神经细胞死亡抑制剂 【技术领域】
本发明涉及一种细胞死亡抑制剂，详细而言，涉及一种具有神经细胞死亡抑制作用的脑神经保护剂。更详细而言，本发明是涉及具有神经细胞死亡抑制作用的下列药剂：以血管性痴呆或变性痴呆(所述变性痴呆以阿尔茨海默病性痴呆为代表)等痴呆性疾病的发展抑制剂、以血管性痴呆或变性痴呆(所述变性痴呆以阿尔茨海默病性痴呆为代表)等痴呆性疾病的预防和/或治疗剂、脑梗塞的复发预防剂、脑梗塞的预防和/或治疗剂。
背景技术
伴随着人口动态的高龄化，认知功能降低的状态即痴呆性疾病患者的增加成为社会问题。痴呆性疾病被定义为“基于脑血管疾病、阿尔茨海默症或其他原因的脑器质性(organic)变化，达到使日常生活产生障碍程度的记忆功能及其他认知功能降低的状态”。
虽然根据原因将痴呆(dementia)分为血管性痴呆及变性痴呆两大类，但任一类的结果均可见到神经细胞脱落。在不知其有效恢复方法的现状下，以抑制病态的发展为第一目标。
为人所知的阿尔茨海默病性痴呆是变性痴呆的一种，推断全世界的患者数目为约1800万人，预料今后将进一步增加，故期待开发预防方法及治疗方法。就阿尔茨海默病性痴呆的病理学特征而言，可列举脑组织的萎缩、大脑皮质的老人斑出现；已获知老人斑是β淀粉样蛋白(β-amyloid)沉积所致。
就阿尔茨海默病性痴呆的治疗法而言，已知有依据胆碱能假说(cholinergic hypothesis)(非专利文献1)的新药、依据淀粉样蛋白连级联反应假说(amyloid cascade hypothesis)(非专利文献2)的新药的开发。
其中，所谓胆碱能假说是依据阿尔茨海默病性痴呆患者的大脑皮质中乙酰胆碱合成酶活性特异性地减少的事实，而考虑通过某种方法补充乙酰胆碱量来治疗的方案。就依据该假说的治疗药而言，创制出具有抑制乙酰胆碱酯酶(是乙酰胆碱分解酶)作用的盐酸多奈哌齐(donepezilHCl)，其具有一定的效果。但是，基于胆碱能假说的药剂，由于是以神经回路的补强为目标，所以对于与病态发展同时出现的神经细胞脱落的事实，其有效性有限。
另一方面，所谓淀粉样蛋白级联反应假说是依据β淀粉样蛋白的凝集、沉积带来神经原纤维的变化，最终引起神经细胞死亡，而考虑通过防止β淀粉样蛋白的沉积来治疗的方案。就基于该假说的治疗药而言，虽然期待γ分泌酶(γ-secretase)的抑制剂、疫苗等开发，但有副作用的问题，至今尚未上市(非专利文献3)。
关于其他治疗途径，曾有报告提出在服用高脂血症治疗剂的HMG-CoA还原酶抑制剂(以下有时称为他汀类药物)的患者中，阿尔茨海默病性痴呆的发病率低的流行病学数据(非专利文献4)；及依据他汀类药物可使β淀粉样蛋白的生成降低的发现，而报告了他汀类药物有作为阿尔茨海默病性痴呆治疗药的可能性(专利文献1至8)。也有曾报告他汀类药物具有抑制γ分泌酶的活性复合物形成的作用(专利文献9)。
上述药剂对于神经细胞死亡的作用有以下报告。也就是说，已知盐酸多奈哌齐具有针对β淀粉样蛋白或谷氨酸的神经毒性的保护作用(非专利文献5及6)以及在缺血模型中的神经细胞保护作用(非专利文献7)。但是，这些都是体外(in vitro)的结果，而且由于显示神经保护作用的浓度也比显示乙酰胆碱酯酶抑制作用的浓度的用量高，在给药的患者中是否发挥神经保护作用并不明确。
此外，在他汀类药物的情况下，已知在实施短暂性脑缺血的动物模型中抑制脑梗塞尺寸增大的报告(非专利文献8)，及通过抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)减少的作用而发挥神经细胞保护作用(非专利文献9)。
也已知将盐酸多奈哌齐等乙酰胆碱酯酶抑制剂与他汀类药物组合而应用于阿尔茨海默病性痴呆的报告(专利文献10)。但是在该文献中不存在具体的数据，也未明确具体以何种药物组合最适合。此外，虽然已知乙酰胆碱酯酶抑制剂的加兰他敏(Galantamine)与他汀类药物并用的临床效果，不过与单独治疗相比，指出该并用治疗的情况增加了副作用的危险性(专利文献11)。此外，尚未有盐酸多奈哌齐对于短暂性脑缺血具有神经保护作用的报告。
如上所述，对于以阿尔茨海默病性痴呆为主的痴呆性疾病而言，尚不存在具有令人满意的、有效的神经细胞死亡抑制作用的药剂提供；此种药剂仍是人们所期望的。此外，具有有效的神经细胞死亡抑制作用的药剂，除对于痴呆性疾病有用之外，不但可作为脑梗塞复发的预防剂，而且还可作为脑梗塞的预防和/或治疗剂。
专利文献1：国际公开第02/062824号公报小册子
专利文献2：国际公开第01/096311号公报小册子
专利文献3：国际公开第01/032161号公报小册子
专利文献4：国际公开第00/028981号公报小册子
专利文献5：国际公开第99/048488号公报小册子
专利文献6：美国专利第6472421号
专利文献7：美国专利第6440387号
专利文献8：美国专利第6080778号
专利文献9：国际公开第2005/063294号公报小册子
专利文献10：国际公开第2005/099823号公报小册子
专利文献11：国际公开第03/082298号公报小册子
非专利文献1：Science，219：1184-1190，1983
非专利文献2：Science，256：184-185，1992
非专利文献3：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98：9312-9317，2001
非专利文献4：Arch.Neurol.，57：1439-1443，2000
非专利文献5：Neuroreport，9：1519-1522，1998
非专利文献6：J.Pharmacol.Exp.Ther.，306：772-777，2003
非专利文献7：Eur.J.Pharmacol.，472：57-63，2003
非专利文献8：Brain Research，1037：52-58，2005
非专利文献9：Therapeutic Research，26：1277-1286，2005
【发明内容】
本发明的目的在于提供对神经细胞死亡显示出优异的抑制作用的药剂。
鉴于这些实际情况，本发明人进行了深入研究，结果惊人地发现在并用匹伐他汀钙等匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐的情况下，可以得到该组合对神经细胞死亡具有特异且显著的抑制作用，从而完成本发明。至目前为止，有关将匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐组合的实例中，并没有报告神经细胞死亡抑制作用发挥至何种程度的实例。
也就是说，本发明提供：
(1)一种神经细胞死亡抑制剂，该神经细胞死亡抑制剂由匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐组合而成；
(2)上述(1)记载的神经细胞死亡抑制剂，其中，所述匹伐他汀类为匹伐他汀钙；
(3)上述(1)或(2)记载的神经细胞死亡抑制剂，其中，所述多奈哌齐盐为盐酸多奈哌齐；
(4)上述(1)至(3)的任一项记载的神经细胞死亡抑制剂，其中，所述的神经细胞死亡抑制剂将含有所述匹伐他汀类的制剂与含有所述多奈哌齐或多奈哌齐盐的制剂组合后进行给药；
(5)上述(1)至(4)的任一项记载的神经细胞死亡抑制剂，其中，所述神经细胞死亡抑制剂为脑神经保护剂；
(6)上述(1)至(4)的任一项记载的神经细胞死亡抑制剂，其中，所述神经细胞死亡抑制剂为痴呆性疾病的预防和/或治疗剂；
(7)上述(6)记载的神经细胞死亡抑制剂，其中，所述痴呆性疾病的预防和/或治疗剂为痴呆性疾病的发展抑制剂；
(8)上述(6)或(7)记载的神经细胞死亡抑制剂，其中，所述痴呆性疾病为血管性痴呆或变性痴呆；
(9)上述(8)记载的神经细胞死亡抑制剂，其中，所述变性痴呆为阿尔茨海默病性痴呆；
(10)上述(1)至(4)的任一项记载的神经细胞死亡抑制剂，其中，所述神经细胞死亡抑制剂为脑梗塞的预防和/或治疗剂；
(11)上述(10)记载的神经细胞死亡抑制剂，其中，所述脑梗塞的预防和/或治疗剂为脑梗塞的复发预防剂；
(12)一种医药组合物，该医药组合物含有匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐，以及制药上可接受的载体；
(13)上述(12)记载的医药组合物，其中，所述匹伐他汀类为匹伐他汀钙；
(14)上述(12)或(13)记载的医药组合物，其中，所述多奈哌齐盐为盐酸多奈哌齐；
(15)上述(12)至(14)的任一项记载的医药组合物，其中，该医药组合物将含有匹伐他汀类的制剂与含有多奈哌齐或多奈哌齐盐的制剂组合后进行给药；
(16)上述(12)至(15)的任一项记载的医药组合物，其中，该医药组合物用于抑制神经细胞死亡；
(17)上述(12)至(16)的任一项记载的医药组合物，其中，该医药组合物用于保护脑神经；
(18)上述(12)至(17)的任一项记载的医药组合物，其中，该医药组合物用于痴呆性疾病的预防和/或治疗；
(19)上述(18)记载的医药组合物，其中，所述痴呆性疾病的预防和/或治疗是指抑制痴呆性疾病的发展；
(20)上述(18)或(19)记载的医药组合物，其中，所述痴呆性疾病为血管性痴呆或变性痴呆；
(21)上述(20)记载的医药组合物，其中，所述变性痴呆为阿尔茨海默病性痴呆；
(22)上述(12)至(15)的任一项记载的医药组合物，其中，该医药组合物用于脑梗塞的预防和/或治疗；
(23)上述(22)记载的医药组合物，其中，所述脑梗塞的预防和/或治疗用于预防脑梗塞复发；
(24)一种抑制患者的神经细胞死亡的方法，该方法包含将含有匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐以及制药上可接受的载体的医药组合物以足以抑制神经细胞死亡的有效量给予患者；
(25)一种保护患者的脑神经的方法，该方法包含将含有匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐以及制药上可接受的载体的医药组合物以足以保护脑神经的有效量给予患者；
(26)上述(24)或(25)记载的方法，其中，所述匹伐他汀类为匹伐他汀钙；
(27)上述(24)至(26)的任一项记载的方法，其中，所述多奈哌齐盐为盐酸多奈哌齐；
(28)上述(24)至(27)的任一项记载的方法，其中，将含有匹伐他汀类的制剂与含有多奈哌齐或多奈哌齐盐的制剂组合后进行给药；
(29)上述(24)至(28)的任一项记载的方法，其中，所述抑制神经细胞死亡或保护脑神经用于痴呆性疾病的预防和/或治疗；
(30)上述(29)记载的方法，其中，所述痴呆性疾病的预防和/或治疗是指抑制痴呆性疾病的发展；
(31)上述(29)或(31)记载的方法，其中，所述痴呆性疾病为血管性痴呆或变性痴呆；
(32)上述(31)记载的方法，其中，所述变性痴呆为阿尔茨海默病性痴呆；
(33)一种预防和/或治疗患者的脑梗塞的方法，该方法包含将含有匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐以及制药上可接受的载体的医药组合物以足以预防和/或治疗脑梗塞的有效量给予患者；
(34)上述(33)记载的方法，其中，所述脑梗塞的预防和/或治疗为预防脑梗塞的复发；
(35)一种匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐的组合的用途，其用于制造神经细胞死亡抑制剂；
(36)一种匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐的组合的用途，其用于制造脑神经保护剂；
(37)上述(35)或(36)记载的用途，其中，所述匹伐他汀类为匹伐他汀钙；
(38)上述(35)至(37)的任一项记载的用途，其中，所述多奈哌齐盐为盐酸多奈哌齐；
(39)上述(35)至(38)的任一项记载的用途，其中，该匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐的组合的用途，是将含有匹伐他汀类的制剂与含有多奈哌齐或多奈哌齐盐的制剂组合后进行使用；
(40)上述(35)至(39)的任一项记载的用途，其中，所述神经细胞死亡抑制剂或脑神经保护剂是用于痴呆性疾病的预防和/或治疗；
(41)上述(40)记载的用途，其中，所述痴呆性疾病的预防和/或治疗是指抑制痴呆性疾病的发展；
(42)上述(40)或(41)记载的用途，其中，所述痴呆性疾病为血管性痴呆或变性痴呆；
(43)上述(42)记载的用途，其中，所述变性痴呆为阿尔茨海默病性痴呆；
(44)一种匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐的组合的用途，其用于制造脑梗塞的预防剂和/或治疗剂；
(45)上述(44)记载的用途，其中，所述脑梗塞的预防剂和/或治疗剂是用于预防脑梗塞的复发。
根据本发明，可以提供对神经细胞死亡显示出优异抑制作用的神经细胞死亡抑制剂，此外，可以提供脑神经保护剂、痴呆性疾病的发展抑制剂、痴呆性疾病的预防和/或治疗剂、脑梗塞的复发预防剂、脑梗塞的预防和/或治疗剂。
【附图说明】
图1是显示匹伐他汀与安理申(Aricept)(盐酸多奈哌齐)单独或并用给药时对神经细胞死亡的作用效果图。
图2是显示辛伐他汀(sinvastatin)与安理申(盐酸多奈哌齐)单独或并用给药时对神经细胞死亡的效果图。
【具体实施方式】
本发明所使用的匹伐他汀类包含匹伐他汀或匹伐他汀盐、或者这些物质的内酯体，也包含与这些物质的水合物等医药品所允许的溶剂形成的溶剂合物。匹伐他汀类具有基于HMG-CoA还原酶抑制作用的胆固醇合成抑制活性，已知可作为高脂血症治疗药。作为匹伐他汀的盐，可列举：钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土类金属盐；苯乙基胺盐等有机胺盐或铵盐等。其中，匹伐他汀类优选匹伐他汀盐，特别优选钙盐、钠盐。
可根据美国专利第5856336号、日本特开平1-279866号公报所记载的方法制造匹伐他汀类。
本发明所使用的多奈哌齐或多奈哌齐盐，已知是基于乙酰胆碱酯酶抑制作用可作为阿尔茨海默病性痴呆的治疗剂。关于盐酸多奈哌齐，可根据公知的方法，例如日本特开平1-79151号公报、日本特开平07-252216号公报、日本特开平11-263774号公报或日本特开平11-171861号公报等所公开的方法容易地进行制造。此外，盐酸多奈哌齐可由市售品(商品名“安理申”)容易地获得。作为多奈哌齐盐，只要是医药上可接受的盐即无特殊限制，可例举如：盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐等无机酸盐；乙酸盐、三氟乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等有机酸盐等；其中，优选盐酸盐。
本发明将匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐进行组合后给药，如下述实施例所示，对大鼠椎骨-总颈动脉结扎(4点缺血)再开通的模型，与分别单独给予匹伐他汀类、或者多奈哌齐或多奈哌齐盐的情况相比较，在并用这两种药剂的情况下，海马CA1区域的神经细胞死亡得到显著地抑制，显示出显著的神经细胞死亡抑制作用。因此，本发明的药剂可用作神经细胞死亡抑制剂。本发明的神经细胞死亡抑制剂还可作为脑神经保护剂、痴呆性疾病的发展抑制剂、痴呆性疾病的预防和/或治疗剂、脑梗塞的复发预防剂、脑梗塞的预防和/或治疗剂。就痴呆性疾病而言，可列举：多发梗塞性痴呆大范围缺血型(包含Binswanger(宾斯旺格)型白质脑病)、多发脑梗塞性、局限性脑梗塞性、遗传性血管性痴呆(CADASIL等)等血管性痴呆；阿尔茨海默病性痴呆(阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease；简称AD)或阿尔茨海默病型老年痴呆(seniledementia Alzheimer’s type；简称SDAT))、额颞叶变性症(额颞叶痴呆(frontotemporal dementia；简称FTD)、匹克氏病(Pick’s disease)等)、路易体痴呆(弥漫性路易体病(Diffuse Lewy body disease；简称DLBD)等)、帕金森氏病(伴有痴呆的帕金森氏病(Parkinson’s disesase(PD)with dementia))、神经原纤维变化型老年痴呆、嗜银颗粒性痴呆、亨丁顿舞蹈症(Huntington’s disesase)、进行性核上性麻痹(progressivesupranuclear palsy)、皮质基底核变性症等变性痴呆；此外，还可列举克雅氏病(Creutzfeldt-Jacob Disease)、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关性痴呆。在这些痴呆性疾病中，本发明的药剂尤其可作为阿尔茨海默病性痴呆的发展抑制剂、阿尔茨海默病性痴呆的预防和/或治疗剂。
本发明所用的药剂或医药组合物的给药方式，并无特殊限制，可依治疗目的而进行适当地选择，可列举如通过片剂、胶囊剂、颗粒剂、薄膜包衣剂、散剂、糖浆剂等口服给药，或者通过注射剂、栓剂、吸入剂、经皮吸收剂、滴眼剂、滴鼻剂等非口服给药。不过，通常情况下，优选口服给药。
在配制口服固体制剂的情况下，可加入赋形剂，且视需要加入粘合剂、崩散剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂等后，通过常用方法制造片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等。作为添加剂可使用该领域一般使用的物质，可例举如：作为赋形剂的乳糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、微晶纤维素、硅酸等；作为粘合剂的水、乙醇、丙醇、单糖浆、明胶液、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、紫胶、磷酸钙、聚乙烯吡咯烷酮等；作为崩散剂的琼脂末、碳酸氢钠、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯(ステアリン酸モノグリセリド)等；作为润滑剂的精制滑石、硬脂酸盐、硼砂、聚乙二醇等；作为着色剂的β-胡萝卜素、黄色三氧化二铁、焦糖(caramel)等；作为矫味剂的蔗糖、橙皮等。
在配制口服固体制剂的情况下，可加入矫味剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂等，并通过常用方法制造内服液剂、糖浆剂、酏剂等。作为添加剂，可使用该领域一般使用的物质，可例举例如作为矫味剂的蔗糖等、作为缓冲剂的柠檬酸钠等、作为稳定剂的黄蓍胶等、作为防腐剂的对羟基苯甲酸酯等。
在配制注射剂的情况下，可添加pH调节剂、稳定剂、等张剂，并通过常用方法制造皮下注射剂、肌肉注射剂及静脉内注射剂。作为添加剂，可使用该领域一般使用的物质，可例举例如作为pH调节剂的磷酸钠等、作为稳定剂的焦亚硫酸钠等、作为等张剂的氯化钠等。
本发明的药剂或医药组合物的使用形式，虽然可以作为如下形式使用：将匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐组合使用，作为经过两种药剂的给药而协同增效的神经细胞死亡抑制剂，以得到脑神经保护、阿尔茨海默症型痴呆的发展抑制、阿尔茨海默症型痴呆的预防和/或治疗、脑梗塞的复发预防、脑梗塞的预防和/或治疗效果，但并不限于这些使用形式。可将匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐同时给予，也可相隔一段时间分别给予。也就是说，对于匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐，可将该两种药剂制成单一制剂使用，或将该两种药剂分别制成制剂而以组合产品(试剂盒)的形式使用。
在本发明中，将该两种药剂制成单一制剂而给药的情况下，匹伐他汀类与多奈哌齐或多奈哌齐盐的配制比以质量比计，在1∶0.005至1∶500的范围；此外，从得到特别优异的协同增效效果的观点出发，优选1∶0.1至1∶10的范围。
此外，在本发明中，将该两种制剂分别制成制剂的情况下，含有匹伐他汀类的制剂可以通过与多奈哌齐或多奈哌齐盐并用给药作为神经细胞死亡抑制剂的形式提供，且可作为与多奈哌齐或多奈哌齐盐并用给药的脑神经保护剂、痴呆性疾病的发展抑制剂、痴呆性疾病的预防和/或治疗剂、脑梗塞的复发预防剂、脑梗塞的预防和/或治疗剂来使用。另一方面，含有多奈哌齐或多奈哌齐盐的制剂可以通过与匹伐他汀类并用给药作为神经细胞死亡抑制剂的形式提供，且可作为与匹伐他汀类并用给药的脑神经保护剂、痴呆性疾病的发展抑制剂、痴呆性疾病的预防和/或治疗剂、脑梗塞的复发预防剂、脑梗塞的预防和/或治疗剂来使用。该两种药剂的剂型可以相同，也可以不同。此外，各成分的给药次数可以不同。
在本发明中，匹伐他汀类的给药量，虽可依患者的体重、年龄、性别、症状等进行适当地选择，但在成人的情况下，通常每日可给药0.01至50mg，优选0.1至20mg，更优选1至10mg。此外，多奈哌齐或多奈哌齐盐的给药量，虽可依症状增减，但在成人的情况下，通常每日可给药0.01至100mg，优选0.1至50mg，更优选1至10mg。此外，给药可为每日1次或分为2次以上给药。
在本说明书中，并入了作为本申请基础申请的日本专利申请2007-259682号说明书中所记载的全部事项。此外，在本申请的日文说明书中，依据目前的表述方法，将该基础申请说明书中的“痴呆”修改为“認知症”。
以下，虽然列举了实施例来进一步说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1 对于大鼠椎骨-总颈动脉结扎(4点缺血)再开通模型的海马CA1区域的神经细胞死亡，依据以下的试验方法评价并用给药匹伐他汀钙(以下，以“匹伐他汀”来表述)与盐酸多奈哌齐(以下，使用商品名“安理申”来表述)时的效果。
1.供试动物及饲育环境
取得7周龄的Crlj:WI系雄性大鼠(日本Charles River株式会社)，经检疫(5日)及驯化(7日以上)后供应实验。在整个实验期间，在维持明暗周期(室内光照明期间：早上6点至下午6点)、温度23±3℃、湿度55±15％的饲育室中进行饲育，并让大鼠自由摄取固体饲料(CRF-1；日本东方酵母工业株式会社(Oriental Yeast Co.，Ltd.))及饮用水(自来水)。
2.溶液配制
将匹伐他汀与安理申在使用时分别悬浮于羧甲基纤维素钠(以下称为CMC-Na，SIGMA)的0.5w/v％水溶液中，且按照使给药量成为5mL/kg的方式进行配制。
3.试验方法
按照平均体重基本均匀的方式，将大鼠分成5组(每组6只)：(1)正常组(未处理组)；(2)溶剂对照组；(3)匹伐他汀(3mg/kg)单独给药组；(4)安理申(0.5mg/kg)单独给药组；(5)匹伐他汀(3mg/kg)和安理申(0.5mg/kg)并用给药组。
将分组之日定为给药的第1日，被检药物每日给药1次，共计6日，合计口服给药6次。此外，对于正常组及溶剂对照组，给予CMC-Na的0.5w/v％水溶液。
在给药的第5日，对于正常组之外的大鼠，经由腹腔内给予35mg/kg的戊巴比妥钠(Nenbutal(登录商标)注射液，大日本制药株式会社)，在麻醉下露出位于第一颈椎部的左右翼孔(alar foramen)，用烙铁将椎骨动脉热凝固且永久结扎两侧椎骨动脉。接下来，露出、剥离两侧总颈动脉，将硅管环状放置并缝合。
在给药的第6日，将正常组之外的大鼠在乙醚麻醉下，通过放置的硅管露出两侧总颈动脉，以杉田式血管夹(瑞穗医科工业株式会社)进行10分钟的短暂性结扎后，缝合皮肤。
在两侧总颈动脉结扎再开通后的第5日(正常组是最终给药的第5日)，对于通过常用方法麻醉后的大鼠，以4％的多聚甲醛(pH 7.4)、继而用波恩氏溶液(Bouin’s solution)(pH 3.5至4.0)进行灌注固定处理，并摘出脑。将固定过的脑进行脱水、透明、包埋于石蜡后，以前囟(bregma)-3.3mm附近制作厚10μm的切片。接下来，将切片进行尼氏(Nissle)染色，在光学显微镜下拍摄右侧海马CA1区域，用影像分析装置(Win ROOF V5.6，三谷商事)计算神经细胞数目，然后测量CA1的长度。
4.数据处理及统计分析
依照下式，求出每单位长度的神经细胞数目，且计算出每组的平均值及标准偏差。
海马CA1神经细胞数目(个数/mm)＝CA1的神经细胞数目(个数)/单位长度(所测定场所的长度：mm)。
对于显著性差异(significant difference)检验，在(1)组与(2)组之间进行Student t检验；在(2)组与(3)、(4)及(5)组之间进行Dunnett多重比较检验。关于显著性标准(significance level)，将任一检验的出错率(p)小于5％当作具有显著性，其分为小于5％(p＜0.05)及小于1％(p＜0.01)进行表述。
结果如图1所示。图1的纵轴表示神经细胞数目(个数/mm)。图1中“##”记号为p＜0.01，表示具有显著性差异；“*”记号为p＜0.05，表示具有显著性差异。如图1所示，在溶剂对照组中，与正常组相比较，可确认海马CA1区域的神经细胞数目有显著减少。
与溶剂对照组相比较，在3mg/kg匹伐他汀的单独给药组、0.5mg/kg安理申的单独给药组中，虽然显示神经细胞数目有增加的倾向，但不具有显著性。就3mg/kg匹伐他汀的单独给药组而言，虽也曾报告具有显著差异(参照非专利文献9)，但在如本发明上述实验方法这样严格的方法中，无法确认有显著差异。
相对于此，在3mg/kg匹伐他汀与0.5mg/kg安理申的并用给药组中，与溶剂对照组相比较，可观察到海马CA1区域的神经细胞数目显著增加，可以确认本发明的两种药剂的并用产生了明显的作用效果。
比较例1 为了确认匹伐他汀以外的他汀类药物的作用，使用辛伐他汀进行同样的试验。也就是说，除了使用辛伐他汀(15mg/kg)代替实施例1中的匹伐他汀以外，供试动物及饲育环境、溶液配制、试验方法、数据处理及统计分析均在完全相同的条件下进行。因此，组的构成为以下5组：(1)正常组(未处理组)；(2)溶剂对照组；(3)辛伐他汀(15mg/kg)单独给药组；(4)安理申(0.5mg/kg)单独给药组；(5)辛伐他汀(15mg/kg)和安理申(0.5mg/kg)并用给药组(各组6至9例)。
此外，辛伐他汀是从(中国)浙江康裕制药有限公司(Zhejiang KangyuPharmaceutical Co.，LTD.)购入，供实验使用。
结果如图2所示。图2的纵轴表示神经细胞数目(个数/mm)。图2中的“**”记号为p＜0.01，表示具有显著性差异。如图2所示，在溶剂对照组中，与正常组相比较，可观察到海马CA1区域的神经细胞数目显著减少。
与溶剂对照组相比较，在15mg/kg辛伐他汀的单独给药组、0.5mg/kg安理申的单独给药组中，虽然显示出神经细胞数目有增加的倾向，但无显著性。此外，与溶剂对照组相比较，在15mg/kg辛伐他汀与0.5mg/kg安理申的并用给药组中，虽然可见到海马CA1区域的神经细胞数目有增加的倾向，但与分别单独给药的情况相比较，其增加的程度小，无法确认两种药剂并用所产生的作用效果。
工业实用性
本发明提供了神经细胞死亡抑制剂，即使在所谓大鼠椎骨-总颈动脉结扎(4点缺血)再开通模型的极严苛条件下，该神经细胞死亡抑制剂仍对神经细胞死亡显示出优异的抑制作用，可提供作为脑神经保护剂、痴呆性疾病的发展抑制剂、痴呆性疾病的预防和/或治疗剂、脑梗塞的复发预防剂、脑梗塞的预防和/或治疗剂的药剂，在医药品产业方面具有工业实用性。