用低剂量MPTP建立雄性猕猴慢性帕金森病模型的方法 【技术领域】
本发明属生命科学技术领域，具体涉及一种建立帕金森病灵长类动物模型的方法。
背景技术：
帕金森病(PD)是仅次于阿尔茨海默病的第二大中枢神经系统退行性疾病。该病一般在50岁至65岁开始发病，发病率随年龄增长而逐渐增加，60岁发病率约为1‰，70岁发病率达3‰至5‰。帕金森病早期主要表现包括静止性震颤、肌强直、行动缓慢、动作启动困难以及姿势异常等。静止性震颤即患者的手或臂不受控制地发抖，在休息时出现或情绪紧张时加重；其他早期症状包括开始活动时感到困难，其后双臂和双腿经常震颤，上肢不能作精细运动，乃致日常生活不能自理，如穿衣、洗漱感觉困难。帕金森病还常伴有抑郁、焦虑、肢体酸痛不适、多汗、流涎等。因此，帕金森病给家庭社会带来沉重的负担。
当基底节中多巴胺(dopamine，DA)含量减少70％时，才开始出现临床症状。因此，去医院就诊的帕金森病患者脑内已出现不可逆的损伤。要在疾病早期进行诊断，建立一个合适的动物模型显得犹为重要。几十年来，研究者建立了多种多样的帕金森病动物模型。从最早的利血平模型、甲基苯丙胺模型到6-羟多巴模型和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶模型(MPTP模型)。最近发现系统的给予农药杀虫剂鱼藤酮能在大鼠模型上产生明确的PD症状。
利血平和甲基苯丙胺都是通过耗竭脑内单胺类神经递质使动物出现骨骼肌僵硬、震颤、舔毛等与帕金森症相似的症状。这两种模型都属于急性损伤模型，不能完全复制原发性帕金森病的病理变化。并且实验对象为啮齿类动物，不能为人类帕金森病提供很好的信息。
6-OHDA与DA有很强的化学相似性，因此能在儿茶酚胺能神经元内特异性聚集，对大鼠、小鼠、猫和灵长类动物均有神经毒性。6-OHDA(8～12μg)注射于纹状体或内侧前脑束，可以造成大鼠的运动平衡障碍，如躯体弯曲、运动不能、肌强直等。随着病程延长，动物会出现吞咽和呼吸困难。6-OHDA单侧损毁制备的PD动物模型在病理、生化方面的表现同人类PD有不少相似之处，如黑质DA能神经元变性、死亡、缺失，胶质细胞增生，黑质和纹状体TH活性及DA含量降低。另一优点是在系统注射DA受体激动剂L-DOPA或促DA释放药物后，可导致不对称的、能够定量化的异常运动行为。因此，药物诱发的旋转行为的量化是评价抗PD药物疗效稳定可靠的指标。缺点是该模型仍属急性损伤模型，不能模拟PD慢性进行性病程特点，不能用于长期神经保护研究中。病理方面也与人类PD有一定差异，如无细胞内包涵体Lewy小体。而且6-OHDA不能透过血脑屏障，只能通过脑内直接给药才能造成黑质神经元的损伤。这样，为在灵长类上的应用增加了一定的难度。
鱼藤酮是一种从植物中提取的天然有机杀虫剂，具有高亲脂性，容易透过血脑屏障，对脑组织线粒体复合酶I具有很强的抑制作用。制备模型的神经毒素来源于自然环境，其慢性暴露的制作方式能较好地模拟PD发病过程，在病理、生化、发病机制、行为改变等方面均能较好地模拟人类PD的相关特征。由于产生类似Lewy小体的α-synuclein阳性包涵体，它成为研究Lewy小体形成的分子机制的有效工具。该模型对研究环境因素与PD病因及发病机制之间的关系具有独特的价值。其慢性、进行性病程特征还特别适合PD的神经保护治疗研究。缺点是鱼藤酮因为其亲脂性，可以进入所有细胞中，并不选择性的累积在DA能神经元中。同时，制备过程费时、费力，不同动物个体的制备效果不一(有些动物无明显毒性效应)。
1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)是一种高亲脂性物质，给药后能够迅速透过血脑屏障并被星形胶质细胞内单胺氧化酶B(MAO-B)转化为1-甲基4-苯基吡啶离子(MPP+)。而后，特异性的在DA能神经元内浓集。MPTP的毒性效应存在种属差异，人和灵长类动物最为敏感，猫和小鼠次之，而大鼠、豚鼠对其有明显的抵抗力。这种种属敏感性差异的原因不明，可能与MPTP进入体内后的分布、代谢及动物体内MAO-B的活性、抗氧化反应能力的差异等有关。目前，利用MPTP制备的帕金森病模型有：①双侧损毁模型：成年恒河猴(猕猴、松鼠猴亦可)，麻醉后，腹腔注射MPTP 2-4mg/Kg，每日一次，共4次，或者按体重0.35-0.5mg/Kg下肢静脉注射MPTP，第1日3次，第2、3日每日2次。在2-4次注射后出现短暂海洛因样急性反应，表现为仰卧、瞌睡、间歇性闭眼、动作减少、重复点头、四肢伸展、头向后仰并向一侧旋转。一周后出现类似于人类的PD症状，如眨眼少、两眼凝视、动作减少、动作迟缓、肢体发僵、震颤、屈曲姿势、发音、吞咽困难等。②单侧损毁模型：恒河猴，按体重0.5-0.7mg/Kg一侧颈动脉注射MPTP，一周后出现损毁对侧肢体活动减少，以及自发性向损毁侧转身。腹腔注射苯丙胺诱发向损毁侧快速旋转，注射阿朴吗啡后向损毁对侧快速旋转。提高剂量至0.8mg/Kg则可制成偏侧为主的双侧PD模型。③MPTP对小鼠有DA能神经毒性，但所需剂量要比损害猴DA能神经元的剂量高得多。一般选10-12周龄，体重25-30g成年C57/BL褐鼠，按体重30-4mg/Kg腹腔注射MPTP，一天一次，连续7次。于第6-7次注射后出现暂时性(2-3h)躯干震颤、竖毛、尾巴过伸、动作减少及爬杆试验障碍。④成年家猫，按体重5mg/Kg腹腔注射MPTP，连续5天。于第2次注射后可见短暂海洛因样毒性反应，如瞳孔散大、流泪、流涎、凝视、活动异常等。在首次注射后次日起逐渐表现出表情呆滞、两眼凝视、瞬目减少、低头弓背、发音低弱、活动减少、动作笨拙、进食困难等PD症状。此模型行为反应持续约1-2周，较小鼠PD模型行为反应持续时间长且稳定。MPTP的动物模型不仅有PD症状，也有DA能神经元选择性损伤的病理改变，因而被广泛用于PD发病机制、诊断及治疗方面的研究工作中。但是，目前利用MPTP建立的灵长类帕金森病模型，主要以急性模型为主，并不能模型人类帕金森病的慢性进程。
技术方案
本发明的目的是针对现有技术的缺陷和不足，提供一种帕金森病灵长类动物模型的建立方法，即用低剂量MPTP建立雄性猕猴慢性帕金森病模型的方法，所建立的模型能模拟人类帕金森病慢性进程。
MPTP诱导的帕金森病已为社会所公认。利用MPTP制备的灵长类PD模型，在症状、体征、病理、生化改变方面均与人类PD相似，而且较稳定，对抗PD药物地反应(包括副作用)也同人类相似。利用MPTP诱导出的灵长类PD症状可以用PD患者的量表进行定量研究。这是目前所建立的最能反映人类PD特征的动物模型。灵长类动物在进化、组织结构、免疫、生理和代谢等方面与人类高度近似，尤其是在神经系统方面，灵长类动物是许多人类特有疾病唯一或最合适的实验动物模型。目前的帕金森病动物模型可分为急性和慢性模型。从最终结果上来看，两种模型均能模拟出人类帕金森病发展到后期的生理、生化改变。但是，人类的帕金森病是在各种因素作用下逐渐表现出病征的，病程能持续十几年甚至几十年。因此，要模拟人类帕金森病，慢性模型具有更大的优势。通过低剂量长期给药MPTP建立的慢性模型可以帮助阐明发病的机理、发现疾病在病情改变中的各种特征表现、可以在模型建立过程中对各种可能的治疗方法进行检测。
为了建立可靠的慢性灵长类帕金森病模型，我们通过低剂量长期肌肉给药MPTP来建立雄性猕猴慢性帕金森病模型。该模型主要通过行为观察、MRI观察脑内结构变化、SPECT观察脑内功能变化来确定模型的有效性。
本发明方法按以下步骤进行：
1、给雄性猕猴肌肉注射MPTP三个月或三个月以上的时间，每隔2～3天注射1次，每次0.2～0.4mg/kg，在注射MPTP的期间，对猕猴每隔1～2天做一次行为观察，注射持续到猕猴出现震颤症状为止；
2、该猕猴在注射MPTP以前进行MRI扫描，得到正常期的图谱，对步骤1注射MPTP过程中的猕猴每20～40天进行一次MRI检测，其结果和正常期的图谱进行对比，以观察脑内黑质区的改变进程；
3、该猕猴在注射MPTP以前进行SPECT扫描，得到正常期的图谱，对步骤1注射MPTP过程中的猕猴每20～40天进行一次SPECT检测，其结果和正常期的图谱进行对比，以观察纹状体成像上的改变进程；
4、注射过MPTP的猕猴，如果：行为观察猴出现震颤，并且在MRI成像上观察到脑内黑质区有神经元缺损，同时在SPECT成像上显示纹状体有神经元缺损，则表明该猕猴就是成功建立的模型。
本发明进一步优化的方法是，行为观察时根据国际通用的Kurlan帕金森氏病量表(见下表1)做行为评分，以评价猕猴帕金森病的严重程度，从而满足模型的使用者的不同要求；进行SPECT扫描时用锝的同位素(99Tc)标记脑内DA转运体。行为观察最好用录象法。
表1
帕金森相关症状
1.震颤
0-无
1-轻微的、低幅度的震颤，间断性的出现
2-中等程度-中等幅度的震颤，在大多数时间都出现
3-严重的-大幅度的震颤，几乎是持续性且干扰了正常的功能
2.身体姿态
0-正常，直立的
1-弯腰、屈背
2-面部贴近地面(脚面)
3.步态
0-正常；流畅的使用四肢
1-行走减慢
2-显著的行走受损；虽然可以移动但是速度很慢并且吃力
3-移动的能力严重降低(受损)
4-不能行走
4.运动徐缓(概括性的)
0-正常的速度以及灵巧的运动
1-所有的运动都表现出轻微的运动减慢
2-中等程度的运动减慢
3-严重的运动减慢；在发起维持运动中非常缓慢的、吃力的、困难
4-基本上没有运动(运动不能)
5.平衡
3-正常
4-在站起或运动的过程中经常失去平衡，靠抓住笼子来支撑
5-严重失去平衡
6.整体运动技能(上肢，左/右))
0-正常；可以在运动和活动中大范围的使用上肢
1-可观察到的上肢使用的减少，但是仍然可以经常的使用
2-上肢使用减少，几乎不用
3-无法或拒绝使用上肢(包括行走)
7.防御性反应(对实验人员防御性的和/或者进攻性的反应)
0-正常；适度的反应
1-可观察到的损伤；缓慢的、不正常的或者短暂的反应
2-对挑衅很少做出反应或者没有反应
帕金森病患者的脑内由于神经元的死亡，导致铁沉积，此现象表现在MRI上为黑色沉积。用锝的同位素(99Tc)标记脑内DA转运体，通过检测脑内DA转运体的含量来判断DA神经元的缺失程度。若脑内DA神经元死亡，DA转运体变会及时的减少，与99Tc的结合率下降，在SPECT成像上显示纹状体颜色变浅。
本发明方法第一次将行为指标、MRI、SPECT三种方法结合，用于帕金森病动物模型的建立。
本发明积极效果：本方法成功建立了慢性灵长类帕金森病模型，所建立的动物模型能模拟人类帕金森病慢性进程。模型不仅有PD症状，也有DA能神经元选择性损伤的病理改变，可广泛用于PD发病机制、诊断及治疗方面的研究工作中。
本研究还发现帕金森猴脑内黑质铁沉积明显，表明黑质损伤。根据铁沉积的面积等，可以计算出黑质损伤程度。这点可为研究人类帕金森病提供有效的诊断手段。
本研究利用SPECT发现帕金森猴脑内DA转运体减少，表明黑质神经元含量减少。根据DA转运体减少的量，可以定量的计算出黑质神经元的缺失数。这点也可以为人类帕金森病的诊断分级提供有用的信息。
本方法最大的优点是，模型猴出现运动症状需要数个月的时间，在这几个月内，研究者可以进行各种研究。例如，摸索帕金森病的发病原因、影响因素等；摸索运动症状出现前，是否有其他方面的改变。这可以为人类帕金森病的早期预防提供非常有用的信息。
【附图说明】
图1表明实施例1中模型猴的症状随时间的增加而加重
图2为实施例1中模型猴与正常猴的MRI扫描结果对比。
图3为实施例1中模型猴与正常猴的SPECT扫描结果对比。
图4表明实施例2中模型猴的症状随时间的增加而加重
【具体实施方式】
实施例1：猕猴为雄性，7岁。MPTP购买自美国Sigma公司。
1、每隔2天给该猕猴肌肉注射MPTP 1次，每次0.2mg/kg。给药3个月出现明显的帕金森病症状，如：四肢震颤、运动缓慢、运动量减少、运动发起困难等。
2、在注射MPTP的期间，对猕猴每隔一天通过录象做一次行为观察，采集猕猴全天的行为数据。录象装置安装在猴房内，排除人的干扰。根据表1做行为评分，结果见图1。
3、对注射MPTP 3个月的猕猴用MRI检测脑内的结构变化，观察脑内黑质区的改变，结果见图2。图2中左边为正常猴的MRI扫描结果，右边为帕金森猴的扫描结果。A为黑质区，可以看出在黑质区有明显的铁沉积，呈黑色棒状。
4、对注射MPTP 3个月的猕猴用SPECT检测脑内变化，用锝的同位素(99Tc)标记脑内DA转运体，观察在SPECT成像上显示的颜色。结果见图3，左边为正常猴SPECT扫描结果，右边为帕金森猴的扫描结果。右边猴纹状体的颜色比正常猴明显变浅，说明帕金森猴的纹状体已经出现明显的损伤。SPECT的数据见下表：
左侧纹状体 (放射性计 数) 右侧纹状体 (放射性计 数) 小脑纹状体 (放射性计 数) 比值 左/小右/ 小 正常 Total：4805 Max：55 Avg：44.51 Total：4847 Max：51 Avg：43.28 Total：3800 Max：40 Avg：35.51 1.251.22 PD Total：6521 Max：106 Avg：97.3 Total：6516 Max：106 Avg：98.7 Total：6536 Max：111 Avg：102.1 0.950.97
说明：根据上表中“比值”这一栏可知，PD猴比正常时脑内放射程度降低显著，说明PD猴脑内DA缺损显著。
步骤1注射MPTP3个月的猕猴，按表1行为评分的总分值为15，录象观察行为上出现了震颤，并且在MRI成像上观察到脑内黑质区有黑色沉积，同时在SPECT成像上显示纹状体颜色变浅，因此该猕猴就是成功建立的模型。
实施例2：猕猴为雄性，8岁。MPTP购买自美国Sigma公司。
1、开始每隔2天给该猕猴肌肉注射MPTP 1次，每次0.2mg/kg。3个月后出现很轻微的症状。增加剂量至每次0.4mg/kg，第六个月出现明显的帕金森病症状。
2、在注射MPTP的期间，对猕猴每隔一天通过录象做一次行为观察，采集猕猴全天的行为数据。录象装置安装在猴房内，排除人的干扰。根据表1做行为评分，结果见图4。
3、对注射MPTP 6个月的猕猴用MRI检测脑内的结构变化，观察脑内黑质区的改变，结果是在黑质区有明显的黑色沉积。
4、对注射MPTP 6个月的猕猴用SPECT检测脑内变化，用锝的同位素(99Tc)标记脑内DA转运体，观察在SPECT成像上显示的颜色。结果是纹状体的颜色比正常猴明显变浅，说明帕金森猴的纹状体已经出现明显的损伤。
步骤1注射MPTP 6个月的猕猴，表1行为评分的总分值为11，录象观察行为上出现了震颤，并且在MRI成像上观察到脑内黑质区有黑色沉积，同时在SPECT成像上显示纹状体颜色变浅，因此该猕猴就是成功建立的模型。
实施例3：猕猴为雄性，7岁。MPTP购买自美国Sigma公司。
1、每隔 2天给该猕猴肌肉注射MPTP 1次，每次0.25mg/kg。第3个月出现明显的帕金森病症状。
2、在注射MPTP的期间，对猕猴每隔一天通过录象做一次行为观察，采集猕猴全天的行为数据。
3、对注射MPTP 3个月的猕猴用MRI检测脑内的结构变化，观察脑内黑质区的改变，结果是在黑质区有明显的黑色沉积。
4、对注射MPTP 3个月的猕猴用SPECT检测脑内变化，用锝的同位素(99Tc)标记脑内DA转运体，观察在SPECT成像上显示的颜色。结果是纹状体的颜色比正常猴明显变浅，说明帕金森猴的纹状体已经出现明显的损伤。
步骤1注射MPTP 3个月的猕猴，表1行为评分的总分值为12，录象观察行为上出现了震颤，并且在MRI成像上观察到脑内黑质区有黑色沉积，同时在SPECT成像上显示纹状体颜色变浅，因此该猕猴就是成功建立的模型。
实施例4：猕猴为雄性，9岁。MPTP购买自美国Si gma公司。
1、每隔2天给该猕猴肌肉注射MPTP 1次，每次0.25mg/kg。第4个月出现明显的帕金森病症状。
2、在注射MPTP的期间，对猕猴每隔一天通过录象做一次行为观察，采集猕猴全天的行为数据。
3、对注射MPTP 4个月的猕猴用MRI检测脑内的结构变化，观察脑内黑质区的改变，结果是在黑质区有明显的黑色沉积。
4、对注射MPTP 4个月的猕猴用SPECT检测脑内变化，用锝的同位素(99Tc)标记脑内DA转运体，观察在SPECT成像上显示的颜色。结果是纹状体的颜色比正常猴明显变浅，说明帕金森猴的纹状体已经出现明显的损伤。
步骤1注射MPTP 4个月的猕猴，表1行为评分的总分值为12，录象观察行为上出现了震颤，并且在MRI成像上观察到脑内黑质区有黑色沉积，同时在SPECT成像上显示纹状体颜色变浅，因此该猕猴就是成功建立的模型。
实施例5：猕猴为雄性，9岁。MPTP购买自美国Sigma公司。
1、每隔2天给该猕猴肌肉注射MPTP 1次，每次0.25mg/kg。第4个月出现明显的帕金森病症状。
2、在注射MPTP的期间，对猕猴每隔一天通过录象做一次行为观察，采集猕猴全天的行为数据。
3、对注射MPTP 4个月的猕猴用MRI检测脑内的结构变化，观察脑内黑质区的改变，结果是在黑质区有明显的黑色沉积。
4、对注射MPTP 4个月的猕猴用SPECT检测脑内变化，用锝的同位素(99Tc)标记脑内DA转运体，观察在SPECT成像上显示的颜色。结果是纹状体的颜色比正常猴明显变浅，说明帕金森猴的纹状体已经出现明显的损伤。
步骤1注射MPTP 4个月的猕猴，表1行为评分的总分值为10，录象观察行为上出现了震颤，并且在MRI成像上观察到脑内黑质区有黑色沉积，同时在SPECT成像上显示纹状体颜色变浅，因此该猕猴就是成功建立的模型。
实施例6：猕猴为雄性，7岁。MPTP购买自美国Sigma公司。
1、每隔2天给该猕猴肌肉注射MPTP 1次，每次0.25mg/kg。第4个月出现明显的帕金森病症状。
2、在注射MPTP的期间，对猕猴每隔一天通过录象做一次行为观察，采集猕猴全天的行为数据。
3、对注射MPTP 4个月的猕猴用MRI检测脑内的结构变化，观察脑内黑质区的改变，结果是在黑质区有明显的黑色沉积。
4、对注射MPTP 4个月的猕猴用SPECT检测脑内变化，用锝的同位素(99Tc)标记脑内DA转运体，观察在SPECT成像上显示的颜色。结果是纹状体的颜色比正常猴明显变浅，说明帕金森猴的纹状体已经出现明显的损伤。
步骤1注射MPTP 4个月的猕猴，表1行为评分的总分值为9，录象观察行为上出现了震颤，并且在MRI成像上观察到脑内黑质区有黑色沉积，同时在SPECT成像上显示纹状体颜色变浅，因此该猕猴就是成功建立的模型。