链亲和素/SCD40L融合蛋白.pdf

链亲和素 /sCD40L 融合蛋白
    技术领域 本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域， 具体涉及来源于动物的多肽， 特别是 CD40 配体。
     背景技术 CD40L/CD40 在细胞和体液免疫中都发挥重要作用。作为免疫细胞激活的共刺激 分子， CD40L 参与机体抗肿瘤的免疫应答。CD40 配体 (CD40 ligand， CD40L) 又称 CD154， 属 于肿瘤坏死因子超家族成员的 II 型跨膜糖蛋白， 主要表达于 CD4+T 细胞， 激活的 B 细胞和 血小板也表达一部份， 可与 B 细胞表面 CD40 结合。其结果， 一方面刺激 B 细胞分泌 IL-4， 后者与 IL-R 结合诱导 B 细胞表达 B7-1/B7-2 ； 另一方面直接诱导 B7-1/B7-2 表达。B7-1/ B7-2 与 T 细胞表面的 CD28/CTLA-24 分子结合， 对 T 细胞活化提供第二信号。 另外， CD40L 也 可以通过促进 DC 细胞的成熟和分泌多种细胞因子从而增强机体的抗肿瘤免疫反应。很多 肿瘤细胞表面表达 CD40， 通过与 CD40 的结合， 可以直接抑制肿瘤细胞的生长， 促进其凋亡。 因此， CD40L 具有抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用。CD40L 基因用来修饰肿瘤细胞， 制备 肿瘤细胞疫苗， 以增强肿瘤抗原的免疫原性。通过原位基因转染 ( 或转导 ) 在肿瘤病灶局 部实现 CD40L 持续有效表达的治疗策略， 已在表浅膀胱癌的临床前研究中显示出诱人的前 景。 但是， 用基因修饰法制备肿瘤细胞疫苗存在如下固有缺陷 ： 修饰效率一般都较低 ( 尤其 是原位基因转染或转导 )， 并取决于肿瘤细胞类型 ； 因影响因素较多， 致使治疗基因的蛋白 质表达产物的有效浓度在局部难于达到并较长时间地维持， 从而实际抗肿瘤的临床效果非 常有限 ； 因个体差异和获得肿瘤标本时肿瘤细胞的成活状态不一致， 往往有些病人因无法 提供成活状态较好的肿瘤细胞， 最终不能制成自体肿瘤细胞疫苗 ； 往往有潜在的病毒载体 安全性问题 ( 所谓 “遗传毒性” ) 和免疫原性问题 ( 反复使用同一病毒载体会影响导入基因 的表达效率 ) ； 很难同时高效表达多个具有协同作用的免疫刺激因子， 并对它们的表达量 进行精确控制。 此外， 基因修饰的自体肿瘤细胞疫苗制备比较费时， 不易大规模开展和广泛 使用。
     发明内容
     本发明要解决的技术问题是提供一种可以对肿瘤细胞进行快速表面修饰并能够 永久地锚定在肿瘤细胞表面的新型 CD40L。
     本发明解决上述技术问题的技术方案是 ：
     一种融合蛋白， 该蛋白由接头肽连接链亲和素和 CD40L 构成， 其中所述的接头肽 的氨基酸序列为 Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Glu Phe。
     本发明融合蛋白中的链亲和素位于接头肽的 N 端 ； 本发明融合蛋白可通过将链亲 和素基因、 CD40L 基因以及连接所述的链亲和素和 CD40L 的接头多核苷酸通过基因重组、 转 化构建工程菌表达获得， 其中基因重组和转化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。 为了便于融合蛋白的分离纯化， 本发明所述的融合蛋白的链亲和素部分的末端还 可以连接有纯化标签， 本发明融合蛋链亲和素的 N 端连有组氨酸标签。
     本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的多核苷酸， 该多核苷酸由成熟链亲和素 cDNA、 可溶 CD40L cDNA 通过 ACG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGGGGC GGA TCC GGC GAA TCC 连接而成 ； 该多核苷酸中成熟链亲和素 cDNA 的末端还可以连接有 CAT CAT CAC CAT CAC CAT。
     将所述的编码本发明融合蛋白的多核苷酸通过基因重组插入到原核表达载体 中， 然后转化大肠杆菌可获得高效表达本发明融合蛋白的工程菌 ； 所述的原核表达载体是 pET24a， 大肠杆菌为 BL21(DE3)。
     本发明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵体的形式存在， 从包涵体中分离纯化 蛋白并复性处理后， 即可获得本发明融合蛋白。
     本发明融合蛋白采用富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽连接 CD40L 和链亲和素， 此 18 肽非常灵活， 有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠， 从而保存各自的生物活性， 使融合蛋白具有链亲和素和 CD40L 的双重活性， 可通过链亲和素与生物素的强力结合将 CD40L 锚定在生物素化的肿瘤细胞表面， 且能在 γ 射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在， 并仍 保持 CD40L 的活性。
     本发明融合蛋白具有双功能， 一方面可以锚定于生物素化的组织局部发挥抗肿瘤 作用， 另一方面可以将融合蛋白锚定于生物素化的灭活肿瘤细胞表面制备 CD40L 膜修饰的 肿瘤疫苗可用于制备预防性和治疗性肿瘤的疫苗。 本发明所述的肿瘤疫苗是将本发明融合 蛋白锚定在生物素化的肿瘤细胞表面获得的。
     本发明所述的肿瘤疫苗的制备充分利用了蛋白质的氨基 ( 即 -NH2) 易生物素化以 及生物素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性， 先用生物素化试剂将生 物素化学交联到欲修饰的肿瘤细胞表面， 然后本发明融合蛋白借助链亲和素与生物素的特 异结合将 CD40L 迅速永久地锚定在肿瘤细胞表面， 从而使 CD40L 在局部达到持续有效的治 疗浓度 ； 再者， 由于一个链亲和素蛋白可结合四个生物素， 因此本发明融合蛋白锚定到肿瘤 细胞的量是可以精确控制的。
     附图说明 图 1 是 6His-SA-L-CD40L-pET24a 重组质粒的结构图。
     图 2 是融合蛋白 6His-SA-L-CD40L 的 SDS-PAGE 电泳图， 其中 1 是分子量标准， 2是 工程菌诱导前， 3 是工程菌诱导后， 4 是包涵体， 5 是 Ni-NTA 柱层析后， 6 是复性后的融合蛋 白， 7 是应用抗 CD40L 抗体进行的 Western blotting 鉴定。
     图 3 是用抗 CD40L 单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化 的 MB49 表面上本发明融合蛋白进行检测的结果， 左峰为未修饰的细胞 ( 阴性对照 )， 而右峰 为本发明融合蛋白锚定修饰的细胞。
     图 4 是用小鼠 B 细胞增殖 MTT 法对融合蛋白的 CD40L 进行生物活性测定的结果， 以 CD40L 标准品作为阳性对照。
     图 5 是本发明融合蛋白治疗表浅性膀胱癌模型的小鼠存活情况曲线图， 以 SA-GFP
     融合蛋白、 CD40L 和 PBS 作为对照。
     图 6 是 SA-sCD40L 融合蛋白锚定于生物素化膀胱粘膜的免疫组织化学检测， 以未 生物素化的小鼠膀胱作为对照。
     图 7 是对各组小鼠进行的 CD4、 CD8 肿瘤浸润淋巴细胞的检测。
     下面将通过实施例进一步说明本发明以及本发明具有的技术效果。 具体实施方式
     下述实施例和实验所用的材料及设备如下 ：
     细 胞 株、 菌株与质粒： MB49 细 胞 ( 鼠 膀 胱 癌 细 胞 株 ) ； 菌 株 Streptomyces avidinii( 亲 和 素 链 霉 菌， ATCC)， DH5α 和 BL21(DE3) ； 原 核 表 达 质 粒 pET24a(Kanar， Novagen)。
     主要生化试剂及材料 ： DNeasy 组织试剂盒和质粒 DNA 的制备试剂盒 (Qiagen)， 寡 核苷酸的合成 (Sigma)， Trizol， SuperScript II 逆转录酶， Platinum Pfx DNA 聚合酶和 T4 DNA 连接酶 (Invitrogen) ； CD40L 标准品 (PEPROTECH)， 琼脂糖和 SDS-PAGE(Biorad) ； 2-Iminobiotin(Sigma) 和 Ni-NTA(Qiagen) 填 料 ； Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce) 和 抗 CD40L 抗体 (BD Biosciences Pharmingen)。
     DNA 片段的连接、 转化及转化子筛选， 限制性内切酶分析， SDS- 聚丙烯酰胺凝胶点 泳等常规方法均参照文献 (Sambrook J， et al.Molecular Cloning-A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York， 2nd edition， 1989) 或厂家提供的产 品说明书 ； DNA 序列分析在大连宝生物工程公司的 DNA 测序服务中心完成。
     例 1 融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L 的制备
     1、 用 DNeasy 组织试剂盒从亲和素链霉菌抽提出细菌的基因组 DNA， 然后用其作为 模板， 通过 Platinum pfx DNA 聚合酶进行 PCR 制备成熟链亲和素 cDNA。
     引物 ：
     5’ GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGG3’ (55nt) 和
     5’ GGAATTCGCCGGATCCGCCCCCGCCGCTGCCTCCGCCCCCGCTGCCCCCGCTCGTCTGCTGAACGGC GTCGAGCGGGTTGCC 3’ (82nt)。
     反应条件 ： 变性 94℃， 2min， 循环 (94℃， 15s → 60℃， 15s → 68℃， 30s)25 轮， 最后 68℃， 5min。
     2、 用 Trizol 抽提起 ConA 活化的小鼠脾细胞的总 RNA， 并以其作为模板， 进行 RT-PCR 制备可溶 CD40L 的 cDNA。
     引物 ： 5’ GGAATTCATGCAAAGAGGTGATGAGGA3’ (27nt) 和
     5’ CCTCGAGTCAGAGTTTGAGTAAGCCAA3’ (27nt)
     反应条件 ： 变性 94℃， 2min， 循环 (94℃， 15s → 60℃， 15s → 68℃， 30s)25 轮， 最后 68℃， 5min。
     3、 构建 6His-SA-L-sCD40L-pET24 重组质粒
     制备的 CD40LcDNA( 含终止码， 两端分别含 EcoRI 和 XhoI 限制性内切酶位点 ) 和 SAcDNA( 不含终止码， 两端分别含 NdeI 和 EcoRI 限制性内切酶位点 )， 将上述 CD40L 和 SA 基因片段克隆于 pET-24 载体中， 获得 6His-SA-L-sCD40L-pET24 重组表达质粒 ( 结构图如图 1 所示 )。其中 L 为富含甘氨酸、 丝氨酸的连接肽 (18 肽 )。重组表达质粒经 DNA 序列分 析鉴定， 验证其正确无误。
     4、 构建 6His-SA-L-sCD40L-pET24/BL21(DE3) 工程菌
     6His-SA-L-sCD40L-pET24 重组表达质粒转化后 BL21(DE3) 感受态细胞后， 用含卡 那霉素的 LB 平皿筛选。 挑取转化平皿上的单菌落接种于加有卡那霉素 (50μg/ml) 的 LB 培 养基中。经 37℃摇床培养扩增至吸光度 A600 为 0.4 ～ 0.5 时， 加入终浓度为 0.1mmol/L 的 IPTG， 37℃诱导表达 4h， 离心 (8000g×10min) 收获菌体， 将细胞破碎后用 12％的 SDS-PAGE 检测分析融合蛋白的表达情况。
     5、 融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L 的表达
     融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L 在菌体中主要以包涵体的形式存在， 其表达量达 15-20％。
     6、 从包涵体中获得融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L
     a. 制备包涵体 ： 5 克菌体悬于 100ml 1×PBS 中， 冰浴中超声 ( 电流 270mA)， 30 秒 ×10 次 ( 每 次 间 隔 30 秒 ) ； 接 着 于 4 ℃ 离 心 10 分 钟 (8000g)， 将 沉 淀 悬 浮 于 100ml 1×PBS( 内含 4mol/L 尿素， 0.5 ％ Triton X-100， 20mmol/L EDTA) 中进行漂洗， 随后离心 (1000g×10 分钟 ) 收集沉淀 ； 漂洗两次后， 溶于 100mmol/L 磷酸钠缓冲液， 8mol/L 尿素 (pH 8.0) 中， 15000g×15 分钟， 取上清液。 b.Ni-NTA 柱层析 ： 将步骤 a 得到的上清液上样于 Ni-NTA 柱 (2.6×5cm)， 用平衡液 (100mmol/L 磷酸钠缓冲液， 8mol/L 尿素， pH8.0) 进行冲洗至样品 A280 恢复至基线 ； 然后用洗 脱液 (100mmol/L 磷酸钠缓冲液， 8mol/L 尿素， pH4.5) 进行洗脱， 洗脱液经 SDS-PAGE 鉴定， 收集融合蛋白质峰 ( 融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L 的分子量为 33.7KD)。
     c. 透析复性 ： 将 Ni-NTA 柱层析纯化获得的 6His-SA-L-sCD40L 融合蛋白调至 OD280 ＝ 0.2， 在大于 20 倍体积的透析液 (100mmol/L NaHCO3， 4.0mol/L 尿素， 1mmol/L 还原型谷 胱苷肽， 0.2mmol/L 氧化型谷胱苷肽， 0.3mol/L 精氨酸， pH 10.0) 中 4℃透析复性 12 小时， 逐渐降低尿素浓度 ； 然后在 50mmol/LNaHCO3， 500mmol/LNaCl， pH 11 中继续透析 6 小时 ； 离 心除去不溶物， 收集上清。
     d.2-Iminobiotin 亲 和 柱 层 析 ： 用 平 衡 液 (50mmol/LNaHCO3， 500mmol/LNaCl， pH 11) 洗脱 5 个柱体积后 ( 柱体积 0.5×2cm)， 将收集的已复性融合蛋白质液上亲和层析柱， 并用平衡液洗脱至样品 A280 恢复至基线 ； 然后， 用 50mmol/LNaAc， pH4.0 洗脱， 分管收集各洗 脱峰， 并用 10x 平衡液 (500mmol/L NaHCO3， 5mol/L NaCl， pH 11) 将收集的融合蛋白质液调 至 pH8.0， 并过滤除菌分装， 储存于 -20℃。
     所得融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L 用 SDS-PAGE 鉴定， 结果如图 3 所示。
     例 2 本发明融合蛋白对肿瘤细胞的修饰效果及其稳定性检测
     用抗 CD40L 抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的 MB49 细胞 表面上的 6His-SA-L-sCD40L 融合蛋白进行检测， 结果见图 4， 几乎 100 ％的肿瘤细胞被修 饰， 且肿瘤细胞表面有大量的 CD40L。对锚定在肿瘤细胞表面的 6His-SA-L-sCD40L 融合蛋 白的稳定性经流式细胞仪进行分析表明， 在一周内这些锚定的融合蛋白在细胞表面的数量 无显著下降。
     例 3 本发明融合蛋白进行 CD40L 生物活性的测定
     利用 CD40L 和 IL4 共同刺激小鼠 B 细胞对融合蛋白进行体外活性测定。制备 C57 小鼠脾细胞悬液。 应用 Ficoll 液密度梯度离心分离单个核细胞， 应用尼龙毛柱分离 B 细胞。 5 96 孔板每孔加入 1×10 的 B 细胞和 10ng/ml 的 IL4， 然后加入不同浓度的 SA-CD40L 融合蛋 白， 同时应用 CD40L 标准品作为对照， 每个浓度设立三个复孔。37℃、 5％ CO2 培养 72 小时。 在培养结束前 4 小时， 每孔加入 5mg/ml 的 MTT 20μl， 继续培养 4 小时， 离心后去除上清， 每 孔加入 100μl 的 DMSO， 测定 OD570nm 的吸光度。结果如图所示， 融合蛋白能够促进小鼠 B 细胞的增殖， 且成剂量依赖关系。与 CD40L 标准品相比， 融合蛋白的生物学活性有所升高。
     例 46His-SA-L-sCD40L 融合蛋白修饰的肿瘤疫苗的制备
     将 107 个 MB49 细 胞 悬 浮 在 1ml 1×PBS 中， 加 入 0.5mg Sulfo-NHS-LC-Biotin 并 混 匀 后， 室 温 下 作 用 30 分 钟 ； 用 1×PBS 洗 涤 细 胞 3 次 后， 每 106 个 MB49 细 胞 加 入 200ng6His-SA-L-sCD40L 融合蛋白， 冰上作用 30 分钟 ； 1×PBS 洗涤细胞 1 次后， 然后用 γ 射线灭活 (20000rad) 即可。
     例 5 本发明融合蛋白治疗小鼠表浅膀胱癌的效果。
     (1) 材料 ： C57 小鼠、 MB49 细胞、 SA-GFP( 即绿色荧光蛋白和链亲和素的融合蛋白 )
     (2) 方法 建立小鼠表浅膀胱癌模型， 攻击所用 MB49 细胞数量为 1×106， 攻击后第三天， 开始 治疗。腹腔注射麻醉小鼠， 膀胱插管， 灌注 100μl 1mg/ml 活化生物素， 保留 30 分钟， 然后 应用 PBS 冲洗 3 遍， 灌注 0.15mg/ml 的 SA-CD40L 治疗， 同时应用 SA-GFP 或 CD40L 为实验对 照， PBS 为阴性对照， 保留 1 小时。治疗每周 2 次， 共治疗 3 周。然后观察肿瘤的生长情况 和小鼠的存活情况。在最后一次灌注治疗后 7 天， 进行各组 CD4、 CD8 肿瘤浸润淋巴细胞的 检测。
     (3) 结果
     如图 5 所示， 本发明融合蛋白治疗组的生存数及生存期显著高于阴性对照组。并 且实验组小鼠肿瘤浸润 CD4、 CD8 淋巴细胞明显升高 ( 图 7)。
     例 6 本发明融合蛋白锚定于生物素化小鼠膀胱的代谢时间检测
     (1) 方法
     小鼠麻醉后给予膀胱插管， 灌注 100μl 1mg/ml 活化生物素， 保留 30 分钟， 然后应 用 PBS 冲洗 3 遍， 灌注 0.15mg/ml 的 SA-CD40L 融合蛋白， 设立未生物素化的小鼠膀胱作为 对照。分别在第 2、 4、 6 天处死小鼠摘取膀胱， 进行冰冻切片， 应用抗 CD40L 抗体进行免疫组 织化学检测。
     (2) 结果
     如图 6 所示， SA-CD40L 融合蛋白能够锚定于生物素化的小鼠膀胱表面， 且锚定后 融合蛋白的代谢延缓。对照组在第 2 天已经检测不到融合蛋白的存在， 而实验组在第 4 天 仍然能够检测到融合蛋白的存在。
     背景技术 CD40L/CD40 在细胞和体液免疫中都发挥重要作用。作为免疫细胞激活的共刺激 分子， CD40L 参与机体抗肿瘤的免疫应答。CD40 配体 (CD40 ligand， CD40L) 又称 CD154， 属 于肿瘤坏死因子超家族成员的 II 型跨膜糖蛋白， 主要表达于 CD4+T 细胞， 激活的 B 细胞和 血小板也表达一部份， 可与 B 细胞表面 CD40 结合。其结果， 一方面刺激 B 细胞分泌 IL-4， 后者与 IL-R 结合诱导 B 细胞表达 B7-1/B7-2 ； 另一方面直接诱导 B7-1/B7-2 表达。B7-1/ B7-2 与 T 细胞表面的 CD28/CTLA-24 分子结合， 对 T 细胞活化提供第二信号。 另外， CD40L 也 可以通过促进 DC 细胞的成熟和分泌多种细胞因子从而增强机体的抗肿瘤免疫反应。很多 肿瘤细胞表面表达 CD40， 通过与 CD40 的结合， 可以直接抑制肿瘤细胞的生长， 促进其凋亡。 因此， CD40L 具有抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用。CD40L 基因用来修饰肿瘤细胞， 制备 肿瘤细胞疫苗， 以增强肿瘤抗原的免疫原性。通过原位基因转染 ( 或转导 ) 在肿瘤病灶局 部实现 CD40L 持续有效表达的治疗策略， 已在表浅膀胱癌的临床前研究中显示出诱人的前 景。 但是， 用基因修饰法制备肿瘤细胞疫苗存在如下固有缺陷 ： 修饰效率一般都较低 ( 尤其 是原位基因转染或转导 )， 并取决于肿瘤细胞类型 ； 因影响因素较多， 致使治疗基因的蛋白 质表达产物的有效浓度在局部难于达到并较长时间地维持， 从而实际抗肿瘤的临床效果非 常有限 ； 因个体差异和获得肿瘤标本时肿瘤细胞的成活状态不一致， 往往有些病人因无法 提供成活状态较好的肿瘤细胞， 最终不能制成自体肿瘤细胞疫苗 ； 往往有潜在的病毒载体 安全性问题 ( 所谓 “遗传毒性” ) 和免疫原性问题 ( 反复使用同一病毒载体会影响导入基因 的表达效率 ) ； 很难同时高效表达多个具有协同作用的免疫刺激因子， 并对它们的表达量 进行精确控制。 此外， 基因修饰的自体肿瘤细胞疫苗制备比较费时， 不易大规模开展和广泛 使用。
     发明内容
     本发明要解决的技术问题是提供一种可以对肿瘤细胞进行快速表面修饰并能够 永久地锚定在肿瘤细胞表面的新型 CD40L。
     本发明解决上述技术问题的技术方案是 ：
     一种融合蛋白， 该蛋白由接头肽连接链亲和素和 CD40L 构成， 其中所述的接头肽 的氨基酸序列为 Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Glu Phe。
     本发明融合蛋白中的链亲和素位于接头肽的 N 端 ； 本发明融合蛋白可通过将链亲 和素基因、 CD40L 基因以及连接所述的链亲和素和 CD40L 的接头多核苷酸通过基因重组、 转 化构建工程菌表达获得， 其中基因重组和转化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。 为了便于融合蛋白的分离纯化， 本发明所述的融合蛋白的链亲和素部分的末端还 可以连接有纯化标签， 本发明融合蛋链亲和素的 N 端连有组氨酸标签。
     本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的多核苷酸， 该多核苷酸由成熟链亲和素 cDNA、 可溶 CD40L cDNA 通过 ACG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGGGGC GGA TCC GGC GAA TCC 连接而成 ； 该多核苷酸中成熟链亲和素 cDNA 的末端还可以连接有 CAT CAT CAC CAT CAC CAT。
     将所述的编码本发明融合蛋白的多核苷酸通过基因重组插入到原核表达载体 中， 然后转化大肠杆菌可获得高效表达本发明融合蛋白的工程菌 ； 所述的原核表达载体是 pET24a， 大肠杆菌为 BL21(DE3)。
     本发明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵体的形式存在， 从包涵体中分离纯化 蛋白并复性处理后， 即可获得本发明融合蛋白。
     本发明融合蛋白采用富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽连接 CD40L 和链亲和素， 此 18 肽非常灵活， 有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠， 从而保存各自的生物活性， 使融合蛋白具有链亲和素和 CD40L 的双重活性， 可通过链亲和素与生物素的强力结合将 CD40L 锚定在生物素化的肿瘤细胞表面， 且能在 γ 射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在， 并仍 保持 CD40L 的活性。
    本发明融合蛋白具有双功能， 一方面可以锚定于生物素化的组织局部发挥抗肿瘤 作用， 另一方面可以将融合蛋白锚定于生物素化的灭活肿瘤细胞表面制备 CD40L 膜修饰的 肿瘤疫苗可用于制备预防性和治疗性肿瘤的疫苗。 本发明所述的肿瘤疫苗是将本发明融合 蛋白锚定在生物素化的肿瘤细胞表面获得的。
     本发明所述的肿瘤疫苗的制备充分利用了蛋白质的氨基 ( 即 -NH2) 易生物素化以 及生物素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性， 先用生物素化试剂将生 物素化学交联到欲修饰的肿瘤细胞表面， 然后本发明融合蛋白借助链亲和素与生物素的特 异结合将 CD40L 迅速永久地锚定在肿瘤细胞表面， 从而使 CD40L 在局部达到持续有效的治 疗浓度 ； 再者， 由于一个链亲和素蛋白可结合四个生物素， 因此本发明融合蛋白锚定到肿瘤 细胞的量是可以精确控制的。
    附图说明 图 1 是 6His-SA-L-CD40L-pET24a 重组质粒的结构图。
     图 2 是融合蛋白 6His-SA-L-CD40L 的 SDS-PAGE 电泳图， 其中 1 是分子量标准， 2是 工程菌诱导前， 3 是工程菌诱导后， 4 是包涵体， 5 是 Ni-NTA 柱层析后， 6 是复性后的融合蛋 白， 7 是应用抗 CD40L 抗体进行的 Western blotting 鉴定。
     图 3 是用抗 CD40L 单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化 的 MB49 表面上本发明融合蛋白进行检测的结果， 左峰为未修饰的细胞 ( 阴性对照 )， 而右峰 为本发明融合蛋白锚定修饰的细胞。
     图 4 是用小鼠 B 细胞增殖 MTT 法对融合蛋白的 CD40L 进行生物活性测定的结果， 以 CD40L 标准品作为阳性对照。
     图 5 是本发明融合蛋白治疗表浅性膀胱癌模型的小鼠存活情况曲线图， 以 SA-GFP
     融合蛋白、 CD40L 和 PBS 作为对照。
     图 6 是 SA-sCD40L 融合蛋白锚定于生物素化膀胱粘膜的免疫组织化学检测， 以未 生物素化的小鼠膀胱作为对照。
     图 7 是对各组小鼠进行的 CD4、 CD8 肿瘤浸润淋巴细胞的检测。
     下面将通过实施例进一步说明本发明以及本发明具有的技术效果。 具体实施方式
     下述实施例和实验所用的材料及设备如下 ：
     细 胞 株、 菌株与质粒： MB49 细 胞 ( 鼠 膀 胱 癌 细 胞 株 ) ； 菌 株 Streptomyces avidinii( 亲 和 素 链 霉 菌， ATCC)， DH5α 和 BL21(DE3) ； 原 核 表 达 质 粒 pET24a(Kanar， Novagen)。
     主要生化试剂及材料 ： DNeasy 组织试剂盒和质粒 DNA 的制备试剂盒 (Qiagen)， 寡 核苷酸的合成 (Sigma)， Trizol， SuperScript II 逆转录酶， Platinum Pfx DNA 聚合酶和 T4 DNA 连接酶 (Invitrogen) ； CD40L 标准品 (PEPROTECH)， 琼脂糖和 SDS-PAGE(Biorad) ； 2-Iminobiotin(Sigma) 和 Ni-NTA(Qiagen) 填 料 ； Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce) 和 抗 CD40L 抗体 (BD Biosciences Pharmingen)。
     DNA 片段的连接、 转化及转化子筛选， 限制性内切酶分析， SDS- 聚丙烯酰胺凝胶点 泳等常规方法均参照文献 (Sambrook J， et al.Molecular Cloning-A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York， 2nd edition， 1989) 或厂家提供的产 品说明书 ； DNA 序列分析在大连宝生物工程公司的 DNA 测序服务中心完成。
     例 1 融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L 的制备
     1、 用 DNeasy 组织试剂盒从亲和素链霉菌抽提出细菌的基因组 DNA， 然后用其作为 模板， 通过 Platinum pfx DNA 聚合酶进行 PCR 制备成熟链亲和素 cDNA。
     引物 ：
     5’ GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGG3’ (55nt) 和
     5’ GGAATTCGCCGGATCCGCCCCCGCCGCTGCCTCCGCCCCCGCTGCCCCCGCTCGTCTGCTGAACGGC GTCGAGCGGGTTGCC 3’ (82nt)。
     反应条件 ： 变性 94℃， 2min， 循环 (94℃， 15s → 60℃， 15s → 68℃， 30s)25 轮， 最后 68℃， 5min。
     2、 用 Trizol 抽提起 ConA 活化的小鼠脾细胞的总 RNA， 并以其作为模板， 进行 RT-PCR 制备可溶 CD40L 的 cDNA。
     引物 ： 5’ GGAATTCATGCAAAGAGGTGATGAGGA3’ (27nt) 和
     5’ CCTCGAGTCAGAGTTTGAGTAAGCCAA3’ (27nt)
     反应条件 ： 变性 94℃， 2min， 循环 (94℃， 15s → 60℃， 15s → 68℃， 30s)25 轮， 最后 68℃， 5min。
     3、 构建 6His-SA-L-sCD40L-pET24 重组质粒
     制备的 CD40LcDNA( 含终止码， 两端分别含 EcoRI 和 XhoI 限制性内切酶位点 ) 和 SAcDNA( 不含终止码， 两端分别含 NdeI 和 EcoRI 限制性内切酶位点 )， 将上述 CD40L 和 SA 基因片段克隆于 pET-24 载体中， 获得 6His-SA-L-sCD40L-pET24 重组表达质粒 ( 结构图如图 1 所示 )。其中 L 为富含甘氨酸、 丝氨酸的连接肽 (18 肽 )。重组表达质粒经 DNA 序列分 析鉴定， 验证其正确无误。
     4、 构建 6His-SA-L-sCD40L-pET24/BL21(DE3) 工程菌
     6His-SA-L-sCD40L-pET24 重组表达质粒转化后 BL21(DE3) 感受态细胞后， 用含卡 那霉素的 LB 平皿筛选。 挑取转化平皿上的单菌落接种于加有卡那霉素 (50μg/ml) 的 LB 培 养基中。经 37℃摇床培养扩增至吸光度 A600 为 0.4 ～ 0.5 时， 加入终浓度为 0.1mmol/L 的 IPTG， 37℃诱导表达 4h， 离心 (8000g×10min) 收获菌体， 将细胞破碎后用 12％的 SDS-PAGE 检测分析融合蛋白的表达情况。
     5、 融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L 的表达
     融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L 在菌体中主要以包涵体的形式存在， 其表达量达 15-20％。
     6、 从包涵体中获得融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L
     a. 制备包涵体 ： 5 克菌体悬于 100ml 1×PBS 中， 冰浴中超声 ( 电流 270mA)， 30 秒 ×10 次 ( 每 次 间 隔 30 秒 ) ； 接 着 于 4 ℃ 离 心 10 分 钟 (8000g)， 将 沉 淀 悬 浮 于 100ml 1×PBS( 内含 4mol/L 尿素， 0.5 ％ Triton X-100， 20mmol/L EDTA) 中进行漂洗， 随后离心 (1000g×10 分钟 ) 收集沉淀 ； 漂洗两次后， 溶于 100mmol/L 磷酸钠缓冲液， 8mol/L 尿素 (pH 8.0) 中， 15000g×15 分钟， 取上清液。 b.Ni-NTA 柱层析 ： 将步骤 a 得到的上清液上样于 Ni-NTA 柱 (2.6×5cm)， 用平衡液 (100mmol/L 磷酸钠缓冲液， 8mol/L 尿素， pH8.0) 进行冲洗至样品 A280 恢复至基线 ； 然后用洗 脱液 (100mmol/L 磷酸钠缓冲液， 8mol/L 尿素， pH4.5) 进行洗脱， 洗脱液经 SDS-PAGE 鉴定， 收集融合蛋白质峰 ( 融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L 的分子量为 33.7KD)。
     c. 透析复性 ： 将 Ni-NTA 柱层析纯化获得的 6His-SA-L-sCD40L 融合蛋白调至 OD280 ＝ 0.2， 在大于 20 倍体积的透析液 (100mmol/L NaHCO3， 4.0mol/L 尿素， 1mmol/L 还原型谷 胱苷肽， 0.2mmol/L 氧化型谷胱苷肽， 0.3mol/L 精氨酸， pH 10.0) 中 4℃透析复性 12 小时， 逐渐降低尿素浓度 ； 然后在 50mmol/LNaHCO3， 500mmol/LNaCl， pH 11 中继续透析 6 小时 ； 离 心除去不溶物， 收集上清。
     d.2-Iminobiotin 亲 和 柱 层 析 ： 用 平 衡 液 (50mmol/LNaHCO3， 500mmol/LNaCl， pH 11) 洗脱 5 个柱体积后 ( 柱体积 0.5×2cm)， 将收集的已复性融合蛋白质液上亲和层析柱， 并用平衡液洗脱至样品 A280 恢复至基线 ； 然后， 用 50mmol/LNaAc， pH4.0 洗脱， 分管收集各洗 脱峰， 并用 10x 平衡液 (500mmol/L NaHCO3， 5mol/L NaCl， pH 11) 将收集的融合蛋白质液调 至 pH8.0， 并过滤除菌分装， 储存于 -20℃。
     所得融合蛋白 6His-SA-L-sCD40L 用 SDS-PAGE 鉴定， 结果如图 3 所示。
     例 2 本发明融合蛋白对肿瘤细胞的修饰效果及其稳定性检测
     用抗 CD40L 抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的 MB49 细胞 表面上的 6His-SA-L-sCD40L 融合蛋白进行检测， 结果见图 4， 几乎 100 ％的肿瘤细胞被修 饰， 且肿瘤细胞表面有大量的 CD40L。对锚定在肿瘤细胞表面的 6His-SA-L-sCD40L 融合蛋 白的稳定性经流式细胞仪进行分析表明， 在一周内这些锚定的融合蛋白在细胞表面的数量 无显著下降。
     例 3 本发明融合蛋白进行 CD40L 生物活性的测定
     利用 CD40L 和 IL4 共同刺激小鼠 B 细胞对融合蛋白进行体外活性测定。制备 C57 小鼠脾细胞悬液。 应用 Ficoll 液密度梯度离心分离单个核细胞， 应用尼龙毛柱分离 B 细胞。 5 96 孔板每孔加入 1×10 的 B 细胞和 10ng/ml 的 IL4， 然后加入不同浓度的 SA-CD40L 融合蛋 白， 同时应用 CD40L 标准品作为对照， 每个浓度设立三个复孔。37℃、 5％ CO2 培养 72 小时。 在培养结束前 4 小时， 每孔加入 5mg/ml 的 MTT 20μl， 继续培养 4 小时， 离心后去除上清， 每 孔加入 100μl 的 DMSO， 测定 OD570nm 的吸光度。结果如图所示， 融合蛋白能够促进小鼠 B 细胞的增殖， 且成剂量依赖关系。与 CD40L 标准品相比， 融合蛋白的生物学活性有所升高。
     例 46His-SA-L-sCD40L 融合蛋白修饰的肿瘤疫苗的制备
     将 107 个 MB49 细 胞 悬 浮 在 1ml 1×PBS 中， 加 入 0.5mg Sulfo-NHS-LC-Biotin 并 混 匀 后， 室 温 下 作 用 30 分 钟 ； 用 1×PBS 洗 涤 细 胞 3 次 后， 每 106 个 MB49 细 胞 加 入 200ng6His-SA-L-sCD40L 融合蛋白， 冰上作用 30 分钟 ； 1×PBS 洗涤细胞 1 次后， 然后用 γ 射线灭活 (20000rad) 即可。
     例 5 本发明融合蛋白治疗小鼠表浅膀胱癌的效果。
     (1) 材料 ： C57 小鼠、 MB49 细胞、 SA-GFP( 即绿色荧光蛋白和链亲和素的融合蛋白 )
     (2) 方法 建立小鼠表浅膀胱癌模型， 攻击所用 MB49 细胞数量为 1×106， 攻击后第三天， 开始 治疗。腹腔注射麻醉小鼠， 膀胱插管， 灌注 100μl 1mg/ml 活化生物素， 保留 30 分钟， 然后 应用 PBS 冲洗 3 遍， 灌注 0.15mg/ml 的 SA-CD40L 治疗， 同时应用 SA-GFP 或 CD40L 为实验对 照， PBS 为阴性对照， 保留 1 小时。治疗每周 2 次， 共治疗 3 周。然后观察肿瘤的生长情况 和小鼠的存活情况。在最后一次灌注治疗后 7 天， 进行各组 CD4、 CD8 肿瘤浸润淋巴细胞的 检测。
     (3) 结果
     如图 5 所示， 本发明融合蛋白治疗组的生存数及生存期显著高于阴性对照组。并 且实验组小鼠肿瘤浸润 CD4、 CD8 淋巴细胞明显升高 ( 图 7)。
     例 6 本发明融合蛋白锚定于生物素化小鼠膀胱的代谢时间检测
     (1) 方法
     小鼠麻醉后给予膀胱插管， 灌注 100μl 1mg/ml 活化生物素， 保留 30 分钟， 然后应 用 PBS 冲洗 3 遍， 灌注 0.15mg/ml 的 SA-CD40L 融合蛋白， 设立未生物素化的小鼠膀胱作为 对照。分别在第 2、 4、 6 天处死小鼠摘取膀胱， 进行冰冻切片， 应用抗 CD40L 抗体进行免疫组 织化学检测。
     (2) 结果
     如图 6 所示， SA-CD40L 融合蛋白能够锚定于生物素化的小鼠膀胱表面， 且锚定后 融合蛋白的代谢延缓。对照组在第 2 天已经检测不到融合蛋白的存在， 而实验组在第 4 天 仍然能够检测到融合蛋白的存在。
    7CN 101935353 A
    序列表1/2 页
     8CN 101935353 A序列表2/2 页