具有含低饱和脂肪和任选地高亚油 酸含量的种子的向日葵植物。
     如本文中所使用的， 术语 “组织培养物” 指包含相同或不同类型的分离的细胞的组 合物， 或者组织成植物部分的此类细胞的集合。组织培养物的例示性类型包括能产生组织 培养物且在植物或植物部分中完整的原生质体、 愈伤组织、 植物块 (plant clump)、 和植物 细胞， 诸如胚、 花粉、 花、 种子、 荚果、 叶、 茎、 根、 根尖、 花药等。 用于制备和维持植物组织培养 物的手段是本领域中公知的。 举例而言， 已经使用构成器官的组织培养物来产生再生植物。 美国专利号 5,959,185、 5,973,234、 5,977,445、 和 6,998,516 描述了某些技术。
     单基因转变的 ( 转变 ) 植物
     当术语 “向日葵植物” 在本发明的语境中使用时， 这还包括所述品种的任何单基因 转变。 如本文中所使用的， 术语 “单基因转变的植物” 指通过称作回交的植物育种技术， 或者 经由基因工程开发的那些向日葵植物， 其中除了经由回交技术转移到品种中的单基因外， 该品种的基本上所有期望的形态学和生理学特征均得到复原。 回交方法可以与本发明一起 使用以改善品种或将某种特征引入品种中。如本文中所使用的， 术语 “回交” 指杂种子代往 回与回归亲本的重复杂交 ( 即与回归亲本回交 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多次 )。 亲本向日葵植 物 ( 其贡献期望特征的基因 ) 称作 “非回归” 或 “供体亲本” 。此术语指在回交方案中使用非 回归亲本一次， 并且非回归亲本因此不再出现的事实。接受来自非回归亲本的一种或多种 基因转移的亲本向日葵植物称为回归亲本， 因为它在回交方案中被使用了数轮 (Poehlman 和 Sleper， 1994 ； Fehr， 1987)。在典型的回交方案中， 将感兴趣的原始品种 ( 回归亲本 ) 与 第二品种 ( 非回归亲本 ) 杂交， 所述第二品种携带要转移的感兴趣的单基因。然后将自此 杂交所得的子代再次与回归亲本杂交， 并重复该过程， 直至获得这样的向日葵植物， 即其中 除了来自非回归亲本的单转移基因外， 回归亲本的基本上所有期望的形态学和生理学特征 均得到复原。
     选择合适的回归亲本是成功回交方法的重要步骤。 回交方案的目的是改变或替换 原始品种中的单一性状或特征。为了实现这点， 对回归品种的单基因进行修饰或者用来自 非回归亲本的期望基因替换， 而保留原始品种的基本上所有剩余的期望的遗传构成， 和因 此保留基本上所有剩余的期望的生理学和形态学构成。 特定非回归亲本的选择会取决于回 交目的。主要目的之一是将一些商业上期望的、 农艺学上重要的性状添加至植物。确切的 回交方案会取决于所改变的特征或性状以确定合适的测试方案。 虽然当所转移的特征是显 性等位基因时回交方法得到简化， 但是也可以转移隐性等位基因。 在此例子中， 引入子代测 试来测定期望的特征是否已经得到成功转移可能是必要的。
     已经鉴定出许多单基因性状， 它们在新品种的开发中不会有规律地被选择， 但是 可以通过回交技术来改良。单基因性状可以是或者不是转基因的， 这些性状的例子包括但不限于雄性不育、 蜡质淀粉、 除草剂抗性、 对细菌、 真菌、 或病毒疾病的抗性、 抗虫性、 雄性能 育、 提高的营养质量、 工业应用、 产率稳定性和产率提高。 这些基因一般经由细胞核遗传。 这 些单基因性状之中的数个记载于美国专利号 5,959,185、 5,973,234 和 5,977,445。
     本发明还涉及用于产生向日葵植物的方法， 其通过将第一亲本向日葵植物与第二 亲本向日葵植物杂交来进行， 其中所述第一或第二亲本向日葵植物是产生具有低饱和脂肪 和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。此外， 第一和第二亲本向日葵植物两者都可 以来源于产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。如此， 使用产 生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物进行的任何此类方法是本 发明的一部分 ( 例如自交、 回交、 杂种生成、 与群体杂交等 )。 使用产生具有低饱和脂肪和任 选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物作为亲本产生的所有植物在本发明的范围内， 包括 那些自从产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物衍生的品种开 发的。有利地， 可以在与其它不同向日葵植物的杂交中使用所述向日葵品种以产生具有卓 越特征的第一代 (F1) 向日葵杂种种子和植物。本发明的品种也可以用于转化， 其中导入外 源基因， 并由本发明的品种进行表达。使用如下向日葵植物经由传统育种方法或者经由通 过本领域技术人员已知的许多方案之任一种转化如下向日葵植物而创建的遗传变体意图 在本发明的范围内， 所述向日葵植物产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 实施例 本发明在以下实施例中进行进一步描述， 所述实施例作为例示提供， 而并不意图 以任何方式限制本发明。
     实施例 1 ： 产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平 (saturate level) 的向日葵种质。表 1 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
     表1
     实施例 2 ： 产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平的向日葵种 质。表 2 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
     表2
     实施例 3 ： 产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平的向日葵种 质。表 3 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
     表3
     如表 3 中可看出的， 数据表明如下的种子油， 其具有高油酸 ( ＞ 80％ ) 背景中低到 2.33％的总饱和类， NuSun(55-50％油酸 ) 背景中没有饱和类 ( ＜ 3.5％ ) 谱， 高达 95.30％ 的油酸水平 ； 低到 0.25％的硬脂酸水平， 低到 1.47％的棕榈酸水平， 和亚油酸 ( ＜ 55％油 酸 ) 背景中的低饱和类 ( ＜ 7.0％ ) 谱。
     实施例 4 ： 产生具有低饱和脂肪、 硬脂酸、 和棕榈酸含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平的向日葵种 质。表 4 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
     如表 4 中可看出的， 此组数据包括硬脂酸 (0.23％ )、 棕榈酸 (1.37％ )、 和总饱和 油 (2.28％ ) 的低数值。实施例 5 ： 低硬脂酸和低棕榈酸的标志物开发
     如本文中所描述的， 开发了标志物开发策略。首先， 鉴定了来自靶标 QTL 区域的 标志物 ( 在 Dow AgroSciences 开发以及来自公共资源 )， 并筛选相应作图群体的亲本品 系之间的多态性。然后在作图群体中筛选了多态性标志物。对于单态 ( 未提供信息的 ) 标志物， 设计了引物以扩增其相应的基因组基因座， 并对扩增子测序以鉴定亲本品系之间 的单核苷酸多态性 (SNP)( 若有的话 )。开发了 TaqMan MGB 等位辨别测定法 (Allelic Discrimination assay) 用于鉴定出的 SNP， 并在各自的群体上定位。第二， 基于脂肪酸候 选基因的序列， 设计在内含子侧翼的引物来从亲本品系分离脂肪酸基因序列。将在序列水 平的核苷酸多态性基于其多态性性质开发成标志物， 然后在作图群体中筛选。 采用 JoinMap 3.0(Van Ooijen， 2004a) 来定位新开发的标志物， 并使用 MapQTL 5(Van Ooijen， 2004b) 来 精细定位 QTL(to fine map QTL)。
     A) 低硬脂酸的标志物开发
     SSR 标志物开发 ： 对 8 种 SSR 标志物筛选 ONN687R xH757B/LS10760B-B-17-3-23-5 作 图 群 图 的 亲 本 品 系 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 之 间 的 多 态 性， 所述 作图群体先前用于定位目标低硬脂酸 QTL。( 参见表 5。)4 种 SSR 标志物， 即 HA0442、 CRT22、 ORS565 和 ORS732 是多态性的。在 ABI 3730 测序仪上解析来自 ONN687R 和 H757B/ LS10760B-B-17-3-23-5 的 HA0442 和 CRT22 扩 增 子， 并 且 对 于 标 志 物 HA0442 分 别 为 163bp 和 165bp， 而 对 于 CRT22 分 别 为 290bp 和 261bp。 在 3 ％ Metaphor 凝 胶 上 解 析 来 自 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 的 ORS565 和 ORS732 扩增子。使用下列 PCR 引物和反应条件用 HA0442、 CRT22、 ORS565 和 ORS732 对相应作图群体 ONN687R xH757B/ LS10760B-B-17-3-23-5 进行基因型分型。
     HA0442 正向引物 ： 5’ -HEX-TGGAACTGTAAATGGACCCAAG-3’ (SEQID NO ： 1)
     HA0442 反向引物 ： 5’ -GCACTGCACCATTTATGAGAAG-3’ (SEQ IDNO ： 2)
     CRT22 正向引物 ： 5’ -HEX-TCGAGATGAAACCGAATGAAGAAA-3’ (SEQ ID NO ： 3)
     CRT22 反向引物 ： 5’ -GTTTCTTGGGACTGATATTGCCAAGTGGG-3’ (SEQ ID NO ： 4)
     ORS565 正向引物 ： 5’ -TGGTCAACGGATTTAGAGTCAA-3’ (SEQ IDNO ： 5)
     ORS565 反向引物 ： 5’ -TCCAGTTTGGTCTTGATTTGG-3’ (SEQ ID NO ： 6)
     ORS732 正向引物 ： 5’ -GCACGGAACTCCTCAAATGT-3’ (SEQ ID NO ： 7)
     ORS732 反向引物 ： 5’ -GCACGGGAAACAAAGAGTCA-3’ (SEQ ID NO ： 8)PCR 成分 ：
     4ng gDNA
     1X PCR 缓冲液 (Qiagen， Valencia， California)
     0.25μM 正向引物
     0.25μM 反向引物
     1mM MgCl2
     0.1mM 每种 dNTP
     0.4％ PVP
     0.04 个单位的 HotStar Taq DNA 聚合酶 (Qiagen， Valencia， California)
     总体积 ： 4.8μl
     温度循环仪设置 ：步骤 1 ： 94℃达 12 分钟
     步骤 2 ： 94℃达 30 秒
     步骤 3 ： 55℃达 30 秒
     步骤 4 ： 72℃达 30 秒
     步骤 5 ： 重复步骤 2、 3 和 4 达 35 个循环
     步骤 6 ： 72℃达 30 分钟
     SNP 标志物开发 ： 使用了 8 对引物来从 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 两者扩增 8 个基因组基因座以开发 SNP 标志物 ( 表 6)。基于来自限制性片段长度多态 性 (RFLP) 探 针 ZVG76、 ZVG77 和 ZVG78 的 序 列 (Kolkman 等 2007)， 设计了三个引物对 (ZVG76snpF/R、 ZVG77snpF/R、 和 ZVG78snpF/R)。HT57F/R、 HT64F/R、 HT131F/R、 HT134F/ R、 和 HT210F/R 的引物序列来自 Lai 等 (2005)。发现 SNP 在来自 HT64F/R、 HT210F/R、 和 ZVG78snpF/R 的扩增子中。将 TaqMan MGB 等位辨别测定法开发用于 HT64F/R 扩增子中的 一个 SNP 基因座和 ZVG78snpF/R 扩增子中的一个 SNP 基因座 ( 参见下文 )， 并使用开发的 TaqMan 测定法用这两种 SNP 标志物对 ONN687R x H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 作图群体 进行基因型分型。
     来 自 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 的 HT64F/R 扩 增 子 中 有 4 个 SNP 基因座 ( 以粗体标记 )。将 TaqMan 测定法开发用于 R- 基因座。正向引物、 反向引 物、 探 针 1 和 探 针 2 的 序 列 分 别 为 5’ -CCGGCTGCTTCTAGACCTTATAAG-3’ (SEQ ID NO ： 9)、 5’ -TCGTCGGTGGGACACACA-3’ (SEQ ID NO ： 10)、 5’ -6FAM-ACTGTTGGATCGGTTC-3’ (SEQ ID NO ： 11)、 和 5’ -VIC-CACTGTTGGATCGATT-3’ (SEQ ID NO-12)。
     TTATTCTCGGCTTCCGGTGTGATTTTACTCTCATGGTTAAGTTTTCAAGAGATTGTCGCGCTGAAAACTTTTTATATTGTTTCGGTATGATCTTGGAGTTTATAGCCTTTGTAAGGTTAAGAATGAAACACCCGGCTGC TTCTAGACCTTATAAGATACCCGTGGGCACTGTTGGATCG TCTGTGTCGTGTTGGCTCTTTCTTCACTCAAGGTCATGATCGTTAG TTCTTCTGTGTGTCCCACCGACGATTTTGA GT ATTGCCATATTTTTCGGGTTCGCATTGCAACCGTTTTTAAAGTTTGCCGAGAAGAAAAGATGGCTTAAATTTTCAACTAAAGCCGATCTTC CCG(SEQ ID NO ： 13)
     来自 ONN687R 和 H757B/LS 10760B-B-17-3-23-5 的 ZVG78snpF/R 扩增子中也有 4 个 SNP 基因座 ( 以粗体标记 )。将 TaqMan 测定法开发用于在 5’ 末端的 R- 基因座。正向 引物、 反向引物、 探针 1 和探针 2 的序列分别为 5’ -GTCCATCTTTCCTCAACGACTTG-3’ (SEQ ID NO ： 14)、 5’ -CCTAAACGCCTCGAAAAAGCT-3’ (SEQ ID NO ： 15)、 5’ -6FAM-TTACCATGTCTATAATGC3’ (SEQ ID NO ： 16)、 和 5’ -VIC-ATTACCATGTCTGTAATGC-3’ (SEQ ID NO ： 17)。
     AACTGAGTTCTGTACGCCAGAGATTTGCCCGACCATGACCGCAGGTCCAAAGTAAGTCTTGCTATTGC ACATTTGCACGATTAACGGTTTCTTATATAGAAGATACATGATTCTTGAATTTATGTAAATAAAACTTGACAGATA TGAATACCGATGGGCTGATGGTGTGCAAATCAAGAAGCCTATTGAAGTTTCGGCTCCAAAGTACGTAGAGTTCTT GATGGATTGGATTGAGTCACAATTGGATGACGAGTCCATCTTTCCTCAACGACTTGGTAATTAGTTAATTACCAT GTCT G GTATA TAATGCATCATTTAATAAAGCTTTTTCGAGGCGTTTAGGAAACTGAAATAGTAATTTTCGATT CGTGCAGGAGCGCCATTTCCCGCCAATTTTAGGGACGTTGTGAAAACGATATTTAAACGCTTGTTTCGT GCGCATATCTACCACAC CATTTTCAGAAGATTGTGAGTCTTAAAGAAGAAGCCCATC26TAAACACTTGTTTCAAGCATTTCATATTGTTTACATGTGTAA(SEQ ID NO ： 18)101945573 A CN 101945581
     说明书23/25 页对这两种 SNP 标志物使用下列 PCR 设置。 实时 PCR 成分 ： 25ng gDNA 1X Taqman 通用 PCR 主混合物 (Master Mix) 22.5μM 正向引物 22.5μM 反向引物 5μM 探针 1 5μM 探针 2 总体积 ： 25μl B io-Rad iCycler 没置 ： 步骤 1 ： 95℃达 15 分钟 步骤 2 ： 94℃达 30 秒 步骤 3 ： 60℃达 1 分钟 步骤 4 ： 重复步骤 2 和 3 达 65 个循环 步骤 5 ： 4℃保持 (forever)Indel 标 志 物 开 发 ： 设 计 引 物 来 从 两 个 亲 本 品 系 ONN687R 和 H757B/ LS10760B-B-17-3-23-5 扩增了 32 个脂肪酸相关基因， 并进行了测序。 7 种基因具有多态性， 4 种基因具有弱扩增， 而所有其它基因是单态性的 ( 表 6)。用所有鉴定出的多态性筛选作 图群体 ONN687R xH757B/LS10760B-B-17-3-23-5。
     定位新标志物并精细定位低硬脂酸 QTL ： 使用 JoinMap 3.0(Van Ooijen， 2004a) 来定位所有新鉴定的多态性标志物。标志物 CRT22 给出显著的分离异常， 而且没有被定位。 从候选基因方法开发的 6 种标志物定位到与靶染色体 17 不同的染色体 ( 表 6)。将 7 种标 志物 HA0442、 ORS565、 HT64、 ZVG78、 KASI-2、 KASI-4、 和 ORS732 定位到染色体 17。将脂肪酸 基因 KASI-2 和 KASI-4 定位到染色体 17， 但不靠近靶标低硬脂酸 QTL( 图 1)。通过新定位 的标志物， 用 MapQTL 5((Van Ooijen， 2004b) 在 HA1875-ORS565 区间中精细定位低硬脂酸 QTL， 所述 HA1875-ORS565 区间在 LG 17 的上部端粒区中跨越 27cM。精细定位的 QTL 具有 23.2 的高 LOD 得分， 而且解释了硬脂酸含量方面 50.8％的变化。可以使用新定位的标志物 来辅助在育种程序中选择低硬脂酸。
     B) 开发和定位棕榈酸 QTL 的 indel 标志物
     在用脂肪酸基因 KASIII-2 的引物对得到的亲本品系 H280R[1]/687R-1-8-1 和 OND 163R 的扩增子序列中观察到了 SNP 和 indels( 表 6， 图 2)。用此引物对筛选作图群体 H280R[1]/687R-1-8-1x OND163R， 并在 3％ Metaphor 凝胶上解析扩增子。 作图程序 JoinMap 3.0(Van Ooijen， 2004a) 在连锁群 5 上的低棕榈酸 QTL 内部定位了这种 indel 标志物 ( 图 3)。
     表6： 调查的脂肪酸基因。虽然本发明已经在某些实施方案中进行了描述， 但是可以在本公开内容的精神和 范围内进一步修饰本发明。因此， 本申请意图覆盖本发明使用其一般原理的任何变型、 用 途、 或改编。 此外， 本申请意图覆盖诸如在本发明所属领域中的已知或习惯实践内和落入所 附权利要求书的限定内的对本公开内容的偏离。
     本申请要求 2007 年 12 月 20 日提交的美国临时专利申请流水号 61/015,591 的申 请日的权益。
    【技术领域】
     本发明涉及新的且独特的向日葵以及相关方法， 所述向日葵产生低饱和脂肪和任 选地高亚油酸的种子。本发明进一步涉及具有草甘膦 (glyphosate) 抗性的非遗传修饰的、 非诱变的向日葵及相关方法。
     发明背景
     栽培的向日葵 (Helianthus annuus L.) 是植物油的全球主要来源。在美国， 每年 种植约四百万英亩向日葵， 主要在达科他州 (Dakotas) 和明尼苏达州 (Minnesota)。
     在过去十年里美国的向日葵种植面积非常快速的扩张部分是由于向日葵育种和 品种改良领域中的数项重要的发展。 一个重大的发展是胞质雄性不育和育性恢复基因的发 现， 即一项容许产生杂种向日葵的发现。在上世纪 70 年代早期期间引入了如此产生的杂 种。
     Fick， “Breeding and Genetics， ” 于 Sunflower Science and Technology279-338(J.F.Carter 编 1978) 提出了向日葵中胞质雄性不育 (CMS) 和遗传育性 恢复的描述。
     向日葵油主要包含棕榈酸 (16:0)、 硬脂酸 (18:0)、 油酸 (18:1)、 亚油酸 (18:2) 和 亚麻酸 (1 8:3)。 虽然植物中存在其它不常见的脂肪酸， 但是棕榈酸、 硬脂酸、 油酸、 亚油酸、 和亚麻酸构成植物油的世界产量中存在的脂肪酸的约 88％。(J.L.Harwood， Plant Acyl Lipids ： Structure， Distribution and Analysis， 4Lipids ： Structure and Function， P.K.Stumpf 和 E.E.Conn 编 (1988)。 ) 棕榈酸和硬脂酸是饱和脂肪酸， 在某些研究中已经证 明了它们促成血浆胆固醇水平升高， 这种升高是冠心病 (coronary heart disease) 的一项 因素。根据最近的研究， 不饱和脂肪酸诸如油酸和亚油酸高的植物油可具有降低血浆胆固 醇的能力。 一般而言， 饱和脂肪酸还具有比碳数目相同的不饱和脂肪酸高的熔点， 这促成食 品中的低温耐受性问题， 而且能促成摄入过程中的蜡质 (waxy) 或油腻口感 (feel in the mouth)。还知道的是， 由具有小于约 3％饱和脂肪酸的脂肪和油制成的食物产品通常每客 (serving) 会含有小于 0.5 克的饱和脂肪， 并且因此可以在目前的标签规定下标记为含有 “零饱和脂肪” 。如此， 就许多原因而言， 生产具有低水平棕榈酸和硬脂酸且有高水平油酸或 亚油酸的向日葵油是理想的。
     任何新的、 理想的植物种质的开发都有许多步骤。植物育种开始于分析和定义当 前种质的问题和弱点、 建立项目目的、 和定义具体的育种目标。 下一步是选择拥有满足项目 目的的性状的种质。目的是在单一品种中组合来自亲本种质的期望性状的改良组合。这些 重要的性状可以包括较高的种子产率 (yield)、 对疾病和昆虫的抗性、 较好的茎和根、 对干 旱和热的耐受性、 和较好的农艺学质量。育种或选择方法的选择取决于植物繁殖的模式、 所改良性状的遗传力、 和商业上 使用的栽培种类型 ( 例如， F1 杂种栽培种、 纯系栽培种等 )。对于高度可遗传的性状， 选择 在单个位置评估的卓越植物个体会是有效的， 而对于具有低遗传力的性状， 选择应当基于 自重复评估相关植物的家族所获得的平均值。流行的选择方法通常包括谱系选择、 改良的 谱系选择、 混合选择 (mass selection)、 和轮回选择。
     遗传的复杂性影响育种方法的选择。 使用回交育种来将一种或少数几种对于高度 可遗传的性状有利的基因转移入想要的栽培种中。 此办法已经广泛地用于育种疾病抗性栽 培种。使用多种轮回选择技术来改善受多个基因控制的数量遗传性状。轮回选择在自花传 粉作物中的使用依赖于传粉容易、 来自每次传粉的成功杂种的频率、 和来自每次成功杂交 的杂种后代的数目。
     每个育种项目应当包括对育种方法效率的周期性客观评估。 评估标准随着目的和 目标而变化， 但是应当包括基于与合适的标准品比较得到的每年来自选择的收益 (gain)、 高级育种系 (advanced breeding line) 的总价值、 和每单位投入 ( 例如每年、 花费的每一 笔美元等 ) 产生的成功栽培种的数目。
     对有希望的高级育种系进行彻底地测试， 并与代表商业目标区的环境中的合适标 准品进行比较达三年或更多年。最好的品系是新商业栽培种的候选 ； 那些在少数几个性状 方面仍有缺陷的品系可以作为亲本使用以产生供进一步选择用的新种群。 这些过程 ( 它们通向上市 (marketing) 和销售 (distribution) 的最终步骤 ) 从 进行第一次杂交的时间起通常花费 8 至 12 年。因此， 新栽培种的开发是耗时的过程， 其需 要精确的预先计划、 资源的有效使用、 和最低限度的方向变化。
     最困难的任务是鉴定遗传上卓越的个体， 因为对于大多数性状， 真实基因型的值 被其它混杂的植物性状或环境因素掩盖。 一种鉴定卓越植物的方法是相对于其它实验植物 和广泛种植的标准栽培种观察其性能 (performance)。 如果单次观察没有结论， 则重复观察 可提供对其遗传价值的更好评估。
     植物育种的目的是开发新的、 独特的且卓越的向日葵栽培种和杂种。育种人员最 初选择并杂交两种或更多种亲本品系， 接着进行重复的自交和选择， 产生许多新的遗传组 合。理论上育种人员可以经由杂交、 自交和突变产生几十亿不同的遗传组合。育种人员在 细胞水平上没有直接对照 (no direct control)。 因此， 两名育种人员绝不会开发出具有相 同向日葵性状的相同品系， 或者甚至非常类似的品系。
     每年， 植物育种人员选择种质来推进到下一世代。这种种质在独特的且不同的地 理学、 气候和土壤条件下种植， 然后在生长期期间和结束时进行进一步选择。 开发的栽培种 是不可预测的。这种不可预测性是由于育种人员的选择， 其发生在独特的环境中， 在 DNA 水 平上没有对照 ( 使用常规的育种方法 )， 而且产生几百万不同的可能的遗传组合。 具有本领 域普通技术的育种人员不能预测他开发的最终所得品系， 只是可能以非常粗略且大体的方 式。 同一育种人员不能通过使用完全相同的初始亲本和相同的选择技术来产生相同的栽培 种两次。这种不可预测性导致花费大量的研究资金来开发卓越的新型向日葵栽培种。
     新的向日葵栽培种的开发要求开发和选择向日葵品种、 杂交这些品种、 和选择卓 越的杂种杂交。 通过在选定的雄性能育亲本之间手工杂交或者通过使用雄性不育系统来产 生杂种种子。 针对某些单基因性状来选择这些杂种， 诸如荚果颜色 (pod color)、 花的颜色、
     短柔毛 (pubescence) 颜色、 或除草剂抗性， 它们指明种子确实是杂种。关于亲本品系， 以及 杂种表型的别的数据影响育种人员决定是否继续特定的杂种杂交。
     使用谱系育种和轮回选择育种方法来从育种群体开发栽培种。育种项目将来自 两种或更多种栽培种或多种运用广泛的 (broad-based) 来源的期望性状组合成育种集合 (breeding pool)， 通过自交和选择期望的表型从所述育种集合开发栽培种。 评估新的栽培 种以确定哪些具有商业潜力。
     谱系育种通常用于改良自花传粉的作物。将两种拥有有利的、 互补性状的亲本杂 交以产生 F1。通过使一个或数个 F1 自交来产生 F2 群体。最好个体的选择可以在 F2 群体中 开始 ； 然后在 F3 中开始选择最好家族中的最好个体。 对家族的重复测试可以在 F4 代中开始 以改善选择具有低遗传力的性状的效率。在育种的高级阶段 ( 即 F6 和 F7)， 对最好的品系 或表型上类似的品系的混合物测试作为新栽培种的推广 (release) 潜力。
     可以使用混合和轮回选择来改善自花传粉或异花传粉作物的群体。 通过使数种不 同亲本互交来鉴定或创建杂合个体的遗传可变群体。 基于个体优越性、 杰出的子代、 或卓越 的组合能力来选择最好的植物。使选定的植物互交以产生新群体， 在其中继续进一步的选 择循环。 回交育种已经用于将简单遗传的、 高度可遗传的性状的基因转移到作为回归亲本 的期望的纯合栽培种或近交系中。要转移的性状来源称作供体亲本。预期所得的植物具有 回归亲本 ( 例如栽培种 ) 的属性和自供体亲本转移的期望性状。初始杂交后， 选择拥有供 体亲本表型的个体， 并与回归亲本重复杂交 ( 回交 )。 预期所得的植物具有回归亲本 ( 例如 栽培种 ) 的属性和自供体亲本转移的期望性状。
     严格意义上的单种子遗传 (single-seed descent) 方法指种植分离群， 每株植物 收获一粒种子样品， 并使用这一粒种子样品来种植下一世代。当群体已经从 F2 推进至期望 的育种水平时， 衍生出品系的植物会各自上溯至不同的 F2 个体。群体中植物的数目每代都 下降， 这是由于一些种子不能萌发或者一些植物不能产生哪怕一粒种子。 因此， 当完成世代 进度时， 并不是所有最初在群体中取样的 F2 植物都会由子代代表。
     在多种子方法中， 向日葵育种人员通常从群体中的每株植物收获种子， 并使它们 脱粒在一起以形成整体 (bulk)。使用整体的一部分来种植下一世代， 而一部分进行保存。 该方法已经被称为改良的单种子遗传。
     已经使用多种子方法来在收获时节约劳动力。 用机器取下种子比单种子方法中用 手自每株取下一粒种子快得多。 多种子方法还使得有可能每个近交世代种植相同数目的群 体种子。收获足够的种子来补偿那些不萌发或不产生种子的植物。
     关于通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可以参见数本参考书之一 ( 例如 Allard， 1960 ； Simmonds， 1979 ； Sneep 等， 1979 ； Fehr， 1987)。
     合适的测试应当检测任何主要的不足， 并建立高于当前栽培种的优越性或改进水 平。除显示卓越的性能外， 必须需要与工业标准相容或者产生新市场的新栽培种。新栽培 种的引入可能由于专门的广告和行销、 改变的种子和商业生产实践、 和新产品利用而使种 子生产者、 种植者、 加工者和消费者承受额外的成本。 推广新栽培种前的测试应当考虑研究 和开发成本以及最终栽培种的技术优越性。对于种子繁殖的栽培种， 容易且经济地产生种 子必须是可行的。
     向日葵是一种重要且有价值的大田作物。如此， 植物育种人员的持续目的是开发 稳定的、 高产率的农艺学上是可靠的 (sound) 向日葵栽培种。当前的目的是使所用土地上 生产的谷粒量最大化， 并为动物和人类供应食物。 为了实现此目的， 向日葵育种人员必须选 择和开发具有产生卓越栽培种的性状的向日葵植物。
     相关领域的上述例子及其相关限制意图是例示性的而非排他性的。 在阅读说明书 后， 相关领域的其它限制对于本领域技术人员会是显而易见的。
     发明概述
     结合系统、 工具和方法来描述以下实施方案， 所述系统、 工具和方法意欲为例示性 和说明性的， 而并不限制范围。 在多个实施方案中， 一个或多个上述问题已经得到减少或消 除， 而其它实施方案涉及其它改进。
     根据本发明， 提供了一种新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂肪含量的种子。 本 发明部分涉及具有低饱和脂肪含量的向日葵种子、 产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日 葵植物的植株或植株部分、 及用于产生通过将产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵植 物与其自身或另一向日葵栽培种杂交来产生的向日葵植物的方法和通过诱变或转化产生 具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。 本发明的各方面提供了新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸 含量的种子。本发明部分涉及具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的向日葵种子、 产生具 有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物的植株或植株部分、 及用于产生通 过将产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物与其自身或另一向日 葵栽培种杂交来产生的向日葵植物的方法和通过诱变或转化产生具有低饱和脂肪含量和 高亚油酸含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。
     具有低饱和脂肪含量的种子的例子包括但不限于如下的种子， 其具有总计约 2.8％或更少、 约 2.9％或更少、 约 3％或更少、 约 3.1％或更少、 约 3.2％或更少、 或约 3.3％ 或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂酸 (18:0) 含量。
     具有低饱和脂肪含量和高亚油酸 (18:2) 含量的种子的例子包括但不限于如下的 种子， 其具有总计约 4.1％或更少、 约 5％或更少、 约 6％或更少、 约 7％或更少、 约 8％或更 少、 约 9％或更少、 约 10％或更少、 约 11％或更少、 或约 12％或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂 酸 (18:0) 含量， 而且具有约 15％、 约 20％、 约 25％、 约 30％、 约 35％、 约 40％、 约 45％、 约 50％、 约 55％、 约 60％、 约 65％、 约 70％、 或约 74％或更多的亚油酸 (18:2)。
     如此， 使用产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物进行 的任何此类方法是本发明的一部分 ( 例如自交、 回交、 杂种生成、 与群体杂交等 )。 使用产生 具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物作为亲本产生的所有植物在 本发明的范围内。有利地， 可以在与其它不同向日葵植物的杂交中使用所述向日葵植物以 产生具有卓越特征的第一代 (F1) 向日葵杂种种子和植物。
     在另一方面， 本发明提供了单基因或多基因转变的向日葵植物， 其产生具有低饱 和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 优选地， 转移的基因可以是显性或隐性等位基因。 转 移的基因可以赋予性状， 诸如除草剂抗性、 抗虫性 (insect resistance)、 对细菌、 真菌或病 毒疾病的抗性、 雄性能育、 雄性不育、 提高的营养质量、 和工业用途。 基因可以是天然存在的 向日葵基因或经由基因工程技术引入的转基因。
     在另一方面， 本发明提供了可再生细胞， 其用于组织培养产生具有低饱和脂肪和 任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。 组织培养能够再生具有上述产生具有低饱和脂 肪和任选地高亚油酸含量之种子的向日葵植物的生理学和形态学特征的植物， 而且能够再 生与上述向日葵植物具有基本上相同基因型的植物。 此类组织培养物中的可再生细胞可以 是胚、 原生质体、 分生细胞、 愈伤组织、 花粉、 叶、 花药、 根、 根尖、 花、 种子、 荚果或茎。更进一 步， 本发明提供了自本发明的组织培养物再生的向日葵植物。
     在另一方面， 本发明提供了一种将期望的性状引入产生具有低饱和脂肪和任选地 高亚油酸含量的种子的向日葵植物中的方法， 其中所述方法包括 ： 将产生具有低饱和脂肪 和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物与包含期望性状的另一向日葵栽培种的植物 杂交以产生 F1 子代植物， 其中所述期望的性状选自下组 ： 雄性不育、 除草剂抗性、 抗虫性、 和对细菌疾病、 真菌疾病或病毒疾病的抗性 ； 选择一株或多株具有期望性状的子代植物以 产生选定的子代植物 ； 将所述选定的子代植物与产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含 量的种子的向日葵植物杂交以产生回交子代植物 ； 选择具有所述期望的性状和产生具有低 饱和脂肪和任选地高亚油酸含量之种子的向日葵植物的生理学和形态学特征的回交子代 植物， 以产生选定的回交子代植物 ； 并重复这些步骤来产生选定的第一或更高 (first or higher) 的回交子代植物， 其包含所述期望的性状和产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油 酸含量之种子的向日葵植物的所有生理学和形态学特征。
     除了上文所描述的例示性方面和实施方案外， 通过研究以下描述， 另外的方面和 实施方案会变得显而易见。
     附图简述
     图 1 显示了低硬脂酸 QTL 在 LG17 的 HA1875-HA1865 区间中的精细定位 ( 小图 A ： 具有新标志物 ( 为蓝色 ) 的 LG 17 的图和小图 B ： 低硬脂酸 QTL 相对于 HA1875-ORS565 区 间的精细定位 ) ；
     图 2 显 示 了 来 自 两 个 亲 本 品 系 的 KASII-2 基 因 的 序 列 比 对， 显 示 了 SNP 和 indel(ID 号 333.1(SEQ ID NO ： 38) 和 333.2(SEQ ID NO ： 39) 代表来自 OND163R 扩增子的 克隆， 而 332.4(SEQ ID NO ： 40) 和 332.5(SEQ ID NO ： 41) 代表来自 H280R[1]/687R-1-8-1 扩增子的克隆 ) ；
     图 3 显示了低棕榈酸 QTL( 小图 A) 和脂肪酸基因 KASIII-2( 小图 B) 在 LG 5 上的 共定位。
     发明的实施方式
     在以下描述和表格中， 使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书 ( 包括 此类术语要给予的范围 ) 的清楚而一致的理解， 提供了下列定义 ：
     等位基因。等位基因指基因的一种或多种可选形式之任一种， 所有该等位基因涉 及一种性状或特征。在双倍体细胞或生物体中， 给定基因的两个等位基因占据一对同源染 色体上的相应基因座。
     回交。 回交指育种人员重复地将杂种子代往回与亲本之一 ( 例如第一代杂种 F1 与 F1 杂种的亲本基因型之一 ) 杂交的过程。
     良种向日葵。已经在某些商业上重要的农艺学性状方面稳定化的向日葵栽培种， 其相对于在同一生长位置、 同时并且在相同条件下生长的验证品种的产率包含约 100％或更大的稳定化产率。在一个实施方案中， “良种向日葵” 意指在某些商业上重要的农艺学性 状方面稳定化的向日葵栽培种， 其相对于在同一生长位置、 同时并且在相同条件下生长的 验证品种的产率包含 110％或更大的稳定化产率。 在另一个实施方案中， “良种向日葵” 意指 在某些商业上重要的农艺学性状方面稳定化的向日葵栽培种， 其相对于在同一生长位置、 同时并且在相同条件下生长的验证品种的产率包含 115％或更大的稳定化产率。
     胚。胚指成熟种子内含有的小植株。
     FAME 分析。脂肪酸甲酯分析是容许精确量化构成复合脂种类的脂肪酸的方法。
     咪唑啉酮 (Imidazolinone) 抗性 (Imi)。抗性和 / 或耐受性是由一种或多种改变 乙酰乳酸合酶 (ALS)( 又称为乙酰羟酸合酶 (AHAS)) 的基因赋予的， 所述基因容许所述酶对 抗咪唑啉酮的作用。
     诱变。诱变指用诱变剂 ( 例如提高突变在靶标植物或植物部分中的频率的化学剂 或物理因素 ) 诱变植物或植物部分。作为非限制性例子， 可以使用 Konzak 的双重化学诱变 技术 ( 如记载于美国专利号 6,696,294) 来在内源植物基因中诱导突变等位基因。
     含油量。 含油量按照占完整干燥种子的百分比来测量， 而且是不同品种的特征。 它 可以使用多种分析技术诸如 NMR、 NIR、 和 Soxhlet 提取来测定。 总脂肪酸百分比。 这通过如下测定， 即从种子提取油样品， 生成所述油样品中存在 的脂肪酸的甲酯， 并使用气相层析来分析各种脂肪酸在样品中的比例。脂肪酸组成也可以 是品种的区别性特征。
     单基因转变的 ( 转变 )。单基因转变的 ( 转变 ) 植物指通过称作回交的植物育种 技术， 或者经由基因工程开发的植物， 其中除了经由回交技术或经由基因工程转移到品种 中的单基因外， 该品种的基本上所有期望的形态学和生理学特征也均得到复原。
     稳定化的。从一个世代能通过繁殖传递到同一品种的近交植物的下一世代。
     总饱和的 (TOTSAT)。油中的饱和脂肪 ( 包括 C12:0、 C14:0、 C16:0、 C18:0、 C20:0、 C22:0 和 C24.0) 占种子油的总百分比。
     根据本发明的具体实施方案， 提供了一种新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂 肪含量的种子。此实施方案涉及具有低饱和脂肪含量的向日葵种子、 产生具有低饱和脂肪 含量的种子的向日葵植物的植株或植株部分、 及用于生产通过将产生具有低饱和脂肪含量 的种子的向日葵植物与其自身或另一向日葵栽培种杂交而产生的向日葵植物的方法和通 过诱变或转化产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。
     本发明的其它方面提供了新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂肪含量和高亚油 酸含量的种子。此实施方案涉及具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的向日葵种子、 产生 具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物的植株或植株部分、 及用于生产 通过将产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物与其自身或另一向 日葵栽培种杂交而产生的向日葵植物的方法和通过诱变或转化产生具有低饱和脂肪含量 和高亚油酸含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。
     具有低饱和脂肪含量的种子的例子包括但不限于如下的种子， 其具有总计约 2.8％或更少、 约 2.9％或更少、 约 3％或更少、 约 3.1％或更少、 约 3.2％或更少、 或约 3.3％ 或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂酸 (18:0) 含量。
     具有低饱和脂肪含量和高亚油酸 (18:2) 含量的种子的例子包括但不限于如下的
     种子， 其具有总计约 6％或更少、 约 4.1％或更少、 约 5％或更少、 约 6％或更少、 约 7％或更 少、 约 8％或更少、 约 9％或更少、 约 10％或更少、 约 11％或更少、 或约 12％或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂酸 (18:0) 含量， 而且具有约 15％、 约 20％、 约 25％、 约 30％、 约 35％、 约 40％、 约 45％、 约 50％、 约 55％、 约 60％、 约 65％、 约 70％、 或约 74％或更多的亚油酸 (18:2)。
     如此， 使用产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物进行 的任何此类方法是本发明的一部分 ( 例如自交、 回交、 杂种生成、 与群体杂交等 )。 使用产生 具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物作为亲本产生的所有植物在 本发明的范围内。有利地， 可以在与其它不同向日葵植物的杂交中使用所述向日葵植物以 产生具有卓越特征的第一代 (F1) 向日葵杂种种子和植物。
     在另一方面， 本发明提供了单基因或多基因转变的向日葵植物， 其产生具有低饱 和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 优选地， 转移的基因可以是显性或隐性等位基因。 优 选地， 转移的基因会赋予性状， 诸如除草剂抗性、 抗虫性、 细菌抗性、 真菌抗性、 病毒疾病抗 性、 雄性能育、 雄性不育、 提高的营养质量、 和工业用途。 基因可以是天然存在的向日葵基因 或经由基因工程技术引入的转基因。
     在另一方面， 本发明提供了可再生细胞， 其用于组织培养产生具有低饱和脂肪和 任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。优选地， 组织培养会能够再生具有上述产生具 有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量之种子向日葵植物的生理学和形态学特征的植物， 而 且能够再生与上述向日葵植物具有基本上相同基因型的植物。此类组织培养物中的可再 生细胞可以是胚、 原生质体、 分生细胞、 愈伤组织、 花粉、 叶、 花药、 根、 根尖、 花、 种子、 荚果或 茎。更进一步， 本发明的实施方案提供了自本发明的组织培养物再生的向日葵植物。 在另一方面， 本发明提供了一种将期望的性状引入产生具有低饱和脂肪和任选地 高亚油酸含量的种子的向日葵植物中的方法， 其中所述方法包括 ： 将产生具有低饱和脂肪 和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物与包含期望性状的另一向日葵栽培种的植物 杂交以产生 F1 子代植物， 其中所述期望的性状选自下组 ： 雄性不育、 除草剂抗性、 抗虫性、 和 对细菌疾病、 真菌疾病或病毒疾病的抗性 ； 选择一株或多株具有期望性状的子代植物以产 生选定的子代植物 ； 将所述选定的子代植物与产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量 的种子的向日葵植物杂交以产生回交子代植物 ； 选择具有所述期望的性状和产生具有低饱 和脂肪和任选地高亚油酸含量之种子的向日葵植物的生理学和形态学特征的回交子代植 物， 以产生选定的回交子代植物 ； 并重复这些步骤来产生选定的第一或更高的回交子代植 物， 其包含所述期望的性状和产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵 植物的所有生理学和形态学特征。
     有用的方法包括但不限于使用直接基因转移方法诸如微粒介导的投递、 DNA 注射、 电穿孔等导入植物组织中的表达载体。 可以使用微粒介质投递用生物射弹装置或使用土壤 杆菌属 (Agrobacterium) 介导的转化将表达载体导入植物组织中。用本发明的原生质获得 的转化体植物意图在本发明的范围内。
     随着使分离和表征编码特定蛋白质产物的基因成为可能的分子生物学技术的出 现， 植物生物学领域的科学家对以下方面形成了强烈的兴趣， 即工程化改造植物的基因组 以含有外来基因， 或者另外的或经修饰型式的天然或内源基因 ( 可能由不同启动子驱动 )， 并进行表达以便以特定的方式改变植物的性状。此类外来的另外的和 / 或经修饰的基因在
     本文中统称为 “转基因” 。在过去 15 至 20 年里， 已经开发了数种用于产生转基因植物的方 法， 并且在具体的实施方案中， 本发明也涉及要求保护的品种或栽培种的转化型式。
     植物转化牵涉构建会在植物细胞中发挥功能的表达载体。 此类载体包含包括在调 节元件 ( 例如启动子 ) 控制下的或者与调节元件 ( 例如启动子 ) 可操作连接的基因的 DNA。 表达载体可以含有一种或多种此类可操作连接的基因 / 调控元件组合。载体可以是质粒形 式， 而且可以单独或者与其它质粒联合使用， 以如下文所描述的那样使用转化方法提供经 转化的向日葵植物， 从而将转基因掺入向日葵植物的遗传物质中。
     供向日葵转化用的表达载体 ： 标志物基因
     表达载体包括至少一种与调节元件 ( 例如启动子 ) 可操作连接的遗传标志， 其容 许通过负选择 ( 即抑制不含该选择标志基因的细胞生长 ) 或者通过正向选择 ( 即筛选由该 遗传标志编码的产物 ) 回收含有所述标志的经转化细胞。许多通常用于植物转化的选择标 志基因是转化领域中公知的， 包括例如编码在代谢上使可以作为抗生素或除草剂的选择性 化学剂解毒的酶的基因， 或者编码对抑制剂不敏感的改变了的靶物的基因。几种正向选择 方法也是本领域中已知的。
     一种通常用于植物转化的选择标志基因是在植物调节信号控制下的新霉素磷酸 转移酶 II(nptII) 基因， 其赋予对卡那霉素的抗性。参见例如 Fraley 等， Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.， 80 ： 4803(1983)。另一种常用的选择标志基因是潮霉素磷酸转移酶基因， 其赋 予对抗生素潮霉素的抗性。参见例如 Vanden Elzen 等， Plant Mol.Biol.， 5： 299(1985)。 赋予对抗生素抗性的细菌起源的另外的选择标志基因包括庆大霉素乙酰转移酶、 链霉素磷酸转移酶、 氨基糖苷 -3’ - 腺嘌呤转移酶 (adenyl transferase) 和博来霉素抗性 决 定 子。 参 见 Hayford 等， Plant Physiol.86 ： 1216(1988) ； Jones 等， Mol.Gen.Genet.， 210 ： 86(1987) ； Svab 等， Plant Mol.Biol.14 ： 197(1990) ； Hille 等， Plant Mol.Biol.7 ： 171(1986)。其它选择标志基因赋予对除草剂诸如草甘膦、 草铵膦 (glufosinate) 或溴苯腈 (bromoxynil) 的抗性。 参见 Comai 等， Nature 317 ： 741-744(1985) ； Gordon-Kamm 等， Plant Cell 2 ： 603-618(1990) ； 和 Stalker 等， Science 242 ： 419-423(1988)。
     其它供植物转化用的选择标志基因不是细菌起源的。 这些基因包括例如小鼠二氢 叶酸还原酶、 植物 5- 烯醇丙酮酰莽草酸 (enolpyruvylshikimate)-3- 磷酸合酶和植物乙酰 乳酸合酶。参见 Eichholtz 等， Somatic Cell Mol.Genet.13 ： 67(1987) ； Shah 等， Science 233 ： 478(1986) ； Charest 等， Plant Cell Rep.8 ： 643(1990)。
     另一类供植物转化用的标志基因需要筛选据推测经转化的植物细胞， 而不对经转 化的细胞直接遗传选择对毒性物质诸如抗生素的抗性。 这些基因特别可用于量化或显现基 因在特定组织中表达的空间样式， 并且通常称为报告基因， 因为它们可以与基因或基因调 节序列融合以调查基因表达。通常用于筛选据推测经转化的细胞的基因包括 β- 葡糖醛酸 糖苷酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶。 参见 R.A.Jefferson， Plant Mol.Biol.Rep.5 ： 387(1987) ； Teeri 等， EMBO J.8 ： 343(1989) ； Koncz 等， Proc.Natl.Acad. SciU.S.A.84 ： 131(1987) ； DeBlock 等， EMBO J.3 ： 1681(1984)。
     最 近， 已 经 可 获 得 用 于 显 现 GUS 活 性 的 体 内 方 法， 其 不 需 要 破 坏 植 物 组 织。 Molecular Probes publication 2908， Imagene， T.M.Green， 第 1 页 - 第 4 页 (1993) ； 和 Naleway 等， J.Cell Biol.115 ： 151a(1991)。然而， 还没有证明这些用于显现 GUS 活性的体
     内方法对于回收经转化的细胞是有用的， 这是由于低灵敏度、 高荧光背景和与使用萤光素 酶基因作为选择标志有关的限制。
     新近， 已经利用编码绿色荧光蛋白 (GFP) 的基因作为原核和真核细胞中基因表达 的标志物。参见 Chalfie 等， Science 263 ： 802(1994)。GFP 和 GFP 突变体可以作为可筛选 标志物使用。
     供向日葵转化用的表达载体 ： 启动子
     表达载体中包含的基因必须由包含调节元件 ( 例如启动子 ) 的核苷酸序列驱动。 数种类型的启动子现在是转化领域中公知的， 可以单独使用或者与启动子联合使用的其它 调节元件也是如此。
     如本文中所使用的， “启动子” 包括提及如下的 DNA 区域， 其在转录起始的上游， 而 且牵涉识别和结合 RNA 聚合酶和其它蛋白质以启动转录。 “植物启动子” 是能够在植物细 胞中启动转录的启动子。 在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织诸如叶、 根、 种 子、 纤维、 木质部导管、 管胞、 或厚壁组织中启动转录的启动子。此类启动子称为 “组织优选 性的” 。仅在某些组织中启动转录的启动子称为 “组织特异性的” 。 “细胞类型” 特异性启动 子主要在一种或多种器官中的某些细胞类型 ( 例如根或叶中的维管细胞 ) 中驱动表达。 “诱 导型” 启动子是在环境控制下的启动子。可招致诱导型启动子转录的环境条件的例子包括 缺氧条件或光的存在。组织特异性的、 组织优选性的、 细胞类型特异性的、 和诱导型启动子 构成 “非组成性” 启动子类。 “组成性” 启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。
     A. 诱导型启动子
     将诱导型启动子与向日葵中表达的基因可操作连接。任选地， 将诱导型启动子与 编码信号序列的核苷酸序列可操作连接， 所述核苷酸序列与向日葵中表达的基因可操作连 接。通过诱导型启动子， 转录速率响应诱导剂而升高。
     可以在本发明中使用任何诱导型启动子。参见 Ward 等， Plant Mol.Biol.22 ： 361-366(1993)。例示性诱导型启动子包括但不限于 ： 那些响应铜的 ACEI 系统的启动 子 (Mett 等， PNAS 90 ： 4567-4571(1993)) ； 响应苯磺酰胺除草剂安全剂的玉米的 In2 基 因 (Hershey 等， Mol.Gen.Genetics 227 ： 229-237(1991) ； 和 Gatz 等， Mol.Gen.Genetics 243 ： 32-38(1994)) ；和 来 自 Tn10 的 Tet 阻 抑 物 (Gatz 等， Mol.Gen.Genetics 227 ： 229-237(1991))。特别优选的诱导型启动子是响应植物正常不响应的诱导剂的启动子。例 示性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子， 其转录活性受糖皮质激素诱 导。Schena 等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88 ： 0421(1991)。
     B. 组成性启动子
     将组成性启动子与向日葵中表达的基因可操作连接， 或者将组成性启动子与编码 信号序列的核苷酸序列可操作连接， 所述编码信号序列的核苷酸序列与向日葵中表达的基 因可操作连接。
     可 以 在 本 发 明 中 利 用 不 同 的 组 成 性 启 动 子。 例 示 性 的 组 成 性 启 动 子 包 括但不限于： 来 自 植 物 病 毒 的 启 动 子， 诸 如 来 自 CaMV 的 35S 启 动 子 (Odell 等， Nature 313 ： 810-812(1985)) ； 来 自 稻 肌 动 蛋 白 基 因 的 启 动 子 (McElroy 等， Plant Cell 2 ： 163-171(1990)) ； 来 自 泛 素 的 启 动 子 (Christensen 等， Plant Mol.Biol.12 ： 619-632(1989)， 和 Christensen 等， Plant Mol.Biol.18 ： 675-689(1992)) ； 来 自 pEMU 的启 动 子 (Last 等， Theor.Appl.Genet.81 ： 581-588(1991)) ； 来 自 MAS 的 启 动 子 (Velten 等， EMBOJ.3 ： 2723-2730(1984)) ； 和来自玉米 H3 组蛋白的启动子 (Lepetit 等， Mol.Gen. Genetics 231 ： 276-285(1992)， 和 Atanassova 等， Plant Journal 2(3) ： 291-300(1992))。 ALS 启动子， 即欧洲油菜 (Brassica napus)ALS3 结构基因 5’ 的 Xba1/NcoI 片段 ( 或与该 Xba1/NcoI 片段相似的核苷酸序列 ) 代表一种特别有用的组成性启动子。参见 PCT 申请 WO 96/30530。
     C. 组织特异性或组织优选性启动子
     将组织特异性启动子与向日葵中表达的基因可操作连接。任选地， 将组织特异性 启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接， 所述编码信号序列的核苷酸序列与向日 葵中表达的基因可操作连接。 用与组织特异性启动子可操作连接的感兴趣基因转化的植物 可以专门或优先在特定组织中生成转基因的蛋白质产物。
     可以在本发明中利用任何组织特异性或组织优选性启动子。例示性组织特异性 或组织优选性启动子包括但不限于 ： 根优选性启动子， 诸如来自菜豆蛋白基因的启动子 (Murai 等， Science 23 ： 476-482(1983)， 和 Sengupta-Gopalan 等， Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.82 ： 3320-3324(1985)) ； 叶特异性和光诱导型启动子， 诸如来自 cab 或核酮糖二磷 酸羧化酶 - 加氧酶 (rubisco) 的启动子 (Simpson 等， EMBO J.4(11) ： 2723-2729(1985)， 和 Timko 等， Nature 318 ： 579-582(1985)) ； 花药特异性启动子， 诸如来自 LAT52 的启动子 (Twell 等， Mol.Gen.Genetics217 ： 240-245(1989)) ； 花粉特异性启动子， 诸如来自 Zm13 的 启动子 (Guerrero 等， Mol.Gen.Genetics 244 ： 161-168(1993)) 或小孢子优选性启动子， 诸 如来自 apg 的启动子 (Twell 等， Sex.Plant Reprod.6 ： 217-224(1993))。
     可以通过将编码信号序列的核苷酸序列可操作连接至编码感兴趣蛋白质的基因 的 5’ 和 / 或 3’ 区域的手段来实现由转基因生成的蛋白质向亚细胞区室诸如叶绿体、 液泡、 过氧化物酶体、 乙醛酸循环体、 细胞壁或线粒体的转运或者分泌入质外体中。 可以在蛋白质 合成和加工过程中测定在结构基因的 5’ 和 / 或 3’ 端的靶向序列， 其中编码的蛋白质最后 被区室化 (compartmentalized)。
     信号序列的存在将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室， 或者分泌至质外体。 许多信号序列是本领域中已知的。参见例如 Becker 等， Plant Mol.Biol.20 ： 49(1992) ； P.S.Close， Master’ s Thesis， Iowa State University(1993) ； C.Knox 等， “Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes from Barley， ” Plant Mol. Biol.9 ： 3-17(1987) ； Lerner 等， Plant Physiol.91 ： 124-129(1989) ； Fontes 等， Plant Cell 3 ： 483-496(1991) ； Matsuoka 等， Proc.Natl Acad.Sci.88 ： 834(1991) ； Gould 等， J.Cell.Biol.108 ： 1657(1989) ； Creissen 等， Plant J.2 ： 129(1991) ； Kalderon 等， A short amino acid sequence able to specify nuclear location， Cell 39 ： 499-509(1984) ； Steifel 等， Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation， Plant Cell 2 ： 785-793(1990)。
     外来蛋白质基因和农艺学基因
     通过根据本发明的转基因植物， 可以以商业量生产外来蛋白质。 如此， 用于选择和 繁殖经转化植物的技术 ( 它们是本领域中充分了解的 ) 产生多种转基因植物， 它们以常规 方式收获， 然后可以从感兴趣的组织或总生物量提取外来蛋白质。可以通过由例如 Heney和 Orr， Anal.Biochem.114 ： 92-6(1981) 所讨论的已知方法来实现从植物生物量的蛋白质 提取。
     在本发明的各方面， 为商业生产外来蛋白质提供的转基因植物是向日葵植物。在 其它方面， 感兴趣的生物量是种子。 对于相对少量的显示较高表达水平的转基因植物， 可以 主要经由常规的 RFLP、 PCR 和 SSR 分析 ( 其鉴定整合 DNA 分子的近似染色体位置 ) 来产生遗 传图谱。 关于这方面的例示性方法， 参见 Glick 和 Thompson， Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology， CRC Press， Boca Raton 269 ： 284(1993)。关于染色体位置 的图谱信息对于主题转基因植物的所有权保护是有用的。 如果进行未经授权的繁殖和与其 它种质进行杂交， 则可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱进行比较以确定后者是 否与主题植物具有共同来源 (parentage)。图谱比较会牵涉杂交、 RFLP、 PCR、 SSR 和测序， 它们都是常规技术。
     同样地， 可以在经转化的植物中表达农艺学基因。 更具体地， 可以对植物进行遗传 工程化改造以表达农艺学感兴趣的各种表型。 可以在这方面使用的例示性基因包括但不限 于下文进行归类的基因。
     1. 赋予对害虫或疾病的抗性并编码下列各项的基因 ： A) 植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因 (R) 产物与病原 体中相应无毒性 (Avr) 基因产物之间的特异性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因转化 植物品种以工程化改造对特定病原体株有抗性的植物。参见例如 Jones 等， Science 266 ： 789(1994)( 克隆对黄枝孢霉 (Cladosporium fulvum) 有抗性的番茄 Cf-9 基因 ) ； Martin 等， Science 262 ： 1432(1993)( 对丁香假单胞菌番茄致病变种 (Pseudomonas syringae pv.tomato) 有抗性的番茄 Pto 基因编码蛋白质激酶 ) ； Mindrinos 等， Cell 78 ： 1089(1994) ( 对丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae) 有抗性的拟南芥 (Arabidopsis)RSP2 基因 )。
     B) 赋予对害虫诸如大豆胞囊线虫有抗性的基因。参见例如 PCT 申请 WO96/30517 ； PCT 申请 WO 93/19181。
     C) 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis) 蛋白、 其衍生物或模仿其的合成 多肽。参见例如 Geiser 等， Gene 48 ： 109(1986)， 其披露了 Bt δ- 内毒素基因的克隆和 核苷酸序列。此外， 编码 δ- 内毒素基因的 DNA 分子可以购自美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection)， Manassas， Va.， 例如以 ATCC 保藏号 40098、 67136、 31995 和 31998 购得。
     D) 凝集素。参见例如 Van Damme 等， Plant Molec.Biol.24 ： 25(1994) 的公开内 容， 其披露了数种君子兰 (Clivia miniata) 甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。
     E) 维生素结合蛋白诸如抗生物素蛋白。参见 PCT 申请 US93/06487。该申请教导 了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对虫害的杀幼虫剂的用途。
     F) 酶抑制剂， 例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见例如 Abe 等， J.Biol.Chem.262 ： 16793(1987)( 稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂的核苷酸序列 ) ； Huub 等， Plant Molec.Biol.2l ： 985(1993)( 编码烟草蛋白水解酶抑制剂 I 的 cDNA 的核苷酸序 列)； Sumitani 等， Biosci.Biotech.Biochem.57 ： 1243(1993)( 硝孢链霉菌 (Streptomyces nitrosporeus)α- 淀粉酶抑制剂的核苷酸序列 ) ； 和美国专利号 5,494,813(Hepher 和 Atkinson， 1996 年 2 月 27 日公开 )。
     G) 昆虫特异性激素或信息素， 诸如蜕皮类固醇或保幼激素， 其变体、 基于其的模拟 物、 或其拮抗剂或激动剂。参见例如 Hammock 等， Nature344 ： 458(1990) 披露的克隆的保幼 激素酯酶 ( 即一种保幼激素灭活剂 ) 的杆状病毒表达的内容。
     H) 昆虫特异性肽或神经肽， 其在表达后破坏受到影响的害虫的生理学。例如参 见 Regan， J.Biol.Chem.269 ： 9(1994)( 表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的 DNA) 和 Pratt 等， Biochem.Biophys.Res.Comm.163 ： 1243(1989)( 在 太 平 洋 折 翅 蠊 (Diploptera puntata) 中鉴定出咽侧体抑制素 (allostatin)) 的公开内容。还可参见 Tomalski 等的美 国专利号 5,266,317， 其披露了编码昆虫特异性、 麻痹性神经毒素的基因。
     I) 在自然界由蛇、 黄蜂 (wasp) 等生成的昆虫特异性毒液。 例如参见 Pang 等， Gene 116 ： 165(1992)， 是关于编码蝎昆虫毒性肽的基因在植物中的异源表达的公开内容。
     J) 酶， 其负责超积累单萜、 倍半萜、 类固醇、 异羟肟酸、 类苯丙烷衍生物或另一具有 杀昆虫活性的非蛋白质分子。
     K) 牵涉对生物学活性分子的修饰 ( 包括翻译后修饰 ) 的酶 ； 例如， 糖酵解酶、 蛋白 水解酶、 脂肪分解酶、 核酸酶、 环化酶、 转氨酶、 酯酶、 水解酶、 磷酸酶、 激酶、 磷酸化酶、 聚合 酶、 弹性蛋白酶、 几丁质酶 (chitinase) 和葡聚糖酶 ( 不管是天然的还是合成的 )。参见以 Scott 等名义的 PCT 申请 WO93/02197， 其披露了 callase 基因的核苷酸序列。含有几丁质 酶编码序列的 DNA 分子可以例如从 ATCC 以保藏号 39637 和 67152 获得。还可参见 Kramer 等， Insect Biochem.Molec.Biol.23 ： 691(1993)( 其教导了编码烟草天蛾几丁质酶的 cDNA 的核苷酸序列 ) 和 Kawalleck 等， Plant Molec.Biol.21 ： 673(1993)( 其提供了欧芹 ubi4-2 多聚泛素基因的核苷酸序列 )。
     L) 刺激信号转导的分子。 例如参见 Botella 等， Plant Molec.Biol.24 ： 757(1994) ( 关 于 绿 豆 钙 调 蛋 白 cDNA 克 隆 的 核 苷 酸 序 列 ) 和 Griess 等， Plant Physiol.104 ： 1467(1994)( 其提供了玉米钙调蛋白 cDNA 克隆的核苷酸序列 ) 的公开内容。
     M) 疏水矩肽 (hydrophobic moment peptide)。参见 PCT 申请 WO 95/16776( 抑 制真菌植物病原体的鲎抗菌肽 (Tachyplesin) 的肽衍生物的公开内容 ) 和 PCT 申请 WO 95/18855( 教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽 )。
     N) 膜通透酶、 通道形成剂或通道阻断剂。例如参见 Jaynes 等， Plant Sci.89 ： 43(1993) 公开的杀菌肽 -β 溶胞肽类似物 (cecropin-β lytic peptide analog) 的异源 表达以使转基因烟草植物对青枯假单胞菌 (Pseudomonas solanacearum) 有抗性。
     O) 病毒侵入蛋白或自其衍生的复合毒素。例如， 病毒外壳蛋白在经转化植物细胞 中的积累赋予对由衍生出该外壳蛋白基因的病毒及相关病毒招致的病毒感染和 / 或疾病 形成的抗性。参见 Beachy 等， Ann.Rev.Phytopathol.28 ： 45l(1990)。已经对经转化的植物 赋予了针对苜蓿花叶病毒、 黄瓜花叶病毒、 烟草线条病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 烟 草蚀刻病毒、 烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。
     P) 昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素。如此， 靶向昆虫肠中的重要代谢功 能的抗体会使受影响的酶失活， 这杀死昆虫。参见 Taylor 等， 摘要号 497， Seventh Int’ l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions(Edinburgh， Scotland)(1994)( 经 由生成单链抗体片段进行的转基因烟草中的酶促失活 )。
     Q) 病毒特异性抗体。参见例如 Tavladoraki 等， Nature 366 ： 469(1993)， 其显示了表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击。
     R) 在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白 (developmental-arrestive protein)。如此， 真菌内 α-l， 4-D- 多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同 -α-1， 4-D- 半乳糖醛酸酶 (galacturonase) 来促进真菌定殖 (colonization) 和植物营养物释放。 参见 Lamb 等， Bio/Technology 10 ： 1436(1992)。 编码豆内多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基 因的克隆和表征由 Toubart 等， Plant J.2 ： 367(1992) 描述。
     S) 在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白。 例如 Logemann 等， Bio/Technology 10 ： 305(1992) 显示了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌疾病具有升高的抗性。
     2. 赋予对除草剂的抗性的基因 ：
     A) 抑制生长点或分生组织的除草剂， 诸如咪唑啉酮或磺酰脲。在这类中的例示性 基因编码突变的 ALS 和 AHAS 酶， 如分别由例如 Lee 等， EMBO J.7 ： 1241(1988) 和 Miki 等， Theor.Appl.Genet.80 ： 449(1990) 所描述的。
     B) 抑制光合作用的除草剂， 诸如三嗪 (psbA 和 gs+ 基因 ) 或苯基氰 ( 腈水解酶 基因 )。Przibila 等， Plant Cell 3 ： 169(1991) 描述了用编码突变的 psbA 基因的质粒转 化衣滴虫 (Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于 Stalker 的美国专利号 4,810,648， 并且含有这些基因的 DNA 分子可以以 ATCC 保藏号 53435、 67441、 和 67442 获得。 编码谷胱甘肽 S- 转移酶的 DNA 的克隆和表达由 Hayes 等， Biochem.J.285 ： 173(1992) 描述。
     3. 赋予或促成如下增值 (value-added) 性状的基因， 诸如 ：
     A) 经修饰的脂肪酸代谢， 例如通过用硬脂酰 -ACP 去饱和酶的反义基因转化 植 物 以 提 高 植 物 的 硬 脂 酸 含 量。 参 见 Knultzon 等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89 ： 2624(1992)。
     B) 降低的肌醇六磷酸盐含量—— 1) 肌醇六磷酸酶编码基因的导入会增强肌醇六 磷酸盐的分解， 向经转化的植物添加更多游离的磷酸盐。 例如， 参见 Van Hartingsveldt 等， Gene 127 ： 87(1993)， 关于黑曲霉 (Aspergillus niger) 肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列 的公开内容。 2) 可以导入降低肌醇六磷酸盐含量的基因。 例如在玉米中， 这可以如下实现， 即克隆与单一等位基因有关的 DNA， 然后再次导入， 所述单一等位基因负责特征为低水平肌 醇六磷酸的玉米突变体。参见 Raboy 等， Maydica 35 ： 383(1990)。
     C) 例如通过用编码改变淀粉分支样式的酶的基因转化植物来实现的经修饰的碳 水化合物组成。参见 Shiroza 等， J.Bacteol.170 ： 810(1988)( 链球菌 (Streptococcus) 突 变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列 )， Steinmetz 等， Mol.Gen.Genet.20 ： 220(1985)( 枯 草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 果聚糖蔗糖酶 (levansucrase) 基因的核苷酸序列 ) ； Pen 等， Bio/Technology 10 ： 292(1992)( 表达地衣芽胞杆菌 (Bacillus lichenifonnis)α- 淀 粉酶的转基因植物的生成 ) ； Elliot 等， Plant Molec.Biol.21 ： 515(1993)( 番茄转化酶基 因的核苷酸序列 ) ； Sogaard 等， J.Biol.Chem.268 ： 22480(1993)( 大麦 α- 淀粉酶基因的定 点诱变 ) ； 和 Fisher 等， Plant Physiol.102 ： 1045(1993)( 玉米胚乳淀粉分支酶 II)。
     用于向日葵转化的方法
     已经开发了许多用于植物转化的方法， 包括生物学和物理植物转化方案。参见 例 如 Miki 等， “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”于 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology， B.R.Glick 和 J.E.Thompson 编 (CRCPress， Inc.， Boca Raton， 1993) 第 67 页 - 第 88 页。另外， 可获得用于植物细胞或组织 转化及植物再生的表达载体和体外培养方法。参见例如 Gruber 等， “Vectors for Plant Transformation” 于 Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology， B.R.Glick 和 J.E.Thompson 编 (CRCPress， Inc.， Boca Raton， 1993) 第 89 页 - 第 119 页。
     A) 土壤杆菌介导的转化——一种用于将表达载体导入植物中的方法是基于土壤 杆菌属的天然转化系统。参见例如 Horsch 等， Science 227 ： 1229(1985). 根癌土壤杆菌 (A.tumefaciens) 和发根土壤杆菌 (A.rhizogenes) 是在遗传上转化植物细胞的植物病原 性土壤细菌。根癌土壤杆菌 (A.tumefaciens) 的 Ti 质粒和发根土壤杆菌 (A.rhizogenes) 的 Ri 质粒携带负责植物的遗传转化的基因。 参见例如 C.I.Kado， Crit.Rev.Plant Sci.10 ： 1(1991)。土壤杆菌属载体系统和土壤杆菌介导的基因转移方法的描述由 Gruber 等， 见上 文， Miki 等， 见上文， 及 Moloney 等， Plant Cell Reports 8 ： 238(1989) 提供。还可参见美 国专利号 5,563,055(Townsend 和 Thomas)， 1996 年 10 月 8 日公开。
     B) 直接基因转移——已经开发了数种植物转化方法 ( 统称为直接基因转移 ) 作为 土壤杆菌介导的转化的备选。植物转化普遍可适用的方法是微粒介导的转化， 其中在测量 为 1 至 4μm 的微粒的表面上携带 DNA。 用生物射弹装置将表达载体导入植物组织中， 所述生 物射弹装置将微粒加速到 300 至 600m/s 的速度， 其足以穿透植物细胞壁和细胞膜。 Sanford 等， Part.Sci.Technol.5 ： 27(1987) ； J.C.Sanford， Trends Biotech.6 ： 299(1988) ； Klein 等， Bio/Technology 6 ： 559-563(1988) ； J.C.Sanford， Physiol.Plant7 ： 206(1990) ； Klein 等， Biotechnology 10 ： 268(1992)。还可参见美国专利号 5,015,580(Christou 等 )， 1991 年 5 月 14 日公开 ； 美国专利号 5,322,783(Tomes 等 )， 1994 年 6 月 21 日公开。
     另一种用于将 DNA 物理投递至植物的方法是对靶细胞的超声处理。 Zhang 等， Bio/ Technology 9 ： 996(1991)。或者， 已经使用脂质体和原生质球融合来将表达载体导入植物 中。Deshayes 等， EMBO J， 4： 2731(1985) ； Christou 等， Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.84 ： 3962(1987)。还已经报道了使用 CaCl2 沉淀、 聚乙烯醇或多 -L- 鸟氨酸来将 DNA 直接摄 取 到 原 生 质 体 中。Hain 等， Mol.Gen.Genet.199 ： 161(1985)， 和 Draper 等， Plant Cell Physiol.23 ： 451(1982)。还已经描述了原生质体和全细胞和组织的电穿孔。Donn 等， 于 Abstracts of VIIthInternational Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC， A2-38， 第 53 页 (1990) ； D’ Halluin 等， Plant Cell 4 ： 1495-1505(1992)， 和 Spencer 等， Plant Mol.Biol.24 ： 51-61(1994)。
     转化向日葵靶标组织后， 上述选择性标志物基因的表达容许优先选择经转化的细 胞、 组织和 / 或植物， 其中使用本领域中公知的再生和选择方法来实现。
     前述转化方法通常会用于产生转基因品种。然后可以将转基因品种与另一 ( 非转 化的或经转化的 ) 品种杂交， 以产生新转基因品种。或者， 可以使用植物育种领域中公知的 传统回交技术将遗传性状移入另一栽培种中， 所述遗传性状已经使用前述转化技术工程化 改造入特定的向日葵栽培种中。 例如， 可以使用回交方法来将工程化改造的性状从公共的、 非良种品种移入良种品种中， 或者从在其基因组中含有外来基因的品种移入不含所述基因 的一种或多种品种中。如本文中所使用的， “杂交” 可以指简单的 XxY 杂交， 或回交过程， 这 取决于上下文。
     向日葵的组织培养可以通过自花传粉或者通过组织培养和再生来进行向日葵植物的进一步生成， 所 述向日葵植物产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 向日葵的各种组织的组 织培养和自其再生植物是已知的。例如， 通过组织培养繁殖向日葵栽培种记载于美国专利 6,998,516。
     可以通过组织培养和再生来进行品种的进一步繁殖。 大豆的各种组织的组织培养 和自其再生植物是公知且广泛公布的。例如， 可以参照美国专利 6,998,516。如此， 本发明 的另一方面是提供如下的细胞， 其在生长和分化后产生具有含低饱和脂肪和任选地高亚油 酸含量的种子的向日葵植物。
     如本文中所使用的， 术语 “组织培养物” 指包含相同或不同类型的分离的细胞的组 合物， 或者组织成植物部分的此类细胞的集合。组织培养物的例示性类型包括能产生组织 培养物且在植物或植物部分中完整的原生质体、 愈伤组织、 植物块 (plant clump)、 和植物 细胞， 诸如胚、 花粉、 花、 种子、 荚果、 叶、 茎、 根、 根尖、 花药等。 用于制备和维持植物组织培养 物的手段是本领域中公知的。 举例而言， 已经使用构成器官的组织培养物来产生再生植物。 美国专利号 5,959,185、 5,973,234、 5,977,445、 和 6,998,516 描述了某些技术。
     单基因转变的 ( 转变 ) 植物
     当术语 “向日葵植物” 在本发明的语境中使用时， 这还包括所述品种的任何单基因 转变。 如本文中所使用的， 术语 “单基因转变的植物” 指通过称作回交的植物育种技术， 或者 经由基因工程开发的那些向日葵植物， 其中除了经由回交技术转移到品种中的单基因外， 该品种的基本上所有期望的形态学和生理学特征均得到复原。 回交方法可以与本发明一起 使用以改善品种或将某种特征引入品种中。如本文中所使用的， 术语 “回交” 指杂种子代往 回与回归亲本的重复杂交 ( 即与回归亲本回交 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多次 )。 亲本向日葵植 物 ( 其贡献期望特征的基因 ) 称作 “非回归” 或 “供体亲本” 。此术语指在回交方案中使用非 回归亲本一次， 并且非回归亲本因此不再出现的事实。接受来自非回归亲本的一种或多种 基因转移的亲本向日葵植物称为回归亲本， 因为它在回交方案中被使用了数轮 (Poehlman 和 Sleper， 1994 ； Fehr， 1987)。在典型的回交方案中， 将感兴趣的原始品种 ( 回归亲本 ) 与 第二品种 ( 非回归亲本 ) 杂交， 所述第二品种携带要转移的感兴趣的单基因。然后将自此 杂交所得的子代再次与回归亲本杂交， 并重复该过程， 直至获得这样的向日葵植物， 即其中 除了来自非回归亲本的单转移基因外， 回归亲本的基本上所有期望的形态学和生理学特征 均得到复原。
     选择合适的回归亲本是成功回交方法的重要步骤。 回交方案的目的是改变或替换 原始品种中的单一性状或特征。为了实现这点， 对回归品种的单基因进行修饰或者用来自 非回归亲本的期望基因替换， 而保留原始品种的基本上所有剩余的期望的遗传构成， 和因 此保留基本上所有剩余的期望的生理学和形态学构成。 特定非回归亲本的选择会取决于回 交目的。主要目的之一是将一些商业上期望的、 农艺学上重要的性状添加至植物。确切的 回交方案会取决于所改变的特征或性状以确定合适的测试方案。 虽然当所转移的特征是显 性等位基因时回交方法得到简化， 但是也可以转移隐性等位基因。 在此例子中， 引入子代测 试来测定期望的特征是否已经得到成功转移可能是必要的。
     已经鉴定出许多单基因性状， 它们在新品种的开发中不会有规律地被选择， 但是 可以通过回交技术来改良。单基因性状可以是或者不是转基因的， 这些性状的例子包括但不限于雄性不育、 蜡质淀粉、 除草剂抗性、 对细菌、 真菌、 或病毒疾病的抗性、 抗虫性、 雄性能 育、 提高的营养质量、 工业应用、 产率稳定性和产率提高。 这些基因一般经由细胞核遗传。 这 些单基因性状之中的数个记载于美国专利号 5,959,185、 5,973,234 和 5,977,445。
     本发明还涉及用于产生向日葵植物的方法， 其通过将第一亲本向日葵植物与第二 亲本向日葵植物杂交来进行， 其中所述第一或第二亲本向日葵植物是产生具有低饱和脂肪 和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。此外， 第一和第二亲本向日葵植物两者都可 以来源于产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。如此， 使用产 生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物进行的任何此类方法是本 发明的一部分 ( 例如自交、 回交、 杂种生成、 与群体杂交等 )。 使用产生具有低饱和脂肪和任 选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物作为亲本产生的所有植物在本发明的范围内， 包括 那些自从产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物衍生的品种开 发的。有利地， 可以在与其它不同向日葵植物的杂交中使用所述向日葵品种以产生具有卓 越特征的第一代 (F1) 向日葵杂种种子和植物。本发明的品种也可以用于转化， 其中导入外 源基因， 并由本发明的品种进行表达。使用如下向日葵植物经由传统育种方法或者经由通 过本领域技术人员已知的许多方案之任一种转化如下向日葵植物而创建的遗传变体意图 在本发明的范围内， 所述向日葵植物产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 实施例 本发明在以下实施例中进行进一步描述， 所述实施例作为例示提供， 而并不意图 以任何方式限制本发明。
     实施例 1 ： 产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平 (saturate level) 的向日葵种质。表 1 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
     表1
    
    实施例 2 ： 产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平的向日葵种 质。表 2 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
     表2
    
    实施例 3 ： 产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平的向日葵种 质。表 3 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
     表3
    
    如表 3 中可看出的， 数据表明如下的种子油， 其具有高油酸 ( ＞ 80％ ) 背景中低到 2.33％的总饱和类， NuSun(55-50％油酸 ) 背景中没有饱和类 ( ＜ 3.5％ ) 谱， 高达 95.30％ 的油酸水平 ； 低到 0.25％的硬脂酸水平， 低到 1.47％的棕榈酸水平， 和亚油酸 ( ＜ 55％油 酸 ) 背景中的低饱和类 ( ＜ 7.0％ ) 谱。
     实施例 4 ： 产生具有低饱和脂肪、 硬脂酸、 和棕榈酸含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平的向日葵种 质。表 4 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
    
    如表 4 中可看出的， 此组数据包括硬脂酸 (0.23％ )、 棕榈酸 (1.37％ )、 和总饱和 油 (2.28％ ) 的低数值。实施例 5 ： 低硬脂酸和低棕榈酸的标志物开发
     如本文中所描述的， 开发了标志物开发策略。首先， 鉴定了来自靶标 QTL 区域的 标志物 ( 在 Dow AgroSciences 开发以及来自公共资源 )， 并筛选相应作图群体的亲本品 系之间的多态性。然后在作图群体中筛选了多态性标志物。对于单态 ( 未提供信息的 ) 标志物， 设计了引物以扩增其相应的基因组基因座， 并对扩增子测序以鉴定亲本品系之间 的单核苷酸多态性 (SNP)( 若有的话 )。开发了 TaqMan MGB 等位辨别测定法 (Allelic Discrimination assay) 用于鉴定出的 SNP， 并在各自的群体上定位。第二， 基于脂肪酸候 选基因的序列， 设计在内含子侧翼的引物来从亲本品系分离脂肪酸基因序列。将在序列水 平的核苷酸多态性基于其多态性性质开发成标志物， 然后在作图群体中筛选。 采用 JoinMap 3.0(Van Ooijen， 2004a) 来定位新开发的标志物， 并使用 MapQTL 5(Van Ooijen， 2004b) 来 精细定位 QTL(to fine map QTL)。
     A) 低硬脂酸的标志物开发
     SSR 标志物开发 ： 对 8 种 SSR 标志物筛选 ONN687R xH757B/LS10760B-B-17-3-23-5 作 图 群 图 的 亲 本 品 系 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 之 间 的 多 态 性， 所述 作图群体先前用于定位目标低硬脂酸 QTL。( 参见表 5。)4 种 SSR 标志物， 即 HA0442、 CRT22、 ORS565 和 ORS732 是多态性的。在 ABI 3730 测序仪上解析来自 ONN687R 和 H757B/ LS10760B-B-17-3-23-5 的 HA0442 和 CRT22 扩 增 子， 并 且 对 于 标 志 物 HA0442 分 别 为 163bp 和 165bp， 而 对 于 CRT22 分 别 为 290bp 和 261bp。 在 3 ％ Metaphor 凝 胶 上 解 析 来 自 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 的 ORS565 和 ORS732 扩增子。使用下列 PCR 引物和反应条件用 HA0442、 CRT22、 ORS565 和 ORS732 对相应作图群体 ONN687R xH757B/ LS10760B-B-17-3-23-5 进行基因型分型。
     HA0442 正向引物 ： 5’ -HEX-TGGAACTGTAAATGGACCCAAG-3’ (SEQID NO ： 1)
     HA0442 反向引物 ： 5’ -GCACTGCACCATTTATGAGAAG-3’ (SEQ IDNO ： 2)
     CRT22 正向引物 ： 5’ -HEX-TCGAGATGAAACCGAATGAAGAAA-3’ (SEQ ID NO ： 3)
     CRT22 反向引物 ： 5’ -GTTTCTTGGGACTGATATTGCCAAGTGGG-3’ (SEQ ID NO ： 4)
     ORS565 正向引物 ： 5’ -TGGTCAACGGATTTAGAGTCAA-3’ (SEQ IDNO ： 5)
     ORS565 反向引物 ： 5’ -TCCAGTTTGGTCTTGATTTGG-3’ (SEQ ID NO ： 6)
     ORS732 正向引物 ： 5’ -GCACGGAACTCCTCAAATGT-3’ (SEQ ID NO ： 7)
     ORS732 反向引物 ： 5’ -GCACGGGAAACAAAGAGTCA-3’ (SEQ ID NO ： 8)PCR 成分 ：
     4ng gDNA
     1X PCR 缓冲液 (Qiagen， Valencia， California)
     0.25μM 正向引物
     0.25μM 反向引物
     1mM MgCl2
     0.1mM 每种 dNTP
     0.4％ PVP
     0.04 个单位的 HotStar Taq DNA 聚合酶 (Qiagen， Valencia， California)
     总体积 ： 4.8μl
     温度循环仪设置 ：步骤 1 ： 94℃达 12 分钟
     步骤 2 ： 94℃达 30 秒
     步骤 3 ： 55℃达 30 秒
     步骤 4 ： 72℃达 30 秒
     步骤 5 ： 重复步骤 2、 3 和 4 达 35 个循环
     步骤 6 ： 72℃达 30 分钟
     SNP 标志物开发 ： 使用了 8 对引物来从 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 两者扩增 8 个基因组基因座以开发 SNP 标志物 ( 表 6)。基于来自限制性片段长度多态 性 (RFLP) 探 针 ZVG76、 ZVG77 和 ZVG78 的 序 列 (Kolkman 等 2007)， 设计了三个引物对 (ZVG76snpF/R、 ZVG77snpF/R、 和 ZVG78snpF/R)。HT57F/R、 HT64F/R、 HT131F/R、 HT134F/ R、 和 HT210F/R 的引物序列来自 Lai 等 (2005)。发现 SNP 在来自 HT64F/R、 HT210F/R、 和 ZVG78snpF/R 的扩增子中。将 TaqMan MGB 等位辨别测定法开发用于 HT64F/R 扩增子中的 一个 SNP 基因座和 ZVG78snpF/R 扩增子中的一个 SNP 基因座 ( 参见下文 )， 并使用开发的 TaqMan 测定法用这两种 SNP 标志物对 ONN687R x H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 作图群体 进行基因型分型。
     来 自 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 的 HT64F/R 扩 增 子 中 有 4 个 SNP 基因座 ( 以粗体标记 )。将 TaqMan 测定法开发用于 R- 基因座。正向引物、 反向引 物、 探 针 1 和 探 针 2 的 序 列 分 别 为 5’ -CCGGCTGCTTCTAGACCTTATAAG-3’ (SEQ ID NO ： 9)、 5’ -TCGTCGGTGGGACACACA-3’ (SEQ ID NO ： 10)、 5’ -6FAM-ACTGTTGGATCGGTTC-3’ (SEQ ID NO ： 11)、 和 5’ -VIC-CACTGTTGGATCGATT-3’ (SEQ ID NO-12)。
    TTATTCTCGGCTTCCGGTGTGATTTTACTCTCATGGTTAAGTTTTCAAGAGATTGTCGCGCTGAAAACTTTTTATATTGTTTCGGTATGATCTTGGAGTTTATAGCCTTTGTAAGGTTAAGAATGAAACACCCGGCTGC TTCTAGACCTTATAAGATACCCGTGGGCACTGTTGGATCG TCTGTGTCGTGTTGGCTCTTTCTTCACTCAAGGTCATGATCGTTAG TTCTTCTGTGTGTCCCACCGACGATTTTGA GT ATTGCCATATTTTTCGGGTTCGCATTGCAACCGTTTTTAAAGTTTGCCGAGAAGAAAAGATGGCTTAAATTTTCAACTAAAGCCGATCTTC CCG(SEQ ID NO ： 13)
     来自 ONN687R 和 H757B/LS 10760B-B-17-3-23-5 的 ZVG78snpF/R 扩增子中也有 4 个 SNP 基因座 ( 以粗体标记 )。将 TaqMan 测定法开发用于在 5’ 末端的 R- 基因座。正向 引物、 反向引物、 探针 1 和探针 2 的序列分别为 5’ -GTCCATCTTTCCTCAACGACTTG-3’ (SEQ ID NO ： 14)、 5’ -CCTAAACGCCTCGAAAAAGCT-3’ (SEQ ID NO ： 15)、 5’ -6FAM-TTACCATGTCTATAATGC3’ (SEQ ID NO ： 16)、 和 5’ -VIC-ATTACCATGTCTGTAATGC-3’ (SEQ ID NO ： 17)。
     AACTGAGTTCTGTACGCCAGAGATTTGCCCGACCATGACCGCAGGTCCAAAGTAAGTCTTGCTATTGC ACATTTGCACGATTAACGGTTTCTTATATAGAAGATACATGATTCTTGAATTTATGTAAATAAAACTTGACAGATA TGAATACCGATGGGCTGATGGTGTGCAAATCAAGAAGCCTATTGAAGTTTCGGCTCCAAAGTACGTAGAGTTCTT GATGGATTGGATTGAGTCACAATTGGATGACGAGTCCATCTTTCCTCAACGACTTGGTAATTAGTTAATTACCAT GTCT G GTATA TAATGCATCATTTAATAAAGCTTTTTCGAGGCGTTTAGGAAACTGAAATAGTAATTTTCGATT CGTGCAGGAGCGCCATTTCCCGCCAATTTTAGGGACGTTGTGAAAACGATATTTAAACGCTTGTTTCGT GCGCATATCTACCACAC CATTTTCAGAAGATTGTGAGTCTTAAAGAAGAAGCCCATC26TAAACACTTGTTTCAAGCATTTCATATTGTTTACATGTGTAA(SEQ ID NO ： 18)101945573 A CN 101945581
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    说明书23/25 页对这两种 SNP 标志物使用下列 PCR 设置。 实时 PCR 成分 ： 25ng gDNA 1X Taqman 通用 PCR 主混合物 (Master Mix) 22.5μM 正向引物 22.5μM 反向引物 5μM 探针 1 5μM 探针 2 总体积 ： 25μl B io-Rad iCycler 没置 ： 步骤 1 ： 95℃达 15 分钟 步骤 2 ： 94℃达 30 秒 步骤 3 ： 60℃达 1 分钟 步骤 4 ： 重复步骤 2 和 3 达 65 个循环 步骤 5 ： 4℃保持 (forever)Indel 标 志 物 开 发 ： 设 计 引 物 来 从 两 个 亲 本 品 系 ONN687R 和 H757B/ LS10760B-B-17-3-23-5 扩增了 32 个脂肪酸相关基因， 并进行了测序。 7 种基因具有多态性， 4 种基因具有弱扩增， 而所有其它基因是单态性的 ( 表 6)。用所有鉴定出的多态性筛选作 图群体 ONN687R xH757B/LS10760B-B-17-3-23-5。
     定位新标志物并精细定位低硬脂酸 QTL ： 使用 JoinMap 3.0(Van Ooijen， 2004a) 来定位所有新鉴定的多态性标志物。标志物 CRT22 给出显著的分离异常， 而且没有被定位。 从候选基因方法开发的 6 种标志物定位到与靶染色体 17 不同的染色体 ( 表 6)。将 7 种标 志物 HA0442、 ORS565、 HT64、 ZVG78、 KASI-2、 KASI-4、 和 ORS732 定位到染色体 17。将脂肪酸 基因 KASI-2 和 KASI-4 定位到染色体 17， 但不靠近靶标低硬脂酸 QTL( 图 1)。通过新定位 的标志物， 用 MapQTL 5((Van Ooijen， 2004b) 在 HA1875-ORS565 区间中精细定位低硬脂酸 QTL， 所述 HA1875-ORS565 区间在 LG 17 的上部端粒区中跨越 27cM。精细定位的 QTL 具有 23.2 的高 LOD 得分， 而且解释了硬脂酸含量方面 50.8％的变化。可以使用新定位的标志物 来辅助在育种程序中选择低硬脂酸。
     B) 开发和定位棕榈酸 QTL 的 indel 标志物
     在用脂肪酸基因 KASIII-2 的引物对得到的亲本品系 H280R[1]/687R-1-8-1 和 OND 163R 的扩增子序列中观察到了 SNP 和 indels( 表 6， 图 2)。用此引物对筛选作图群体 H280R[1]/687R-1-8-1x OND163R， 并在 3％ Metaphor 凝胶上解析扩增子。 作图程序 JoinMap 3.0(Van Ooijen， 2004a) 在连锁群 5 上的低棕榈酸 QTL 内部定位了这种 indel 标志物 ( 图 3)。
    
    表6： 调查的脂肪酸基因。虽然本发明已经在某些实施方案中进行了描述， 但是可以在本公开内容的精神和 范围内进一步修饰本发明。因此， 本申请意图覆盖本发明使用其一般原理的任何变型、 用 途、 或改编。 此外， 本申请意图覆盖诸如在本发明所属领域中的已知或习惯实践内和落入所 附权利要求书的限定内的对本公开内容的偏离。
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     遗传的复杂性影响育种方法的选择。 使用回交育种来将一种或少数几种对于高度 可遗传的性状有利的基因转移入想要的栽培种中。 此办法已经广泛地用于育种疾病抗性栽 培种。使用多种轮回选择技术来改善受多个基因控制的数量遗传性状。轮回选择在自花传 粉作物中的使用依赖于传粉容易、 来自每次传粉的成功杂种的频率、 和来自每次成功杂交 的杂种后代的数目。
     每个育种项目应当包括对育种方法效率的周期性客观评估。 评估标准随着目的和 目标而变化， 但是应当包括基于与合适的标准品比较得到的每年来自选择的收益 (gain)、 高级育种系 (advanced breeding line) 的总价值、 和每单位投入 ( 例如每年、 花费的每一 笔美元等 ) 产生的成功栽培种的数目。
     对有希望的高级育种系进行彻底地测试， 并与代表商业目标区的环境中的合适标 准品进行比较达三年或更多年。最好的品系是新商业栽培种的候选 ； 那些在少数几个性状 方面仍有缺陷的品系可以作为亲本使用以产生供进一步选择用的新种群。 这些过程 ( 它们通向上市 (marketing) 和销售 (distribution) 的最终步骤 ) 从 进行第一次杂交的时间起通常花费 8 至 12 年。因此， 新栽培种的开发是耗时的过程， 其需 要精确的预先计划、 资源的有效使用、 和最低限度的方向变化。
     最困难的任务是鉴定遗传上卓越的个体， 因为对于大多数性状， 真实基因型的值 被其它混杂的植物性状或环境因素掩盖。 一种鉴定卓越植物的方法是相对于其它实验植物 和广泛种植的标准栽培种观察其性能 (performance)。 如果单次观察没有结论， 则重复观察 可提供对其遗传价值的更好评估。
     植物育种的目的是开发新的、 独特的且卓越的向日葵栽培种和杂种。育种人员最 初选择并杂交两种或更多种亲本品系， 接着进行重复的自交和选择， 产生许多新的遗传组 合。理论上育种人员可以经由杂交、 自交和突变产生几十亿不同的遗传组合。育种人员在 细胞水平上没有直接对照 (no direct control)。 因此， 两名育种人员绝不会开发出具有相 同向日葵性状的相同品系， 或者甚至非常类似的品系。
     每年， 植物育种人员选择种质来推进到下一世代。这种种质在独特的且不同的地 理学、 气候和土壤条件下种植， 然后在生长期期间和结束时进行进一步选择。 开发的栽培种 是不可预测的。这种不可预测性是由于育种人员的选择， 其发生在独特的环境中， 在 DNA 水 平上没有对照 ( 使用常规的育种方法 )， 而且产生几百万不同的可能的遗传组合。 具有本领 域普通技术的育种人员不能预测他开发的最终所得品系， 只是可能以非常粗略且大体的方 式。 同一育种人员不能通过使用完全相同的初始亲本和相同的选择技术来产生相同的栽培 种两次。这种不可预测性导致花费大量的研究资金来开发卓越的新型向日葵栽培种。
     新的向日葵栽培种的开发要求开发和选择向日葵品种、 杂交这些品种、 和选择卓 越的杂种杂交。 通过在选定的雄性能育亲本之间手工杂交或者通过使用雄性不育系统来产 生杂种种子。 针对某些单基因性状来选择这些杂种， 诸如荚果颜色 (pod color)、 花的颜色、
     短柔毛 (pubescence) 颜色、 或除草剂抗性， 它们指明种子确实是杂种。关于亲本品系， 以及 杂种表型的别的数据影响育种人员决定是否继续特定的杂种杂交。
     使用谱系育种和轮回选择育种方法来从育种群体开发栽培种。育种项目将来自 两种或更多种栽培种或多种运用广泛的 (broad-based) 来源的期望性状组合成育种集合 (breeding pool)， 通过自交和选择期望的表型从所述育种集合开发栽培种。 评估新的栽培 种以确定哪些具有商业潜力。
     谱系育种通常用于改良自花传粉的作物。将两种拥有有利的、 互补性状的亲本杂 交以产生 F1。通过使一个或数个 F1 自交来产生 F2 群体。最好个体的选择可以在 F2 群体中 开始 ； 然后在 F3 中开始选择最好家族中的最好个体。 对家族的重复测试可以在 F4 代中开始 以改善选择具有低遗传力的性状的效率。在育种的高级阶段 ( 即 F6 和 F7)， 对最好的品系 或表型上类似的品系的混合物测试作为新栽培种的推广 (release) 潜力。
     可以使用混合和轮回选择来改善自花传粉或异花传粉作物的群体。 通过使数种不 同亲本互交来鉴定或创建杂合个体的遗传可变群体。 基于个体优越性、 杰出的子代、 或卓越 的组合能力来选择最好的植物。使选定的植物互交以产生新群体， 在其中继续进一步的选 择循环。 回交育种已经用于将简单遗传的、 高度可遗传的性状的基因转移到作为回归亲本 的期望的纯合栽培种或近交系中。要转移的性状来源称作供体亲本。预期所得的植物具有 回归亲本 ( 例如栽培种 ) 的属性和自供体亲本转移的期望性状。初始杂交后， 选择拥有供 体亲本表型的个体， 并与回归亲本重复杂交 ( 回交 )。 预期所得的植物具有回归亲本 ( 例如 栽培种 ) 的属性和自供体亲本转移的期望性状。
     严格意义上的单种子遗传 (single-seed descent) 方法指种植分离群， 每株植物 收获一粒种子样品， 并使用这一粒种子样品来种植下一世代。当群体已经从 F2 推进至期望 的育种水平时， 衍生出品系的植物会各自上溯至不同的 F2 个体。群体中植物的数目每代都 下降， 这是由于一些种子不能萌发或者一些植物不能产生哪怕一粒种子。 因此， 当完成世代 进度时， 并不是所有最初在群体中取样的 F2 植物都会由子代代表。
     在多种子方法中， 向日葵育种人员通常从群体中的每株植物收获种子， 并使它们 脱粒在一起以形成整体 (bulk)。使用整体的一部分来种植下一世代， 而一部分进行保存。 该方法已经被称为改良的单种子遗传。
     已经使用多种子方法来在收获时节约劳动力。 用机器取下种子比单种子方法中用 手自每株取下一粒种子快得多。 多种子方法还使得有可能每个近交世代种植相同数目的群 体种子。收获足够的种子来补偿那些不萌发或不产生种子的植物。
     关于通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可以参见数本参考书之一 ( 例如 Allard， 1960 ； Simmonds， 1979 ； Sneep 等， 1979 ； Fehr， 1987)。
     合适的测试应当检测任何主要的不足， 并建立高于当前栽培种的优越性或改进水 平。除显示卓越的性能外， 必须需要与工业标准相容或者产生新市场的新栽培种。新栽培 种的引入可能由于专门的广告和行销、 改变的种子和商业生产实践、 和新产品利用而使种 子生产者、 种植者、 加工者和消费者承受额外的成本。 推广新栽培种前的测试应当考虑研究 和开发成本以及最终栽培种的技术优越性。对于种子繁殖的栽培种， 容易且经济地产生种 子必须是可行的。
     向日葵是一种重要且有价值的大田作物。如此， 植物育种人员的持续目的是开发 稳定的、 高产率的农艺学上是可靠的 (sound) 向日葵栽培种。当前的目的是使所用土地上 生产的谷粒量最大化， 并为动物和人类供应食物。 为了实现此目的， 向日葵育种人员必须选 择和开发具有产生卓越栽培种的性状的向日葵植物。
     相关领域的上述例子及其相关限制意图是例示性的而非排他性的。 在阅读说明书 后， 相关领域的其它限制对于本领域技术人员会是显而易见的。
     发明概述
     结合系统、 工具和方法来描述以下实施方案， 所述系统、 工具和方法意欲为例示性 和说明性的， 而并不限制范围。 在多个实施方案中， 一个或多个上述问题已经得到减少或消 除， 而其它实施方案涉及其它改进。
     根据本发明， 提供了一种新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂肪含量的种子。 本 发明部分涉及具有低饱和脂肪含量的向日葵种子、 产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日 葵植物的植株或植株部分、 及用于产生通过将产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵植 物与其自身或另一向日葵栽培种杂交来产生的向日葵植物的方法和通过诱变或转化产生 具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。 本发明的各方面提供了新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸 含量的种子。本发明部分涉及具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的向日葵种子、 产生具 有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物的植株或植株部分、 及用于产生通 过将产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物与其自身或另一向日 葵栽培种杂交来产生的向日葵植物的方法和通过诱变或转化产生具有低饱和脂肪含量和 高亚油酸含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。
     具有低饱和脂肪含量的种子的例子包括但不限于如下的种子， 其具有总计约 2.8％或更少、 约 2.9％或更少、 约 3％或更少、 约 3.1％或更少、 约 3.2％或更少、 或约 3.3％ 或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂酸 (18:0) 含量。
     具有低饱和脂肪含量和高亚油酸 (18:2) 含量的种子的例子包括但不限于如下的 种子， 其具有总计约 4.1％或更少、 约 5％或更少、 约 6％或更少、 约 7％或更少、 约 8％或更 少、 约 9％或更少、 约 10％或更少、 约 11％或更少、 或约 12％或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂 酸 (18:0) 含量， 而且具有约 15％、 约 20％、 约 25％、 约 30％、 约 35％、 约 40％、 约 45％、 约 50％、 约 55％、 约 60％、 约 65％、 约 70％、 或约 74％或更多的亚油酸 (18:2)。
     如此， 使用产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物进行 的任何此类方法是本发明的一部分 ( 例如自交、 回交、 杂种生成、 与群体杂交等 )。 使用产生 具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物作为亲本产生的所有植物在 本发明的范围内。有利地， 可以在与其它不同向日葵植物的杂交中使用所述向日葵植物以 产生具有卓越特征的第一代 (F1) 向日葵杂种种子和植物。
     在另一方面， 本发明提供了单基因或多基因转变的向日葵植物， 其产生具有低饱 和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 优选地， 转移的基因可以是显性或隐性等位基因。 转 移的基因可以赋予性状， 诸如除草剂抗性、 抗虫性 (insect resistance)、 对细菌、 真菌或病 毒疾病的抗性、 雄性能育、 雄性不育、 提高的营养质量、 和工业用途。 基因可以是天然存在的 向日葵基因或经由基因工程技术引入的转基因。
     在另一方面， 本发明提供了可再生细胞， 其用于组织培养产生具有低饱和脂肪和 任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。 组织培养能够再生具有上述产生具有低饱和脂 肪和任选地高亚油酸含量之种子的向日葵植物的生理学和形态学特征的植物， 而且能够再 生与上述向日葵植物具有基本上相同基因型的植物。 此类组织培养物中的可再生细胞可以 是胚、 原生质体、 分生细胞、 愈伤组织、 花粉、 叶、 花药、 根、 根尖、 花、 种子、 荚果或茎。更进一 步， 本发明提供了自本发明的组织培养物再生的向日葵植物。
     在另一方面， 本发明提供了一种将期望的性状引入产生具有低饱和脂肪和任选地 高亚油酸含量的种子的向日葵植物中的方法， 其中所述方法包括 ： 将产生具有低饱和脂肪 和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物与包含期望性状的另一向日葵栽培种的植物 杂交以产生 F1 子代植物， 其中所述期望的性状选自下组 ： 雄性不育、 除草剂抗性、 抗虫性、 和对细菌疾病、 真菌疾病或病毒疾病的抗性 ； 选择一株或多株具有期望性状的子代植物以 产生选定的子代植物 ； 将所述选定的子代植物与产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含 量的种子的向日葵植物杂交以产生回交子代植物 ； 选择具有所述期望的性状和产生具有低 饱和脂肪和任选地高亚油酸含量之种子的向日葵植物的生理学和形态学特征的回交子代 植物， 以产生选定的回交子代植物 ； 并重复这些步骤来产生选定的第一或更高 (first or higher) 的回交子代植物， 其包含所述期望的性状和产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油 酸含量之种子的向日葵植物的所有生理学和形态学特征。
     除了上文所描述的例示性方面和实施方案外， 通过研究以下描述， 另外的方面和 实施方案会变得显而易见。
     附图简述
     图 1 显示了低硬脂酸 QTL 在 LG17 的 HA1875-HA1865 区间中的精细定位 ( 小图 A ： 具有新标志物 ( 为蓝色 ) 的 LG 17 的图和小图 B ： 低硬脂酸 QTL 相对于 HA1875-ORS565 区 间的精细定位 ) ；
     图 2 显 示 了 来 自 两 个 亲 本 品 系 的 KASII-2 基 因 的 序 列 比 对， 显 示 了 SNP 和 indel(ID 号 333.1(SEQ ID NO ： 38) 和 333.2(SEQ ID NO ： 39) 代表来自 OND163R 扩增子的 克隆， 而 332.4(SEQ ID NO ： 40) 和 332.5(SEQ ID NO ： 41) 代表来自 H280R[1]/687R-1-8-1 扩增子的克隆 ) ；
     图 3 显示了低棕榈酸 QTL( 小图 A) 和脂肪酸基因 KASIII-2( 小图 B) 在 LG 5 上的 共定位。
     发明的实施方式
     在以下描述和表格中， 使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书 ( 包括 此类术语要给予的范围 ) 的清楚而一致的理解， 提供了下列定义 ：
     等位基因。等位基因指基因的一种或多种可选形式之任一种， 所有该等位基因涉 及一种性状或特征。在双倍体细胞或生物体中， 给定基因的两个等位基因占据一对同源染 色体上的相应基因座。
     回交。 回交指育种人员重复地将杂种子代往回与亲本之一 ( 例如第一代杂种 F1 与 F1 杂种的亲本基因型之一 ) 杂交的过程。
     良种向日葵。已经在某些商业上重要的农艺学性状方面稳定化的向日葵栽培种， 其相对于在同一生长位置、 同时并且在相同条件下生长的验证品种的产率包含约 100％或更大的稳定化产率。在一个实施方案中， “良种向日葵” 意指在某些商业上重要的农艺学性 状方面稳定化的向日葵栽培种， 其相对于在同一生长位置、 同时并且在相同条件下生长的 验证品种的产率包含 110％或更大的稳定化产率。 在另一个实施方案中， “良种向日葵” 意指 在某些商业上重要的农艺学性状方面稳定化的向日葵栽培种， 其相对于在同一生长位置、 同时并且在相同条件下生长的验证品种的产率包含 115％或更大的稳定化产率。
     胚。胚指成熟种子内含有的小植株。
     FAME 分析。脂肪酸甲酯分析是容许精确量化构成复合脂种类的脂肪酸的方法。
     咪唑啉酮 (Imidazolinone) 抗性 (Imi)。抗性和 / 或耐受性是由一种或多种改变 乙酰乳酸合酶 (ALS)( 又称为乙酰羟酸合酶 (AHAS)) 的基因赋予的， 所述基因容许所述酶对 抗咪唑啉酮的作用。
     诱变。诱变指用诱变剂 ( 例如提高突变在靶标植物或植物部分中的频率的化学剂 或物理因素 ) 诱变植物或植物部分。作为非限制性例子， 可以使用 Konzak 的双重化学诱变 技术 ( 如记载于美国专利号 6,696,294) 来在内源植物基因中诱导突变等位基因。
     含油量。 含油量按照占完整干燥种子的百分比来测量， 而且是不同品种的特征。 它 可以使用多种分析技术诸如 NMR、 NIR、 和 Soxhlet 提取来测定。 总脂肪酸百分比。 这通过如下测定， 即从种子提取油样品， 生成所述油样品中存在 的脂肪酸的甲酯， 并使用气相层析来分析各种脂肪酸在样品中的比例。脂肪酸组成也可以 是品种的区别性特征。
     单基因转变的 ( 转变 )。单基因转变的 ( 转变 ) 植物指通过称作回交的植物育种 技术， 或者经由基因工程开发的植物， 其中除了经由回交技术或经由基因工程转移到品种 中的单基因外， 该品种的基本上所有期望的形态学和生理学特征也均得到复原。
     稳定化的。从一个世代能通过繁殖传递到同一品种的近交植物的下一世代。
     总饱和的 (TOTSAT)。油中的饱和脂肪 ( 包括 C12:0、 C14:0、 C16:0、 C18:0、 C20:0、 C22:0 和 C24.0) 占种子油的总百分比。
     根据本发明的具体实施方案， 提供了一种新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂 肪含量的种子。此实施方案涉及具有低饱和脂肪含量的向日葵种子、 产生具有低饱和脂肪 含量的种子的向日葵植物的植株或植株部分、 及用于生产通过将产生具有低饱和脂肪含量 的种子的向日葵植物与其自身或另一向日葵栽培种杂交而产生的向日葵植物的方法和通 过诱变或转化产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。
     本发明的其它方面提供了新的向日葵植物， 其产生具有低饱和脂肪含量和高亚油 酸含量的种子。此实施方案涉及具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的向日葵种子、 产生 具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物的植株或植株部分、 及用于生产 通过将产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵植物与其自身或另一向 日葵栽培种杂交而产生的向日葵植物的方法和通过诱变或转化产生具有低饱和脂肪含量 和高亚油酸含量的种子的向日葵植物来创建变体的方法。
     具有低饱和脂肪含量的种子的例子包括但不限于如下的种子， 其具有总计约 2.8％或更少、 约 2.9％或更少、 约 3％或更少、 约 3.1％或更少、 约 3.2％或更少、 或约 3.3％ 或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂酸 (18:0) 含量。
     具有低饱和脂肪含量和高亚油酸 (18:2) 含量的种子的例子包括但不限于如下的
     种子， 其具有总计约 6％或更少、 约 4.1％或更少、 约 5％或更少、 约 6％或更少、 约 7％或更 少、 约 8％或更少、 约 9％或更少、 约 10％或更少、 约 11％或更少、 或约 12％或更少的棕榈酸 (16:0) 和硬脂酸 (18:0) 含量， 而且具有约 15％、 约 20％、 约 25％、 约 30％、 约 35％、 约 40％、 约 45％、 约 50％、 约 55％、 约 60％、 约 65％、 约 70％、 或约 74％或更多的亚油酸 (18:2)。
     如此， 使用产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物进行 的任何此类方法是本发明的一部分 ( 例如自交、 回交、 杂种生成、 与群体杂交等 )。 使用产生 具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物作为亲本产生的所有植物在 本发明的范围内。有利地， 可以在与其它不同向日葵植物的杂交中使用所述向日葵植物以 产生具有卓越特征的第一代 (F1) 向日葵杂种种子和植物。
     在另一方面， 本发明提供了单基因或多基因转变的向日葵植物， 其产生具有低饱 和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 优选地， 转移的基因可以是显性或隐性等位基因。 优 选地， 转移的基因会赋予性状， 诸如除草剂抗性、 抗虫性、 细菌抗性、 真菌抗性、 病毒疾病抗 性、 雄性能育、 雄性不育、 提高的营养质量、 和工业用途。 基因可以是天然存在的向日葵基因 或经由基因工程技术引入的转基因。
     在另一方面， 本发明提供了可再生细胞， 其用于组织培养产生具有低饱和脂肪和 任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。优选地， 组织培养会能够再生具有上述产生具 有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量之种子向日葵植物的生理学和形态学特征的植物， 而 且能够再生与上述向日葵植物具有基本上相同基因型的植物。此类组织培养物中的可再 生细胞可以是胚、 原生质体、 分生细胞、 愈伤组织、 花粉、 叶、 花药、 根、 根尖、 花、 种子、 荚果或 茎。更进一步， 本发明的实施方案提供了自本发明的组织培养物再生的向日葵植物。 在另一方面， 本发明提供了一种将期望的性状引入产生具有低饱和脂肪和任选地 高亚油酸含量的种子的向日葵植物中的方法， 其中所述方法包括 ： 将产生具有低饱和脂肪 和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物与包含期望性状的另一向日葵栽培种的植物 杂交以产生 F1 子代植物， 其中所述期望的性状选自下组 ： 雄性不育、 除草剂抗性、 抗虫性、 和 对细菌疾病、 真菌疾病或病毒疾病的抗性 ； 选择一株或多株具有期望性状的子代植物以产 生选定的子代植物 ； 将所述选定的子代植物与产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量 的种子的向日葵植物杂交以产生回交子代植物 ； 选择具有所述期望的性状和产生具有低饱 和脂肪和任选地高亚油酸含量之种子的向日葵植物的生理学和形态学特征的回交子代植 物， 以产生选定的回交子代植物 ； 并重复这些步骤来产生选定的第一或更高的回交子代植 物， 其包含所述期望的性状和产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵 植物的所有生理学和形态学特征。
     有用的方法包括但不限于使用直接基因转移方法诸如微粒介导的投递、 DNA 注射、 电穿孔等导入植物组织中的表达载体。 可以使用微粒介质投递用生物射弹装置或使用土壤 杆菌属 (Agrobacterium) 介导的转化将表达载体导入植物组织中。用本发明的原生质获得 的转化体植物意图在本发明的范围内。
     随着使分离和表征编码特定蛋白质产物的基因成为可能的分子生物学技术的出 现， 植物生物学领域的科学家对以下方面形成了强烈的兴趣， 即工程化改造植物的基因组 以含有外来基因， 或者另外的或经修饰型式的天然或内源基因 ( 可能由不同启动子驱动 )， 并进行表达以便以特定的方式改变植物的性状。此类外来的另外的和 / 或经修饰的基因在
     本文中统称为 “转基因” 。在过去 15 至 20 年里， 已经开发了数种用于产生转基因植物的方 法， 并且在具体的实施方案中， 本发明也涉及要求保护的品种或栽培种的转化型式。
     植物转化牵涉构建会在植物细胞中发挥功能的表达载体。 此类载体包含包括在调 节元件 ( 例如启动子 ) 控制下的或者与调节元件 ( 例如启动子 ) 可操作连接的基因的 DNA。 表达载体可以含有一种或多种此类可操作连接的基因 / 调控元件组合。载体可以是质粒形 式， 而且可以单独或者与其它质粒联合使用， 以如下文所描述的那样使用转化方法提供经 转化的向日葵植物， 从而将转基因掺入向日葵植物的遗传物质中。
     供向日葵转化用的表达载体 ： 标志物基因
     表达载体包括至少一种与调节元件 ( 例如启动子 ) 可操作连接的遗传标志， 其容 许通过负选择 ( 即抑制不含该选择标志基因的细胞生长 ) 或者通过正向选择 ( 即筛选由该 遗传标志编码的产物 ) 回收含有所述标志的经转化细胞。许多通常用于植物转化的选择标 志基因是转化领域中公知的， 包括例如编码在代谢上使可以作为抗生素或除草剂的选择性 化学剂解毒的酶的基因， 或者编码对抑制剂不敏感的改变了的靶物的基因。几种正向选择 方法也是本领域中已知的。
     一种通常用于植物转化的选择标志基因是在植物调节信号控制下的新霉素磷酸 转移酶 II(nptII) 基因， 其赋予对卡那霉素的抗性。参见例如 Fraley 等， Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.， 80 ： 4803(1983)。另一种常用的选择标志基因是潮霉素磷酸转移酶基因， 其赋 予对抗生素潮霉素的抗性。参见例如 Vanden Elzen 等， Plant Mol.Biol.， 5： 299(1985)。 赋予对抗生素抗性的细菌起源的另外的选择标志基因包括庆大霉素乙酰转移酶、 链霉素磷酸转移酶、 氨基糖苷 -3’ - 腺嘌呤转移酶 (adenyl transferase) 和博来霉素抗性 决 定 子。 参 见 Hayford 等， Plant Physiol.86 ： 1216(1988) ； Jones 等， Mol.Gen.Genet.， 210 ： 86(1987) ； Svab 等， Plant Mol.Biol.14 ： 197(1990) ； Hille 等， Plant Mol.Biol.7 ： 171(1986)。其它选择标志基因赋予对除草剂诸如草甘膦、 草铵膦 (glufosinate) 或溴苯腈 (bromoxynil) 的抗性。 参见 Comai 等， Nature 317 ： 741-744(1985) ； Gordon-Kamm 等， Plant Cell 2 ： 603-618(1990) ； 和 Stalker 等， Science 242 ： 419-423(1988)。
     其它供植物转化用的选择标志基因不是细菌起源的。 这些基因包括例如小鼠二氢 叶酸还原酶、 植物 5- 烯醇丙酮酰莽草酸 (enolpyruvylshikimate)-3- 磷酸合酶和植物乙酰 乳酸合酶。参见 Eichholtz 等， Somatic Cell Mol.Genet.13 ： 67(1987) ； Shah 等， Science 233 ： 478(1986) ； Charest 等， Plant Cell Rep.8 ： 643(1990)。
     另一类供植物转化用的标志基因需要筛选据推测经转化的植物细胞， 而不对经转 化的细胞直接遗传选择对毒性物质诸如抗生素的抗性。 这些基因特别可用于量化或显现基 因在特定组织中表达的空间样式， 并且通常称为报告基因， 因为它们可以与基因或基因调 节序列融合以调查基因表达。通常用于筛选据推测经转化的细胞的基因包括 β- 葡糖醛酸 糖苷酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶。 参见 R.A.Jefferson， Plant Mol.Biol.Rep.5 ： 387(1987) ； Teeri 等， EMBO J.8 ： 343(1989) ； Koncz 等， Proc.Natl.Acad. SciU.S.A.84 ： 131(1987) ； DeBlock 等， EMBO J.3 ： 1681(1984)。
     最 近， 已 经 可 获 得 用 于 显 现 GUS 活 性 的 体 内 方 法， 其 不 需 要 破 坏 植 物 组 织。 Molecular Probes publication 2908， Imagene， T.M.Green， 第 1 页 - 第 4 页 (1993) ； 和 Naleway 等， J.Cell Biol.115 ： 151a(1991)。然而， 还没有证明这些用于显现 GUS 活性的体
     内方法对于回收经转化的细胞是有用的， 这是由于低灵敏度、 高荧光背景和与使用萤光素 酶基因作为选择标志有关的限制。
     新近， 已经利用编码绿色荧光蛋白 (GFP) 的基因作为原核和真核细胞中基因表达 的标志物。参见 Chalfie 等， Science 263 ： 802(1994)。GFP 和 GFP 突变体可以作为可筛选 标志物使用。
     供向日葵转化用的表达载体 ： 启动子
     表达载体中包含的基因必须由包含调节元件 ( 例如启动子 ) 的核苷酸序列驱动。 数种类型的启动子现在是转化领域中公知的， 可以单独使用或者与启动子联合使用的其它 调节元件也是如此。
     如本文中所使用的， “启动子” 包括提及如下的 DNA 区域， 其在转录起始的上游， 而 且牵涉识别和结合 RNA 聚合酶和其它蛋白质以启动转录。 “植物启动子” 是能够在植物细 胞中启动转录的启动子。 在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织诸如叶、 根、 种 子、 纤维、 木质部导管、 管胞、 或厚壁组织中启动转录的启动子。此类启动子称为 “组织优选 性的” 。仅在某些组织中启动转录的启动子称为 “组织特异性的” 。 “细胞类型” 特异性启动 子主要在一种或多种器官中的某些细胞类型 ( 例如根或叶中的维管细胞 ) 中驱动表达。 “诱 导型” 启动子是在环境控制下的启动子。可招致诱导型启动子转录的环境条件的例子包括 缺氧条件或光的存在。组织特异性的、 组织优选性的、 细胞类型特异性的、 和诱导型启动子 构成 “非组成性” 启动子类。 “组成性” 启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。
     A. 诱导型启动子
     将诱导型启动子与向日葵中表达的基因可操作连接。任选地， 将诱导型启动子与 编码信号序列的核苷酸序列可操作连接， 所述核苷酸序列与向日葵中表达的基因可操作连 接。通过诱导型启动子， 转录速率响应诱导剂而升高。
     可以在本发明中使用任何诱导型启动子。参见 Ward 等， Plant Mol.Biol.22 ： 361-366(1993)。例示性诱导型启动子包括但不限于 ： 那些响应铜的 ACEI 系统的启动 子 (Mett 等， PNAS 90 ： 4567-4571(1993)) ； 响应苯磺酰胺除草剂安全剂的玉米的 In2 基 因 (Hershey 等， Mol.Gen.Genetics 227 ： 229-237(1991) ； 和 Gatz 等， Mol.Gen.Genetics 243 ： 32-38(1994)) ；和 来 自 Tn10 的 Tet 阻 抑 物 (Gatz 等， Mol.Gen.Genetics 227 ： 229-237(1991))。特别优选的诱导型启动子是响应植物正常不响应的诱导剂的启动子。例 示性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子， 其转录活性受糖皮质激素诱 导。Schena 等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88 ： 0421(1991)。
     B. 组成性启动子
     将组成性启动子与向日葵中表达的基因可操作连接， 或者将组成性启动子与编码 信号序列的核苷酸序列可操作连接， 所述编码信号序列的核苷酸序列与向日葵中表达的基 因可操作连接。
     可 以 在 本 发 明 中 利 用 不 同 的 组 成 性 启 动 子。 例 示 性 的 组 成 性 启 动 子 包 括但不限于： 来 自 植 物 病 毒 的 启 动 子， 诸 如 来 自 CaMV 的 35S 启 动 子 (Odell 等， Nature 313 ： 810-812(1985)) ； 来 自 稻 肌 动 蛋 白 基 因 的 启 动 子 (McElroy 等， Plant Cell 2 ： 163-171(1990)) ； 来 自 泛 素 的 启 动 子 (Christensen 等， Plant Mol.Biol.12 ： 619-632(1989)， 和 Christensen 等， Plant Mol.Biol.18 ： 675-689(1992)) ； 来 自 pEMU 的启 动 子 (Last 等， Theor.Appl.Genet.81 ： 581-588(1991)) ； 来 自 MAS 的 启 动 子 (Velten 等， EMBOJ.3 ： 2723-2730(1984)) ； 和来自玉米 H3 组蛋白的启动子 (Lepetit 等， Mol.Gen. Genetics 231 ： 276-285(1992)， 和 Atanassova 等， Plant Journal 2(3) ： 291-300(1992))。 ALS 启动子， 即欧洲油菜 (Brassica napus)ALS3 结构基因 5’ 的 Xba1/NcoI 片段 ( 或与该 Xba1/NcoI 片段相似的核苷酸序列 ) 代表一种特别有用的组成性启动子。参见 PCT 申请 WO 96/30530。
     C. 组织特异性或组织优选性启动子
     将组织特异性启动子与向日葵中表达的基因可操作连接。任选地， 将组织特异性 启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接， 所述编码信号序列的核苷酸序列与向日 葵中表达的基因可操作连接。 用与组织特异性启动子可操作连接的感兴趣基因转化的植物 可以专门或优先在特定组织中生成转基因的蛋白质产物。
     可以在本发明中利用任何组织特异性或组织优选性启动子。例示性组织特异性 或组织优选性启动子包括但不限于 ： 根优选性启动子， 诸如来自菜豆蛋白基因的启动子 (Murai 等， Science 23 ： 476-482(1983)， 和 Sengupta-Gopalan 等， Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.82 ： 3320-3324(1985)) ； 叶特异性和光诱导型启动子， 诸如来自 cab 或核酮糖二磷 酸羧化酶 - 加氧酶 (rubisco) 的启动子 (Simpson 等， EMBO J.4(11) ： 2723-2729(1985)， 和 Timko 等， Nature 318 ： 579-582(1985)) ； 花药特异性启动子， 诸如来自 LAT52 的启动子 (Twell 等， Mol.Gen.Genetics217 ： 240-245(1989)) ； 花粉特异性启动子， 诸如来自 Zm13 的 启动子 (Guerrero 等， Mol.Gen.Genetics 244 ： 161-168(1993)) 或小孢子优选性启动子， 诸 如来自 apg 的启动子 (Twell 等， Sex.Plant Reprod.6 ： 217-224(1993))。
     可以通过将编码信号序列的核苷酸序列可操作连接至编码感兴趣蛋白质的基因 的 5’ 和 / 或 3’ 区域的手段来实现由转基因生成的蛋白质向亚细胞区室诸如叶绿体、 液泡、 过氧化物酶体、 乙醛酸循环体、 细胞壁或线粒体的转运或者分泌入质外体中。 可以在蛋白质 合成和加工过程中测定在结构基因的 5’ 和 / 或 3’ 端的靶向序列， 其中编码的蛋白质最后 被区室化 (compartmentalized)。
     信号序列的存在将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室， 或者分泌至质外体。 许多信号序列是本领域中已知的。参见例如 Becker 等， Plant Mol.Biol.20 ： 49(1992) ； P.S.Close， Master’ s Thesis， Iowa State University(1993) ； C.Knox 等， “Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes from Barley， ” Plant Mol. Biol.9 ： 3-17(1987) ； Lerner 等， Plant Physiol.91 ： 124-129(1989) ； Fontes 等， Plant Cell 3 ： 483-496(1991) ； Matsuoka 等， Proc.Natl Acad.Sci.88 ： 834(1991) ； Gould 等， J.Cell.Biol.108 ： 1657(1989) ； Creissen 等， Plant J.2 ： 129(1991) ； Kalderon 等， A short amino acid sequence able to specify nuclear location， Cell 39 ： 499-509(1984) ； Steifel 等， Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation， Plant Cell 2 ： 785-793(1990)。
     外来蛋白质基因和农艺学基因
     通过根据本发明的转基因植物， 可以以商业量生产外来蛋白质。 如此， 用于选择和 繁殖经转化植物的技术 ( 它们是本领域中充分了解的 ) 产生多种转基因植物， 它们以常规 方式收获， 然后可以从感兴趣的组织或总生物量提取外来蛋白质。可以通过由例如 Heney和 Orr， Anal.Biochem.114 ： 92-6(1981) 所讨论的已知方法来实现从植物生物量的蛋白质 提取。
     在本发明的各方面， 为商业生产外来蛋白质提供的转基因植物是向日葵植物。在 其它方面， 感兴趣的生物量是种子。 对于相对少量的显示较高表达水平的转基因植物， 可以 主要经由常规的 RFLP、 PCR 和 SSR 分析 ( 其鉴定整合 DNA 分子的近似染色体位置 ) 来产生遗 传图谱。 关于这方面的例示性方法， 参见 Glick 和 Thompson， Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology， CRC Press， Boca Raton 269 ： 284(1993)。关于染色体位置 的图谱信息对于主题转基因植物的所有权保护是有用的。 如果进行未经授权的繁殖和与其 它种质进行杂交， 则可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱进行比较以确定后者是 否与主题植物具有共同来源 (parentage)。图谱比较会牵涉杂交、 RFLP、 PCR、 SSR 和测序， 它们都是常规技术。
     同样地， 可以在经转化的植物中表达农艺学基因。 更具体地， 可以对植物进行遗传 工程化改造以表达农艺学感兴趣的各种表型。 可以在这方面使用的例示性基因包括但不限 于下文进行归类的基因。
     1. 赋予对害虫或疾病的抗性并编码下列各项的基因 ： A) 植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因 (R) 产物与病原 体中相应无毒性 (Avr) 基因产物之间的特异性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因转化 植物品种以工程化改造对特定病原体株有抗性的植物。参见例如 Jones 等， Science 266 ： 789(1994)( 克隆对黄枝孢霉 (Cladosporium fulvum) 有抗性的番茄 Cf-9 基因 ) ； Martin 等， Science 262 ： 1432(1993)( 对丁香假单胞菌番茄致病变种 (Pseudomonas syringae pv.tomato) 有抗性的番茄 Pto 基因编码蛋白质激酶 ) ； Mindrinos 等， Cell 78 ： 1089(1994) ( 对丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae) 有抗性的拟南芥 (Arabidopsis)RSP2 基因 )。
     B) 赋予对害虫诸如大豆胞囊线虫有抗性的基因。参见例如 PCT 申请 WO96/30517 ； PCT 申请 WO 93/19181。
     C) 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis) 蛋白、 其衍生物或模仿其的合成 多肽。参见例如 Geiser 等， Gene 48 ： 109(1986)， 其披露了 Bt δ- 内毒素基因的克隆和 核苷酸序列。此外， 编码 δ- 内毒素基因的 DNA 分子可以购自美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection)， Manassas， Va.， 例如以 ATCC 保藏号 40098、 67136、 31995 和 31998 购得。
     D) 凝集素。参见例如 Van Damme 等， Plant Molec.Biol.24 ： 25(1994) 的公开内 容， 其披露了数种君子兰 (Clivia miniata) 甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。
     E) 维生素结合蛋白诸如抗生物素蛋白。参见 PCT 申请 US93/06487。该申请教导 了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对虫害的杀幼虫剂的用途。
     F) 酶抑制剂， 例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见例如 Abe 等， J.Biol.Chem.262 ： 16793(1987)( 稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂的核苷酸序列 ) ； Huub 等， Plant Molec.Biol.2l ： 985(1993)( 编码烟草蛋白水解酶抑制剂 I 的 cDNA 的核苷酸序 列)； Sumitani 等， Biosci.Biotech.Biochem.57 ： 1243(1993)( 硝孢链霉菌 (Streptomyces nitrosporeus)α- 淀粉酶抑制剂的核苷酸序列 ) ； 和美国专利号 5,494,813(Hepher 和 Atkinson， 1996 年 2 月 27 日公开 )。
     G) 昆虫特异性激素或信息素， 诸如蜕皮类固醇或保幼激素， 其变体、 基于其的模拟 物、 或其拮抗剂或激动剂。参见例如 Hammock 等， Nature344 ： 458(1990) 披露的克隆的保幼 激素酯酶 ( 即一种保幼激素灭活剂 ) 的杆状病毒表达的内容。
     H) 昆虫特异性肽或神经肽， 其在表达后破坏受到影响的害虫的生理学。例如参 见 Regan， J.Biol.Chem.269 ： 9(1994)( 表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的 DNA) 和 Pratt 等， Biochem.Biophys.Res.Comm.163 ： 1243(1989)( 在 太 平 洋 折 翅 蠊 (Diploptera puntata) 中鉴定出咽侧体抑制素 (allostatin)) 的公开内容。还可参见 Tomalski 等的美 国专利号 5,266,317， 其披露了编码昆虫特异性、 麻痹性神经毒素的基因。
     I) 在自然界由蛇、 黄蜂 (wasp) 等生成的昆虫特异性毒液。 例如参见 Pang 等， Gene 116 ： 165(1992)， 是关于编码蝎昆虫毒性肽的基因在植物中的异源表达的公开内容。
     J) 酶， 其负责超积累单萜、 倍半萜、 类固醇、 异羟肟酸、 类苯丙烷衍生物或另一具有 杀昆虫活性的非蛋白质分子。
     K) 牵涉对生物学活性分子的修饰 ( 包括翻译后修饰 ) 的酶 ； 例如， 糖酵解酶、 蛋白 水解酶、 脂肪分解酶、 核酸酶、 环化酶、 转氨酶、 酯酶、 水解酶、 磷酸酶、 激酶、 磷酸化酶、 聚合 酶、 弹性蛋白酶、 几丁质酶 (chitinase) 和葡聚糖酶 ( 不管是天然的还是合成的 )。参见以 Scott 等名义的 PCT 申请 WO93/02197， 其披露了 callase 基因的核苷酸序列。含有几丁质 酶编码序列的 DNA 分子可以例如从 ATCC 以保藏号 39637 和 67152 获得。还可参见 Kramer 等， Insect Biochem.Molec.Biol.23 ： 691(1993)( 其教导了编码烟草天蛾几丁质酶的 cDNA 的核苷酸序列 ) 和 Kawalleck 等， Plant Molec.Biol.21 ： 673(1993)( 其提供了欧芹 ubi4-2 多聚泛素基因的核苷酸序列 )。
     L) 刺激信号转导的分子。 例如参见 Botella 等， Plant Molec.Biol.24 ： 757(1994) ( 关 于 绿 豆 钙 调 蛋 白 cDNA 克 隆 的 核 苷 酸 序 列 ) 和 Griess 等， Plant Physiol.104 ： 1467(1994)( 其提供了玉米钙调蛋白 cDNA 克隆的核苷酸序列 ) 的公开内容。
     M) 疏水矩肽 (hydrophobic moment peptide)。参见 PCT 申请 WO 95/16776( 抑 制真菌植物病原体的鲎抗菌肽 (Tachyplesin) 的肽衍生物的公开内容 ) 和 PCT 申请 WO 95/18855( 教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽 )。
     N) 膜通透酶、 通道形成剂或通道阻断剂。例如参见 Jaynes 等， Plant Sci.89 ： 43(1993) 公开的杀菌肽 -β 溶胞肽类似物 (cecropin-β lytic peptide analog) 的异源 表达以使转基因烟草植物对青枯假单胞菌 (Pseudomonas solanacearum) 有抗性。
     O) 病毒侵入蛋白或自其衍生的复合毒素。例如， 病毒外壳蛋白在经转化植物细胞 中的积累赋予对由衍生出该外壳蛋白基因的病毒及相关病毒招致的病毒感染和 / 或疾病 形成的抗性。参见 Beachy 等， Ann.Rev.Phytopathol.28 ： 45l(1990)。已经对经转化的植物 赋予了针对苜蓿花叶病毒、 黄瓜花叶病毒、 烟草线条病毒、 马铃薯 X 病毒、 马铃薯 Y 病毒、 烟 草蚀刻病毒、 烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。
     P) 昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素。如此， 靶向昆虫肠中的重要代谢功 能的抗体会使受影响的酶失活， 这杀死昆虫。参见 Taylor 等， 摘要号 497， Seventh Int’ l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions(Edinburgh， Scotland)(1994)( 经 由生成单链抗体片段进行的转基因烟草中的酶促失活 )。
     Q) 病毒特异性抗体。参见例如 Tavladoraki 等， Nature 366 ： 469(1993)， 其显示了表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击。
     R) 在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白 (developmental-arrestive protein)。如此， 真菌内 α-l， 4-D- 多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同 -α-1， 4-D- 半乳糖醛酸酶 (galacturonase) 来促进真菌定殖 (colonization) 和植物营养物释放。 参见 Lamb 等， Bio/Technology 10 ： 1436(1992)。 编码豆内多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基 因的克隆和表征由 Toubart 等， Plant J.2 ： 367(1992) 描述。
     S) 在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白。 例如 Logemann 等， Bio/Technology 10 ： 305(1992) 显示了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌疾病具有升高的抗性。
     2. 赋予对除草剂的抗性的基因 ：
     A) 抑制生长点或分生组织的除草剂， 诸如咪唑啉酮或磺酰脲。在这类中的例示性 基因编码突变的 ALS 和 AHAS 酶， 如分别由例如 Lee 等， EMBO J.7 ： 1241(1988) 和 Miki 等， Theor.Appl.Genet.80 ： 449(1990) 所描述的。
     B) 抑制光合作用的除草剂， 诸如三嗪 (psbA 和 gs+ 基因 ) 或苯基氰 ( 腈水解酶 基因 )。Przibila 等， Plant Cell 3 ： 169(1991) 描述了用编码突变的 psbA 基因的质粒转 化衣滴虫 (Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于 Stalker 的美国专利号 4,810,648， 并且含有这些基因的 DNA 分子可以以 ATCC 保藏号 53435、 67441、 和 67442 获得。 编码谷胱甘肽 S- 转移酶的 DNA 的克隆和表达由 Hayes 等， Biochem.J.285 ： 173(1992) 描述。
     3. 赋予或促成如下增值 (value-added) 性状的基因， 诸如 ：
     A) 经修饰的脂肪酸代谢， 例如通过用硬脂酰 -ACP 去饱和酶的反义基因转化 植 物 以 提 高 植 物 的 硬 脂 酸 含 量。 参 见 Knultzon 等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89 ： 2624(1992)。
     B) 降低的肌醇六磷酸盐含量—— 1) 肌醇六磷酸酶编码基因的导入会增强肌醇六 磷酸盐的分解， 向经转化的植物添加更多游离的磷酸盐。 例如， 参见 Van Hartingsveldt 等， Gene 127 ： 87(1993)， 关于黑曲霉 (Aspergillus niger) 肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列 的公开内容。 2) 可以导入降低肌醇六磷酸盐含量的基因。 例如在玉米中， 这可以如下实现， 即克隆与单一等位基因有关的 DNA， 然后再次导入， 所述单一等位基因负责特征为低水平肌 醇六磷酸的玉米突变体。参见 Raboy 等， Maydica 35 ： 383(1990)。
     C) 例如通过用编码改变淀粉分支样式的酶的基因转化植物来实现的经修饰的碳 水化合物组成。参见 Shiroza 等， J.Bacteol.170 ： 810(1988)( 链球菌 (Streptococcus) 突 变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列 )， Steinmetz 等， Mol.Gen.Genet.20 ： 220(1985)( 枯 草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 果聚糖蔗糖酶 (levansucrase) 基因的核苷酸序列 ) ； Pen 等， Bio/Technology 10 ： 292(1992)( 表达地衣芽胞杆菌 (Bacillus lichenifonnis)α- 淀 粉酶的转基因植物的生成 ) ； Elliot 等， Plant Molec.Biol.21 ： 515(1993)( 番茄转化酶基 因的核苷酸序列 ) ； Sogaard 等， J.Biol.Chem.268 ： 22480(1993)( 大麦 α- 淀粉酶基因的定 点诱变 ) ； 和 Fisher 等， Plant Physiol.102 ： 1045(1993)( 玉米胚乳淀粉分支酶 II)。
     用于向日葵转化的方法
     已经开发了许多用于植物转化的方法， 包括生物学和物理植物转化方案。参见 例 如 Miki 等， “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”于 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology， B.R.Glick 和 J.E.Thompson 编 (CRCPress， Inc.， Boca Raton， 1993) 第 67 页 - 第 88 页。另外， 可获得用于植物细胞或组织 转化及植物再生的表达载体和体外培养方法。参见例如 Gruber 等， “Vectors for Plant Transformation” 于 Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology， B.R.Glick 和 J.E.Thompson 编 (CRCPress， Inc.， Boca Raton， 1993) 第 89 页 - 第 119 页。
     A) 土壤杆菌介导的转化——一种用于将表达载体导入植物中的方法是基于土壤 杆菌属的天然转化系统。参见例如 Horsch 等， Science 227 ： 1229(1985). 根癌土壤杆菌 (A.tumefaciens) 和发根土壤杆菌 (A.rhizogenes) 是在遗传上转化植物细胞的植物病原 性土壤细菌。根癌土壤杆菌 (A.tumefaciens) 的 Ti 质粒和发根土壤杆菌 (A.rhizogenes) 的 Ri 质粒携带负责植物的遗传转化的基因。 参见例如 C.I.Kado， Crit.Rev.Plant Sci.10 ： 1(1991)。土壤杆菌属载体系统和土壤杆菌介导的基因转移方法的描述由 Gruber 等， 见上 文， Miki 等， 见上文， 及 Moloney 等， Plant Cell Reports 8 ： 238(1989) 提供。还可参见美 国专利号 5,563,055(Townsend 和 Thomas)， 1996 年 10 月 8 日公开。
     B) 直接基因转移——已经开发了数种植物转化方法 ( 统称为直接基因转移 ) 作为 土壤杆菌介导的转化的备选。植物转化普遍可适用的方法是微粒介导的转化， 其中在测量 为 1 至 4μm 的微粒的表面上携带 DNA。 用生物射弹装置将表达载体导入植物组织中， 所述生 物射弹装置将微粒加速到 300 至 600m/s 的速度， 其足以穿透植物细胞壁和细胞膜。 Sanford 等， Part.Sci.Technol.5 ： 27(1987) ； J.C.Sanford， Trends Biotech.6 ： 299(1988) ； Klein 等， Bio/Technology 6 ： 559-563(1988) ； J.C.Sanford， Physiol.Plant7 ： 206(1990) ； Klein 等， Biotechnology 10 ： 268(1992)。还可参见美国专利号 5,015,580(Christou 等 )， 1991 年 5 月 14 日公开 ； 美国专利号 5,322,783(Tomes 等 )， 1994 年 6 月 21 日公开。
     另一种用于将 DNA 物理投递至植物的方法是对靶细胞的超声处理。 Zhang 等， Bio/ Technology 9 ： 996(1991)。或者， 已经使用脂质体和原生质球融合来将表达载体导入植物 中。Deshayes 等， EMBO J， 4： 2731(1985) ； Christou 等， Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.84 ： 3962(1987)。还已经报道了使用 CaCl2 沉淀、 聚乙烯醇或多 -L- 鸟氨酸来将 DNA 直接摄 取 到 原 生 质 体 中。Hain 等， Mol.Gen.Genet.199 ： 161(1985)， 和 Draper 等， Plant Cell Physiol.23 ： 451(1982)。还已经描述了原生质体和全细胞和组织的电穿孔。Donn 等， 于 Abstracts of VIIthInternational Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC， A2-38， 第 53 页 (1990) ； D’ Halluin 等， Plant Cell 4 ： 1495-1505(1992)， 和 Spencer 等， Plant Mol.Biol.24 ： 51-61(1994)。
     转化向日葵靶标组织后， 上述选择性标志物基因的表达容许优先选择经转化的细 胞、 组织和 / 或植物， 其中使用本领域中公知的再生和选择方法来实现。
     前述转化方法通常会用于产生转基因品种。然后可以将转基因品种与另一 ( 非转 化的或经转化的 ) 品种杂交， 以产生新转基因品种。或者， 可以使用植物育种领域中公知的 传统回交技术将遗传性状移入另一栽培种中， 所述遗传性状已经使用前述转化技术工程化 改造入特定的向日葵栽培种中。 例如， 可以使用回交方法来将工程化改造的性状从公共的、 非良种品种移入良种品种中， 或者从在其基因组中含有外来基因的品种移入不含所述基因 的一种或多种品种中。如本文中所使用的， “杂交” 可以指简单的 XxY 杂交， 或回交过程， 这 取决于上下文。
     向日葵的组织培养可以通过自花传粉或者通过组织培养和再生来进行向日葵植物的进一步生成， 所 述向日葵植物产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 向日葵的各种组织的组 织培养和自其再生植物是已知的。例如， 通过组织培养繁殖向日葵栽培种记载于美国专利 6,998,516。
     可以通过组织培养和再生来进行品种的进一步繁殖。 大豆的各种组织的组织培养 和自其再生植物是公知且广泛公布的。例如， 可以参照美国专利 6,998,516。如此， 本发明 的另一方面是提供如下的细胞， 其在生长和分化后产生具有含低饱和脂肪和任选地高亚油 酸含量的种子的向日葵植物。
     如本文中所使用的， 术语 “组织培养物” 指包含相同或不同类型的分离的细胞的组 合物， 或者组织成植物部分的此类细胞的集合。组织培养物的例示性类型包括能产生组织 培养物且在植物或植物部分中完整的原生质体、 愈伤组织、 植物块 (plant clump)、 和植物 细胞， 诸如胚、 花粉、 花、 种子、 荚果、 叶、 茎、 根、 根尖、 花药等。 用于制备和维持植物组织培养 物的手段是本领域中公知的。 举例而言， 已经使用构成器官的组织培养物来产生再生植物。 美国专利号 5,959,185、 5,973,234、 5,977,445、 和 6,998,516 描述了某些技术。
     单基因转变的 ( 转变 ) 植物
     当术语 “向日葵植物” 在本发明的语境中使用时， 这还包括所述品种的任何单基因 转变。 如本文中所使用的， 术语 “单基因转变的植物” 指通过称作回交的植物育种技术， 或者 经由基因工程开发的那些向日葵植物， 其中除了经由回交技术转移到品种中的单基因外， 该品种的基本上所有期望的形态学和生理学特征均得到复原。 回交方法可以与本发明一起 使用以改善品种或将某种特征引入品种中。如本文中所使用的， 术语 “回交” 指杂种子代往 回与回归亲本的重复杂交 ( 即与回归亲本回交 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或更多次 )。 亲本向日葵植 物 ( 其贡献期望特征的基因 ) 称作 “非回归” 或 “供体亲本” 。此术语指在回交方案中使用非 回归亲本一次， 并且非回归亲本因此不再出现的事实。接受来自非回归亲本的一种或多种 基因转移的亲本向日葵植物称为回归亲本， 因为它在回交方案中被使用了数轮 (Poehlman 和 Sleper， 1994 ； Fehr， 1987)。在典型的回交方案中， 将感兴趣的原始品种 ( 回归亲本 ) 与 第二品种 ( 非回归亲本 ) 杂交， 所述第二品种携带要转移的感兴趣的单基因。然后将自此 杂交所得的子代再次与回归亲本杂交， 并重复该过程， 直至获得这样的向日葵植物， 即其中 除了来自非回归亲本的单转移基因外， 回归亲本的基本上所有期望的形态学和生理学特征 均得到复原。
     选择合适的回归亲本是成功回交方法的重要步骤。 回交方案的目的是改变或替换 原始品种中的单一性状或特征。为了实现这点， 对回归品种的单基因进行修饰或者用来自 非回归亲本的期望基因替换， 而保留原始品种的基本上所有剩余的期望的遗传构成， 和因 此保留基本上所有剩余的期望的生理学和形态学构成。 特定非回归亲本的选择会取决于回 交目的。主要目的之一是将一些商业上期望的、 农艺学上重要的性状添加至植物。确切的 回交方案会取决于所改变的特征或性状以确定合适的测试方案。 虽然当所转移的特征是显 性等位基因时回交方法得到简化， 但是也可以转移隐性等位基因。 在此例子中， 引入子代测 试来测定期望的特征是否已经得到成功转移可能是必要的。
     已经鉴定出许多单基因性状， 它们在新品种的开发中不会有规律地被选择， 但是 可以通过回交技术来改良。单基因性状可以是或者不是转基因的， 这些性状的例子包括但不限于雄性不育、 蜡质淀粉、 除草剂抗性、 对细菌、 真菌、 或病毒疾病的抗性、 抗虫性、 雄性能 育、 提高的营养质量、 工业应用、 产率稳定性和产率提高。 这些基因一般经由细胞核遗传。 这 些单基因性状之中的数个记载于美国专利号 5,959,185、 5,973,234 和 5,977,445。
     本发明还涉及用于产生向日葵植物的方法， 其通过将第一亲本向日葵植物与第二 亲本向日葵植物杂交来进行， 其中所述第一或第二亲本向日葵植物是产生具有低饱和脂肪 和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。此外， 第一和第二亲本向日葵植物两者都可 以来源于产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物。如此， 使用产 生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物进行的任何此类方法是本 发明的一部分 ( 例如自交、 回交、 杂种生成、 与群体杂交等 )。 使用产生具有低饱和脂肪和任 选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物作为亲本产生的所有植物在本发明的范围内， 包括 那些自从产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子的向日葵植物衍生的品种开 发的。有利地， 可以在与其它不同向日葵植物的杂交中使用所述向日葵品种以产生具有卓 越特征的第一代 (F1) 向日葵杂种种子和植物。本发明的品种也可以用于转化， 其中导入外 源基因， 并由本发明的品种进行表达。使用如下向日葵植物经由传统育种方法或者经由通 过本领域技术人员已知的许多方案之任一种转化如下向日葵植物而创建的遗传变体意图 在本发明的范围内， 所述向日葵植物产生具有低饱和脂肪和任选地高亚油酸含量的种子。 实施例 本发明在以下实施例中进行进一步描述， 所述实施例作为例示提供， 而并不意图 以任何方式限制本发明。
     实施例 1 ： 产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平 (saturate level) 的向日葵种质。表 1 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
     表1
    
    实施例 2 ： 产生具有低饱和脂肪含量和高亚油酸含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平的向日葵种 质。表 2 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
     表2
    
    实施例 3 ： 产生具有低饱和脂肪含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平的向日葵种 质。表 3 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
     表3
    
    如表 3 中可看出的， 数据表明如下的种子油， 其具有高油酸 ( ＞ 80％ ) 背景中低到 2.33％的总饱和类， NuSun(55-50％油酸 ) 背景中没有饱和类 ( ＜ 3.5％ ) 谱， 高达 95.30％ 的油酸水平 ； 低到 0.25％的硬脂酸水平， 低到 1.47％的棕榈酸水平， 和亚油酸 ( ＜ 55％油 酸 ) 背景中的低饱和类 ( ＜ 7.0％ ) 谱。
     实施例 4 ： 产生具有低饱和脂肪、 硬脂酸、 和棕榈酸含量的种子的向日葵
     已经经由正常的育种技术开发出了具有低得异乎寻常的饱和类水平的向日葵种 质。表 4 中提供了向日葵栽培种的种子含油量。
    
    如表 4 中可看出的， 此组数据包括硬脂酸 (0.23％ )、 棕榈酸 (1.37％ )、 和总饱和 油 (2.28％ ) 的低数值。实施例 5 ： 低硬脂酸和低棕榈酸的标志物开发
     如本文中所描述的， 开发了标志物开发策略。首先， 鉴定了来自靶标 QTL 区域的 标志物 ( 在 Dow AgroSciences 开发以及来自公共资源 )， 并筛选相应作图群体的亲本品 系之间的多态性。然后在作图群体中筛选了多态性标志物。对于单态 ( 未提供信息的 ) 标志物， 设计了引物以扩增其相应的基因组基因座， 并对扩增子测序以鉴定亲本品系之间 的单核苷酸多态性 (SNP)( 若有的话 )。开发了 TaqMan MGB 等位辨别测定法 (Allelic Discrimination assay) 用于鉴定出的 SNP， 并在各自的群体上定位。第二， 基于脂肪酸候 选基因的序列， 设计在内含子侧翼的引物来从亲本品系分离脂肪酸基因序列。将在序列水 平的核苷酸多态性基于其多态性性质开发成标志物， 然后在作图群体中筛选。 采用 JoinMap 3.0(Van Ooijen， 2004a) 来定位新开发的标志物， 并使用 MapQTL 5(Van Ooijen， 2004b) 来 精细定位 QTL(to fine map QTL)。
     A) 低硬脂酸的标志物开发
     SSR 标志物开发 ： 对 8 种 SSR 标志物筛选 ONN687R xH757B/LS10760B-B-17-3-23-5 作 图 群 图 的 亲 本 品 系 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 之 间 的 多 态 性， 所述 作图群体先前用于定位目标低硬脂酸 QTL。( 参见表 5。)4 种 SSR 标志物， 即 HA0442、 CRT22、 ORS565 和 ORS732 是多态性的。在 ABI 3730 测序仪上解析来自 ONN687R 和 H757B/ LS10760B-B-17-3-23-5 的 HA0442 和 CRT22 扩 增 子， 并 且 对 于 标 志 物 HA0442 分 别 为 163bp 和 165bp， 而 对 于 CRT22 分 别 为 290bp 和 261bp。 在 3 ％ Metaphor 凝 胶 上 解 析 来 自 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 的 ORS565 和 ORS732 扩增子。使用下列 PCR 引物和反应条件用 HA0442、 CRT22、 ORS565 和 ORS732 对相应作图群体 ONN687R xH757B/ LS10760B-B-17-3-23-5 进行基因型分型。
     HA0442 正向引物 ： 5’ -HEX-TGGAACTGTAAATGGACCCAAG-3’ (SEQID NO ： 1)
     HA0442 反向引物 ： 5’ -GCACTGCACCATTTATGAGAAG-3’ (SEQ IDNO ： 2)
     CRT22 正向引物 ： 5’ -HEX-TCGAGATGAAACCGAATGAAGAAA-3’ (SEQ ID NO ： 3)
     CRT22 反向引物 ： 5’ -GTTTCTTGGGACTGATATTGCCAAGTGGG-3’ (SEQ ID NO ： 4)
     ORS565 正向引物 ： 5’ -TGGTCAACGGATTTAGAGTCAA-3’ (SEQ IDNO ： 5)
     ORS565 反向引物 ： 5’ -TCCAGTTTGGTCTTGATTTGG-3’ (SEQ ID NO ： 6)
     ORS732 正向引物 ： 5’ -GCACGGAACTCCTCAAATGT-3’ (SEQ ID NO ： 7)
     ORS732 反向引物 ： 5’ -GCACGGGAAACAAAGAGTCA-3’ (SEQ ID NO ： 8)PCR 成分 ：
     4ng gDNA
     1X PCR 缓冲液 (Qiagen， Valencia， California)
     0.25μM 正向引物
     0.25μM 反向引物
     1mM MgCl2
     0.1mM 每种 dNTP
     0.4％ PVP
     0.04 个单位的 HotStar Taq DNA 聚合酶 (Qiagen， Valencia， California)
     总体积 ： 4.8μl
     温度循环仪设置 ：步骤 1 ： 94℃达 12 分钟
     步骤 2 ： 94℃达 30 秒
     步骤 3 ： 55℃达 30 秒
     步骤 4 ： 72℃达 30 秒
     步骤 5 ： 重复步骤 2、 3 和 4 达 35 个循环
     步骤 6 ： 72℃达 30 分钟
     SNP 标志物开发 ： 使用了 8 对引物来从 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 两者扩增 8 个基因组基因座以开发 SNP 标志物 ( 表 6)。基于来自限制性片段长度多态 性 (RFLP) 探 针 ZVG76、 ZVG77 和 ZVG78 的 序 列 (Kolkman 等 2007)， 设计了三个引物对 (ZVG76snpF/R、 ZVG77snpF/R、 和 ZVG78snpF/R)。HT57F/R、 HT64F/R、 HT131F/R、 HT134F/ R、 和 HT210F/R 的引物序列来自 Lai 等 (2005)。发现 SNP 在来自 HT64F/R、 HT210F/R、 和 ZVG78snpF/R 的扩增子中。将 TaqMan MGB 等位辨别测定法开发用于 HT64F/R 扩增子中的 一个 SNP 基因座和 ZVG78snpF/R 扩增子中的一个 SNP 基因座 ( 参见下文 )， 并使用开发的 TaqMan 测定法用这两种 SNP 标志物对 ONN687R x H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 作图群体 进行基因型分型。
     来 自 ONN687R 和 H757B/LS10760B-B-17-3-23-5 的 HT64F/R 扩 增 子 中 有 4 个 SNP 基因座 ( 以粗体标记 )。将 TaqMan 测定法开发用于 R- 基因座。正向引物、 反向引 物、 探 针 1 和 探 针 2 的 序 列 分 别 为 5’ -CCGGCTGCTTCTAGACCTTATAAG-3’ (SEQ ID NO ： 9)、 5’ -TCGTCGGTGGGACACACA-3’ (SEQ ID NO ： 10)、 5’ -6FAM-ACTGTTGGATCGGTTC-3’ (SEQ ID NO ： 11)、 和 5’ -VIC-CACTGTTGGATCGATT-3’ (SEQ ID NO-12)。
    TTATTCTCGGCTTCCGGTGTGATTTTACTCTCATGGTTAAGTTTTCAAGAGATTGTCGCGCTGAAAACTTTTTATATTGTTTCGGTATGATCTTGGAGTTTATAGCCTTTGTAAGGTTAAGAATGAAACACCCGGCTGC TTCTAGACCTTATAAGATACCCGTGGGCACTGTTGGATCG TCTGTGTCGTGTTGGCTCTTTCTTCACTCAAGGTCATGATCGTTAG TTCTTCTGTGTGTCCCACCGACGATTTTGA GT ATTGCCATATTTTTCGGGTTCGCATTGCAACCGTTTTTAAAGTTTGCCGAGAAGAAAAGATGGCTTAAATTTTCAACTAAAGCCGATCTTC CCG(SEQ ID NO ： 13)
     来自 ONN687R 和 H757B/LS 10760B-B-17-3-23-5 的 ZVG78snpF/R 扩增子中也有 4 个 SNP 基因座 ( 以粗体标记 )。将 TaqMan 测定法开发用于在 5’ 末端的 R- 基因座。正向 引物、 反向引物、 探针 1 和探针 2 的序列分别为 5’ -GTCCATCTTTCCTCAACGACTTG-3’ (SEQ ID NO ： 14)、 5’ -CCTAAACGCCTCGAAAAAGCT-3’ (SEQ ID NO ： 15)、 5’ -6FAM-TTACCATGTCTATAATGC3’ (SEQ ID NO ： 16)、 和 5’ -VIC-ATTACCATGTCTGTAATGC-3’ (SEQ ID NO ： 17)。
     AACTGAGTTCTGTACGCCAGAGATTTGCCCGACCATGACCGCAGGTCCAAAGTAAGTCTTGCTATTGC ACATTTGCACGATTAACGGTTTCTTATATAGAAGATACATGATTCTTGAATTTATGTAAATAAAACTTGACAGATA TGAATACCGATGGGCTGATGGTGTGCAAATCAAGAAGCCTATTGAAGTTTCGGCTCCAAAGTACGTAGAGTTCTT GATGGATTGGATTGAGTCACAATTGGATGACGAGTCCATCTTTCCTCAACGACTTGGTAATTAGTTAATTACCAT GTCT G GTATA TAATGCATCATTTAATAAAGCTTTTTCGAGGCGTTTAGGAAACTGAAATAGTAATTTTCGATT CGTGCAGGAGCGCCATTTCCCGCCAATTTTAGGGACGTTGTGAAAACGATATTTAAACGCTTGTTTCGT GCGCATATCTACCACAC CATTTTCAGAAGATTGTGAGTCTTAAAGAAGAAGCCCATC26TAAACACTTGTTTCAAGCATTTCATATTGTTTACATGTGTAA(SEQ ID NO ： 18)101945573 A CN 101945581
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    说明书23/25 页对这两种 SNP 标志物使用下列 PCR 设置。 实时 PCR 成分 ： 25ng gDNA 1X Taqman 通用 PCR 主混合物 (Master Mix) 22.5μM 正向引物 22.5μM 反向引物 5μM 探针 1 5μM 探针 2 总体积 ： 25μl B io-Rad iCycler 没置 ： 步骤 1 ： 95℃达 15 分钟 步骤 2 ： 94℃达 30 秒 步骤 3 ： 60℃达 1 分钟 步骤 4 ： 重复步骤 2 和 3 达 65 个循环 步骤 5 ： 4℃保持 (forever)Indel 标 志 物 开 发 ： 设 计 引 物 来 从 两 个 亲 本 品 系 ONN687R 和 H757B/ LS10760B-B-17-3-23-5 扩增了 32 个脂肪酸相关基因， 并进行了测序。 7 种基因具有多态性， 4 种基因具有弱扩增， 而所有其它基因是单态性的 ( 表 6)。用所有鉴定出的多态性筛选作 图群体 ONN687R xH757B/LS10760B-B-17-3-23-5。
     定位新标志物并精细定位低硬脂酸 QTL ： 使用 JoinMap 3.0(Van Ooijen， 2004a) 来定位所有新鉴定的多态性标志物。标志物 CRT22 给出显著的分离异常， 而且没有被定位。 从候选基因方法开发的 6 种标志物定位到与靶染色体 17 不同的染色体 ( 表 6)。将 7 种标 志物 HA0442、 ORS565、 HT64、 ZVG78、 KASI-2、 KASI-4、 和 ORS732 定位到染色体 17。将脂肪酸 基因 KASI-2 和 KASI-4 定位到染色体 17， 但不靠近靶标低硬脂酸 QTL( 图 1)。通过新定位 的标志物， 用 MapQTL 5((Van Ooijen， 2004b) 在 HA1875-ORS565 区间中精细定位低硬脂酸 QTL， 所述 HA1875-ORS565 区间在 LG 17 的上部端粒区中跨越 27cM。精细定位的 QTL 具有 23.2 的高 LOD 得分， 而且解释了硬脂酸含量方面 50.8％的变化。可以使用新定位的标志物 来辅助在育种程序中选择低硬脂酸。
     B) 开发和定位棕榈酸 QTL 的 indel 标志物
     在用脂肪酸基因 KASIII-2 的引物对得到的亲本品系 H280R[1]/687R-1-8-1 和 OND 163R 的扩增子序列中观察到了 SNP 和 indels( 表 6， 图 2)。用此引物对筛选作图群体 H280R[1]/687R-1-8-1x OND163R， 并在 3％ Metaphor 凝胶上解析扩增子。 作图程序 JoinMap 3.0(Van Ooijen， 2004a) 在连锁群 5 上的低棕榈酸 QTL 内部定位了这种 indel 标志物 ( 图 3)。
    
    表6： 调查的脂肪酸基因。虽然本发明已经在某些实施方案中进行了描述， 但是可以在本公开内容的精神和 范围内进一步修饰本发明。因此， 本申请意图覆盖本发明使用其一般原理的任何变型、 用 途、 或改编。 此外， 本申请意图覆盖诸如在本发明所属领域中的已知或习惯实践内和落入所 附权利要求书的限定内的对本公开内容的偏离。
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