一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法 【技术领域】
本发明涉及一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法。背景技术 很多农艺性状包括作物产量性状、 代谢途径、 蛋白复合体及信号传导途径等受 多基因控制。遗传操纵多个基因无论对于基础研究还是生物工程均具有重要的应用 前 景。 金 大 米 (Ye X， Al Babili S， Kloti A， Zhang J， Lucca P， Beyer P， Potrykus I(2000)Engineering theprovitamin A(beta-carotene)biosynthetic pathway into(carotenoid-free)riceendosperm.Science 287 ： 303-305) 和 紫 番 茄 (Butelli E， Titta L， Giorgio M， Mock HP， Matros A， Peterek S， Schijlen EG， Hall RD， Bovy AG， Luo J， Martin C(2008)Enrichmentof tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of selecttranscription factors.Nat Biotechnol 26 ： 1301-1308) 的培 育即是多基因转基因作物的两个成功案例。 将多个基因组装到同一个表达载体转化作物是 培育多基因转基因作物直接和高效的方法， 但这一方法的限制因子是表达载体的构建。因 为很难找到合适的酶切位点， 当使用传统的酶切连接方法将 5 个以上的基因组装到同一个 表达载体上时将非常困难。
为此， 几个研究小组建立了几种方便多基因组装的方法， 包括基于归位内切酶 建立的 pRCS/pAUX 和 pSAT 载体系统 (Goderis IJ， De Bolle MF， Francois IE， Wouters PF， BroekaertWF， Cammue BP(2002)A set of modular plant transformation vectors allowing flexibleinsertion of up to six expression units.Plant Mol Biol 50 ： 17-27 ； Tzfira T， TianGW， Lacroix B， Vyas S， Li J， Leitner-Dagan Y， Krichevsky A， Taylor T， Vainstein A， Citovsky V(2005)pSAT vectors ： a modular series of plasmids for autofluorescentprotein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol Biol 57 ： 503-516 ； Dafny-Yelin M， Tzfira T(2007)Delivery of multiple transgenes to plant cells.PlantPhysiol 145 ： 1118-1128)， 基于 Cre/loxP 和归位内切 酶建立的的载体系统 (Lin L， Liu YG， Xu X， Li B(2003)Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigeneassembly and transformation vector system. Proc Natl Acad Sci U S A 100 ： 5962-5967) 以及基于 Gateway 技术建立的 MultiRound Gateway(Chen QJ， Zhou HM， Chen J， Wang XC(2006)A Gateway-based platform for multigene plant transformation.Plant Mol Biol 62 ： 927-936)。 然而， 使用上述方法进 行多基因组装仍然比较费时、 费力和费钱。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法。
本发明提供的构建同时表达两个以上基因的重组表达载体的方法， 命名为 MISSA， 包括交替进行的两组重组 ； 第一组重组 ： 将类型 I 供体菌与类型 I 受体菌共培养， 类型 I 供体菌中的目标基因整合到类型 I 受体菌中的类型 I 受体载体上， 得到重组菌 ； 第二组重组 ： 将类型 II 供体菌与类型 II 受体菌共培养， 类型 II 供体菌中的目标基因整合到类型 II 受 体菌中的类型 II 受体载体上， 得到重组菌 ； 两组重组各进行一次以上， 将两个以上的目标 基因组装到同一受体载体上 ；
所述类型 I 受体菌为如下 (a) 或 (b) ：
(a) 将类型 I 受体载体导入出发菌 A 得到的重组菌 ；
(b) 所述第二组重组得到的重组菌 ；
所述类型 II 受体菌为如下 (c) 或 (d) ：
(c) 将类型 II 受体载体导入出发菌 A 得到的重组菌 ；
(d) 所述第一组重组得到的重组菌 ；
所述类型 I 受体菌在所述第一组重组后转变为所述类型 II 受体菌 ； 所述类型 II 受体菌在所述第二组重组后转变为所述类型 I 受体菌 ； 所述类型 I 受体载体在所述第一组 重组后转变为所述类型 II 受体载体 ； 所述类型 II 受体载体在所述第二组重组后转变为所 述类型 I 受体载体 ；
所述出发菌 A 为满足如下条件的大肠杆菌 ： 含有 Cre 重组酶编码基因和 λ 噬菌体 位点特异性重组蛋白编码基因 ； 所述类型 I 受体载体满足如下条件 ： 容量为 100-300kb、 单拷贝、 含有 loxP-attR2 框； loxP-attR2 框的功能如下 ： loxP 位点在 Cre 重组酶作用下与另一载体上的 loxP 位点 发生特异性重组 ； attR2 位点在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的 attL2 位点发生特异性重组 ；
所述类型 II 受体载体满足如下条件 ： 容量为 100-300kb、 单拷贝、 含有 loxP-attL1 框； loxP-attL1 框的功能如下 ： loxP 位点在 Cre 重组酶作用下与另一载体上的 loxP 位点 发生特异性重组 ； attL1 位点在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的 attR1 位点发生特异性重组 ；
所述类型 I 供体菌是将类型 I 供体载体导入出发菌 B 得到的 ； 所述类型 I 供体载 体满足如下条件 ： 不能在受体菌中复制、 含有接合转移必须元件 oriT 和 loxP-attL1-attL2 框、 目标基因位于 attL1 位点和 attL2 位点之间 ； loxP-attL1-attL2 框的功能如下 ： loxP 位 点在 Cre 重组酶作用下与另一载体上的 loxP 位点发生特异性重组 ； attL1 位点在 λ 噬菌体 位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的 attR1 位点发生特异性重组， 形成 attB1 位 点； attL2 位点在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的 attR2 位点发生 特异性重组， 形成 attB2 位点 ；
所 述 类 型 II 供 体 菌 是 将 类 型 II 供 体 载 体 导 入 出 发 菌 B 得 到 的 ； 所述类 型 II 供体载体满足如下条件 ： 不能在受体菌中复制、 含有接合转移必须元件 oriT 和 loxP-attR2-attR1 框， 目标基因位于 attR1 位点和 attR2 位点之间 ； loxP-attR2-attR1 框 的功能如下 ： loxP 位点在 Cre 重组酶作用下与另一载体上的 loxP 位点发生特异性重组 ； attR1 位点在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的 attL1 位点发生特异 性重组， 形成 attB1 位点 ； attR2 位点在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载 体上的 attL2 位点发生特异性重组反应， 形成 attB2 位点 ；
所述类型 I 供体菌和 / 或所述 II 供体菌中， 出发菌 B 为满足如下条件的大肠杆菌 ：
含有接合转移蛋白 Tra 的编码基因和自杀载体的复制起始蛋白的编码基因。
所述方法在应用中， 可自第二次重组开始， 每次重组都以上一次重组得到的重组 菌作为受体菌与类型 I 供体菌或类型 II 供体菌共培养 ； 类型 I 供体菌和类型 II 供体菌交 替采用 ； 类型 I 受体菌和类型 II 受体菌交替转换。
所述类型 I 供体载体为 (1) 或 (2) 或 (3) ； 所述类型 II 供体载体为 (4) 或 (5) 或 (6) ；
(1) 将目标基因插入载体 pL-ccdB 的 attL1 位点和 attL2 位点之间得到的重组质 粒； (2) 将目标基因插入载体 pLC-ccdB 的 attL1 位点和 attL2 位点之间得到的重组质粒 ； (3) 通过 Gateway BP 反应将目标基因插入载体 pP-ccdB 的 attP1 位点和 attP2 位点之间得 到的重组质粒 (Gateway BP 反应后 attP1-attP2 框转变为 attL1-attL2 框 ) ； (4) 将目标基 因插入载体 pR-ccdB 的 attR1 位点和 attR2 位点之间得到的重组质粒 ； (5) 将目标基因插入 载体 pRG-ccdB 的 attR1 位点和 attR2 位点之间得到的重组质粒 ； (6) 通过 Gateway BP 反应 将目标基因插入载体 pPr-ccdB 的 attP2 位点和 attP1 位点之间得到的重组质粒 (Gateway BP 反应后 attP2-attP1 框转变为 attR2-attR1 框 ) ；
所述载体 pL-ccdB 自上游至下游依次包括 ： loxP 位点、 attL1 位点、 ccdB 基因、 pUC\origin、 attL2 位点、 sacB 基因、 抗性筛选基因和 oriT 位点 ； 所述载体 pLC-ccdB 自上 游至下游依次包括 ： loxP 位点、 抗性筛选基因、 attL1 位点、 ccdB 基因、 pUC\origin、 attL2 位点、 sacB 基因、 oriR6kγ 和 oriT 位点 ； 所述载体 pR-ccdB 自上游至下游依次包括 ： loxP 位点、 attR2 位点、 ccdB 基因、 pUC\origin、 attR1 位点、 sacB 基因、 抗性筛选基因、 oriR6kγ 和 oriT 位点 ； 所述载体 pRG-ccdB 自上游至下游依次包括 ： loxP 位点、 抗性筛选基因、 attR2 位点、 ccdB 基因、 pUC\origin、 attR1 位点、 sacB 基因、 oriR6kγ 和 oriT 位点 ； 所述载体 pP-ccdB 自上游至下游依次包括 ： loxP 位点、 attP1 位点、 pUC\origin、 ccdB 基因、 attP2 位 点、 sacB 基因、 抗性筛选基因、 oriR6kγ 和 oriT 位点 ； 所述载体 pPr-ccdB 自上游至下游依 次包括 ： loxP 位点、 attP2 位点、 pUC\origin、 ccdB 基因、 attP1 位点、 sacB 基因、 抗性筛选 基因、 oriR6kγ 和 oriT 位点 ；
所述类型 I 受体载体可为载体 TAC-RTL、 载体 TAC-LTR、 载体 BIBAC-RTL 或载体 BIBAC-LTR ； 所述载体 TAC-RTL 自上游至下游依次包括 ： RB、 attR2 位点、 loxP 位点、 LB、 抗性 筛选基因、 pRiA4\ori 和 P1\ori ； 所述载体 TAC-LTR 自上游至下游依次包括 ： RB、 loxP 位点、 attR2 位点、 LB、 抗性筛选基因、 pRiA4\ori 和 P1\ori ； 所述载体 BIBAC-RTL 自上游至下游依 次包括 ： RB、 attR2 位点、 loxP 位点、 LB、 抗性筛选基因、 F\ori、 pRiA4\ori 和 oriT 位点 ； 所 述载体 BIBAC-LTR 自上游至下游依次包括 ： RB、 loxP 位点、 attR2 位点、 LB、 抗性筛选基因、 F\ori、 pRiA4\ori 和 oriT 位点。
所述 RB 为 T-DNA 右边界 ； 所述 LB 为 T-DNA 左边界 ； 所述抗性筛选基因为卡那霉素 抗性基因 (KnR)、 氯霉素抗性基因 (CmR) 或硫酸庆大霉素抗性基因 (GmR)。
所述 loxP 位点的核苷酸序列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 1 至 34 位所示 ； 所述 attL1 位点的核苷酸序列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 423 至 522 位所示 ； 所述 ccdB 基 因的核苷酸序列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 673 至 978 位所示 ； 所述 pUC\origin 的核 苷酸序列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 1102 至 1775 位所示 ； 所述 attL2 位点的核苷酸序 列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 2165 至 2264 位所示 ； 所述 sacB 基因的核苷酸序列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 2401 至 3822 位所示 ； 所述氯霉素抗性基因 (CmR) 的核苷酸序列 如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 4403 至 5110 位所示 ； 所述 oriR6kγ 的核苷酸序列如序列 表的序列 1 自 5’ 末端第 5169 至 5522 位所示 ； 所述 oriT 位点的核苷酸序列如序列表的序 列 1 自 5’ 末端第 5530 至 5851 位所示 ； 所述硫酸庆大霉素抗性基因 (GmR) 的核苷酸序列如 序列表的序列 4 自 5’ 末端第 290 至 823 位所示 ； 所述 attR2 位点的核苷酸序列如序列表的 序列 3 自 5’ 末端第 430 至 554 位所示 ； 所述 attR1 位点的核苷酸序列如序列表的序列 3 自 5’ 末端第 2210 至 2334 位所示 ； 所述 attP1 位点的核苷酸序列如序列表的序列 5 自 5’ 末端 第 424 至 655 位所示 ； 所述 attP2 位点的核苷酸序列如序列表的序列 5 自 5’ 末端第 2305 至 2536 位所示。
所述载体 pL-ccdB 的核苷酸序列如序列表的序列 1 所示 (GenBank accession numbers ： GU574771) ； 所述载体 pLC-ccdB 的核苷酸序列如序列表的序列 2 所示 (GenBank accessionnumbers ： GU574773) ； 所述载体 pR-ccdB 的核苷酸序列如序列表的序列 3 所示 (GenBankaccession numbers ： GU574774) ； 所述载体 pRG-ccdB 的核苷酸序列如序列表的序 列 4 所示 (GenBank accession numbers ： GU574776) ； 所述载体 pP-ccdB 的核苷酸序列如序 列表的序列 5 所示 (GenBank accession numbers ： GU574772) ； 所述载体 pPr-ccdB 的核苷酸 序列如序列表的序列 6 所示 (GenBank accession numbers ： GU574775)。所述载体 TAC-RTL 的核苷酸序列如 GenBank accession numbers ： GU574777 所示 ； 所述载体 TAC-LTR 的核苷 酸序列如 GenBank accession numbers ： GU574778 所示 ； 所述载体 BIBAC-RTL 的核苷酸序 列如 GenBank accession numbers ： GU574779 所示 ； 所述载体 BIBAC-LTR 的核苷酸序列如 GenBank accession numbers ： GU574780 所示。
所述出发菌 B 为大肠杆菌 BW20767 或具有类似功能特征的其它大肠杆菌菌株 ； 所 述出发菌 A 为将 pAH57-cre 转化大肠杆菌 DH10B 得到的重组菌或具有类似功能特征的其它 大肠杆菌菌株。所述 pAH57-cre 的制备方法如下 ： 以序列表的序列 7 所示 DNA(CreF) 和序 列表的序列 8 所示 DNA(CreR) 为引物， 以大肠杆菌 SW106 的的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 BstXI 和 NheI 酶切， 得到酶切产物 ； 用限制性内 切酶 BstXI 和 NheI 酶切 pAH57， 得到载体骨架 ； 将酶切产物和载体骨架连接， 得到重组质粒 pAH57-cre。
所述方法可用于多基因表达。
所述方法在可用于培育转基因动物、 转基因植物或转基因微生物。
应用所述方法培育得到的转基因植物、 动物或微生物也属于本发明的保护范围。
MISSA 系统由菌株和载体组成。 菌株包括供体菌和受体菌， 载体包括供体载体和受 体载体。供体菌染色体上携带的复制起始蛋白 Pir 负责供体载体的复制扩增， 携带的接合 转移蛋白 Tra 负责供体载体的接合转移。受体菌能够诱导表达两套位点特异性重组蛋白 ： Cre 重组酶 ( 表达受阿拉伯糖诱导， 受葡萄糖抑制 ) 和 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白 ( 包 括 Int， Xis 和 IHF， 表达受 42℃热击诱导 )。当混和供体菌和受体菌时， 供体菌和受体菌发 生接合生殖， 供体菌中的供体载体由于携带 oriT 元件而转移到受体菌中 ； 在受体菌中供体 载体和受体载体在两套位点特异性重组酶的作用下发生重组反应。
受体载体含 loxP-attR2 或 loxP-attL1 框， 来自单拷贝高容量的 TAC 或 BIBAC 载 体； 供体载体由 pL 和 pR 两个系列组成 ； pL 系列供体载体含 loxP-attL1-attL2 框， pR 系列的供体载体含 loxP-attR2-attR1 框， 基因或表达框或功能 DNA 元件位于 attL1 和 attL2 之 间或 attR2 和 attR1 之间。多轮的体内重组过程由 pL 系列和 pR 系列的供体载体交替与 受体载体进行的重组反应构成。每轮重组反应由两个重组事件构成 ： 供体载体首先在 Cre/ loxP 介导下重组进而整合到受体载体， 然后在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白介导下重组 进而去除多余的 loxP 位点和载体骨架序列。由于上轮重组反应引入了下轮重组反应的序 列特异性位点 (attL1 或 attR2)， 重组反应可以循环进行下去。这样， 经过多轮循环重组反 应， 可以将多个基因组装到表达载体上。图 1 和图 2 为 MISSA 载体系统及组装原理示意图， 图 2 与图 1 的区别在于供体载体中抗性筛选基因的位置不同 ； A： MISSA 载体由受体载体和 供体载体构成 ； B 和 C 为 MISSA 体内重组反应 ； R2 代表 attR2， L1 代表 attL1， L2 代表 attL2， G1 代表要表达的第一个目的基因， R2 代表 attR2， R1 代表 attR1， G2 代表要表达的第二个 目的基因 ； Kn， 卡那霉素 ； Ap， 氨苄青霉素 ； Cm， 氯霉素 ； Glu， 葡萄糖 ； Suc， 蔗糖。
供体载体是将目的基因插入骨架载体得到的， 可通过酶切连接的方法用功能性 DNA 序列取代骨架载体 pL-/pR-/pLC-/pRG-ccdB 中的 pUC_ori-ccdB 框来获得功能型 pL-/ pLC- 和 pR-/pRG- 供体载体， 也可通过 Gateway BP 克隆 (Invitrogen) 的方法取代 pP-/ pPr-ccdB 中的 pUC_ori-ccdB 框获得 pL-/pR- 系列的供体载体。pLC- 与 pL- 系列的供体载 体相似， 所不同的是前者的细菌筛选标记基因位于 loxP 和 attL1 之间 ； pRG- 与 pR- 系列的 供体载体相似， 所不同的是前者的细菌筛选标记基因为庆大霉素抗性基因， 且位于 loxP 和 attR2 之间。
发明人基于细菌接合生殖和两套体内位点特异性重组系统建立了省时、 省力和省 钱的多基因组装方法， 命名为 MISSA(multiple-round in vivo site-specific assembly， 多轮体内位点特异性组装 )。当使用 MISSA 技术进行多基因组装时， 一旦将目标基因构建 到供体载体上， 剩下的工作就是混和供体菌和受体菌等极其简单的实验， 不需要额外的体 外分子操作， 不需要购买昂贵的重组酶， 在大大节约成本的同时极大地提高了工作效率。 因 此， MISSA 是一种省时、 省力和省钱的多基因组装技术。 附图说明
图 1 为 MISSA 载体系统及组装原理示意图 ； 图 2 为第二套 MISSA 供体载体及组装原理图 ； 图 3 为十种重组质粒的结构示意图 ；具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。
pDNR-Dual ： 购自 BD Biosciences Clontech， 产品目录号 639610。pENTR1A ： 购 自 Invitrogen， 产品目录号 A10462。pDONR221 ： 购自 Invitrogen， 产品目录号 12536017。 pUC18 ： 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司， 目录号 ： D3218。
pGWC ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Chen QJ， Zhou HM， Chen J，Wang XC(2006)Using a modified TA cloning method to create entry clones.Anal Biochem 358 ： 120-125。pL34R12-CmR-ccdB 和 pL12R34sB-EGFP ： 公众可以从中国农业大 学获得 ； 参考文献 ： Chen QJ， Zhou HM， Chen J， Wang XC(2006)A Gateway-based platform for multigeneplant transformation.Plant Mol Biol 62 ： 927-936。pBSL238 ：公 众 可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Alexeyev MF， Shokolenko IN(1995)RP4 oriT and RP4 oriT-R6K oriVDNA cassettes for construction of specialized vectors. Biotechniques 19 ： 22-4， 26。pGL12 ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Chen QJ， Zhou HM， Chen J， Wang XC(2006b)Using a modified TA cloning method to create entry clones.Anal Biochem 358 ： 120-125。pMDC99 ： 公众可以从中国农业大学获 得； 参考文献 ： Curtis MD， Grossniklaus U(2003)Agateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.Plant Physiol 133 ： 462-469。 pL12R34sB-MAR ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： ChenQJ， Zhou HM， Chen J， Wang XC(2006a)A Gateway-based platform for multigene planttransformation. Plant Mol Biol 62 ： 927-936。pBI121 ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： De AF， Patti T， Marchetti S(2007)Improvement of the pBI121 plantexpression vector by leader replacement with a sequence combining a poly(CAA)anda CT motif. Transgenic Res 16 ： 731-738。pGalK ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Warming S， Costantino N， Court DL， Jenkins NA， Copeland NG(2005)Simple andhighly efficient BAC recombineering using galK selection.Nucleic Acids Res 33 ： e36。pCH20 ： 公众 可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Hamilton CM， Frary A， Lewis C， TanksleySD(1996) Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A 93 ： 9975-9979。pAH57 ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参 考 文 献： Haldimann A， Wanner BL(2001)Conditional-replication， integration， excision， and retrieval plasmid-host systems for gene structure-function studies of bacteria.J Bacteriol 183 ： 6384-6393。pYLTAC747 ： 公众可以从中国农业大学获 得； 参考文献 ： Lin L， Liu YG， Xu X， Li B(2003)Efficient linking and transfer of multiple genes by amultigene assembly and transformation vector system.Proc Natl Acad Sci U S A 100 ： 5962-5967。大肠杆菌 BW20767 ： 公众可以从中国农业大学获 得； 参考文献 ： Metcalf WW， JiangW， Daniels LL， Kim SK， Haldimann A， Wanner BL(1996) Conditionally replicative andconjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning， mutagenesis， and allelereplacement in bacteria.Plasmid 35 ： 1-13。大肠 杆菌 SW106 ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Warming S， Costantino N， Court DL， Jenkins NA， Copeland NG(2005)Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.Nucleic AcidsRes 33 ： e36。大肠杆菌 DH10B ： 公众可以从中国 农业大学获得 ； 参考文献 ： Durfee T et al.(2008)The complete genome sequence of Escherichia coli DH10B ： insights into thebiology of a laboratory workhorse.J Bacteriol 190 ： 2597-606。
表 1 实施例中各个名称引物对应的核苷酸序列
实施例 1、 重组表达载体
一、 构建 CmR 基因表达框
1、 以 CmF01 和 CmR01 为引物， 以 pGWC 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
2、 以 CmF02 和 CmR01 为引物， 以步骤 1 的 PCR 扩增产物为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
3、 用限制性内切酶 BamHI 和 SalI 酶切 pL34R12-CmR-ccdB ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤 2 的 PCR 扩增产物连接， 得到 重组质粒 pL34R12-Cm+。
二、 去除 oriR6KγHindIII 位点
1、 重组质粒 pL4R2mVT 的构建
①以 CmF03 和 CmR02 为引物， 以 pL34R12-Cm+ 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩 增产物用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pL34R12-CmR-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL34R12-Cm2 ；
④用限制性内切酶 SacI 和 SmaI 酶切 pBSL238， 回收小片段 ；
⑤用限制性内切酶 SacI 和 SmaI 酶切 pL34R12-Cm2， 回收载体骨架 ；
⑥将步骤④的小片段和步骤⑤的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL34R12-CVT ；
⑦用限制性内切酶 AflII 和 HindIII 酶切 pL34R12-CVT， 回收载体骨架 ；
⑧将 omVF 和 omVR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤⑦的载体骨架连接， 得到重 组质粒 pL4R2mVT。
2、 重组质粒 pVTm3 的构建
①用限制性内切酶 NheI 和 EcoRI 酶切 pL34R12-CVT， 回收载体骨架 ；
②将 oASF 和 oASR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤①的载体骨架连接， 得到重 组质粒 pVTm1 ；
③用限制性内切酶 HindIII 酶切 pVTm1 ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶切使 其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架自连， 得到重组质粒 pVTm2 ；
④用限制性内切酶 DraI 和 NheI 酶切 pVTm2 ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶 切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架自连， 得到重组质粒 pVTm3。
三、 去除 sacB 的 KpnI 和 SacII 位点
1、 pDNR-Dual 经 NotI 酶切后自连， 得到质粒 pSacB ；
2、 用限制性内切酶 KpnI 和 SacII 酶切 pSacB， 回收载体骨架 ；
3、 将 omsBF 和 omsBR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤 2 的载体骨架连接， 得到 重组质粒 pSacBm。
四、 携带 loxP 位点的供体载体骨架的构建
1、 重组质粒 pAVTCsB 的构建
①以 CmF 和 CmR 为引物， 以 pL34R12-Cm+ 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产 物；
②用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pUC18 ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚 酶酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤①的 PCR 扩增产物连接， 得到重组质 粒 pUC18-Cm ；
③用限制性内切酶 NcoI 和 SalI 酶切 pUC18-Cm， 回收载体骨架 ；
④将 oloxPF 和 oloxPR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤③的载体骨架连接， 得 到重组质粒 pUC18-loxP ；
⑤以 CmF2 和 CmR2 为引物， 以 pL34R12-Cm+ 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增 产物用限制性内切酶 NotI 和 NcoI 酶切， 得到酶切产物 ；
⑥用限制性内切酶 NotI 和 NcoI 酶切 pUC18-loxP， 回收载体骨架 ；
⑦ 将 步 骤 ⑤ 的 酶 切 产 物 和 步 骤 ⑥ 的 载 体 骨 架 连 接， 得到重组质粒 pUC18-loxP-Cm ；
⑧以 sacBF 和 sacBR 为引物， 以 pSacBm 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产 物用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切， 得到酶切产物 ；
⑨用限制性内切酶 NotI 和 XhoI 酶切 pUC18-loxP-Cm， 回收载体骨架 ；
⑩ 将 步 骤 ⑧ 的 酶 切 产 物 和 步 骤 ⑨ 的 载 体 骨 架 连 接， 得到重组质粒 pUC18-loxP-CsB ；
以 oriVTF 和 oriVTR 为引物， 以 pL4R2mVT 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩 用限制性内切酶 XbaI 和 NcoI 酶切 pUC18-loxP-CsB， 回收载体骨架 ； 将步骤 的酶切产物和步骤 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pAVTCsB。增产物用限制性内切酶 NheI 和 BspHI 酶切， 得到酶切产物 ；
2、 重组质粒 pAGVTsB 的构建
①以 oriVTF2 和 oriVTR 为引物， 以 pVTm3 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增 产物用限制性内切酶 XhoI 和 BspHI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 XhoI 和 NcoI 酶切 pUC18-loxP-Cm， 回收载体骨架 ；
③ 将 步 骤 ① 的 酶 切 产 物 和 步 骤 ② 的 载 体 骨 架 连 接， 得到重组质粒 PUC18-loxP-VT ；
④以 sacBF 和 sacBR 为引物， 以 pSacBm 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产 物用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切， 得到酶切产物 ；
⑤用限制性内切酶 NotI 和 XhoI 酶切 pUC18-loxP-VT， 回收载体骨架 ；
⑥ 将 步 骤 ④ 的 酶 切 产 物 和 步 骤 ⑤ 的 载 体 骨 架 连 接， 得到重组质粒pUC18-loxP-VTsB ；
⑦以 CmF3 和 CmR3 为引物， 以 pL34R12-Cm+ 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产 物；
⑧用限制性内切酶 SalI 酶切 pUC-loxP-VTsB ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶 酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤⑦的 PCR 扩增产物连接， 得到重组质粒 pACVTsB ；
⑨以 GmF 和 GmR 为引物， 以 pGWG 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
⑩用限制性内切酶 SalI 酶切 pUC-loxP-VTsB ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶 酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤⑨的 PCR 扩增产物连接， 得到重组质粒 pAGVTsB。
五、 attR2-attR1 框的构建
1、 以 ApF2 和 ApR2 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
2、 用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pL34R12-CmR-ccdB ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤 1 的 PCR 扩增产物连接， 得到 重组质粒 pL34R12-A ； 3、 用限制性内切酶 PacI 和 BspHI 酶切 pL34R12-A， 回收载体骨架 ；
4、 将 oPaBsF 和 oPaBsR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤 3 的载体骨架连接， 得 到重组质粒 pL3R12-A ；
5、 用限制性内切酶 AscI 和 AflII 酶切 pL3R12-A， 回收载体骨架 ；
6、 将 oAsAfF 和 oAsAfR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤 5 的载体骨架连接， 得 到重组质粒 pR-GA ；
7、 以 ccdBF 和 ccdBR 为引物， 以 pENTR1A 为模板进行 PCR 扩增， 将 PCR 扩增产物用 限制性内切酶 BspHI 酶切， 得到酶切产物 ；
8、 用限制性内切酶 BspHI 和 EcoRV 酶切 pR-GA， 回收载体骨架 ；
9、 将步骤 7 的酶切产物和步骤 8 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pRAcB。
六、 attL1-attL2 框的构建
1、 以 pUC-oriF 和 pUC-oriR 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 将 PCR 扩增产 物用限制性内切酶 NheI 酶切， 得到酶切产物 ；
2、 用限制性内切酶 DraI 和 XbaI 酶切 pGL12， 回收载体骨架 ；
3、 将步骤 1 的酶切产物和步骤 2 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL-2ori ；
4、 以 ApF 和 ApR 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 将 PCR 扩增产物用限制性 内切酶 NcoI 和 XbaI 酶切， 得到酶切产物 ；
5、 用限制性内切酶 BspHI 和 NheI 酶切 pL-2ori， 回收载体骨架 ；
6、 将步骤 4 的酶切产物和步骤 5 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL-Ap ；
7、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pRAcB， 回收约 1623bp 的片段 ；
8、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pL-Ap， 回收含 attL 框片段 ( 约 1856bp) ；
9、 将步骤 7 的大片段和步骤 8 的片段连接， 得到重组质粒 pLAcB。
七、 attP1-attP2 框的构建
1、 以 ApF3 和 ApR3 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
2、 用限制性内切酶 SalI 酶切 pDONR221 ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶切使 其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤 1 的 PCR 扩增产物连接， 得到重组质粒 p221-A ；
3、 用限制性内切酶 ApaI 和 PvuII 酶切 pGWG， 回收约 2063bp 的片段 ；
4、 用 限 制 性 内 切 酶 ApaI 和 PvuII 酶 切 p221-A， 回 收 含 attP 框 的 片 段 ( 约 1637bp) ；
5、 将步骤 3 的小片段与步骤 4 的载体骨架连接， 得到重组质粒 p221-AG ；
6、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pL-Ap， 回收小片段 ( 约 700bp) ；
7、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 p221-AG， 回收载体骨架 ；
8、 将步骤 6 的小片段与步骤 7 的载体骨架连接， 得到重组质粒 p221G-2ori ；
9、 以 ApF 和 ApR 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用限 制性内切酶 XbaI 和 NocI 酶切， 得到酶切产物 ；
10、 用限制性内切酶 NheI 和 BspHI 酶切 p221G-2ori， 回收载体骨架 ；
11、 将步骤 9 的酶切产物和步骤 10 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pP-A ；
12、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pRAcB， 回收约 1623bp 的片段 ；
13、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pP-A， 回收载体骨架 ； 14、 将步骤 12 的小片段与步骤 13 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pPAcB。
八、 attP2-attP1 盒的构建
1、 用限制性内切酶 ApaI 和 NheI 酶切 pDONR221 ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶 酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架自连， 得到重组质粒 p221Δ ；
2、 以 ApF2 和 ApR2 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
3、 用限制性内切酶 SalI 酶切 p221Δ ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶切使其产 生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤 2 的 PCR 扩增产物连接， 得到重组质粒 p221Δ-Ap ；
4、 用限制性内切酶 AhdI 酶切 pRAcB ； 回收约 1623bp 的片段， 用 T4 DNA 多聚酶酶 切使其产生平末端 ；
5、 用限制性内切酶 PvuII 酶切 p221Δ-Ap， 回收载体骨架 ； 回收含 attP 框片段的 片段 ( 约 1690bp) ；
6、 将步骤 4 的平末端片段与步骤 5 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pPrAcB。
九、 用于制备供体载体的骨架载体的构建
1、 pL-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pLAcB， 回收含 attL 框片段 ( 约 1856bp) ；
②用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pAVTCsB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL-ccdB。
2、 pR-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 ApaI 和 PstI 酶切 pRAcB， 回收含 attR 框片段 ( 约 1926bp) ；
②用限制性内切酶 ApaI 和 PstI 酶切 pL-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pR-ccdB。
3、 pP-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pAVTCsB， 回收约 3538bp 的大片段 ；
②用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pPAcB， 回收含 attP1 框片段 ( 约 2592bp) ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pP-ccdB。
4、 pPr-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 ApaI 和 PstI 酶切 pL-ccdB， 回收约 4001bp 的大片段 ；
②用限制性内切酶 ApaI 和 PstI 酶切 pPrAcB， 回收含 attP2 框片段 ( 约 2168bp) ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pPr-ccdB。
5、 pLC-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pACVTsB， 回收约 3612bp 的大片段 ；
②用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pLAcB， 回收含 attL 框片段 ( 约 1856bp) ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pLC-ccdB。
6、 pRG-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pAGVTsB， 回收约 3528bp 的大片段 ；
②用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pR-ccdB， 回收约 2389bp 片段 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pRG-ccdB。
十、 受体载体的构建
1、 BIBAC-LTR 的构建
①以 GalF 和 GalR 为引物， 以 pGalK 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用 限制性内切酶 SalI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 SmaI 和 SalI 酶切 pL34R12-CVT， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的酶切产物与步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL34R12-CVTG ；
④用限制性内切酶 NcoI 和 SalI 酶切 pL34R12-CVTG， 回收载体骨架 ；
⑤将 oloxPF 和 oloxPR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤④的载体骨架连接， 得 到重组质粒 p32CVTGL ；
⑥用限制性内切酶 SacI 和 NcoI 酶切 p32CVTGL ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶 酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架自连， 得到重组质粒 p32CL ；
⑦用限制性内切酶 PacI 和 SacII 酶切 p32CL ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶 切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架自连， 得到重组质粒 pL3R12-CL ；
⑧以 BIBAC-LTRF 和 BIBAC-LTRR 为引物， 以 pL3R12-CL 为模板进行 PCR 扩增， 得到 的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切， 得到酶切产物 ；
⑨用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pCH20， 回收载体骨架 ；
⑩将步骤⑧的酶切产物与步骤⑨的载体骨架连接， 得到重组质粒 BIBAC-LTR。
2、 BIBAC-RTL 的构建
①以 BIBAC-RTLF 和 BIBAC-RTLR 为引物， 以 pL3R12-CL 为模板进行 PCR 扩增， 得到 的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pCH20， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的酶切产物与步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 BIBAC-RTL。
3、 TAC-RTL 的构建
①用限制性内切酶 NotI 和 PmeI 酶切 pYLTAC747， 回收载体骨架 ；
②将 oTACF 和 oTACR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤①的载体骨架连接， 得到 重组质粒 pYLTAC747Δ ；③以 TAC-RTLF 和 TAC-RTLR 为引物， 以 pL3R12-CL 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 HindIII 和 NotI 酶切， 回收酶切产物 ；
④用限制性内切酶 HindIII 和 NotI 酶切 pYLTAC747Δ， 回收载体骨架 ；
⑤将步骤③的酶切产物和步骤④的载体骨架连接， 得到重组质粒 TAC-RTL。
4、 TAC-LTR 的构建
①以 TAC-LTRF 和 TAC-LTRR 为引物， 以 pL3R12-CL 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 HindIII 和 NotI 酶切， 回收酶切产物 ；
②用限制性内切酶 HindIII 和 NotI 酶切 pYLTAC747Δ， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 TAC-LTR。
实施例 2、 MISSA 实验
一、 供体载体的构建
1、 供体载体 pL-Hyg 的构建
①以 MarkerF 和 MarkerR 为引物， pMDC99 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增 产物用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pL-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL-Hyg。
2、 供体载体 pR-TM2 的构建
①用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pL12R34sB-MAR， 回收约 983bp 片段 ；
②用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pR-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pR-TM2。
3、 供体载体 pL-GUS 的构建
①用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pBI121， 回收约 3032bp 片段 ；
②用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pL-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL-GUS。
4、 供体载体 pR-EGFP 的构建
①用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pL12R34sB-EGFP， 回收约 1862bp 片段 ；
②用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pR-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pR-EGFP。
二、 供体菌和受体菌的构建
1、 供体菌的构建
将重组质粒 pL-Hyg 转化大肠杆菌 BW20767， 得到的重组菌为供体菌 I(pL-Hyg)。
将重组质粒 pR-TM2 转化大肠杆菌 BW20767， 得到的重组菌为供体菌 II(pR-TM2)。
将重组质粒 pL-GUS 转化大肠杆菌 BW20767， 得到的重组菌为供体菌 I(pL-GUS)。
将 重 组 质 粒 pR-EGFP 转 化 大 肠 杆 菌 BW20767， 得到的重组菌为供体菌 II(pR-EGFP)。
2、 受体菌的构建
①以 CreF 和 CreR 为引物， 以大肠杆菌 SW106 的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 BstXI 和 NheI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 BstXI 和 NheI 酶切 pAH57， 得到载体骨架 ；③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pAH57-cra ；
④将 BIBAC-LTR 和 pAH57-cre 转化至大肠杆菌 DH10B 中， 得到受体菌 I。
三、 MISSA 实验
分别进行四次重组 ： 第一次重组的受体菌为受体菌 ( 类型 I)， 供体菌为实施例 1 制备的供体菌 I(pL-Hyg) ； 第二次重组的受体菌 ( 类型 II) 为第一次重组得到的重组菌， 供 体菌为供体菌 II(pR-TM2) ； 第三次重组的受体菌 ( 类型 I) 为第二次重组得到的重组菌， 供 体菌为供体菌 I(pL-GUS) ； 第四次重组的受体菌 ( 类型 II) 为第三次重组得到的重组菌， 供 体菌为供体菌 II(pR-EGFP)。
1、 相关培养基的制备
C25 板 ： 添加氯霉素的 LB 平板， 氯霉素的终浓度为 25ug/ml ；
KA 板 ： 添加卡那霉素和氨苄青霉素的 LB 平板， 卡那霉素的终浓度为 25ug/ml， 氨苄 青霉素的终浓度为 50ug/ml ；
KAC 板 ： 添加氯霉素、 卡那霉素和氨苄青霉素的 LB 平板， 氯霉素的终浓度为 25ug/ ml， 卡那霉素的终浓度为 25ug/ml， 氨苄青霉素的终浓度为 50ug/ml ；
KAGluSuc 板 ： 添加卡那霉素、 氨苄青霉素、 葡萄糖和蔗糖的 LB 平板， 卡那霉素的终 浓度为 25ug/ml， 氨苄青霉素的终浓度为 50ug/ml， 葡萄糖的终浓度为 0.2％ ( 质量百分含 量 )， 蔗糖的终浓度为 6％ ( 质量百分含量 )。
2、 构建同时表达四个基因的重组表达载体
(1) 第一次重组
①接合转移及 Cre/loxP 重组
供体菌在 C25 板上划线， 37℃培养 16 ～ 24hr(30℃培养 24 ～ 36hr 也可 ) ； 受体菌 在 KA 板上划线， 30℃培养 24 ～ 36hr。从平板上刮取等量的供体菌和受体菌， 分别重悬在 1.2ml 的 LB 中， 重复 “离心、 弃上清、 再加 1.2ml LB 重悬” 步骤 2 次， 洗去培养物中的抗生 素。供体菌菌液和受体菌菌液各取 600ul 混和， 30℃静置一个小时后， 涂 KAC 板， 30℃培养 24 ～ 36hr。
② λ 噬菌体位点特异性重组蛋白介导下体内重组
用牙签挑取 18 个菌落 ( 每牙签挑 6 个菌落 )， 置 6ml LB( 含质量百分含量为 0.2％ 的葡萄糖 ) 中， 42℃水浴中振荡培养 1 小时。涂 KAGluSuc 板， 30℃培养 24 ～ 36hr。
③重组克隆鉴定
随机挑选上述生长出来的克隆分别在 KA 板上和 C25 板上一对一划线。随机挑取 在 KA 板上生长且 C25 板上不生长的 20 个菌落进行 PCR 鉴定。
PCR 鉴定结果表明， 第一次重组中， Hyg 的克隆效率为 90％。
(2) 第二次重组
方法同步骤 (1)。
PCR 鉴定结果表明， 第二次重组中， TM2 的克隆效率为 80％。
(3) 第三次重组
方法同步骤 (1)。
PCR 鉴定结果表明， 第三次重组中， GUS 的克隆效率为 85％。
本发明涉及一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法。背景技术 很多农艺性状包括作物产量性状、 代谢途径、 蛋白复合体及信号传导途径等受 多基因控制。遗传操纵多个基因无论对于基础研究还是生物工程均具有重要的应用 前 景。 金 大 米 (Ye X， Al Babili S， Kloti A， Zhang J， Lucca P， Beyer P， Potrykus I(2000)Engineering theprovitamin A(beta-carotene)biosynthetic pathway into(carotenoid-free)riceendosperm.Science 287 ： 303-305) 和 紫 番 茄 (Butelli E， Titta L， Giorgio M， Mock HP， Matros A， Peterek S， Schijlen EG， Hall RD， Bovy AG， Luo J， Martin C(2008)Enrichmentof tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of selecttranscription factors.Nat Biotechnol 26 ： 1301-1308) 的培 育即是多基因转基因作物的两个成功案例。 将多个基因组装到同一个表达载体转化作物是 培育多基因转基因作物直接和高效的方法， 但这一方法的限制因子是表达载体的构建。因 为很难找到合适的酶切位点， 当使用传统的酶切连接方法将 5 个以上的基因组装到同一个 表达载体上时将非常困难。
为此， 几个研究小组建立了几种方便多基因组装的方法， 包括基于归位内切酶 建立的 pRCS/pAUX 和 pSAT 载体系统 (Goderis IJ， De Bolle MF， Francois IE， Wouters PF， BroekaertWF， Cammue BP(2002)A set of modular plant transformation vectors allowing flexibleinsertion of up to six expression units.Plant Mol Biol 50 ： 17-27 ； Tzfira T， TianGW， Lacroix B， Vyas S， Li J， Leitner-Dagan Y， Krichevsky A， Taylor T， Vainstein A， Citovsky V(2005)pSAT vectors ： a modular series of plasmids for autofluorescentprotein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol Biol 57 ： 503-516 ； Dafny-Yelin M， Tzfira T(2007)Delivery of multiple transgenes to plant cells.PlantPhysiol 145 ： 1118-1128)， 基于 Cre/loxP 和归位内切 酶建立的的载体系统 (Lin L， Liu YG， Xu X， Li B(2003)Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigeneassembly and transformation vector system. Proc Natl Acad Sci U S A 100 ： 5962-5967) 以及基于 Gateway 技术建立的 MultiRound Gateway(Chen QJ， Zhou HM， Chen J， Wang XC(2006)A Gateway-based platform for multigene plant transformation.Plant Mol Biol 62 ： 927-936)。 然而， 使用上述方法进 行多基因组装仍然比较费时、 费力和费钱。
为此， 几个研究小组建立了几种方便多基因组装的方法， 包括基于归位内切酶 建立的 pRCS/pAUX 和 pSAT 载体系统 (Goderis IJ， De Bolle MF， Francois IE， Wouters PF， BroekaertWF， Cammue BP(2002)A set of modular plant transformation vectors allowing flexibleinsertion of up to six expression units.Plant Mol Biol 50 ： 17-27 ； Tzfira T， TianGW， Lacroix B， Vyas S， Li J， Leitner-Dagan Y， Krichevsky A， Taylor T， Vainstein A， Citovsky V(2005)pSAT vectors ： a modular series of plasmids for autofluorescentprotein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol Biol 57 ： 503-516 ； Dafny-Yelin M， Tzfira T(2007)Delivery of multiple transgenes to plant cells.PlantPhysiol 145 ： 1118-1128)， 基于 Cre/loxP 和归位内切 酶建立的的载体系统 (Lin L， Liu YG， Xu X， Li B(2003)Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigeneassembly and transformation vector system. Proc Natl Acad Sci U S A 100 ： 5962-5967) 以及基于 Gateway 技术建立的 MultiRound Gateway(Chen QJ， Zhou HM， Chen J， Wang XC(2006)A Gateway-based platform for multigene plant transformation.Plant Mol Biol 62 ： 927-936)。 然而， 使用上述方法进 行多基因组装仍然比较费时、 费力和费钱。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法。
本发明提供的构建同时表达两个以上基因的重组表达载体的方法， 命名为 MISSA， 包括交替进行的两组重组 ； 第一组重组 ： 将类型 I 供体菌与类型 I 受体菌共培养， 类型 I 供体菌中的目标基因整合到类型 I 受体菌中的类型 I 受体载体上， 得到重组菌 ； 第二组重组 ： 将类型 II 供体菌与类型 II 受体菌共培养， 类型 II 供体菌中的目标基因整合到类型 II 受 体菌中的类型 II 受体载体上， 得到重组菌 ； 两组重组各进行一次以上， 将两个以上的目标 基因组装到同一受体载体上 ；
所述类型 I 受体菌为如下 (a) 或 (b) ：
(a) 将类型 I 受体载体导入出发菌 A 得到的重组菌 ；
(b) 所述第二组重组得到的重组菌 ；
所述类型 II 受体菌为如下 (c) 或 (d) ：
(c) 将类型 II 受体载体导入出发菌 A 得到的重组菌 ；
(d) 所述第一组重组得到的重组菌 ；
所述类型 I 受体菌在所述第一组重组后转变为所述类型 II 受体菌 ； 所述类型 II 受体菌在所述第二组重组后转变为所述类型 I 受体菌 ； 所述类型 I 受体载体在所述第一组 重组后转变为所述类型 II 受体载体 ； 所述类型 II 受体载体在所述第二组重组后转变为所 述类型 I 受体载体 ；
所述出发菌 A 为满足如下条件的大肠杆菌 ： 含有 Cre 重组酶编码基因和 λ 噬菌体 位点特异性重组蛋白编码基因 ； 所述类型 I 受体载体满足如下条件 ： 容量为 100-300kb、 单拷贝、 含有 loxP-attR2 框； loxP-attR2 框的功能如下 ： loxP 位点在 Cre 重组酶作用下与另一载体上的 loxP 位点 发生特异性重组 ； attR2 位点在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的 attL2 位点发生特异性重组 ；
所述类型 II 受体载体满足如下条件 ： 容量为 100-300kb、 单拷贝、 含有 loxP-attL1 框； loxP-attL1 框的功能如下 ： loxP 位点在 Cre 重组酶作用下与另一载体上的 loxP 位点 发生特异性重组 ； attL1 位点在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的 attR1 位点发生特异性重组 ；
所述类型 I 供体菌是将类型 I 供体载体导入出发菌 B 得到的 ； 所述类型 I 供体载 体满足如下条件 ： 不能在受体菌中复制、 含有接合转移必须元件 oriT 和 loxP-attL1-attL2 框、 目标基因位于 attL1 位点和 attL2 位点之间 ； loxP-attL1-attL2 框的功能如下 ： loxP 位 点在 Cre 重组酶作用下与另一载体上的 loxP 位点发生特异性重组 ； attL1 位点在 λ 噬菌体 位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的 attR1 位点发生特异性重组， 形成 attB1 位 点； attL2 位点在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的 attR2 位点发生 特异性重组， 形成 attB2 位点 ；
所 述 类 型 II 供 体 菌 是 将 类 型 II 供 体 载 体 导 入 出 发 菌 B 得 到 的 ； 所述类 型 II 供体载体满足如下条件 ： 不能在受体菌中复制、 含有接合转移必须元件 oriT 和 loxP-attR2-attR1 框， 目标基因位于 attR1 位点和 attR2 位点之间 ； loxP-attR2-attR1 框 的功能如下 ： loxP 位点在 Cre 重组酶作用下与另一载体上的 loxP 位点发生特异性重组 ； attR1 位点在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载体上的 attL1 位点发生特异 性重组， 形成 attB1 位点 ； attR2 位点在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白的作用下与另一载 体上的 attL2 位点发生特异性重组反应， 形成 attB2 位点 ；
所述类型 I 供体菌和 / 或所述 II 供体菌中， 出发菌 B 为满足如下条件的大肠杆菌 ：
含有接合转移蛋白 Tra 的编码基因和自杀载体的复制起始蛋白的编码基因。
所述方法在应用中， 可自第二次重组开始， 每次重组都以上一次重组得到的重组 菌作为受体菌与类型 I 供体菌或类型 II 供体菌共培养 ； 类型 I 供体菌和类型 II 供体菌交 替采用 ； 类型 I 受体菌和类型 II 受体菌交替转换。
所述类型 I 供体载体为 (1) 或 (2) 或 (3) ； 所述类型 II 供体载体为 (4) 或 (5) 或 (6) ；
(1) 将目标基因插入载体 pL-ccdB 的 attL1 位点和 attL2 位点之间得到的重组质 粒； (2) 将目标基因插入载体 pLC-ccdB 的 attL1 位点和 attL2 位点之间得到的重组质粒 ； (3) 通过 Gateway BP 反应将目标基因插入载体 pP-ccdB 的 attP1 位点和 attP2 位点之间得 到的重组质粒 (Gateway BP 反应后 attP1-attP2 框转变为 attL1-attL2 框 ) ； (4) 将目标基 因插入载体 pR-ccdB 的 attR1 位点和 attR2 位点之间得到的重组质粒 ； (5) 将目标基因插入 载体 pRG-ccdB 的 attR1 位点和 attR2 位点之间得到的重组质粒 ； (6) 通过 Gateway BP 反应 将目标基因插入载体 pPr-ccdB 的 attP2 位点和 attP1 位点之间得到的重组质粒 (Gateway BP 反应后 attP2-attP1 框转变为 attR2-attR1 框 ) ；
所述载体 pL-ccdB 自上游至下游依次包括 ： loxP 位点、 attL1 位点、 ccdB 基因、 pUC\origin、 attL2 位点、 sacB 基因、 抗性筛选基因和 oriT 位点 ； 所述载体 pLC-ccdB 自上 游至下游依次包括 ： loxP 位点、 抗性筛选基因、 attL1 位点、 ccdB 基因、 pUC\origin、 attL2 位点、 sacB 基因、 oriR6kγ 和 oriT 位点 ； 所述载体 pR-ccdB 自上游至下游依次包括 ： loxP 位点、 attR2 位点、 ccdB 基因、 pUC\origin、 attR1 位点、 sacB 基因、 抗性筛选基因、 oriR6kγ 和 oriT 位点 ； 所述载体 pRG-ccdB 自上游至下游依次包括 ： loxP 位点、 抗性筛选基因、 attR2 位点、 ccdB 基因、 pUC\origin、 attR1 位点、 sacB 基因、 oriR6kγ 和 oriT 位点 ； 所述载体 pP-ccdB 自上游至下游依次包括 ： loxP 位点、 attP1 位点、 pUC\origin、 ccdB 基因、 attP2 位 点、 sacB 基因、 抗性筛选基因、 oriR6kγ 和 oriT 位点 ； 所述载体 pPr-ccdB 自上游至下游依 次包括 ： loxP 位点、 attP2 位点、 pUC\origin、 ccdB 基因、 attP1 位点、 sacB 基因、 抗性筛选 基因、 oriR6kγ 和 oriT 位点 ；
所述类型 I 受体载体可为载体 TAC-RTL、 载体 TAC-LTR、 载体 BIBAC-RTL 或载体 BIBAC-LTR ； 所述载体 TAC-RTL 自上游至下游依次包括 ： RB、 attR2 位点、 loxP 位点、 LB、 抗性 筛选基因、 pRiA4\ori 和 P1\ori ； 所述载体 TAC-LTR 自上游至下游依次包括 ： RB、 loxP 位点、 attR2 位点、 LB、 抗性筛选基因、 pRiA4\ori 和 P1\ori ； 所述载体 BIBAC-RTL 自上游至下游依 次包括 ： RB、 attR2 位点、 loxP 位点、 LB、 抗性筛选基因、 F\ori、 pRiA4\ori 和 oriT 位点 ； 所 述载体 BIBAC-LTR 自上游至下游依次包括 ： RB、 loxP 位点、 attR2 位点、 LB、 抗性筛选基因、 F\ori、 pRiA4\ori 和 oriT 位点。
所述 RB 为 T-DNA 右边界 ； 所述 LB 为 T-DNA 左边界 ； 所述抗性筛选基因为卡那霉素 抗性基因 (KnR)、 氯霉素抗性基因 (CmR) 或硫酸庆大霉素抗性基因 (GmR)。
所述 loxP 位点的核苷酸序列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 1 至 34 位所示 ； 所述 attL1 位点的核苷酸序列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 423 至 522 位所示 ； 所述 ccdB 基 因的核苷酸序列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 673 至 978 位所示 ； 所述 pUC\origin 的核 苷酸序列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 1102 至 1775 位所示 ； 所述 attL2 位点的核苷酸序 列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 2165 至 2264 位所示 ； 所述 sacB 基因的核苷酸序列如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 2401 至 3822 位所示 ； 所述氯霉素抗性基因 (CmR) 的核苷酸序列 如序列表的序列 1 自 5’ 末端第 4403 至 5110 位所示 ； 所述 oriR6kγ 的核苷酸序列如序列 表的序列 1 自 5’ 末端第 5169 至 5522 位所示 ； 所述 oriT 位点的核苷酸序列如序列表的序 列 1 自 5’ 末端第 5530 至 5851 位所示 ； 所述硫酸庆大霉素抗性基因 (GmR) 的核苷酸序列如 序列表的序列 4 自 5’ 末端第 290 至 823 位所示 ； 所述 attR2 位点的核苷酸序列如序列表的 序列 3 自 5’ 末端第 430 至 554 位所示 ； 所述 attR1 位点的核苷酸序列如序列表的序列 3 自 5’ 末端第 2210 至 2334 位所示 ； 所述 attP1 位点的核苷酸序列如序列表的序列 5 自 5’ 末端 第 424 至 655 位所示 ； 所述 attP2 位点的核苷酸序列如序列表的序列 5 自 5’ 末端第 2305 至 2536 位所示。
所述载体 pL-ccdB 的核苷酸序列如序列表的序列 1 所示 (GenBank accession numbers ： GU574771) ； 所述载体 pLC-ccdB 的核苷酸序列如序列表的序列 2 所示 (GenBank accessionnumbers ： GU574773) ； 所述载体 pR-ccdB 的核苷酸序列如序列表的序列 3 所示 (GenBankaccession numbers ： GU574774) ； 所述载体 pRG-ccdB 的核苷酸序列如序列表的序 列 4 所示 (GenBank accession numbers ： GU574776) ； 所述载体 pP-ccdB 的核苷酸序列如序 列表的序列 5 所示 (GenBank accession numbers ： GU574772) ； 所述载体 pPr-ccdB 的核苷酸 序列如序列表的序列 6 所示 (GenBank accession numbers ： GU574775)。所述载体 TAC-RTL 的核苷酸序列如 GenBank accession numbers ： GU574777 所示 ； 所述载体 TAC-LTR 的核苷 酸序列如 GenBank accession numbers ： GU574778 所示 ； 所述载体 BIBAC-RTL 的核苷酸序 列如 GenBank accession numbers ： GU574779 所示 ； 所述载体 BIBAC-LTR 的核苷酸序列如 GenBank accession numbers ： GU574780 所示。
所述出发菌 B 为大肠杆菌 BW20767 或具有类似功能特征的其它大肠杆菌菌株 ； 所 述出发菌 A 为将 pAH57-cre 转化大肠杆菌 DH10B 得到的重组菌或具有类似功能特征的其它 大肠杆菌菌株。所述 pAH57-cre 的制备方法如下 ： 以序列表的序列 7 所示 DNA(CreF) 和序 列表的序列 8 所示 DNA(CreR) 为引物， 以大肠杆菌 SW106 的的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 BstXI 和 NheI 酶切， 得到酶切产物 ； 用限制性内 切酶 BstXI 和 NheI 酶切 pAH57， 得到载体骨架 ； 将酶切产物和载体骨架连接， 得到重组质粒 pAH57-cre。
所述方法可用于多基因表达。
所述方法在可用于培育转基因动物、 转基因植物或转基因微生物。
应用所述方法培育得到的转基因植物、 动物或微生物也属于本发明的保护范围。
MISSA 系统由菌株和载体组成。 菌株包括供体菌和受体菌， 载体包括供体载体和受 体载体。供体菌染色体上携带的复制起始蛋白 Pir 负责供体载体的复制扩增， 携带的接合 转移蛋白 Tra 负责供体载体的接合转移。受体菌能够诱导表达两套位点特异性重组蛋白 ： Cre 重组酶 ( 表达受阿拉伯糖诱导， 受葡萄糖抑制 ) 和 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白 ( 包 括 Int， Xis 和 IHF， 表达受 42℃热击诱导 )。当混和供体菌和受体菌时， 供体菌和受体菌发 生接合生殖， 供体菌中的供体载体由于携带 oriT 元件而转移到受体菌中 ； 在受体菌中供体 载体和受体载体在两套位点特异性重组酶的作用下发生重组反应。
受体载体含 loxP-attR2 或 loxP-attL1 框， 来自单拷贝高容量的 TAC 或 BIBAC 载 体； 供体载体由 pL 和 pR 两个系列组成 ； pL 系列供体载体含 loxP-attL1-attL2 框， pR 系列的供体载体含 loxP-attR2-attR1 框， 基因或表达框或功能 DNA 元件位于 attL1 和 attL2 之 间或 attR2 和 attR1 之间。多轮的体内重组过程由 pL 系列和 pR 系列的供体载体交替与 受体载体进行的重组反应构成。每轮重组反应由两个重组事件构成 ： 供体载体首先在 Cre/ loxP 介导下重组进而整合到受体载体， 然后在 λ 噬菌体位点特异性重组蛋白介导下重组 进而去除多余的 loxP 位点和载体骨架序列。由于上轮重组反应引入了下轮重组反应的序 列特异性位点 (attL1 或 attR2)， 重组反应可以循环进行下去。这样， 经过多轮循环重组反 应， 可以将多个基因组装到表达载体上。图 1 和图 2 为 MISSA 载体系统及组装原理示意图， 图 2 与图 1 的区别在于供体载体中抗性筛选基因的位置不同 ； A： MISSA 载体由受体载体和 供体载体构成 ； B 和 C 为 MISSA 体内重组反应 ； R2 代表 attR2， L1 代表 attL1， L2 代表 attL2， G1 代表要表达的第一个目的基因， R2 代表 attR2， R1 代表 attR1， G2 代表要表达的第二个 目的基因 ； Kn， 卡那霉素 ； Ap， 氨苄青霉素 ； Cm， 氯霉素 ； Glu， 葡萄糖 ； Suc， 蔗糖。
供体载体是将目的基因插入骨架载体得到的， 可通过酶切连接的方法用功能性 DNA 序列取代骨架载体 pL-/pR-/pLC-/pRG-ccdB 中的 pUC_ori-ccdB 框来获得功能型 pL-/ pLC- 和 pR-/pRG- 供体载体， 也可通过 Gateway BP 克隆 (Invitrogen) 的方法取代 pP-/ pPr-ccdB 中的 pUC_ori-ccdB 框获得 pL-/pR- 系列的供体载体。pLC- 与 pL- 系列的供体载 体相似， 所不同的是前者的细菌筛选标记基因位于 loxP 和 attL1 之间 ； pRG- 与 pR- 系列的 供体载体相似， 所不同的是前者的细菌筛选标记基因为庆大霉素抗性基因， 且位于 loxP 和 attR2 之间。
发明人基于细菌接合生殖和两套体内位点特异性重组系统建立了省时、 省力和省 钱的多基因组装方法， 命名为 MISSA(multiple-round in vivo site-specific assembly， 多轮体内位点特异性组装 )。当使用 MISSA 技术进行多基因组装时， 一旦将目标基因构建 到供体载体上， 剩下的工作就是混和供体菌和受体菌等极其简单的实验， 不需要额外的体 外分子操作， 不需要购买昂贵的重组酶， 在大大节约成本的同时极大地提高了工作效率。 因 此， MISSA 是一种省时、 省力和省钱的多基因组装技术。 附图说明
图 1 为 MISSA 载体系统及组装原理示意图 ； 图 2 为第二套 MISSA 供体载体及组装原理图 ； 图 3 为十种重组质粒的结构示意图 ；具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。
pDNR-Dual ： 购自 BD Biosciences Clontech， 产品目录号 639610。pENTR1A ： 购 自 Invitrogen， 产品目录号 A10462。pDONR221 ： 购自 Invitrogen， 产品目录号 12536017。 pUC18 ： 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司， 目录号 ： D3218。
pGWC ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Chen QJ， Zhou HM， Chen J，Wang XC(2006)Using a modified TA cloning method to create entry clones.Anal Biochem 358 ： 120-125。pL34R12-CmR-ccdB 和 pL12R34sB-EGFP ： 公众可以从中国农业大 学获得 ； 参考文献 ： Chen QJ， Zhou HM， Chen J， Wang XC(2006)A Gateway-based platform for multigeneplant transformation.Plant Mol Biol 62 ： 927-936。pBSL238 ：公 众 可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Alexeyev MF， Shokolenko IN(1995)RP4 oriT and RP4 oriT-R6K oriVDNA cassettes for construction of specialized vectors. Biotechniques 19 ： 22-4， 26。pGL12 ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Chen QJ， Zhou HM， Chen J， Wang XC(2006b)Using a modified TA cloning method to create entry clones.Anal Biochem 358 ： 120-125。pMDC99 ： 公众可以从中国农业大学获 得； 参考文献 ： Curtis MD， Grossniklaus U(2003)Agateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.Plant Physiol 133 ： 462-469。 pL12R34sB-MAR ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： ChenQJ， Zhou HM， Chen J， Wang XC(2006a)A Gateway-based platform for multigene planttransformation. Plant Mol Biol 62 ： 927-936。pBI121 ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： De AF， Patti T， Marchetti S(2007)Improvement of the pBI121 plantexpression vector by leader replacement with a sequence combining a poly(CAA)anda CT motif. Transgenic Res 16 ： 731-738。pGalK ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Warming S， Costantino N， Court DL， Jenkins NA， Copeland NG(2005)Simple andhighly efficient BAC recombineering using galK selection.Nucleic Acids Res 33 ： e36。pCH20 ： 公众 可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Hamilton CM， Frary A， Lewis C， TanksleySD(1996) Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A 93 ： 9975-9979。pAH57 ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参 考 文 献： Haldimann A， Wanner BL(2001)Conditional-replication， integration， excision， and retrieval plasmid-host systems for gene structure-function studies of bacteria.J Bacteriol 183 ： 6384-6393。pYLTAC747 ： 公众可以从中国农业大学获 得； 参考文献 ： Lin L， Liu YG， Xu X， Li B(2003)Efficient linking and transfer of multiple genes by amultigene assembly and transformation vector system.Proc Natl Acad Sci U S A 100 ： 5962-5967。大肠杆菌 BW20767 ： 公众可以从中国农业大学获 得； 参考文献 ： Metcalf WW， JiangW， Daniels LL， Kim SK， Haldimann A， Wanner BL(1996) Conditionally replicative andconjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning， mutagenesis， and allelereplacement in bacteria.Plasmid 35 ： 1-13。大肠 杆菌 SW106 ： 公众可以从中国农业大学获得 ； 参考文献 ： Warming S， Costantino N， Court DL， Jenkins NA， Copeland NG(2005)Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.Nucleic AcidsRes 33 ： e36。大肠杆菌 DH10B ： 公众可以从中国 农业大学获得 ； 参考文献 ： Durfee T et al.(2008)The complete genome sequence of Escherichia coli DH10B ： insights into thebiology of a laboratory workhorse.J Bacteriol 190 ： 2597-606。
表 1 实施例中各个名称引物对应的核苷酸序列
实施例 1、 重组表达载体
一、 构建 CmR 基因表达框
1、 以 CmF01 和 CmR01 为引物， 以 pGWC 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
2、 以 CmF02 和 CmR01 为引物， 以步骤 1 的 PCR 扩增产物为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
3、 用限制性内切酶 BamHI 和 SalI 酶切 pL34R12-CmR-ccdB ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤 2 的 PCR 扩增产物连接， 得到 重组质粒 pL34R12-Cm+。
二、 去除 oriR6KγHindIII 位点
1、 重组质粒 pL4R2mVT 的构建
①以 CmF03 和 CmR02 为引物， 以 pL34R12-Cm+ 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩 增产物用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pL34R12-CmR-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL34R12-Cm2 ；
④用限制性内切酶 SacI 和 SmaI 酶切 pBSL238， 回收小片段 ；
⑤用限制性内切酶 SacI 和 SmaI 酶切 pL34R12-Cm2， 回收载体骨架 ；
⑥将步骤④的小片段和步骤⑤的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL34R12-CVT ；
⑦用限制性内切酶 AflII 和 HindIII 酶切 pL34R12-CVT， 回收载体骨架 ；
⑧将 omVF 和 omVR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤⑦的载体骨架连接， 得到重 组质粒 pL4R2mVT。
2、 重组质粒 pVTm3 的构建
①用限制性内切酶 NheI 和 EcoRI 酶切 pL34R12-CVT， 回收载体骨架 ；
②将 oASF 和 oASR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤①的载体骨架连接， 得到重 组质粒 pVTm1 ；
③用限制性内切酶 HindIII 酶切 pVTm1 ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶切使 其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架自连， 得到重组质粒 pVTm2 ；
④用限制性内切酶 DraI 和 NheI 酶切 pVTm2 ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶 切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架自连， 得到重组质粒 pVTm3。
三、 去除 sacB 的 KpnI 和 SacII 位点
1、 pDNR-Dual 经 NotI 酶切后自连， 得到质粒 pSacB ；
2、 用限制性内切酶 KpnI 和 SacII 酶切 pSacB， 回收载体骨架 ；
3、 将 omsBF 和 omsBR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤 2 的载体骨架连接， 得到 重组质粒 pSacBm。
四、 携带 loxP 位点的供体载体骨架的构建
1、 重组质粒 pAVTCsB 的构建
①以 CmF 和 CmR 为引物， 以 pL34R12-Cm+ 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产 物；
②用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pUC18 ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚 酶酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤①的 PCR 扩增产物连接， 得到重组质 粒 pUC18-Cm ；
③用限制性内切酶 NcoI 和 SalI 酶切 pUC18-Cm， 回收载体骨架 ；
④将 oloxPF 和 oloxPR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤③的载体骨架连接， 得 到重组质粒 pUC18-loxP ；
⑤以 CmF2 和 CmR2 为引物， 以 pL34R12-Cm+ 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增 产物用限制性内切酶 NotI 和 NcoI 酶切， 得到酶切产物 ；
⑥用限制性内切酶 NotI 和 NcoI 酶切 pUC18-loxP， 回收载体骨架 ；
⑦ 将 步 骤 ⑤ 的 酶 切 产 物 和 步 骤 ⑥ 的 载 体 骨 架 连 接， 得到重组质粒 pUC18-loxP-Cm ；
⑧以 sacBF 和 sacBR 为引物， 以 pSacBm 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产 物用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切， 得到酶切产物 ；
⑨用限制性内切酶 NotI 和 XhoI 酶切 pUC18-loxP-Cm， 回收载体骨架 ；
⑩ 将 步 骤 ⑧ 的 酶 切 产 物 和 步 骤 ⑨ 的 载 体 骨 架 连 接， 得到重组质粒 pUC18-loxP-CsB ；
以 oriVTF 和 oriVTR 为引物， 以 pL4R2mVT 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩 用限制性内切酶 XbaI 和 NcoI 酶切 pUC18-loxP-CsB， 回收载体骨架 ； 将步骤 的酶切产物和步骤 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pAVTCsB。增产物用限制性内切酶 NheI 和 BspHI 酶切， 得到酶切产物 ；
2、 重组质粒 pAGVTsB 的构建
①以 oriVTF2 和 oriVTR 为引物， 以 pVTm3 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增 产物用限制性内切酶 XhoI 和 BspHI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 XhoI 和 NcoI 酶切 pUC18-loxP-Cm， 回收载体骨架 ；
③ 将 步 骤 ① 的 酶 切 产 物 和 步 骤 ② 的 载 体 骨 架 连 接， 得到重组质粒 PUC18-loxP-VT ；
④以 sacBF 和 sacBR 为引物， 以 pSacBm 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产 物用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切， 得到酶切产物 ；
⑤用限制性内切酶 NotI 和 XhoI 酶切 pUC18-loxP-VT， 回收载体骨架 ；
⑥ 将 步 骤 ④ 的 酶 切 产 物 和 步 骤 ⑤ 的 载 体 骨 架 连 接， 得到重组质粒pUC18-loxP-VTsB ；
⑦以 CmF3 和 CmR3 为引物， 以 pL34R12-Cm+ 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产 物；
⑧用限制性内切酶 SalI 酶切 pUC-loxP-VTsB ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶 酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤⑦的 PCR 扩增产物连接， 得到重组质粒 pACVTsB ；
⑨以 GmF 和 GmR 为引物， 以 pGWG 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
⑩用限制性内切酶 SalI 酶切 pUC-loxP-VTsB ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶 酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤⑨的 PCR 扩增产物连接， 得到重组质粒 pAGVTsB。
五、 attR2-attR1 框的构建
1、 以 ApF2 和 ApR2 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
2、 用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pL34R12-CmR-ccdB ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤 1 的 PCR 扩增产物连接， 得到 重组质粒 pL34R12-A ； 3、 用限制性内切酶 PacI 和 BspHI 酶切 pL34R12-A， 回收载体骨架 ；
4、 将 oPaBsF 和 oPaBsR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤 3 的载体骨架连接， 得 到重组质粒 pL3R12-A ；
5、 用限制性内切酶 AscI 和 AflII 酶切 pL3R12-A， 回收载体骨架 ；
6、 将 oAsAfF 和 oAsAfR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤 5 的载体骨架连接， 得 到重组质粒 pR-GA ；
7、 以 ccdBF 和 ccdBR 为引物， 以 pENTR1A 为模板进行 PCR 扩增， 将 PCR 扩增产物用 限制性内切酶 BspHI 酶切， 得到酶切产物 ；
8、 用限制性内切酶 BspHI 和 EcoRV 酶切 pR-GA， 回收载体骨架 ；
9、 将步骤 7 的酶切产物和步骤 8 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pRAcB。
六、 attL1-attL2 框的构建
1、 以 pUC-oriF 和 pUC-oriR 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 将 PCR 扩增产 物用限制性内切酶 NheI 酶切， 得到酶切产物 ；
2、 用限制性内切酶 DraI 和 XbaI 酶切 pGL12， 回收载体骨架 ；
3、 将步骤 1 的酶切产物和步骤 2 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL-2ori ；
4、 以 ApF 和 ApR 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 将 PCR 扩增产物用限制性 内切酶 NcoI 和 XbaI 酶切， 得到酶切产物 ；
5、 用限制性内切酶 BspHI 和 NheI 酶切 pL-2ori， 回收载体骨架 ；
6、 将步骤 4 的酶切产物和步骤 5 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL-Ap ；
7、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pRAcB， 回收约 1623bp 的片段 ；
8、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pL-Ap， 回收含 attL 框片段 ( 约 1856bp) ；
9、 将步骤 7 的大片段和步骤 8 的片段连接， 得到重组质粒 pLAcB。
七、 attP1-attP2 框的构建
1、 以 ApF3 和 ApR3 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
2、 用限制性内切酶 SalI 酶切 pDONR221 ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶切使 其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤 1 的 PCR 扩增产物连接， 得到重组质粒 p221-A ；
3、 用限制性内切酶 ApaI 和 PvuII 酶切 pGWG， 回收约 2063bp 的片段 ；
4、 用 限 制 性 内 切 酶 ApaI 和 PvuII 酶 切 p221-A， 回 收 含 attP 框 的 片 段 ( 约 1637bp) ；
5、 将步骤 3 的小片段与步骤 4 的载体骨架连接， 得到重组质粒 p221-AG ；
6、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pL-Ap， 回收小片段 ( 约 700bp) ；
7、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 p221-AG， 回收载体骨架 ；
8、 将步骤 6 的小片段与步骤 7 的载体骨架连接， 得到重组质粒 p221G-2ori ；
9、 以 ApF 和 ApR 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用限 制性内切酶 XbaI 和 NocI 酶切， 得到酶切产物 ；
10、 用限制性内切酶 NheI 和 BspHI 酶切 p221G-2ori， 回收载体骨架 ；
11、 将步骤 9 的酶切产物和步骤 10 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pP-A ；
12、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pRAcB， 回收约 1623bp 的片段 ；
13、 用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pP-A， 回收载体骨架 ； 14、 将步骤 12 的小片段与步骤 13 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pPAcB。
八、 attP2-attP1 盒的构建
1、 用限制性内切酶 ApaI 和 NheI 酶切 pDONR221 ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶 酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架自连， 得到重组质粒 p221Δ ；
2、 以 ApF2 和 ApR2 为引物， 以 pUC18 为模板进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 ；
3、 用限制性内切酶 SalI 酶切 p221Δ ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶切使其产 生平末端 ； 将平末端的载体骨架与步骤 2 的 PCR 扩增产物连接， 得到重组质粒 p221Δ-Ap ；
4、 用限制性内切酶 AhdI 酶切 pRAcB ； 回收约 1623bp 的片段， 用 T4 DNA 多聚酶酶 切使其产生平末端 ；
5、 用限制性内切酶 PvuII 酶切 p221Δ-Ap， 回收载体骨架 ； 回收含 attP 框片段的 片段 ( 约 1690bp) ；
6、 将步骤 4 的平末端片段与步骤 5 的载体骨架连接， 得到重组质粒 pPrAcB。
九、 用于制备供体载体的骨架载体的构建
1、 pL-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pLAcB， 回收含 attL 框片段 ( 约 1856bp) ；
②用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pAVTCsB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL-ccdB。
2、 pR-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 ApaI 和 PstI 酶切 pRAcB， 回收含 attR 框片段 ( 约 1926bp) ；
②用限制性内切酶 ApaI 和 PstI 酶切 pL-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pR-ccdB。
3、 pP-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pAVTCsB， 回收约 3538bp 的大片段 ；
②用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pPAcB， 回收含 attP1 框片段 ( 约 2592bp) ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pP-ccdB。
4、 pPr-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 ApaI 和 PstI 酶切 pL-ccdB， 回收约 4001bp 的大片段 ；
②用限制性内切酶 ApaI 和 PstI 酶切 pPrAcB， 回收含 attP2 框片段 ( 约 2168bp) ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pPr-ccdB。
5、 pLC-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pACVTsB， 回收约 3612bp 的大片段 ；
②用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pLAcB， 回收含 attL 框片段 ( 约 1856bp) ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pLC-ccdB。
6、 pRG-ccdB 载体的构建
①用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pAGVTsB， 回收约 3528bp 的大片段 ；
②用限制性内切酶 NotI 和 SalI 酶切 pR-ccdB， 回收约 2389bp 片段 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pRG-ccdB。
十、 受体载体的构建
1、 BIBAC-LTR 的构建
①以 GalF 和 GalR 为引物， 以 pGalK 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用 限制性内切酶 SalI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 SmaI 和 SalI 酶切 pL34R12-CVT， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的酶切产物与步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL34R12-CVTG ；
④用限制性内切酶 NcoI 和 SalI 酶切 pL34R12-CVTG， 回收载体骨架 ；
⑤将 oloxPF 和 oloxPR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤④的载体骨架连接， 得 到重组质粒 p32CVTGL ；
⑥用限制性内切酶 SacI 和 NcoI 酶切 p32CVTGL ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶 酶切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架自连， 得到重组质粒 p32CL ；
⑦用限制性内切酶 PacI 和 SacII 酶切 p32CL ； 回收载体骨架， 用 T4 DNA 多聚酶酶 切使其产生平末端 ； 将平末端的载体骨架自连， 得到重组质粒 pL3R12-CL ；
⑧以 BIBAC-LTRF 和 BIBAC-LTRR 为引物， 以 pL3R12-CL 为模板进行 PCR 扩增， 得到 的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切， 得到酶切产物 ；
⑨用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pCH20， 回收载体骨架 ；
⑩将步骤⑧的酶切产物与步骤⑨的载体骨架连接， 得到重组质粒 BIBAC-LTR。
2、 BIBAC-RTL 的构建
①以 BIBAC-RTLF 和 BIBAC-RTLR 为引物， 以 pL3R12-CL 为模板进行 PCR 扩增， 得到 的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 AscI 和 PacI 酶切 pCH20， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的酶切产物与步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 BIBAC-RTL。
3、 TAC-RTL 的构建
①用限制性内切酶 NotI 和 PmeI 酶切 pYLTAC747， 回收载体骨架 ；
②将 oTACF 和 oTACR 退火形成双链 DNA 片段， 然后与步骤①的载体骨架连接， 得到 重组质粒 pYLTAC747Δ ；③以 TAC-RTLF 和 TAC-RTLR 为引物， 以 pL3R12-CL 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 HindIII 和 NotI 酶切， 回收酶切产物 ；
④用限制性内切酶 HindIII 和 NotI 酶切 pYLTAC747Δ， 回收载体骨架 ；
⑤将步骤③的酶切产物和步骤④的载体骨架连接， 得到重组质粒 TAC-RTL。
4、 TAC-LTR 的构建
①以 TAC-LTRF 和 TAC-LTRR 为引物， 以 pL3R12-CL 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 HindIII 和 NotI 酶切， 回收酶切产物 ；
②用限制性内切酶 HindIII 和 NotI 酶切 pYLTAC747Δ， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 TAC-LTR。
实施例 2、 MISSA 实验
一、 供体载体的构建
1、 供体载体 pL-Hyg 的构建
①以 MarkerF 和 MarkerR 为引物， pMDC99 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增 产物用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pL-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL-Hyg。
2、 供体载体 pR-TM2 的构建
①用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pL12R34sB-MAR， 回收约 983bp 片段 ；
②用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pR-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pR-TM2。
3、 供体载体 pL-GUS 的构建
①用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pBI121， 回收约 3032bp 片段 ；
②用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pL-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pL-GUS。
4、 供体载体 pR-EGFP 的构建
①用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pL12R34sB-EGFP， 回收约 1862bp 片段 ；
②用限制性内切酶 HindIII 和 EcoRI 酶切 pR-ccdB， 回收载体骨架 ；
③将步骤①的小片段和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pR-EGFP。
二、 供体菌和受体菌的构建
1、 供体菌的构建
将重组质粒 pL-Hyg 转化大肠杆菌 BW20767， 得到的重组菌为供体菌 I(pL-Hyg)。
将重组质粒 pR-TM2 转化大肠杆菌 BW20767， 得到的重组菌为供体菌 II(pR-TM2)。
将重组质粒 pL-GUS 转化大肠杆菌 BW20767， 得到的重组菌为供体菌 I(pL-GUS)。
将 重 组 质 粒 pR-EGFP 转 化 大 肠 杆 菌 BW20767， 得到的重组菌为供体菌 II(pR-EGFP)。
2、 受体菌的构建
①以 CreF 和 CreR 为引物， 以大肠杆菌 SW106 的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 扩增产物用限制性内切酶 BstXI 和 NheI 酶切， 得到酶切产物 ；
②用限制性内切酶 BstXI 和 NheI 酶切 pAH57， 得到载体骨架 ；③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接， 得到重组质粒 pAH57-cra ；
④将 BIBAC-LTR 和 pAH57-cre 转化至大肠杆菌 DH10B 中， 得到受体菌 I。
三、 MISSA 实验
分别进行四次重组 ： 第一次重组的受体菌为受体菌 ( 类型 I)， 供体菌为实施例 1 制备的供体菌 I(pL-Hyg) ； 第二次重组的受体菌 ( 类型 II) 为第一次重组得到的重组菌， 供 体菌为供体菌 II(pR-TM2) ； 第三次重组的受体菌 ( 类型 I) 为第二次重组得到的重组菌， 供 体菌为供体菌 I(pL-GUS) ； 第四次重组的受体菌 ( 类型 II) 为第三次重组得到的重组菌， 供 体菌为供体菌 II(pR-EGFP)。
1、 相关培养基的制备
C25 板 ： 添加氯霉素的 LB 平板， 氯霉素的终浓度为 25ug/ml ；
KA 板 ： 添加卡那霉素和氨苄青霉素的 LB 平板， 卡那霉素的终浓度为 25ug/ml， 氨苄 青霉素的终浓度为 50ug/ml ；
KAC 板 ： 添加氯霉素、 卡那霉素和氨苄青霉素的 LB 平板， 氯霉素的终浓度为 25ug/ ml， 卡那霉素的终浓度为 25ug/ml， 氨苄青霉素的终浓度为 50ug/ml ；
KAGluSuc 板 ： 添加卡那霉素、 氨苄青霉素、 葡萄糖和蔗糖的 LB 平板， 卡那霉素的终 浓度为 25ug/ml， 氨苄青霉素的终浓度为 50ug/ml， 葡萄糖的终浓度为 0.2％ ( 质量百分含 量 )， 蔗糖的终浓度为 6％ ( 质量百分含量 )。
2、 构建同时表达四个基因的重组表达载体
(1) 第一次重组
①接合转移及 Cre/loxP 重组
供体菌在 C25 板上划线， 37℃培养 16 ～ 24hr(30℃培养 24 ～ 36hr 也可 ) ； 受体菌 在 KA 板上划线， 30℃培养 24 ～ 36hr。从平板上刮取等量的供体菌和受体菌， 分别重悬在 1.2ml 的 LB 中， 重复 “离心、 弃上清、 再加 1.2ml LB 重悬” 步骤 2 次， 洗去培养物中的抗生 素。供体菌菌液和受体菌菌液各取 600ul 混和， 30℃静置一个小时后， 涂 KAC 板， 30℃培养 24 ～ 36hr。
② λ 噬菌体位点特异性重组蛋白介导下体内重组
用牙签挑取 18 个菌落 ( 每牙签挑 6 个菌落 )， 置 6ml LB( 含质量百分含量为 0.2％ 的葡萄糖 ) 中， 42℃水浴中振荡培养 1 小时。涂 KAGluSuc 板， 30℃培养 24 ～ 36hr。
③重组克隆鉴定
随机挑选上述生长出来的克隆分别在 KA 板上和 C25 板上一对一划线。随机挑取 在 KA 板上生长且 C25 板上不生长的 20 个菌落进行 PCR 鉴定。
PCR 鉴定结果表明， 第一次重组中， Hyg 的克隆效率为 90％。
(2) 第二次重组
方法同步骤 (1)。
PCR 鉴定结果表明， 第二次重组中， TM2 的克隆效率为 80％。
(3) 第三次重组
方法同步骤 (1)。
PCR 鉴定结果表明， 第三次重组中， GUS 的克隆效率为 85％。
(4) 第四次重组方法同步骤 (1)。 PCR 鉴定结果表明， 第四次重组中， EGFP 克隆效率为 92％。20101979596 A CN 101979601
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