鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株及其应用.pdf

鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株及其应用
    技术领域 本发明涉及一株重组弱毒疫苗株， 尤其涉及一株表达流行毒株主要保护性抗原蛋 白 VP2 的鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株， 本发明还涉及该重组弱毒疫苗株在制备 防制鸡传染性法氏囊病生物制品中的应用， 属于鸡传染性法氏囊病的防制领域。
     背景技术 鸡传染性法氏囊病 (Infectious Bursal Disease， IBD) 是由鸡传染性法氏囊病 病毒 (Infectious Bursal Disease Virus， IBDV) 引起的一种主要危害雏鸡的急性、 高度 接触性、 免疫抑制性、 致死性传染病， 被世界动物卫生组织 (OIE) 列为 “影响社会经济的重 要疾病” 。该病于 1957 年首次爆发于美国， 现已大面积流行于欧州、 东南亚、 非州、 南美洲等 地。 中国的流行情况也比较严重， 一直威胁着中国养禽业的发展。 IBDV 有两个血清型， 仅血 清 I 型对鸡致病。血清 I 型毒株由于不断变异又分为经典毒株、 变异毒株、 超强毒株 (very virulent IBDV， vvIBDV)， 其中 vvIBDV 的致死率高达 60％以上， 而且耐过鸡群会呈现对禽 流感、 新城疫等免疫失败 (Müller H， Islam M R， Raue R.Research on infectious bursal disease-the past， the presentand the future.Vet.Microbiol.2003， 97 ： 153-165.)。 最 近研究发现， 野生鸟类也能感染 vvIBDV。免疫抑制、 抗原变异， 特别是 vvIBDV 的出现， 使得 该病的防控形势更加严峻。
     IBDV 属于双 RNA 病毒科禽双 RNA 病毒属， 其基因组由两个双股 RNA 节段组成。B 节段长 2827bp， 编码具有 RNA 聚合酶活性的 VP1 蛋白。A 节段长 3260bp， 包括两个开放阅 读框 (ORF) ： 小 ORF 在前， 编码非结构蛋白 VP5 ； 大 ORF 在后， 编码 VP2、 VP3 和 VP4 蛋白。 VP2 是 IBDV 唯一的衣壳蛋白， 是 IBDV 主要的毒力蛋白和宿主保护性抗原 (Garriga D， Querol-Audi J， Abaitua F， et al.The 2.6-Angstrom structure of infectious bursal disease virus-derived T-1particles reveals new stabilizing elements of the virus capsid.J.Virol.， 2006， 80 ： 6895-6905.)。
     最近， IBDV 新的变异趋向已被监测到。 本发明人实验室对分离鉴定的 vvIBDV 进行 全基因组序列分析还发现， HLJ-0504 代表了一群具有基因组新特征的 vvIBDV， 这类病毒具 有超强毒的 A 节段和介于强弱毒之间的 B 节段， VP2 基因存在抗原漂变， 其对 SPF 鸡致死率 高达 86.7％， 该类病毒在东北地区、 广西以及法国均有存在。依据主要保护性抗原基因 VP2 绘制的遗传进化树分析发现， HLJ-0504 株在国内流行毒株中具有代表性。
     疫苗免疫是防控 vvIBDV 的主要手段， 但 vvIBDV 致病性很强且不适应细胞培养， 活 疫苗株的获得只能通过将野生 vvIBDV 在鸡胚或 CEF 细胞上传代致弱 (Wang X M， Fu C Y， Gao H L， et al.Pathogenicantigenic and molecular characterization of very virulent strain(Gx)of infectious bursal disease virus isolated in China.Agri.Sci.China， et al.Changes inVP2 gene during the 2003， 2： 566-572.Wang X M， Zeng X W， Gao H L， attenuation of very virulent infectious bursaldisease Virus strain Gx isolated in China.Avian Dis.， 2004， 48 ： 77-83.Wang， X.， Zhang H.， Gao H.， et al.Changes in
     VP3 and VP5 genesduring the attenuation of very virulent infectious bursal disease virusstrain Gx isolated in China.Virus Genes， 2007， 34 ： 67-73.Yamaguchi T， Ogawa M， Inoshima Y， et al.Identification of sequence changesresponsible for the attenuation of highly virulent infectious bursaldisease virus.Virology， 1996， 223 ： 219-223.)。 这种传统的疫苗株驯化方法费时费力， 往往需要数年时间， 而且结果 带有随机性。对于高致病力的、 易变异的 vvIBDV 的防控， 特别是突发疫情的防控， 开展疫苗 株的快速构建研究迫在眉睫。
     反向遗传技术是研究基因功能和进行分子修饰的有力工具。 国外研究者对建立快 速的疫苗株筛选方法做了一些探索工作。 Mundt 等曾以疫苗株 D78 为亲本毒， 拯救获得嵌合 病毒 D78-Chim， 该病毒对经典毒和变异株的攻击均能产生保护。此外， 有研究者曾以缺失 VP5 的策略试图构建疫苗株， VP5 缺失虽然导致复制延迟但并不影响宿主对 IBDV 的体液免 疫反应强度。Lim 等曾通过点突变使 vvIBDV HK46 株适应非允许细胞 CEF， 但没有进一步评 估其致病性和免疫原性。
     在 过 去 近 60 年 里， IBDV 曾 经 出 现 过 两 次 大 的 变 异， 每次变异都因为新毒株 突破了原有疫苗免疫保护而造成了严重损失 (Müller H， Islam M R， RaueR.Research on infectious bursal disease-the past ， the present and the future.Vet. Microbiol.2003， 97 ： 153-165.)。近 20 年来， 鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株 (vvIBDV) 在 危害养禽业的同时， 也在发生和累计着微小的变异， 是否会出现抗原性大的变异或者出现 毒力更强的毒株可能只是个时间问题。传统的传代致弱的疫苗株驯化方法费时费力， 不能 满足突发疫情应急防控的需要。 所以， 应用先进的反向遗传操作技术， 依据流行病学监控信 息， 针对流行毒株， 有目的的快速构建 IBDV 新型疫苗毒株具有重大的现实意义。 发明内容
     本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足， 提供一株表达 vvIBDV 流行 毒株主要保护性抗原蛋白 VP2 的重组弱毒疫苗株， 该毒株有较高的复制滴度， 对鸡无致病 性， 遗传稳定性良好， 有较好的免疫原性。
     本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的 ：
     一 株 表 达 vvIBDV 流 行 毒 株 主 要 保 护 性 抗 原 蛋 白 VP2 的 重 组 弱 毒 疫 苗 株 (rGtHLJVP2)， 其微生物保藏号是 ： CGMCC No.3749 ； 分类命名是 ： 鸡传染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus) ； 保藏时间是 ： 2010 年 4 月 20 日 ： 保藏单位是 ： 中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ： 保藏地址是 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所。
     本发明克隆了流行超强毒株 HLJ-0504 的主要保护性抗原基因 VP2， 将其核苷酸进 行突变修饰 (A889T/G980A)， 然后将其替换 IBDV 弱毒株 Gt 基因组的相应区段， 构建 IBDV 重组基因组的感染性克隆， 利用 IBDV 反向遗传操作系统， 拯救并鉴定了重组弱毒疫苗株 rGtHLJVP2。在感染性克隆里， IBDV 基因组的两端均克隆有核酶的 cDNA 序列。核酶的本质 是一种具有剪切酶活性的 RNA。锤头状核酶结构 (hammerhead ribozyme， HamRz) 核心序列 共有 58 个核糖核酸， 自我剪切位点在其 3′末端 C 处 ； 丁肝病毒核酶结构 (hepatitis delta ribozyme， HdvRz) 共有 88 个核糖核酸， 自我剪切位点在其 5′末端 G 处。核酶序列的引入实现了从转录水平上控制重组 IBDV 基因组的完整性， 这是实现高效病毒拯救的关键之一。 vvIBDV 不能够适应 CEF 细胞， 这是由 VP2 的 253 和 284 位氨基酸位点决定的 (Qi X L， Gao H L， Gao Y L， et al.Naturally occurring mutations atresidues 253 and 284 in VP2 contribute to the cell tropism andvirulence of very virulent infectious bursal disease.Antiviral Res.， 2009， 84 ： 225-233.)。 vvIBDV HLJ-0504 核苷酸突变 A889T/G980A 导致了 VP2 的氨基酸突变 Q253H 和 A284T， 这是感染性克隆有感染性并在 DF1 和 CEF 细胞上 能够拯救出重组病毒的前提。
     感 染 性 克 隆 pCAGGGtAHLJVP2HRT 与 pCAGGGtBHRT 共 转 染 细 胞 后， 经 IFA 和 电 镜观察证明， 拯救出了重组弱毒疫苗株 rGtHLJVP2。测序证明， 本发明重组弱毒疫苗株 rGtHLJVP2 是一株以弱毒株 Gt 为骨架， 其主要保护性抗原基因 VP2 被 vvIBDV HLJ-0504 相 应区域替换了的重组病毒。
     本发明重组弱毒疫苗株 (rGtHLJVP2) 主要具有以下几方面的特点 ：
     (1) 复制特性良好。rGtHLJVP2 在 CEF 细胞上与 Gt 具有相似的复制动力学曲线， 接毒后 48h-60h， 病毒滴度可达到 107TCID50/ml 以上。在 SPF 鸡的法氏囊内， rGtHLJVP2 与 Gt 也具有相当的病毒载量。
     (2) 安全性好， 对 SPF 鸡无致病性。rGtHLJVP2 尽管具有 vvIBDV 的 VP2 基因， 但由 于做了分子修饰， 与 Gt 对照组一样， 对 SPF 鸡不呈现致病性。 在接种 SPF 鸡后的 14 天内， 试 验鸡的精神状态良好， 未出现任何发病症状 ； 法氏囊正常， 没有萎缩， 没有明显的显微病变。 rGtHLJVP2 和弱毒疫苗株 Gt 一样对 SPF 鸡无致病性， 但中等毒力疫苗 B87 对法氏囊造成了 严重萎缩和不可逆病理损伤。
     (3) 遗传稳定性良好。rGtHLJVP2 在 CEF 细胞和 SPF 鸡上分别盲传 15 代和 5 代， 病毒滴度保持稳定， 基因组没有发生意外突变， 毒力也没有返强。
     (4) 免疫原性良好。rGtHLJVP2 免疫 SPF 鸡后， 7d 80％血清抗体阳转， 10d 100％ 阳转， 而且能够 100％保护强毒攻击。rGtHLJVP2 和中等毒力疫苗 B87 相当， 优于弱毒疫苗 株 Gt。
     总之， 本发明重组弱毒疫苗株 rGtHLJVP2 具有良好的复制性、 遗传稳定性和安全 性。在免疫效果上， 本发明弱毒疫苗株和中等毒力疫苗相当， 优于弱毒疫苗株。本发明重组 弱毒疫苗株具备了作为疫苗株的高效、 低毒的特点， 是一株良好的疫苗候选毒株， 可以用于 鸡传染性法氏囊病 (IBD) 的防控。 附图说明
     图 1HLJ-0504 株 VP2 基因的突变修饰及替换 Gt 株相应区段流程图。
     图 2 感染性克隆示意图。
     图 3 用 HLJ-0504 株 VP2 基因替换 Gt 株基因组相应区段过程中的各步 PCR 产 物； M.1kb DNA Ladder Marker ； 1.PCR 产物 GtHLJ0504VP2I ； 2.PCR 产物 GtHLJ0504VP2II ； 3.GtHLJ0504VP2III ； 4.PCR 产物 GtAHLJVP2HRT。
     图 4 重组病毒在 CEF 上的 CPE(100X) ； 左 .rGtHLJVP2 ； 右 . 正常细胞对照。
     图 5 间接免疫荧光检测重组病毒 (×100) ； 左 .rGtHLJVP2 ； 右 . 正常细胞对照。
     图 6 电镜下的重组病毒 rGtHLJVP2(40000×)。图 7 重组病毒 rGtHLJVP2 在 CEF 细胞上的复制动力学曲线。
     图 8 重组病毒 rGtHLJVP2 体内 ( 法氏囊 ) 复制动力学曲线。
     图 9 重组病毒接毒后鸡囊重指数变化曲线。
     图 10 重组病毒接种 SPF 鸡的法氏囊的病理变化 (20X)。
     图 11 重组病毒诱导试验鸡的抗体滴度。
     图 12 不同疫苗免疫试验鸡抗体消长曲线。
     图 13 试 验 鸡 二 免 及 攻 毒 后 各 组 鸡 囊 重 指 数 变 化 曲 线 ； d p.i. ： dayspost-infection( 接种后天数 ) ； d p.c. ： days post challenge( 攻毒后天数 )。
     图 14 试 验 鸡 二 免 及 攻 毒 后 法 氏 囊 的 病 理 变 化 (20X) ； d p.i. ： dayspost-infection( 接种后天数 ) ； d p.c. ： days post challenge( 攻毒后天数 )。
     图 15 试验鸡二免后法氏囊中的病毒载量。 具体实施方式
     下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 实施例 1 重组弱毒疫苗株 rGtHLJVP2 的设计、 拯救、 鉴定及免疫效力初步评价
     1 材料和方法
     1.1 材料
     1.1.1 病毒
     HLJ-0504， vvIBDV[ 购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所菌毒种室 ( 对外 )] ； Gt， IBDV 弱毒疫苗株， 由哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病课题组 ( 本发明人课题组 ) 将 vvIBDV Gx 株连续传代致弱并保存， 具体方法可参考有关文献 (Wang X M， Zeng X W， Gao H L， et al.Changes in VP2 geneduring the attenuation of very virulent infectious bursal disease Virus strain Gxisolated in China.Avian Dis.， 2004， 48 ： 77-83 ； Wang， X.， Zhang H.， Gao H.， et al.Changes in VP3 and VP5 genes during the attenuation of very virulent infectiousbursal disease virus strain Gx isolated in China. Virus Genes， 2007， 34 ： 67-73.)。
     1.1.2 质粒
     pT-HLJ0504AHRT ： 将 HLJ-0504 基因组 A 节段克隆入 pMD18T 载体， A 节段 5’ 端和 3’ 端已分别加入核酶结构的 cDNA 序列， 分别为 HamRz(58bp) ： 5′ TGTTAAGCGTCTGATG
     AGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTC3 ′和 HdvRz(88bp) ： 5 ′ GGGTCG GCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGG
     TCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG3 ′。 pCAGGGtAHRT 和 pCAGGGtBHRT ： 分别将 IBDV 弱毒株 Gt 的基因组的 A、 B 节段克隆入真核表达 载体 pCAGGS， 基因组两端已分别引入了核酶结构 HamRz 和 HdvRz(Qi X L， Gao Y L， Gao H L， et al.An improved method forInfectious bursal disease virus rescue using RNA polymerase II system.J.Virol.Methods， 2007， 142 ： 81-88.)。上述质粒均由本发明人课
     题组构建和保存。
     1.1.3 细胞和单克隆抗体
     DFI 细胞购自美国模式培养集存库 (American type culture collection， ATCC) ； 原代鸡胚成纤维细胞 (CEF) 按常规方法用 SPF 鸡胚制备 ； 抗 IBDVVP2 蛋白单克隆抗体 6H7D 由本发明人课题组制备 ； Top10F′菌种由本发明人实验室保存 (Top10F′菌种也可从生物 试剂公司购买得到 )。
     1.1.4 实验动物
     SPF 鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供， 饲养于超滤负压 隔离器中。
     1.1.5 主要试剂
     各种限制性内切酶、 PrimeSTARTM HS DNA Polymerase、 DNA Marker、 dNTP 等购于 大连宝生物公司 ； 胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自 Omega 公司 ； Plasmid Midi Kit 为 TM TM QIAGEN 产品 ； Lipofectamine -2000， Superscript RT-PCR Systems 试剂盒购于英俊生物 技术有限公司 (Invitrogen) ； Opti-MEM I Medium 为 GIBCO 产品 ； 荧光素 (FITC) 标记的羊 抗鼠 IgG 为 Sigma 产品。 1.2 引物设计与合成
     用 于 RT-PCR、 融 合 PCR 以 及 点 突 变 的 引 物 见 表 1， 由英俊生物技术有限公司 (invitrogen) 合成。
     注： 斜体部分为限制性酶切位点序列 ； 有下划线的序列为核酶序列 ； 小写字母表 示引入的突变核苷酸 ； 引物依据 IBDV HLJ-0504 毒株的序列 (GenBank 登录号为 GQ451330 和 GQ451331) 设计。
     1.3HLJ-0504 株 VP2 基因突变位点的引入
     为了在 HLJ-0504 株 VP2 上引入氨基酸突变 Q253H 和 A284T， 以 pT-HLJ0504AHRT 为模板， 运用 PCR 介导的定点突变方法， 在 HLJ-0504 株 VP2 基因上先后引入核苷酸突变 A889T、 G980A。所用的聚合酶是高保真的 PrimeSTARTM HS DNA Polymerase。
     首 先，以 pT-HLJ0504AHRT 为 模 板，用 引 物 GxA889TU/GxA889TL( 表 1) 在
     HLJ-0504 株 VP2 基 因 上 引 入 核 苷 酸 突 变 A889T。PCR 程 序 是 ： 95 ℃ 5min ； 95 ℃ 30s， 55℃ 1min， 68℃ 6min， 18 个循环 ； 72℃ 10min。用 DpnI 降解 PCR 产物中被甲基化的模板 pT-HLJ0504AHRT(37℃ 1h)， 将处理过的 PCR 产物转化感受态细胞 Top10F’ ， 提取并鉴定阳 性质粒， 命名为 pT-HLJ0504A889HRT。
     然 后，以 pT-HLJ0504A889HRT 为 模 板，用 引 物 GxG980AU/GxG980AL( 表 1) 在 HLJ-0504 株 VP2 基 因 上 引 入 第 二 个 核 苷 酸 突 变 G980A。 具 体 过 程 同 上。 最 终 获 得 VP2 上 带 有 两 个 核 苷 酸 突 变 A889T、 G980A 的 重 组 质 粒 pT-HLJ0504A889/980HRT。 将 pT-HLJ0504A889/980HRT 送英俊生物技术有限公司 (Invitrogen) 测序， 分别测三个克隆。
     1.4HLJ-0504 株 VP2 基因替换 Gt 株基因组相应区段
     用融合 PCR 技术完成 VP2 基因的替换， 具体步骤如下 ：
     ①第一步 PCR ： 以 pCAGGGtAHRT 为模板， AU03/F9VP2Q173L 为引物， 扩增 Gt 株基因 组 A 节段 VP2 基因之前的区段。 反应程序为 ： 95℃ 5min ； 94℃ 30s， 59.3℃ 30s， 72℃ 30s， 循环 30 次 ； 72℃延伸 10min。PCR 产物命名为 GtHLJ0504VP2I( 预期长度 200bp)。
     ②第二步 PCR ： 以 pT-HLJ0504A889/980HRT 为模板， 以 F9VP2Q173U/F9VP2Q1512L 为 引 物， 扩 增 经 突 变 修 饰 的 HLJ-0504 株 的 VP2 基 因。 反 应 程 序 为 ： 95 ℃ 5min ； 94 ℃ 30s， 53.3 ℃ 30s， 72 ℃ 1min 10s，循 环 30 次 ； 72 ℃ 延 伸 10min。PCR 产 物 命 名 为 GtHLJ0504VP2II( 预期长度 1327bp)。
     ③第三步 PCR ： 以 pCAGGGtAHRT 为模板， F9VP2Q1512U/AL03 为引物， 扩增 Gt 株基因 组 A 节段 VP2 基因之后的区段。 反应程序为 ： 95℃ 5min ； 94℃ 30s， 62.5℃ 30s， 72℃ 2min 10s， 循环 30 次 ； 72℃延伸 10min。PCR 产物命名为 GtHLJ0504VP2III( 预期长度 1950bp)。
     ④第四步 PCR( 融合 PCR) ： 以 GtHLJ0504VP2I、 GtHLJ0504VP2II、 GtHLJ0504VP2III 为模板， AU03/AL03 为引物进行融合 PCR 反应， PCR 为两个反应串联。第 1 个反应不加引物， 条件为 ： 95℃ 5min ； 94℃ 30s， 65℃ 2min， 72℃ 3min 40s， 循环 8 次 ； 72℃延伸 10min。反 应完毕后在第 1 个反应的体系内加入引物 AU03/AL03， 继续进行第 2 个 PCR 反应， 反应条件 为： 95℃ 5min ； 94℃ 30s， 68.6℃ 30s， 72℃ 3min 40s， 循环 30 次 ； 72℃延伸 10min。 PCR 产 物命名为 GtHLJVP2HRT( 预期长度 3406bp)( 见图 1)。
     1.5 感染性分子克隆的构建
     将融合 PCR 产物 GtAHLJVP2HRT 经限制性内切酶 Cla I/Kpn I 酶切， 与经同样酶切 处理的体 pCAGGS 连接， 筛选阳性克隆， 经酶切、 测序鉴定后， 命名为 pCAGGGtAHLJVP2HRT( 见 图 2)。
     1.6 重组病毒拯救
     用 Plasmid Midi Kits(QIAGEN) 制 备 纯 化 序 列 正 确 的 重 组 质 粒 pCAGGGtAHLJVP2HRT 和 pCAGGGtBHRT， 然后用 LipofectamineTM 2000(Invitrogen) 介导共转 染 DFI 细胞。具体操作如下 ：
     ①将 DFI 细胞饲养于六孔板内， 待细胞生长至 60-80％时 ( 最好在细胞处于对数生 长期内 ) 进行转染 ；
     ②将重组质粒 pCAGGGtAHLJVP2HRT 和 pCAGGGtBHRT( 质粒浓度均为 1μg/μl， 每种 质粒 2μl) 稀释于 246μl Opti-MEM 中， 混匀静置 ； TM
     ③ 将 10μl Lipofectamine 2000(Invitrogen， Carlsbad， CA， USA) 稀 释 于240μl Opti-MEM 中， 轻微混匀， 室温孵育 5min ；
     ④将稀释的质粒和 LipofectamineTM 2000 在一个 EP 管中轻微混匀， 室温孵育 20min ；
     ⑤在此孵育时间内， 将六孔板内培养液吸出， 用无双抗的 Hank’ s 液将细胞洗三 次， 再用少量的 Opti-MEM I reduced serum medium(Opti-MEM)(Invitrogen， Carlsbad， CA， USA) 将待转染孔细胞洗一次， 然后每孔加入 0.5ml Opti-MEM， 于 37℃ CO2 培养箱孵育 ； TM
     ⑥待时间截止后， 将 500ul 质粒和 Lipofectamine 2000 混合液滴加于刚处理过 的 DFI 细胞单层上， 置 37℃ CO2 培养箱孵育 ；
     ⑦ 8-10h 后， 吸去培养液， 用含双抗的 Hank’ s 液将细胞洗三次， 每孔细胞加入 2ml DMEM( 含 10％ PAA 胎牛血清和 100U/ml 双抗 ) 置 37℃ CO2 培养箱继续培养。
     ⑧ 72h 后收获细胞悬液， 反复冻溶 3 次， 取细胞悬液连续在 CEF 上传代， 拯救出的 重组病毒被命名为 rGtHLJVP2。同时设立空载体 pCAGGS 对照和正常细胞对照。
     1.7 拯救的重组病毒鉴定
     1.7.1 间接免疫荧光 (IFA) 检测
     将重组病毒感染 CEF， 16h 后， 无水乙醇室温固定细胞 20min， 常规方法做 IFA 检测。 所用一抗为抗 IBDV-VP2 单克隆抗体 6H7D， 二抗为荧光素 (FITC) 标记的羊抗鼠 IgG。同时 设非感染 CEF 细胞对照。
     1.7.2 电镜观察
     将收获的重组病毒细胞悬液反复冻融 3 次， 3000rpm 于 4℃离心 10min， 取其上清 12000rpm 于 4℃离心 10min， 适量 PBS 重悬沉淀， 然后做负染电镜观察。同时设非感染 CEF 细胞对照。
     1.7.3RT-PCR 鉴定
     用 PureLinkTM Viral RNA/DNA Kits(Invitrogen) 试剂盒按说明书从细胞毒中提 取 RNA， 并进行反转录。 以 AU/F6VP2Q1512L、 BU/B1344L 引物分别扩增 A、 B 节段的部分片段， 将 PCR 产物克隆入 pMD18T 载体并测序鉴定。
     1.8 重组病毒在 CEF 细胞上的复制特性
     重组病毒 rGtHLJVP2 以 104 TCID50 接种铺满单层的 CEF， 于感染后 12h、 24h、 36h、 48h、 60h、 72h 分别取细胞上清， 常法滴定其 TCID50 效价 ； 重复测定 3 次， 取其平均值， 绘制病 毒复制动力学曲线。同时设 Gt 株对照。
     1.9 动物实验
     将 14 日龄 SPF 鸡随机分为三个组， 每组 45 只。第 1 组， 接种 104.4TCID50 重组病毒 rGtHLJVP2， 接种途径为点眼滴鼻。 第 2 组， 接种 104.4TCID50Gt 株病毒， 接种途径为点眼滴鼻。 第 3 组， 接种 200ul DMEM。接毒后每天观察鸡的精神状态。于接毒后 3、 5、 7、 10、 14d， 各组 分别随机剖杀 5 只鸡。对剖杀鸡只分离血清， 置于 -70℃待检测其抗体水平。观察各脏器 尤其是法氏囊的病变 ； 采取法氏囊， 计算囊重比和囊指数 ； 每个法氏囊分两部分， 一部分用 10％中性福尔马林固定， 进行病理组织学分析 ； 另一部分则用于病毒基因组提取。
     1.9.1 囊重比
     分别称取鸡的体重和法氏囊重量， 统计分析后， 计算囊重比 (Bursalof fabricius weight/Body weight ratio， F/B) 和囊指数 (BBIX)。 F/B ＝ ( 法氏囊重 / 体重 )X1000 ； BBIX＝试验组鸡囊重比 / 空白对照组鸡囊肿比 ； 当 BBIX ＜ 0.7 时， 判为法氏囊萎缩。
     1.9.2 重组病毒体内复制动力学研究
     将接毒后 3、 5、 7、 10、 14d 的部分法氏囊用适量 PBS 研磨， 将悬液反复冻溶三次， 常 法提取 IBDV 全基因组 RNA， 利用本实验室建立的 real-timeRT-PCR 方法检测法氏囊中的病 毒载量。每个时间点重复三次， 计算其平均数和标准差， 绘制病毒复制动力学曲线。
     1.9.3 试验鸡血清抗体的检测
     用 IDEXX IBDV Antibody Test Kit 检测接毒后 3、 5、 7、 10、 14d 分离的血清中的抗 体效价， 具体步骤见说明书。
     1.9.4 试验鸡法氏囊中 IBDV 基因组部分片段扩增及测序
     取各试验组部分法氏囊用适量 PBS 研磨， 将悬液反复冻溶三次， 按照 1.7.3 方法， 以 AU/F6VP2Q1512L、 BU/B1344L 引物分别扩增 IBDV A、 B 节段的部分片段， 将 PCR 产物克隆 入 pMD18T 载体并测序鉴定。
     1.9.5 攻毒保护试验
     上述试验结束后， 对每组中的剩余鸡只进行攻毒保护实验。用地方流行分离超强 毒株 HLJ-0504[ 购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所菌毒种室 ( 对外 )]， 对每只鸡进行 4 攻毒， 途径为滴鼻点眼， 攻毒剂量为 10 ELD50， 统计各试验组的死亡数， 计算其攻毒保护率。 1.10 拯救病毒遗传稳定性试验
     1.10.1 在 CEF 细胞上的稳定性
     将重组病毒在 CEF 细胞上连续传代至 15 代， 按 1.7.3 方法进行 IBDV 基因组片段 扩增和和测序分析。
     1.10.2 在 SPF 鸡上的遗传稳定性
     将重组病毒在 2 周龄 SPF 鸡上连续传代至 5 代。每代接种后连续观察 5 天 ； 然后 将其剖杀采集法氏囊， 按 1.7.3 方法进行 IBDV 基因组片段扩增和和测序分析。并将每代部 分法氏囊经 10％中性福尔马林固定后进行病理组织学观察。
     2、 试验结果
     2.1VP2 修饰、 替换与感染性分子克隆构建
     通 过 融 合 PCR 将 HLJ-0504 株 带 有 两 个 点 突 变 的 VP2 基 因 替 换 了 Gt 株 A 节 段 的 相 应 区 段，融 合 PCR 各 步 的 PCR 产 物 分 别 是 GtHLJ0504VP2I(203bp)、 GtHLJ0504VP2II(1327bp)、 GtHLJ0504VP2III(1938bp)、 GtHLJVP2HRT(3406bp)， 与预期相符 ( 图 3)。GtHLJVP2HRT 经 ClaI 和 KpnI 双酶切后被克隆入 pCAGGS， 得到的重组真核表达载 体命名为 pCAGGGtAHLJVP2HRT。测序结果证明， HLJ0504 株 VP2 基因被成功引入两个点突变 A889T/G980A ； 修饰后的 HLJ-0504 株 VP2 基因正确替换 Gt 株基因组相应区段 ； 重组 A 节段 5’ 端和 3’ 端分别存在核酶结构序列 HamRz 和 HdvRz ； 重组感染性克隆 pCAGGGtAHLJVP2HRT 构建正确。
     2.2 病毒拯救
     pCAGGGtAHLJVP2HRT 与 pCAGGGtBHRT 共转染组， 在 CEF 上传第三代时， 可见细胞 病变 (CPE)( 图 4) ； 第三代以后， CPE 更加明显 ； 接毒后 72h， 细胞碎裂但不悬浮， 折光性 增强， 呈砂砾状。而空载体对照组和正常细胞未见 CPE。将拯救获得的重组病毒命名为 rGtHLJVP2。
     2.3 重组病毒的鉴定
     2.3.1 重组病毒 IFA 检测
     抗 VP2 单克隆抗体介导的间接免疫荧光鉴定结果显示， rGtHLJVP2 感染 CEF 后可 检测到特异荧光信号 ( 图 5)。而未接毒对照组观察不到荧光信号。
     2.3.2 重组病毒电镜观察
     电镜下可观察到 rGtHLJVP2 细胞培养物上清中有直径 60nm 左右、 无囊膜的病毒粒 子， 这与 IBDV 特有的形态结构一致 ( 图 6)， 而非感染 CEF 细胞电镜下观察不到病毒粒子。
     2.3.3 重组病毒 RT-PCR 鉴定
     从 rGtHLJVP2 第四代毒中扩增 A、 B 节段部分片段， 获得了预期大小约为 1400bp、 1340bp 的片段。测序结果显示， 序列特征与预期一致， 即重组病毒 rGtHLJVP2 是以 Gt 株病 毒基因组为骨架， 其 VP2 基因被修饰后的 HLJ-0504 相应区段所替换。
     2.4 重组病毒复制特性研究
     2.4.1 体外复制特性
     依据感染 CEF 后不同时间段细胞培养液中病毒的 TCID50 效价， 绘制了重组病毒 rGtHLJVP2 和 Gt 对照毒的复制动力学曲线 ( 图 7)。重组病毒 rGtHLJVP2 与 Gt 具有相似的 复制动力学曲线， 接毒后 12h 可检测到病毒 ； 接毒后 48h-60h， 病毒滴度可达到 107TCID50/ml 以上。 2.4.2 体内复制特性
     应 用 real-time RT-PCR 测 定 了 拯 救 病 毒 rGtHLJVP2 和 Gt 对 照 毒 在 感 染 SPF 鸡后不同时间点内靶器官法氏囊中的病毒载量， 体内复制动力学曲线表明 ： 拯救病毒 rGtHLJVP2 与 Gt 在体内复制能力相当 ( 图 8)。
     2.5 重组病毒的致病性
     2.5.1 症状及剖检变化
     重组病毒 rGtHLJVP2 与 Gt 对照组和 DMEM 对照组一样， 在接种 SPF 鸡后的 14 天内， 试验鸡的精神状态良好， 未出现任何发病症状 ； 法氏囊及其它脏器未见到眼观病变。
     2.5.2 试验鸡的囊指数
     各试验组囊指数 (BBIX) 见图 9。重组病毒 rGtHLJVP2 与 Gt 对照组和 DMEM 对照组 一样， 在接种 SPF 鸡后的 14 天内， BBIX 均大于 0.7， 即法氏囊没有出现萎缩症状。
     2.5.3 试验鸡法氏囊的组织病理变化
     重组病毒 rGtHLJVP2 与 Gt 对照毒试验组， 仅在感染后 3 天 (3dp.i.) 和 5d p.i. 个 别淋巴滤泡内呈现淋巴细胞轻度减少， 之后法氏囊均无发现明显病理变化。DMEM 阴性对照 组法氏囊无明显病变 ( 图 10)。
     2.6 重组病毒的免疫效果评价
     2.6.1 试验鸡血清抗体的检测结果
     血清抗体检测结果见表 2。7d p.i.， 重组病毒 rGtHLJVP2 组有 80％鸡阳转， 对照 毒 Gt 试验组有 60％鸡阳转 ； 10d p.i. 后， rGtHLJVP2 组和 Gt 组均发生 100％阳转。抗体产 生情况见图 11， 7d p.i. 后， rGtHLJVP2 组抗体效价显著高于 Gt 组。DMEM 阴性对照组未检 测到特异性抗体。
     表 2 各试验组鸡血清抗体效价检测
     注： a 表示血清抗体阳转鸡只数 / 检测的鸡只
     2.6.2 攻毒保护试验
     攻毒结果显示， rGtHLJVP2 组在攻毒后连续 10 天观察期内未出现鸡只死亡， 保护 率达到 100％ (20/20) ； Gt 组有 1 只鸡死亡， 保护率为 95％ (19/20) ； 而 DMEM 组保护率仅为 15％ (3/20)。
     2.7 重组病毒 rGtHLJVP2 遗传稳定性
     2.7.1 重组病毒基因组序列的稳定性
     通过 RT-PCR， 从 rGtHLJVP2 在 CEF 细胞上的第 5、 10、 15 代病毒， 以及在 SPF 鸡上传 代的第 1、 5 代毒中扩增获得 A、 B 节段部分片段， 获得了预期大小约为 1400bp、 1340bp 的片 段。测序结果显示， 序列特征与 rGtHLJVP2 一致， 在 CEF 细胞和 SPF 鸡上传代均未发生额外 突变。
     2.7.2 重组病毒复制滴度的稳定性
     重组病毒 rGtHLJVP2 在 CEF 细胞上的第 8 代和第 15 代滴度分别为 107TCID50/ml、 107.2TCID50/ml， 差异不显著。
     2.7.3 重组病毒致病力的稳定性
     重组病毒 rGtHLJVP2 在 SPF 鸡上盲传 5 代， 接种鸡未出现任何临床症状 ； 剖检和病 理切片均显示， 法氏囊及其它脏器未出现显著特征性病理变化。说明重组病毒 rGtHLJVP2 未出现致病力返强现象。
     试验例 1 rGtHLJVP2 的免疫学评价试验
     1 材料和方法
     1.1 材料
     1.1.1 病毒和实验动物
     HLJ-0504 和 vvIBDV 均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所菌毒种室 ( 对 外)； Gt， IBDV 弱毒疫苗株， 由本课题组将 vvIBDV Gx 株连续传代致弱并保存， 具体方法可 参考有关文献 (Wang X M， Zeng X W， Gao H L， et al.Changes in VP2 gene during the attenuation of very virulent infectious bursaldisease Virus strain Gx isolated in China.Avian Dis.， 2004， 48 ： 77-83 ； Wang， X.， Zhang H.， Gao H.， et al.Changes in VP3 and VP5 genes during the attenuation ofvery virulent infectious bursal disease virus strain Gx isolated in China.VirusGenes， 2007， 34 ： 67-73.)。
     B87 疫苗， 为 IBDV 中等毒力活疫苗 ( 可通过生物制品公司购买得到 )。
     SPF 鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供， 饲养于超滤负压 隔离器中。
     1.2.2 主要试剂
     鸡淋巴细胞分离液 (LTS-1090) 购于天津灏洋生物制品科技有限责任公司 ； Mouse Anti-Chicken CD4-FITC、 Mouse Anti-Chicken CD8b-RPE、 Mouse Anti-Chicken CD3-SPRD、 Mouse IgG1-FITC、 Mouse IgG2a-RPE、 Mouse IgG1-SRPD 购于 SouthernBiotech 公司 ； 肝素 钠 (GMS12059.5) 购于 Invitrogen 公司 ； 鸡 γ-IFN ELISA KIT、 鸡 IL-2 ELISA KIT、 鸡 IL-4 ELISAKIT 为 SAN JOSE 产品。
     1.2 试验分组与免疫
     随机将 14 日龄的 SPF 鸡分为 4 组， 每组 50 只， 各组鸡均单独饲养在负压超滤隔离 器中。所有鸡只均通过滴鼻点眼途径免疫， 7 日龄首免， 间隔一周进行二免。第 1 组免疫 105 TCID50 的重组病毒 rGtHLJVP2， 第 2 组免疫 105TCID50 弱毒疫苗株 Gt， 第 3 组免疫 103ELD50 中 等毒力疫苗 B87， 第 4 组为 DMEM 对照组。第二次免疫剂量和途径同一免。
     1.3 血清抗体检测
     分别在第一次免疫后 7 天， 第二次免疫后 7、 14、 21 天采血并分离血清， 置于 -70℃。 用 IDEXX IBDV Antibody Test Kit 检测上述试验设计中所分离血清的抗体水平， 滴度大于 396 判为阳性。
     1.4 疫苗株致病力评估
     分别在第二次免疫后 7、 14、 21 天每组随机剖杀 10 只鸡， 观察各脏器尤其是法氏 囊的病变。同时称量实验鸡体重和法氏囊的重量， 计算囊重比和囊指数 ； 将其每个法氏 囊分为两部分， 一部分用 10％中性福尔马林固定， 进行病理组织学分析 ； 另一部分则用于 Real-time RT-PCR 病毒载量的检测。
     1.4.1 囊重比与囊指数
     分别称取鸡的体重和法氏囊重量， 统计分析后， 计算囊重比 (Bursalof fabricius weight/Body weight ratio， F/B) 和囊指数 (BBIX)。 F/B ＝ ( 法氏囊重 / 体重 )X1000 ； BBIX ＝试验组鸡囊重比 / 空白对照组鸡囊肿比 ； 当 BBIX ＜ 0.7 时， 判为法氏囊萎缩。
     1.4.2 法氏囊组织病理学观察
     观察和分析法氏囊病理切片， 判断组织学病变分值 (Thehistopathologic bursal lesion score， HBLS)。根据法氏囊病理组织学变化 ( 淋巴细胞坏死、 淋巴滤泡萎缩或减少 等 ) 的不同程度， 将其分为 5 个分值 ： 1， 没有任何病变 ； 2， 散在的或部分滤泡病变 ； 3， 小于 或等于 50％的滤泡发生病变 ； 4， 50％ -75％的滤泡发生病变 ； 5， 75％ -100％的滤泡发生病 变。每组各时间点的 HBLS 为 3 只鸡的平均数。
     1.5 疫苗株在法氏囊中的载量检测
     从二免后 7、 14、 21 天的法氏囊中常规方法提取 RNA， 用 real-timeRT-PCR 检测病毒 载量。
     1.6 攻毒保护试验
     第二次免疫后 21 天， rGtHLJVP2 组、 Gt 组、 B87 组、 DMEM 组各剩余免疫鸡 20 只。用 地方流行超强毒株 HLJ-0504 对每组鸡进行攻毒， 以检测疫苗株的攻毒保护效果， 途径为滴 4 鼻点眼， 攻毒剂量为 10 ELD50。攻毒后连续观察 10 天， 统计各试验组的死亡数， 计算其攻毒 保护率。并在攻毒后 3， 7， 10 天采集血清。
     2 试验结果
     2.1 试验鸡血清抗体水平比较各试验组的抗体消长曲线见图 12。一免后和二免后， rGtHLJVP2、 Gt 及 B87 试验组 的抗体水平逐步升高 ； rGtHLJVP2 组和 B87 组抗体消长曲线基本一致 ； rGtHLJVP2 组和 B87 组的抗体效价明显高于 Gt 组， 其中二免后第 3 周， rGtHLJVP2 组和 B87 组的抗体效价比 Gt 组高 2 倍。攻毒后， 各组抗体效价短暂小幅下降后， 快速回升。
     2.2 疫苗株的致病力比较
     2.2.1 试验鸡的囊指数
     依据各试验组的囊指数 (BBIX) 绘制的法氏囊病理动态变化曲线见图 13。1) rGtHLJVP2 与 Gt 试验组， 除二免后 1 周 (7d p.i.) 外， 在免疫后各试验期内均没有出现法 氏囊萎缩的症状， 即 BBIX 均大于 0.7 ； 2)rGtHLJVP2 组与 Gt 组法氏囊的变化趋势基本一 致； 3) 疫苗组 B87 试验组各时期内法氏囊都处于严重的萎缩状态， 免疫期内其 BBIX 值介于 0.21-0.37 之间， 明显低于 rGtHLJVP2 与 Gt 试验组。
     2.2.2 试验鸡法氏囊的组织病理变化
     各实验组的法氏囊组织病理变化见图 14， 组织学病变分值见表 3。
     1)rGtHLJVP2 与 Gt 试验组相似， 在整个免疫期内， 法氏囊基本正常， 仅个别淋巴滤 泡出现轻度减少， 组织学病变分值 HBLS 均小于 2。2)B87 疫苗对照组对法氏囊的病理损伤 很严重， 法氏囊滤泡体积萎缩， 滤泡内淋巴细胞显著减少， 间质内成纤维细胞增生， HBLS 始 终为 5。
     表 3 各试验组鸡法氏囊的 HBLS
     2.3 试验鸡法氏囊病毒载量的检测
     二免后， rGtHLJVP2 组、 B87 组以及 Gt 组的法氏囊中均能检测到 IBDV， 病毒载量均 在 1000 拷贝 /g 组织以上 ( 图 15)。
     2.4 疫苗株免疫保护效果比较
     2.4.1 对致死率的保护
     攻毒保护实验结果显示， rGtHLJVP2 和 B87 试验组在攻毒后连续 10 天观察期内未 出现鸡只死亡， 保护率达到 100％ (20/20) ； Gt 组有 1 只鸡死亡， 保护率为 95％ (19/20) ； 而 DMEM 组攻毒后， 只有 3 只鸡存活， 其保护率仅为 15％ (3/20)。
     2.4.2 对法氏囊损伤的保护
     rGtHLJVP2 与 Gt 免疫组， 即使在 vvIBDV 攻击后， 其法氏囊仍然没有发生萎缩， 而 B87 组和 Gt 组在 vvIBDV 攻击后 BBIX 分别降到了 0.18 和 0.13 的极低水平 ( 图 14 和表 3)。
     rGtHLJVP2 与 G t 试验组在 vvIBDV 攻击后法氏囊能保持基本正常状态， 仅个别淋 巴滤泡出现减少 ； 而 B87 疫苗对照组和 DMEM 对照组一样， 在 vvIBDV 攻击后法氏囊病理变化 更加严重 ( 图 14)。
     目前防控 vvIBDV 的活疫苗主要有 2 类 ： 弱毒活疫苗、 中等或中等偏强毒力活疫苗。 本试验利用 SPF 鸡比较和评价了 IBDV 重组弱毒疫苗株 rGtHLJVP2 与弱毒疫苗 Gt、 中等毒力 疫苗 B87 的免疫效力和安全性。在免疫效果上， rGtHLJVP2 和中等毒力疫苗 B87 相当， 优于 弱毒疫苗株 Gt ； 在安全性上， rGtHLJVP2 和弱毒疫苗株 Gt 一样对 SPF 鸡无致病性， 但中等毒 力疫苗 B87 对法氏囊造成了严重萎缩和不可逆病理损伤。本发明重组病毒 rGtHLJVP2 具备 了作为疫苗株的高效、 低毒的特点， 可以用于 IBD 的防控。