点击化学合成具有分支结构的组蛋白去乙酰酶抑制剂 【技术领域】 ： 本发明属于生物医药技术领域， 特别涉及一种点击化学合成的具有 “分支” 结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂， 该类抑制剂可作为制备治疗心血管疾病， 免疫类 疾病和神经退行性疾病药物的应用。
【背景技术】 ： 赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化是一对可逆的蛋白质转录后修饰过 程。催化该可逆过程的两个酶分别是 HDAC( 组蛋白去乙酰化酶， histone deacetylase) 和 HAT( 组蛋白乙酰基转移酶， histone acetyltransferase)。HAT 和 HDAC 通过协同作用， 共 同决定底物蛋白的乙酰化程度， 进而调控细胞内众多的理化过程 ( 如蛋白的结合和转运， 信号传导和基因表达等 )。已知的 HDAC/HAT 的底物蛋白包括 ： 组蛋白， 微管蛋白， Hsp90 和 转录因子 ( 如 p53， NF-B， Ku70 和 Stat3) 等。其中， 组蛋白是研究的最早和最多的底物蛋 白， HDAC 和 HAT 的命名也由此而来。HDAC 和 HAT 对组蛋白的乙酰化修饰是表观遗传学中调 控基因表达的一种重要方式。
现有的临床研究和药理研究表明， HDAC 是治疗许多疾病的 ( 潜在 ) 靶点， 这些疾 病包括 ： 癌症， 心血管疾病， 免疫类疾病和神经退行性疾病等。 临床前研究表明， 组蛋白去乙 酰化酶抑制剂可选择性地杀死癌细胞， 并且和许多的抗癌药物有很好的增效作用。2006 年 十月， 由美国默克公司研发的辛二酰苯胺异羟肟酸成为了第一个获准的 HDAC 靶向药物。
我们曾发表过用点击化学合成具有 “非分支” 结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂的 方法 (Journal of Medicinal Chemistry， 2008， 7417-7427)。其相关的七个化合物的结构 如下 ：
总体而言， 这类 “非分支” 的组蛋白去乙酰化酶抑制剂分子的生物活性相对较差。
【发明内容】 ： 本发明所要解决的技术问题是提供一种新的点击化学合成的具有 “分支” 结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂， 所公开的内容包括 ： 化合物的结构， 制备方法和应 用。本发明的创新在于 ： 1) 通过引入 “分支” 结构来增强组蛋白去乙酰化酶抑制剂的生物活 性； 2) 通过使用手性氨基酸来方便地合成具有手性 “分支” 结构的组蛋白去乙酰化酶抑制 剂。
本发明提供的利用点击化学合成的具有 “分支” 结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂 ( 即母体药物分子 )， 其结构通式为 M1 ：
其中， A 是一个 C1-C6 的烷基链， R1 和 R2 包括但不局限于各种烷基， 环烷基， 杂烷 基， 杂环烷基， 链烯基， 环烯基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环炔基， 杂炔基， 环杂炔基， 芳基， 或杂芳基， R1 和 R2 可以相同也可以不同 ；
本发明包括， 通过对上述的 A、 R1 和 / 或 R2 进行取代衍生化或桥接衍生化而得到 的化合物。包括 A、 R1 和 / 或 R2 上的至少某一个氢原子被取代基替换而得到的化合物 ； 取 代基包括烷基， 环烷基， 杂烷基， 杂环烷基， 链烯基， 环烯基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环 炔基， 杂炔基， 环杂炔基， 芳基， 杂芳基， 卤素， ＝ O， ＝ S， -CF3， -OCF3， 羧基 (-COOH)， 磺酸基 (-SO3H)， 氰基 (-CN)， 羟基 (-OH)， 氨基 (-NH2)， 或硝基 (-NO2) ；
还包括在 A、 R1 和 / 或 R2 的至少某一个单键中间插入桥接基团而得到的化合物 ； 桥 接基团包括硫醚基 (-S-)， 醚基 (-O-)， 亚氨基 (-HN-)， 羰基 (-(CO)-)， 磺酰基 (-(SO2)-)， 或 亚磺酰基 (-(SO)-) ；
本发明还包括经对 A、 R1 和 / 或 R2 交替进行取代基替换和插入桥接基团而得到的 化合物。
本发明提供的结构通式 M1 的优选结构之一为通式 M2 的结构， 即通式 M1 中的 A 在 通式 M2 中被特定地选定为次甲基 CH， R2 在通式 M2 中被特定地选定为一个一取代， 二取代或 三取代的乙烯基 (R3R4C ＝ CR5)，
其中， R3， R4 和 R5 包括但不局限于氢原子， 烷基， 环烷基， 杂烷基， 杂环烷基， 链烯 基， 环烯基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环炔基， 杂炔基， 环杂炔基， 芳基， 或杂芳基， R3， R4 和 R5 可以相同也可以不同 ；
本发明包括， 通过对 R3， R4 和 / 或 R5 进行取代衍生化或桥接衍生化而得到的化合 物。包括 R3， R4 和 / 或 R5 上的至少某一个氢原子被取代基替换而得到的化合物 ； 取代基包 括烷基， 环烷基， 杂烷基， 杂环烷基， 链烯基， 环烯基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环炔基， 杂 炔基， 环杂炔基， 芳基， 杂芳基， 卤素， ＝ O， ＝ S， -CF3， -OCF3， 羧基 (-COOH)， 磺酸基 (-SO3H)， 氰基 (-CN)， 羟基 (-OH)， 氨基 (-NH2)， 或硝基 (-NO2) ；
还包括对 R3， R4 和 / 或 R5 上的至少某一个单键中间插入桥接基团而得到的化合物 ； 桥接基团包括但不局限于硫醚基 (-S-)， 醚基 (-O-)， 亚氨基 (-HN-)， 羰基 (-(CO)-)， 磺酰基 (-(SO2)-)， 或亚磺酰基 (-(SO)-) ；
本发明包括通过对 R3， R4 和 R5 交替进行取代基替换和插入桥接基团而得到的化合 物。
本发明提供的结构通式 M2 的优选结构之一是通式 M3 的结构， 即通式 M2 中的 R3 在 通式 M3 中被特定地选定为一个 ( 一取代或多取代的 ) 芳香取代基 ( 芳基或杂芳基 ) ；
其中， X1， X2， X3， X4 和 X5 是 N 或 CH， 可以相同也可以不同 ；
本发明包括， 通过对上述的 X1， X2， X3， X4 和 / 或 X5 进行取代衍生化或桥接衍生化而 得到的化合物。 包括， 当 X1， X2， X3， X4 和 / 或 X5 为 CH 时， 其上的至少某一个氢原子被取代基替 换而得到的化合物 ； 取代基包括烷基， 环烷基， 杂烷基， 杂环烷基， 链烯基， 环烯基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环炔基， 杂炔基， 环杂炔基， 芳基， 杂芳基， 卤素， ＝ O， ＝ S， -CF3， -OCF3， 羧 基 (-COOH)， 磺酸基 (-SO3H)， 氰基 (-CN)， 羟基 (-OH)， 氨基 (-NH2)， 或硝基 (-NO2) ；
还包括， 当 X1， X2， X3， X4 和 / 或 X5 为 CH 时， 在 C-H 单键中间插入桥接基团而得到 的化合物 ； 桥接基团包括硫醚基 (-S-)， 醚基 (-O-)， 亚氨基 (-HN-)， 羰基 (-(CO)-)， 磺酰基 (-(SO2)-)， 或亚磺酰基 (-(SO)-) ；
本发明包括通过对 X1， X2， X 3， X4 和 X5 交替进行取代基替换和插入桥接基团而得到 的化合物。
根据通式 M3 所述的结构， 其供参考的化合物包括但不局限于如下所示的分子 ：
本发明提供的结构通式 M4 为通式 M1 的另一优选结构， 即通式 M1 中的 R2 在通式 M4 中特定地选定为一个苯并的杂芳环，
其中， X6， X7， X8 和 X9 是 N 或 CH， 可以相同也可以不同 ； Q1 可以是 NH， S或O； Q2 可以 是 N 或 CH ；
本发明包括， 通过对 Q1， Q2， X6， X7， X8 和 / 或 X9 进行取代衍生化或桥接衍生化而 得到的化合物。包括， 当 Q1 为 NH， 及 Q2， X 6， X7， X8 和 / 或 X9 为 CH 时， 其上的至少某一个氢 原子被取代基替换而得到的化合物 ； 取代基包括烷基， 环烷基， 杂烷基， 杂环烷基， 链烯基， 环烯基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环炔基， 杂炔基， 环杂炔基， 芳基， 杂芳基， 卤素， ＝ O， ＝ S， -CF3， -OCF3， 羧基 (-COOH)， 磺酸基 (-SO3H)， 氰基 (-CN)， 羟基 (-OH)， 氨基 (-NH2)， 或硝基 (-NO2) ；
还包括， 当 Q1 为 NH， 及 Q2， X6， X7， X8 和 / 或 X9 为 CH 时， 其上的至少某一个单键中 间插入桥接基团而得到的化合物 ； 桥接基团包括硫醚基 (-S-)， 醚基 (-O-)， 亚氨基 (-HN-)， 羰基 (-(CO)-)， 磺酰基 (-(SO2)-)， 或亚磺酰基 (-(SO)-)。
本发明包括通过对 Q1， Q2， X6， X7， X8 和 X9 交替进行取代基替换和插入桥接基团而得 到的化合物。
本发明提供的具有通式 M4 结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以以手性氨基酸为 原料， 经点击化学合成得到 ( 参见实施例 1 和 2)。
根据通式 M4 所述的结构， 其可供参考的化合物包括但不局限于如下所示的分子 ：
以上所述母体药物分子在药学上可接受的各种形式 本发明还包括以上化合物所相应的药学上可接受的盐和前药， 以及医药活性代谢物， 和这些代谢物在药学上可接受的盐。 本发明还包括以上所有化合物的各种溶剂化形式， 特别是相关化合物的水合物形式。 还包括以上所有化合物通过和药学上可接受的分散剂或 载体物质相结合所得到的复合物， 包括但不局限于脂质体， 纳米颗粒， 高分子聚合物， 微乳 等。还包括以上所有化合物的前药分子， 前药是指借助于体内代谢的方式将其于体内转化 为相应的药物分子。具体包括 ：
酯基前药 ：
一种基于以上任一项所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂 ( 母体药物分子 ) 的酯基前 药设计， 该前药的结构通式如 M5 所示，
其中， R6 包括但不局限于氢原子， 烷基， 环烷基， 杂烷基， 杂环烷基， 链烯基， 环烯 基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环炔基， 杂炔基， 环杂炔基， 芳基， 或杂芳基 ；
本发明包括对 R6 进行取代衍生化或桥接衍生化而得到的化合物。具体包括 R6 的 至少某一个氢原子被取代基替换而得到的化合物 ； 取代基包括烷基， 环烷基， 杂烷基， 杂环 烷基， 链烯基， 环烯基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环炔基， 杂炔基， 环杂炔基， 芳基， 杂芳基， 卤素， ＝ O， ＝ S， -CF3， -OCF3， 羧基 (-COOH)， 磺酸基 (-SO3H)， 氰基 (-CN)， 羟基 (-OH)， 氨基 (-NH2)， 或硝基 (-NO2) ；
还包括 R6 的至少某一个单键中间插入桥接基团而得到的化合物 ； 桥接基团包括 硫醚基 (-S-)， 醚基 (-O-)， 亚氨基 (-HN-)， 羰基 (-(CO)-)， 磺酰基 (-(SO2)-)， 或亚磺酰基 (-(SO)-)。
本发明包括通过对 R6 交替进行取代基替换和插入桥接基团而得到的化合物。
糖基前药 ：
一种糖基前药分子的设计， 所涉及的糖基前药是将以上任一项所述的组蛋白去乙 酰化酶抑制剂 ( 母体药物分子 ) 作为糖苷配基而得到的糖缀分子， 在该糖缀分子中， 原母体 药物分子的羟肟酸官能团的羟基上的氢原子被糖基取代， 糖基包括但不仅限于葡萄糖， 半 乳糖， 乳糖， 麦芽糖， 蔗糖， 葡萄糖醛酸， 甘露糖， N- 乙酰基葡萄糖， N- 乙酰基半乳糖， 木糖， 或唾液酸 ；
本发明包括糖基部分的羟基上的氢原子被酰基取代而得到的化合物。
芳基前药 ：
一种基于以上任一项所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂 ( 母体药物分子 ) 的芳基前 药设计， 该前药的结构通式如 M6 所示，
其中， Ar 是一个芳基或杂芳基 ；本发明包括对 Ar 进行取代衍生化或桥接衍生化而得到的化合物。包括 Ar 的至少 某一个氢原子被取代基替换而得到的化合物 ； 取代基包括烷基， 环烷基， 杂烷基， 杂环烷基， 链烯基， 环烯基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环炔基， 杂炔基， 环杂炔基， 芳基， 杂芳基， 卤素， ＝ O， ＝ S， -CF3， -OCF3， 羧基 (-COOH)， 磺酸基 (-SO3H)， 氰基 (-CN)， 羟基 (-OH)， 氨基 (-NH2)， 或硝基 (-NO2) ；
还包括 Ar 的至少某一个单键中间插入桥接基团而得到的化合物 ； 桥接基团包括 硫醚基 (-S-)， 醚基 (-O-)， 亚氨基 (-HN-)， 羰基 (-(CO)-)， 磺酰基 (-(SO2)-)， 或亚磺酰基 (-(SO)-)。
本权利要求包括对 Ar 通过交替进行取代基替换和插入桥接基团而得到的化合 物。
Ar 的优选结构如下所示 ：
盐：
一种基于以上任一项所述的母体药物分子或前药化合物所相应的药学上可接受 的盐， 以及医药活性代谢物， 和这些代谢物在药学上可接受的盐。 所述的药学上可接受的盐 是指药物分子在能保持或部分保持原有生物活性， 并且适用于医药用途的某些盐类。
这些盐类包括三种形式 ：
一是以上所述的母体药物分子或前药化合物与某种酸 ( 这些酸包括但不局限于 ： 甲酸， 乙酸， 丙酸， 琥珀酸， 甘醇酸， 葡萄糖酸， 乳酸， 苹果酸， 酒石酸， 甘氨酸， 精氨酸， 柠檬 酸， 反丁烯二酸， 反丁烯二酸， 烷基磺酸， 芳基磺酸， 盐酸， 硫酸， 磷酸， 草酸， 丙二酸， 水杨酸， 龙胆酸等 ) 所对应的阴离子所形成的盐 ；
另一种是以上所述的母体药物分子或前药化合物与某种阳离子 ( 这些阳离子包 括但不局限于铵基， 季铵基阳离子， 锂离子， 钠离子， 钾离子， 镁离子， 钙离子， 铝离子， 锌离 子等 ) 所形成的盐 ；
第三种是以上所述的母体药物分子或前药化合物与有机胺质子化后形成的阳离 子所形成的盐， 这些有机胺包括但不局限于 ： 胆碱， 乙二醇胺， 吗啉等。
立体异构体 ：
本发明还包括以上所述的母体药物分子或前药化合物及其盐所表示的所有化合 物的各种异构形式。包括非镜像异构体， 镜像异构体， 互变异构体， 双键的 E/Z 异构体。任 何具有一定基础的化学工作者均可分离出上述光学纯或者立体异构纯的化合物。
本发明还包括以上所述的母体药物分子或前药化合物及其盐所表示的化合物的 可能消旋体或 / 和镜像异构物或 / 和非镜像异构物的混合物。
一种药物组合物， 它包含 ： 以上任一项所述的母体药物分子或前药化合物以及药 学上可接受的载体。
上述化合物的医学应用
本发明包括以上任一项所述的母体药物分子、 前药化合物、 盐、 立体异构体或组合 物作为但不局限于去组蛋白乙酰化酶抑制剂， 单独， 或者与其它药物， 稀释剂， 赋形剂和 / 或其它药物载体联合使用， 来作为制备治疗相关疾病的药物的应用。这些疾病已有许多已 知涉及或部分藉由 HDAC 活性所调节。在下一段落所列出的疾病中， 已知 HDAC 活性对于促 进使疾病发作扮演某种角色， 或者可藉由本发明的化合物加以治疗。
这些病症包括但不限于增生性病症 ( 如癌症 )， 神经变性疾病 ( 如， 亨廷顿病， 聚谷 氨酰胺病， 帕金森病， 阿尔茨海默病， 癫痈发作， 纹状体黑质变性， 进行性核上性麻痹， 扭转 张力不全， 痉挛性斜颈和运动障碍， 家族性震颤， 抽动秽语综合症， 弥漫性 Lewy 体疾病， 皮 克病， 颅内出血， 原发性侧索硬化症， 脊髓性肌肉萎缩症， 肌萎缩侧索硬化症， 肥大性间质性 多神经病， 视网膜色素变性， 遗传性视神经萎缩， 遗传性痉挛性截瘫， 进行性共济失调症和 Shy-Drager 症候群等 )， 代谢性疾病 ( 如， II 型糖尿病 )， 眼部退化疾病 ( 包括， 青光眼， 老 年黄斑变性， 虹膜红变性青光眼 )， 炎性疾病和 / 或免疫系统病症 ( 如， 类风湿关节炎， 骨性 关节炎， 青少年慢性关节炎， 移植物抗宿主病， 牛皮癣， 哮喘， 脊椎关节病， 克罗恩病， 炎性肠 病， 结肠溃疡， 酒精型肝炎， 糖尿病， Sjoegrens 综合症， 多发性硬化症， 强直性脊椎炎， 膜性 肾小球病， 椎间盘性疼痛， 全身性红斑狼疮等 )， 涉及血管新生的疾病 ( 如， 癌症， 牛皮癣， 类 风湿性关节炎等 )， 心理疾病 ( 如， 双向性神经障碍， 精神分裂症， 躁狂症， 抑郁， 痴呆等 )， 心 血管疾病 ( 如， 心力衰竭， 再狭窄， 动脉硬化等 )， 纤维化疾病 ( 如， 肝纤维化， 囊性纤维化， 血 管纤维瘤等 )， 感染性疾病 ( 如， 真菌感染， 病毒性感染， 原虫感染等 )， 造血性疾病 ( 如， 海 洋性贫血， 镰状细胞性贫血等 )。
本发明尤其是可以作为制备治疗肿瘤的药物的应用， 肿瘤类型包括但不局限于 ： 乳癌， 肺癌， 卵巢癌， 前列腺癌， 头癌， 颈癌， 直肠癌， 胃癌， 脑癌， 白血病等。
以上任一项所述的母体药物分子、 前药化合物、 盐、 立体异构体或组合物的组蛋白 去乙酰化酶抑制剂可以通过胃肠给药 ( 口服或直肠给药 )， 或非胃肠给药 ( 包括但不局限于 皮下， 肌肉， 静脉内和皮肤内等途径 )。
服给药的固体剂型包括但不局限于 ： 胶囊， 药锭， 药片， 粉末， 颗粒和微胶囊。含有 以上任一项所述的母体药物分子、 前药化合物、 盐、 立体异构体或组合物的组蛋白去乙酰化 酶抑制剂与至少一种惰性并且药学上可接受的赋形剂或载剂混合。 这些赋形剂和载剂包括 柠檬酸钠或磷酸二钙， 和/或 ： 1) 填充剂 ( 如， 淀粉， 乳糖， 蔗糖， 葡萄糖， 甘露醇和水杨酸 ) ； 2) 结合剂 ( 如， 羧甲基纤维素， 褐藻酸盐， 明胶聚乙烯吡咯烷酮， 蔗糖和阿拉伯胶 ) ； 3) 崩解 剂 ( 如， 洋菜胶， 碳酸钙， 马铃薯或树薯淀粉， 褐藻酸， 某些硅酸盐和碳酸钠 ) ； 4) 溶解延迟剂 ( 如， 石蜡 ) ； 5) 吸收加速剂 ( 如， 季铵化合物 ) ； 6) 润湿剂 ( 如， 鲸蜡醇， 单硬脂酸甘油酯 ) ； 7) 吸附剂 ( 如， 滑石粉， 硬脂酸钙， 硬脂酸镁， 固体聚乙二醇 )。固体剂型可制备成具有涂层 或外壳。
口服给药的液态剂型除了活性化合物以外， 还包括但不局限于药学上可接受的惰性稀释剂 ( 如， 水或其它溶剂 )， 稳定剂和乳化剂 ( 如， 乙基醇， 碳酸乙酯， 乙酸乙酯， 苯甲酸 醇， 苯甲酸苯甲酯， 丙二醇， 1， 3- 丁二醇， 二甲基甲酰胺， 棉籽油， 花生油， 玉米油， 胚芽油， 橄 榄油， 蓖麻油， 芝麻油， 甘油， 四氢呋喃醇， 聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯类等 )， 悬浮剂 ( 如， 乙氧化异硬脂基醇类， 聚氧乙烯山梨醇酐酯等 )， 润湿剂， 甜味剂， 香料和调香剂等。
用于直肠或阴道给予的优选组合物包括但不仅限于栓剂 ； 栓剂可由以上任一项所 述的母体药物分子、 前药化合物、 盐、 立体异构体或组合物与适当的非刺激性赋形剂或载体 混合而得。
用于局部给药的剂型包括但不局限于粉末， 贴片， 喷剂， 油膏和吸入剂。以上任一 项所述的母体药物分子、 前药化合物、 盐、 立体异构体或组合物在无菌条件下与药学上可接 受的载体和所需的任何辅剂混合而得。这些辅剂包括但不限于任何防腐剂， 缓冲剂和 / 或 混合剂等。
非肠道注射用药配方包括但不局限于药学上可以接受的无菌水剂或非水溶剂， 分 散剂， 悬浮剂或乳化剂以及使用前才配成可注射的无菌水溶液的粉针剂。
优先选择的计量范围为每公斤体重每天约 0.01-300 毫克 ； 更优选的计量范围为 每公斤体重每天约 0.2-80 毫克。也可以选择适当的计量每天多次分剂给药。 本发明所涉及的术语的含义 ：
烷基 ： 是指直链或带有直链的脂肪烃基团 ； 优先选择为 C1-C14 的烷基 ； 更优先的 选择为 C1-C10 的烷基 ； 最优先的选择为 C1-C6。实施例包括但不局限于 ： 甲基， 乙基， 正丙 基， 2- 丙基， 正丁基， 异丁基， 特丁基， 己基等。
环烷基 ： 是指饱和或部分饱和的单环、 稠环或螺环之碳环。 以 3-9 个碳原子组成的 环为优先选择。实例包括， 但不限于 ： 环丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基等。
杂烷基 ： 是指直链或含有支链烷基的基团， 并且在主链中， 至少含有一个或多个选 自 S， O 和 N 的杂原子。优先选择含有 2-14 个原子链。杂烷基包括， 但不限于 ： 醚类、 硫醚 类、 烷基酯类， 第二或第三烷基胺类、 烷基亚磺酸等。
杂环烷基 ： 是指至少含有一个选自 N， S， O 的杂原子的环烷基。优选含有 1-3 个杂 原子。优选的环为 3-14 员环， 更优先选择的环为 4-7 员环。杂环烷基包括， 但不限于 ： 吡咯 烷基、 二氢吡咯基、 四氢吡咯基、 二氢吡唑基、 哌啶基、 吗啉四氢呋喃基、 四氢硫代呋喃基、 四 氢吡喃基等。
链烯基 ： 作为一基团的一部分时是指至少含有一个碳 - 碳双键的脂肪烃基团， 可 以作为直链也可以带有支链。优先选择具有 C2-C14 的烯基。C1-C12 则更好 ； 最为优先选 择的是 C2-C6 的烯基。该基团可在其主链中含有多个双键且其构象可各自为 E 或 Z。烯基 基团的例子包括， 但不限于 ： 乙烯基、 丙烯基等。
环烯基 ： 是指环烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳双键所取代。
杂烯基 ： 是指杂烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳双键所取代。
杂环烯基 ： 是指杂环烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳双键所取代。
链炔基 ： 作为一基团的一部分时是指至少含有一个碳 - 碳三键的脂肪烃基团， 可 以作为直链也可以带有支链。优先选择具有 C2-C14 的炔基。C1-C12 则更好 ； 最为优先选 择的是 C2-C6 的炔基。该基团可在其主链中含有多个双键且其构象可各自为 E 或 Z。炔基 基团的例子包括， 但不限于 ： 乙炔基、 丙炔基等。
环炔基 ： 是指环烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳三键所取代。
杂炔基 ： 是指杂烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳三键所取代。
杂环炔基 ： 是指杂环烷基中至少某一个碳碳单键被一个碳碳三键所取代。
芳基 ： 作为一基团或一基团的部分是指 ： (1) 芳香性的单环或稠环 ： 优先选择具有 5-12 个碳原子的芳香性碳环 ( 环原子均为碳的环状构造 )。芳基的实例包括， 但不限于 ： 苯 基、 萘基 ； (2) 可以连接部分饱和的碳环， 例如 ： 苯基和 C5-7 环烷基或 C5-7 环烯基基团系互 相稠合而形成一环状结构。实例包括， 但不限于 ： 四氢萘基、 茚基或氢茚基等。芳基基团可 被一个或多个取代基取代。
杂芳基 ： 是指单环性或稠合的多环芳香杂环。优先选择含有一个或多个选自 N， O 或 / 和 S 的杂原子 5-7 员芳香环。典型的杂芳基取代基包括实例， 但不限于 ： 呋喃基， 噻吩 基， 吡咯， 吡唑， 三唑， 噻唑， 吡啶， 嘧啶， 吡嗪， 吲哚， 苯并咪唑等。
卤素 ： 氟， 氯， 溴和碘。
酰基 ： 是指 [R-CO-] 基团， R 包括烷基， 环烷基， 杂烷基， 杂环烷基， 链烯基， 环烯基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环炔基， 杂炔基， 环杂炔基， 芳基， 杂芳基。酰基的实例包括但不 局限于 ： 乙酰基、 丙酰基、 异丁酰基、 苯甲酰基等。
取代基团 ： 包 括 但 不 局 限 于 烷 基， 环 烷 基， 杂 烷 基， 杂 环 烷 基， 链 烯 基， 环烯 基， 杂烯基， 杂环烯基， 链炔基， 环炔基， 杂炔基， 环杂炔基， 芳基， 杂芳基， 卤素， ＝ O， ＝ S， -CF3， -OCF3， 羧基 (-COOH)， 磺酸基 (-SO3H)， 氰基 (-CN)， 羟基 (-OH)， 氨基 (-NH2)， 硝基 (-NO2)。
取代衍生化 ： 母体化合物的一个或多个氢原子被 “取代基团” 取代的过程。
桥接基团 ： 是指具有两个连接位点的取代基 (-A-)， 它们可以插入某一单键 X-Y 中， 形成 X-A-Y 的新结构。桥接基团包括但不局限于 ： 硫醚基 (-S-)， 醚基 (-O-)， 亚氨基 (-HN-)， 羰基 (-(CO)-)， 磺酰基 (-(SO2)-)， 亚磺酰基 (-(SO)-)。
桥接衍生化 ： 某一个取代基被桥接衍生化是指， 通过某一个或多个单键被插入 “桥 接基团” 而得到新分子结构的过程。 被插入桥接基团的单键可以位于取代基内， 或位于该取 代基与分子的其它片段的连接处。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂 ： 抑制组蛋白去乙酰化酶的 IC50 值为 100uM 或更低的化 合物。
本发明的优点和积极效果 ：
本发明提出的具有 “分支” 结构的组蛋白去乙酰化酶抑制剂， 比已有的非分支化合 物具有更好的生物活性。组蛋白去乙酰化酶是新近确立的抗癌靶点蛋白 ； 组蛋白去乙酰化 酶抑制剂也可作为制备治疗治疗心血管疾病， 免疫类疾病和神经退行性疾病药物的应用。 【具体实施方式】 ：
化学合成实例
本发明所用的合成路线和方法， 可以广泛应用于类似物的合成。下面的实施例仅 仅是用来说明所发明的具体化合物的合成方法。但在合成方法上没有任何限制。本文实施 例没有详述的化合物的合成， 只要更换合适的原始原料， 依据化学常识， 在有必要时稍微更 改一下反应条件即可， 而对于本领域技术人员， 这种化合物的合成是在其所掌握的知识范围内完全可以实现的。
反应所使用的试剂和原料主要来自但不仅限于以下供应商 ： Aldrich Chemical Company， Lancaster Synthesis Ltd 等。反应产物通是用快速层析分离得到目标化合物 (J.Org.Chem.， 1978， 43 ： 2923)。反应产物使用 1H-NMR 来确证结构 ； 通常， s 表示单峰， d表 示双峰， t 表示三重峰， m 表示多重峰， br 表示宽峰， dd 表示双重峰， dt 表示三重峰的双重 峰； 偶合常数的单位是 Hz。
合成路线一 ( 以下实施 1 的合成方法如合成路线一所示。)
实施例 1， 步骤一 ： E-(2- 甲氧乙氧甲基 ) 甲基 -3- 碘化丙烯酸酯
在含有 5g E- 碘化丙烯酸的 N， N- 二甲基甲酰酰 (DMF， 24mL) 中加入 3.8mL 的甲氧 乙氧甲基氯 (MEMCl) 和 4g K2CO3， 在室温下搅拌一个小时。反应完毕后， 加入 24mL 的水， 再 用 24mL 的乙醚萃取三次。 有机相再用水、 饱和食盐水洗涤， 用无水硫酸钠干燥。 干燥完后用 旋转蒸发仪减压蒸馏除去乙醚， 过硅胶柱 ( 展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝ 10 ∶ 1， 体积比 ) 纯化得到的产物 E-(2- 甲氧乙氧甲基 ) 甲基 -3- 碘化丙烯酸酯 3.193g， 产率为 44.2％。
步骤二 ： (2- 甲氧乙氧甲基 ) 甲基 -(2E)-5-( 三甲基硅基 ) 戊 -2- 烯 -4- 炔酸酯
在 40mL 的三乙胺中加入 3.09g 产物 E-(2- 甲氧乙氧甲基 ) 甲基 -3- 碘化丙烯酸 酯， 在氮气保护下加入 0.62g 三苯基磷钯和 0.20g 碘化亚铜催化剂， 再加入 2.5mL 三甲基硅 炔， 室温下搅拌一个小时。 反应完后， 混合物倒入 200mL 的饱和氯化铵水溶液中， 再用 100mL 的乙醚萃取三次。有机相用饱和食盐水洗涤， 再用无水硫酸钠干燥， 减压蒸馏除去乙醚， 过硅胶柱 ( 展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝ 20 ∶ 1) 纯化， 得到 2.180g 的淡黄色油状液体 (2- 甲氧乙氧甲基 ) 甲基 -(2E)-5-( 三甲基硅基 ) 戊 -2- 烯 -4- 炔酸酯， 产率为 78.9％。
步骤三 ： E-5-( 三甲基硅基 ) 戊 -2- 烯 -4- 炔酸
在 105mL 四氢呋喃中加入 2.12g(2- 甲氧乙氧甲基 )- 甲基 -(2E)-5-( 三甲基硅
基 ) 戊 -2- 炔 -4- 烯酸酯和 8.3mL 3mol/L 的盐酸， 室温下搅拌三天， 用 TLC(5％的甲醇二氯 甲烷溶液， 产品点的 Rf 值为 0.1 左右 ) 点板检测反应程度。反应完后， 减压蒸馏除去四氢 呋喃。再加入 200mL 水中， 用 100mL 二氯四烷萃取三次。有机相再用饱和食盐水洗涤， 用无 水硫酸钠干燥。减压蒸馏得到 1.40g 橙红色固体 E-5-( 三甲基硅基 ) 戊 -2- 烯 -4- 炔酸， 产率为 95％。
步骤四 ： E-N-( 对甲氧基苄基氧 )-5-( 三甲基硅基 ) 戊 -2- 烯 -4- 炔胺
将 168mg E-5-( 三 甲 基 硅 基 ) 戊 -2- 烯 -4- 炔 酸 溶 于 3mL 二 氯 甲 烷 中， 再加 入 0.13mL 草酰氯和痕量的 DMF， 室温下搅拌一个小时， 反应完后， 减压蒸馏得到橙红色 的糖浆。然后加入 4mL 二氯甲烷， 冷却到 0 ℃， 这为溶液 A。在另一个锥形瓶 B 中， 加入 285mgH2NOPMB·HCl、 0.51mL 二异丙基乙胺 (DIPEA) 和 10mL 二氯甲烷， 并冷却到 0℃。A 溶 液缓慢加入到 B 溶液中， 在 0℃下搅拌反应半个小时。反应完后， 加入冰冷的 20mL 0.1mol/ L 盐酸溶液和 20mL 二氯甲烷。有机相用 20mL 0.1mol/L 盐酸溶液萃取两次， 再用无水硫酸 钠干燥， 减压蒸馏除去二氯甲烷。 粗产品过硅胶柱 ( 展开剂 石油醚∶乙酸乙酯＝ 5 ∶ 1， 体 积比 ) 纯化得到白色油状液体 253mg， 产率 84％。
步骤五 ： E-1- 苯基 -1- 烯 3- 庚醇
在含有 30mL 乙醚的干燥圆底烧瓶中加入 1mL 肉桂醛 (7.9mmol)， 氮气保护并在冰 浴条件下滴加 10mL 正丁基锂的四氢呋喃溶液 (1.6M)， 反应液立即从无色变为深红色。 搅拌 下反应过夜。第二天在冰浴条件下， 滴加 30mL 饱和氯化铵溶液， 反应液由深红色变为黄色。 用分液漏斗分液。上层为乙醚层， 下层为水层， 水层用 50mL 乙醚萃取两次。乙醚层用无水 硫酸钠干燥， 减压蒸馏除去乙醚， 并用硅胶柱 ( 展开剂 石油醚∶乙酸乙酯＝ 20 ∶ 1) 纯化 产物。得到 1.38g 淡黄色液体， 产率为 92.0％。
步骤六 ： E-1- 苯基 -3- 叠氮 -1- 庚烯
在含有 10mL 干燥甲苯的圆底烧瓶中加入 380mg(2mmol) 的 E-1- 苯基 -1- 烯 -3- 庚 醇和 0.65mL(3mmol) 的 DPPA。在冰浴条件下加入 0.45mL(3mmol) 的 DBU。冰浴下搅拌两个 小时， 然后在室温下反应过夜。第二天用 TLC 板检测反应完全。将反应液倒入 50mL 水中， 并用 50mL 乙酸乙酯萃取三次。减压蒸馏除去乙酸乙酯， 过硅胶柱 ( 展开剂纯石油醚， 体积 比 ) 纯化产物， 得到 350mg 淡黄色液体， 产率为 81.4％。
步骤七： (E)-N-(4-methoxybenzyloxy)3-(1-((E)-1-phenylhept-1-en-3-yl)-1 H-1， 2， 3-triazol-4-yl)acrylamide
在含有 10mL 四氢呋喃和 10mL 甲醇的圆底烧瓶中加入 287mg(1mmol) 的 E-N-( 对甲 氧基苄基氧 )-5-( 三甲基硅基 ) 戊 -2- 烯 -4- 炔胺和 182mg(1.2mmol) 的氟化铯。通过点 TLC 板来检测反应的程度。脱掉 TMS 的中间体的极性比 E 的更强。完全反应后， 减压蒸馏除 去溶剂。加入 100mL 的饱和食盐水中， 再用 100mL 的二氯甲烷萃取三次。混合的二氯甲烷 用无水硫酸钠干燥， 然后减压蒸馏除去二氯甲烷。得到的白色固体溶于 20mL 四氢呋喃中， 在这个溶液中， 顺序加入 280mg(1.3mmol) 叠氮化合物、 350mg(1mmol) 催化剂 P(OEt)3CuI 和 0.33mL(2mmol) 的二异丙基乙胺。在室温下搅拌， 反应过夜， 并用 TLC 板检验反应完全。减 压蒸馏除去溶剂， 残余的固体用 100mL 的二氯甲烷和 100mL 1％的硫酸铜溶液分离。 水相再 用 100mL 的二氯甲烷萃取两次。混合的二氯甲烷用无水硫酸钠干燥， 然后减压蒸馏除去二 氯甲烷， 过硅胶柱 ( 展开剂 ： 甲醇∶二氯甲烷＝ 1 ∶ 100， 体积比 ) 纯化产物， 得到 315mg 白色固体， 产率 73.4％。
步骤八 ： (E)-N-(4-methoxybenzyloxy)-3-(1-((E)-1-phenylhept-1-en-3-yl)-1 H-1， 2， 3-triazol-4-yl)acrylamide
在含有 20mL 二氯甲烷的圆底烧瓶中， 顺序加入 200mg(0.47mmol) 的 P、 1mL( 二 氯甲烷体积的 5 ％ ) 的三氟乙酸和 0.3mL(1.5mmol) 的三异丙基硅烷。混合物在室温下 搅拌， 并用 TLC 板检测反应的程度。反应完全后， 将反应混合物溶于 50mL 乙腈中， 并用 DOWEXMARATHONE WBA 阴离子交换树脂中和。 树脂用 25mL 的乙腈洗涤两次。 混合的乙腈减压 蒸馏得到固体。用 C-18 反相柱 ( 展开剂 水∶乙腈＝ 5 ∶ 1 ～ 1 ∶ 1， 体积比 ) 纯化产物 得到白色的固体 70mg， 产率 46.4％。 1H NMR(400Hz， DMSO-d6) ： δ10.81(s， 1H)， 9.06(s， 1H)， 8.49(s， 1H)， 7.48-7.26(m， 6H)， 6.66-6.53(m， 3H)， 5.33(q， J ＝ 7.0Hz， 1H)， 2.10-2.00(m， 2H)， 1.32-1.10(m， 4H)， 0.85(t， J ＝ 7.0Hz， 3H)。
合成路线二 ( 以下实施例 2 采用的合成方法如合成路线二所示。)
实施例 2， 步骤一 ： 合成化合物 D3
EDC 的盐酸盐 (287 mg， 1.5mmol)， 2- 氨基苯酚 D1(131mg， 1.2mmol)， HOBt(270mg， 2.0mmol) 和 D2(217mg， 1mmol) 于 室 温 下 加 入 到 5ml DMF 溶 剂 中， 然后加入三乙基胺 (144μl， 1.0mmol). 反应在室温下搅拌 1 小时 .。反应的混合物中加入 25mL 乙酸乙酯， 然 后用 25ml 1M 的盐酸溶液， 25mL 饱和碳酸氢钠溶液， 和 25mL 饱和氯化钠水溶液依次洗涤。 有机相溶液用无水硫酸镁干燥后， 减压蒸除溶剂。 所得粗产物使用硅胶柱分离 ( 流动相 ： 石 油醚 / 乙酸乙酯＝ 5/1)， 得到黄色固体产品 D3 275mg( 分离产率 90％ )。
步骤二 ： 合成化合物 D4
在 室 温 下， 将 酰 胺 D3(100mg)， 三 苯 基 磷 (206mg， 0.79mmol) 和 4A 分 子 筛 (4g/ mmolD3) 溶 于 4mL 四 氢 呋 喃， 搅 拌 1 小 时， 然 后 温 度 降 低 至 0 ℃， 并 滴 加 DIAD(0.16ml， 0.79mmol) 的四氢呋喃 (1ml) 溶液。反应液的温度逐渐升至室温， 并继续搅拌 8 个小时。减 压旋蒸除去溶剂， 然后加入乙醚 (5ml)， 并在室温下搅拌 1 小时。过滤， 蒸除溶剂， 使用硅胶 柱分离 ( 流动相 ： 石油醚 / 乙酸乙酯＝ 15/1) 得到白色固体 D4 79mg， 分离产率 74％。
步骤三 ： 合成化合物 D5
将 D4(290mg， 1mmol) 的二氯甲烷 (10mL) 溶液冷却至 0℃， 加入催化量的三氟乙酸，
让温度逐渐升至室温， 持续搅拌直至原料 D4 消失。然后， 反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。 所得到的有机相溶液待用。
在另一个反应瓶中， 加入刚制备的 TfN3(3mmol) 试剂的二氯甲烷 (10mL) 溶液和催 化量的硫酸铜固体和碳酸钠溶液。 将前述的有机溶液加入。 在加入甲醇， 直至水相和有机相 互相融合为一相溶液。在室温下搅拌过夜。于减压下旋蒸除去溶剂， 然后加入 30mL 的二氯 甲烷溶剂， 并用水 (30mLX3) 洗涤， 干燥后减压下旋蒸除去溶剂， 使用硅胶柱分离 ( 流动相 ： 石油醚 / 乙醚＝ 20/1) 得到无色液体 D5 165mg， 分离产率 80％。
步骤四 ： 合成化合物 D7
白 色 固 体 D6(1mmol) 溶 于 20mL 四 氢 呋 喃 中， 在 这 个 溶 液 中， 顺序加入 188mg(1.3mmol) 叠氮化合物 D6、 350mg(1mmol) 催化剂 P(OEt)3CuI 和 0.33mL(2mmol) 的二 异丙基乙胺。 在室温下搅拌， 反应过夜， 并用 TLC 板检验反应完全。 减压蒸馏除去溶剂， 残余 的固体用 100mL 的二氯甲烷和 100mL 1％的硫酸铜溶液分离。水相再用 100mL 的二氯甲烷 萃取两次。混合的二氯甲烷用无水硫酸钠干燥， 然后减压蒸馏除去二氯甲烷， 过硅胶柱 ( 展 开剂 ： 甲醇∶二氯甲烷＝ 1 ∶ 100) 纯化产物， 得到 325mg 白色固体 D7， 分离产率 72％。
步骤五 ： 合成化合物 D8
在含有 20mL 二氯甲烷的圆底烧瓶中， 顺序加入 200mg D7、 1mL( 二氯甲烷体积的 5％ ) 的三氟乙酸和 0.3mL 的三异丙基硅烷。混合物在室温下搅拌， 并用 TLC 板检测反应 的程度。反应完全后， 将反应混合物溶于 50mL 乙腈中， 并用 DOWEX MARATHONE WBA 阴离子 交换树脂中和。树脂用 25 mL 的乙腈洗涤两次。混合的乙腈减压蒸馏得到固体。用 C-18 反相柱 ( 展开剂 水∶乙腈＝ 5 ∶ 1 ～ 1 ∶∶ 1) 纯化产物得到白色的固体 120mg。1H NMR(400Hz， DMSO-d6) ： δ10.8(s， 1H)， 9.5(s， 1H)， 8.65(s， 1H)， 7.8-7.6(m， 2H)， 7.5-7.2(m， 3H)， 6.54(d， J ＝ 15.6Hz)， 6.10(d， J ＝ 7.0Hz， 1H)， 2.92(m， 1H)， 1.03(d， J ＝ 6.8Hz， 3H)， 0.87(d， J ＝ 6.8Hz， 3H)。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂的生物活性测试方法
组蛋白去乙酰基酶活性测定
酶 活 测 定 可 用 BIOMOL 公 司 的 HDACi 测 试 试 剂 盒 进 行 测 试 ( 参 见 Journal of Medicinal Chemistry， 2008， 7417-7427.)。实验于 96 孔板上进行。实验设置包括空白对 照， 阴性对照， 阳性对照和化合物 5 个剂量组 (100nM， 200nM， 500nM， 1.0uM 和 10uM)。 实验测 定分两个阶段进行。 在第一阶段的反应液包括 ： HDAC 酶溶液 (15uL， 1U)， 组蛋白去乙酰化酶 抑制剂溶液 (10uL) 和 HDAC 酶的荧光多肽底物融液 (25uL)。这三个溶液都是 Tris 的缓冲 溶液 ( 包含 50mM Tris pH 8.0， 137mM 氯化钠， 2.7mM 氯化钾， 1mM 氯化镁和 1mg/mL 的 BSA)。 该反应液在 30℃进行反应 45 分钟。在第二阶段， 首先加入试剂盒中的 “developer” 溶液 50uL， 然后在室温下反应 30 分钟， 然后在读板机上读取荧光数据 ( 吸收光 ： 350nm， 发射光 ： 450nm)。使用分析软件 Prism 4.0 自一系列数据中得到 IC50 值。
抑制肿瘤细 GI50 值的测定
药物抑制肿瘤细胞生长的 GI50 值的测定 ：
1 将用于筛选的肿瘤细胞系用 RPMI1640 培养基加 5％胎牛血清和 2mM L- 谷氨酰 胺培养。
2 将不同细胞系按照每孔 5000-40000 个细胞分别接种至 96 孔板， 并将 96 孔板置于 37° C， 5％ CO2， 和 100％相对湿度下培养 24 小时。
3 从接种有不同细胞系的 96 孔板中各取其一， 并将细胞固定、 染色、 测量光吸收值 Tz， ( 具体步骤见后 )。
4 将待测药物以不同浓度加入各孔中， 在 37℃， 5％ CO2， 和 100％相对湿度下培养 48 小时。
5 每孔中加入冷的 TCA 溶液 ( 对于贴壁细胞， TCA 终浓度为 10 ％， 悬浮细胞为 16％ )， 4℃固定 1 小时。弃去孔中液体， 水洗 5 次后晾干。
6 每孔中加入 0.4％ SRB 溶液 ( 含 1％乙酸 )， 室温染色 10 分钟。用 1％乙酸溶液 洗 5 次， 洗去未结合的染料并晾干。
7 用未缓冲的 10mM Tris 溶液溶解结合的染料， 测量每孔在 515nm 波长下的光吸收 值， 设对照组值为 C， 实验组值为 Ti。
按照 GI50 ＝ [(Ti-Tz)/(C-Tz)]x100％的公式计算 GI50 值。22