在哺乳动物个体中改善免疫功能的方法以及预防或治疗疾病的方法
相关申请的交叉参考
[0001]本申请要求2006年2月16日申请的美国临时申请号60/773,924的权益，该临时申请整体在此引入作为参考。
政府支持的声明
[0002]本发明以国立卫生研究院资助号AI24187、AI46710、CA38355、AI45809、AI007244、AG001743和AG20189得到政府支持。政府拥有本发明的某些权益。
发明领域
[0003]本发明涉及通过给予其需要的哺乳动物受试者能够结合细胞因子的抗体或与抗体复合的细胞因子或与细胞因子受体复合的细胞因子增加细胞因子或淋巴因子的生物活性的方法。本发明还涉及通过给予其需要的哺乳动物受试者与抗体复合的细胞因子或与细胞因子受体复合的细胞因子治疗肿瘤疾病、自身免疫病或感染性疾病或者扩增造血细胞群的方法。
发明背景
[0004]与某些细胞因子(特别是IL-2、IL-7和IL-15)接触保持了幼稚(![]()
)和记忆T细胞的存活。Smith，Science 240：1169，1988；Waldmann，Annu Rev Biochem 58：875，1989；Ku等，Science 288：675，2000；Sprent等，Annu Rev Immunol 20：551，2002；Schluns等，Nat RevImmunol 3：269，2003。对IL-2和IL-15的反应很大程度上受控于由β-链(CD122)和通用γ-链(γc)组成的共有二聚受体。Waldmann，Annu RevBiochem 58：875，1989；Takeshita等，Science 257：379，1992；Nakamura等，Nature 369：330，1994。CD122表达在针对限定抗原初免的“记忆”CD8+细胞上以及在具有类似表型的天然CD8+细胞群上尤其高。这些CD122高(hi)记忆表型(MP)CD8+细胞在体外在IL-2或IL-15作用下增殖，IL-15还在体内控制它们的存活和间断性增殖(更新)。Smith，Science 240：1169，1988；Zhang等，Immunity 8：591，1998；Sprent等，Annu Rev Immunol 20：551，2002。对IL-7的响应性受控于由α链(CD127)和γc链组成的二聚化受体；IL-7受体在幼稚和记忆T细胞上均高度表达。Goodwin等，Cell 60：941，1990；Sudo等，Proc.Natl.Acad Sci.90：9125，1993；Tan等，J.Exp.Med.195：1523，2002。
[0005]IL-2对CD4+T调节细胞的体内存活也是至关重要的。Malek等，Nat Rev Immunol 4：665，2004；Fontenot等，Nat Immunol 6：331，2005。随后发现这些细胞的特征在于IL-2Rα(CD25)的强组成型表达，IL-2Rα使这些细胞表达高亲和性三聚化αβγc受体(IL-2Rαβγc)，由此利用低水平IL-2。CD4+T调节细胞在注射抗IL-2单克隆抗体(IL-2mAb)后消失，反映出它们对IL-2的依赖性。Murakami等，Proc NatlAcad Sci USA 99：8832，2002；Setoguchi等，J Exp Med 201：723，2005。
[0006]IL-15一般作为结合IL-15Rα的细胞缔合性细胞因子于体内被提呈。IL-15Rα在提呈内源性IL-15方面起强制性作用。因此，和IL-15-/-小鼠一样(Kennedy等，J Exp Med 191：771-80，2000)，IL-15Rα-/-小鼠没有CD122hi CD8+细胞和NK细胞(Lodolce等，Immunity 9：669-76，1998)，推测是因为在IL-15R-/-小鼠中合成的IL-15不能离开胞质。尽管如此，IL-2Rβγc+细胞可在没有IL-15Rα的情况下响应于可溶性重组形式的IL-15而增殖(Lodolce等，J Exp Med 194：1187-94，2001)。而且，在某些条件下，IL-15Rα可为抑制性的。因此，据报道，用可溶性重组形式的IL-15α注射小鼠抑制NK细胞增殖(Nguyen等，J Immunol 169：4279-87，2002)和在体内的某些T-依赖性免疫应答(Ruckert等，Eur JImmunol 33：3493-3503，2003；Ruckert等，J Immunol 174：5507-15，2005；Wei等，J Immunol 167：577-82，2001；Ruchatz等，J Immunol 160：5654-5660，1998)，而在体外加入sIL-15Rα可阻止细胞系对IL-15的响应(Ruckert等，Eur J Immunol 33：3493-3503，2003；Ruckert等，JImmunol 174：5507-15，2005；Wei等，J Immunol 167：577-82，2001；Ruchatz等，J Immunol 160：5654-5660，1998；Budagian等，J Biol Chem279：40368-75，2004；Mortier等，J Immunol 173：1681-1688，2004；Eisenman等，Cytokine 20：121-29，2002)。尽管有这些发现，但也有其它报告称sIL-15Rα(Giron-Michel等，Blood 106：2302-10，2005)还有IL-15Rα的可溶性sushi结构域(Mortier等，J Biol Chem，2005，纸质版前的电子版)可增强人细胞系的IL-15响应。本领域需要通过给予哺乳动物受试者细胞因子改善哺乳动物受试者中的免疫功能的疗法，以及治疗诸如自身免疫病、肿瘤疾病或感染性疾病等疾病的改善方法。
发明概述
[0007]一般地讲，本发明涉及通过给予其需要的哺乳动物受试者含有能够结合细胞因子的抗体的组合物或含有细胞因子和细胞因子受体的组合物治疗疾病的方法。本发明还涉及通过在给药前使抗体与细胞因子复合并将细胞因子抗体复合物给予哺乳动物受试者而治疗疾病的方法。本发明还涉及如下治疗疾病的方法：在给药前使细胞因子与细胞因子受体复合，并将细胞因子/细胞因子受体复合物给予哺乳动物受试者。如下提供在哺乳动物受试者中改善免疫功能的方法：给予含有能够结合细胞因子的抗体或与抗体复合的细胞因子的组合物，由此增加细胞因子在哺乳动物受试者中的生物活性。如下提供在哺乳动物受试者中改善免疫功能的方法：给予含有与细胞因子受体复合的细胞因子的组合物，由此增加细胞因子在哺乳动物受试者中的生物活性。所述病症包括但不限于肿瘤疾病、自身免疫病、感染性疾病或由放疗或细胞毒性药物治疗或原发性或继发性免疫缺陷或衰老引起的造血细胞减少。细胞因子抗体复合物可为细胞因子和结合细胞因子的抗体，例如单克隆抗体。细胞因子/细胞因子受体复合物可为例如白介素15/白介素15受体α复合物。通过给予与抗体复合的细胞因子或细胞因子/细胞因子受体复合物增加细胞因子的生物活性的方法可出现以下结果：扩增造血细胞或T细胞亚群，例如扩增CD8+T细胞和CD4+T调节细胞，或扩增CD8+T细胞，或在阻止CD8+T细胞扩增的同时扩增CD4+T调节细胞，或扩增幼稚T细胞(![]()
T cells)(CD4+T细胞和CD8+T细胞这二者)或记忆T细胞或其组合。
[0008]提供在哺乳动物受试者中改善免疫功能的方法，该方法包括给予哺乳动物受试者能够结合细胞因子的抗体，由此增加细胞因子在哺乳动物受试者中的生物活性。提供用于哺乳动物受试者中改善免疫功能的方法，该方法包括给予哺乳动物受试者结合细胞因子受体的细胞因子，由此增加细胞因子在哺乳动物受试者中的生物活性。用于改善免疫功能的方法可由在哺乳动物受试者中增加细胞因子向靶细胞的提呈而产生。该方法还包括在所述给药前使抗体与细胞因子复合，并将细胞因子抗体复合物给予哺乳动物受试者。一方面，含有Fc部分的单克隆抗体结合细胞因子。所述细胞因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、I型干扰素、II型干扰素、IFN-α、IFN-β或IFN-γ。细胞因子受体可为细胞因子的天然受体，例如能够结合白介素15的白介素15受体α。
[0009]设想了所述方法的许多变体。例如，在一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增造血细胞群。在又一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增T细胞群、B细胞群或NK细胞群或其组合。在又一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增CD8+T细胞和CD4+T调节细胞。另一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD8+T细胞。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD4+T细胞。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD4+T调节细胞，并阻止CD8+T细胞的扩增。另一方面，增加细胞因子的生物活性扩增幼稚T细胞或记忆T细胞或其组合。在所述方法的变体中，增加I型干扰素或II型干扰素对非造血细胞的生物活性改善哺乳动物受试者中的免疫功能。另一方面，增加细胞因子的生物活性离体扩增细胞群。又一方面，增加细胞因子的生物活性在体内扩增细胞群。
[0010]提供一种改善哺乳动物受试者中的免疫功能的方法，其包括给予哺乳动物受试者能够结合细胞因子的抗体，由此增加细胞因子在哺乳动物受试者中的生物活性。一方面，细胞因子可为白介素2。又一方面，细胞因子可为白介素7。改善免疫功能的方法可起因于哺乳动物受试者中细胞因子向靶细胞的提呈增加。该方法还包括在给药前使抗体与细胞因子复合，并将细胞因子抗体复合物给予哺乳动物受试者。该方法还包括在给药前使细胞因子与其细胞因子受体复合，并将细胞因子/细胞因子受体复合物给予哺乳动物受试者。一方面，含有Fc部分的单克隆抗体或细胞因子受体结合细胞因子。又一方面，哺乳动物受试者由于哺乳动物受试者老龄化而具有弱化的免疫系统。在该方法的一个方面，增加细胞因子向靶细胞的提呈以改善免疫功能扩增幼稚T细胞或记忆T细胞或其组合。该方法可提供以下疗效：在哺乳动物受试者中降低或消除肿瘤疾病、自身免疫病或感染性疾病，或防止其发生或复发。该方法可提供以下疗效：扩增造血细胞群，或改善由放疗或细胞毒性药物治疗或哺乳动物受试者中的原发性或继发性免疫缺陷或衰老引起的细胞减少的造血细胞恢复。
[0011]提供一种在哺乳动物受试者中预防或治疗自身免疫病的方法，其包括以有效减轻或消除自身免疫病或防止其发生或复发的量给予哺乳动物受试者能够结合细胞因子的抗体。该方法还包括在所述给药前使抗体与细胞因子复合，并将细胞因子抗体复合物给予哺乳动物受试者。该方法还包括在给药前使细胞因子与其细胞因子受体复合，并将细胞因子/细胞因子受体复合物给予哺乳动物受试者。一方面，含有Fc部分的单克隆抗体结合细胞因子。所述细胞因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、I型干扰素、II型干扰素、IFN-α、IFN-β或IFN-γ。自身免疫病包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、炎性肠病、银屑病、系统性红斑狼疮、变应性疾病或哮喘。
[0012]设想了该方法的许多变体。又一方面，该方法包括增加细胞因子的生物活性。例如，在一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增造血细胞群。在又一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增T细胞群、B细胞群或NK细胞群或其组合。在又一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增CD8+T细胞和CD4+T调节细胞。另一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD8+T细胞。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD4+T细胞。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD4+T调节细胞，并阻止CD8+T细胞的扩增。另一方面，增加细胞因子的生物活性扩增幼稚T细胞或记忆T细胞或其组合。在该方法的变体中，增加I型干扰素或II型干扰素对非造血细胞的生物活性改善哺乳动物受试者中的免疫功能。另一方面，增加细胞因子的生物活性离体扩增细胞群。又一方面，增加细胞因子的生物活性在体内扩增细胞群。
[0013]提供一种在哺乳动物受试者中预防或治疗肿瘤疾病的方法，其包括以有效减轻或消除肿瘤疾病或防止其发生或复发的量给予哺乳动物受试者能够结合细胞因子的抗体。所述肿瘤疾病包括但不限于癌症、实体瘤、肉瘤、黑素瘤、癌、白血病或淋巴瘤。该方法还包括在所述给药前使抗体与细胞因子复合，然后将细胞因子抗体复合物给予哺乳动物受试者。该方法还包括在给药前使细胞因子与其细胞因子受体复合，并将细胞因子/细胞因子受体复合物给予哺乳动物受试者。一方面，含有Fc部分的单克隆抗体或含有Fc部分的细胞因子受体结合细胞因子。所述细胞因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、I型干扰素、II型干扰素、IFN-α、IFN-β或IFN-γ。
[0014]该方法还供增加细胞因子的生物活性。设想了该方法的许多变体。例如，在一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增造血细胞群。在又一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增T细胞群、B细胞群或NK细胞群或其组合。在又一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增CD8+T细胞和CD4+T调节细胞。另一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD8+T细胞。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD4+T细胞。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD4+T调节细胞，并阻止CD8+T细胞的扩增。另一方面，增加细胞因子的生物活性扩增幼稚T细胞或记忆T细胞或其组合。在该方法的变体中，增加I型干扰素或II型干扰素对非造血细胞的生物活性改善哺乳动物受试者中的免疫功能。另一方面，增加细胞因子的生物活性离体扩增细胞群。又一方面，增加细胞因子的生物活性在体内扩增细胞群。
[0015]提供一种用于在哺乳动物受试者中改善免疫功能的方法，其包括给予哺乳动物受试者白介素15和白介素15受体α，由此增加白介素15在哺乳动物受试者中的生物活性。该方法还可以包括增加白介素15向靶细胞的提呈，以改善哺乳动物受试者中的免疫功能。该方法还可以包括在所述给药前使白介素15与白介素15受体α复合，并将白介素15/白介素15受体α复合物给予哺乳动物受试者。在该方法的一方面，增加白介素15向靶细胞的提呈以改善免疫功能扩增幼稚T细胞或记忆T细胞或其组合。增加的生物活性可具有以下疗效：减轻或消除哺乳动物受试者中的肿瘤疾病或感染性疾病，或防止其发生或复发。增加的生物活性可具有以下疗效：扩增造血细胞群，或改善由放疗或细胞毒性药物治疗或哺乳动物受试者中的原发性或继发性免疫缺陷或哺乳动物受试者的衰老引起的细胞减少的造血细胞恢复。又一方面，哺乳动物受试者由于哺乳动物受试者的老龄化而具有弱化的免疫系统。
[0016]提供一种在哺乳动物受试者中扩增造血细胞群的方法，其包括给予哺乳动物受试者能够结合细胞因子的抗体，由此在哺乳动物受试者中提供扩增造血细胞群的疗效。该方法还包括在所述给药前使抗体与细胞因子复合，并将细胞因子抗体复合物给予哺乳动物受试者。该方法还包括在给药前使细胞因子与其细胞因子受体复合，并将细胞因子/细胞因子受体复合物给予哺乳动物受试者。一方面，含有Fc部分的单克隆抗体或含有Fc部分的细胞因子受体结合细胞因子。所述细胞因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、I型干扰素、II型干扰素、IFN-α、IFN-β或IFN-γ。
[0017]该方法还供增加细胞因子的生物活性。设想了该方法的许多变体。例如，在一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增造血细胞群。在又一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增T细胞群、B细胞群或NK细胞群或其组合。在又一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增CD8+T细胞和CD4+T调节细胞。另一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD8+T细胞。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD4+T细胞。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD4+T调节细胞，并阻止CD8+T细胞的扩增。另一方面，增加细胞因子的生物活性扩增幼稚T细胞或记忆T细胞或其组合。又一方面，增加细胞因子的生物活性可以扩增NK细胞群，或者可以扩增B细胞群。又一方面，细胞因子抗体复合物的疗效可以改善由放疗或细胞毒性药物治疗或哺乳动物受试者中的原发性或继发性免疫缺陷产生的造血细胞减少的造血细胞恢复。另一方面，增加细胞因子的生物活性离体扩增细胞群。又一方面，增加细胞因子的生物活性在体内扩增细胞群。
[0018]提供一种用于在哺乳动物受试者中预防或治疗感染性疾病的方法，其包括以有效减轻或消除感染性疾病或防止其发生或复发的量给予哺乳动物受试者能够结合细胞因子的抗体。该方法还包括在所述给药前使抗体与细胞因子复合，并将细胞因子抗体复合物给予哺乳动物受试者。该方法还包括在给药前使细胞因子与其细胞因子受体复合，并将细胞因子/细胞因子受体复合物给予哺乳动物受试者。又一方面，将抗体或与抗体复合的细胞因子或与其受体复合的细胞因子与疫苗一起给予，以增加免疫应答或增强疫苗效力。一方面，含有Fc部分的单克隆抗体结合细胞因子。所述细胞因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、I型干扰素、II型干扰素、IFN-α、IFN-β或IFN-γ。
[0019]该方法还提供增加细胞因子的生物活性。设想了该方法的许多变体。例如，在一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增造血细胞群。在又一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增T细胞群、B细胞群或NK细胞群或其组合。在又一个变体中，增加细胞因子的生物活性扩增CD8+T细胞和CD4+T调节细胞。另一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD8+T细胞。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD4+T细胞。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增CD4+T调节细胞，并阻止CD8+T细胞的扩增。另一方面，增加细胞因子的生物活性扩增幼稚T细胞或记忆T细胞或其组合。在该方法的变体中，增加I型干扰素或II型干扰素对非造血细胞的生物活性改善哺乳动物受试者中的免疫功能。又一方面，增加细胞因子的生物活性扩增天然杀伤细胞群或扩增B细胞群。
附图简述
[0020]图1A和1B显示了IL-2或IL-2单克隆抗体在体内对记忆表型(MP)CD8+细胞的刺激。
[0021]图2显示了MP CD8+细胞在体内在IL-2或IL-2单克隆抗体作用下的增殖。
[0022]图3A、3B和3C显示了MP和抗原(Ag)特异性记忆CD8+T细胞借助于IL-2和IL-2单克隆抗体的组合在体内的显著选择性扩增。
[0023]图4A和4B表明，针对IL-2/IL-2单克隆抗体复合物的CD8+T细胞增殖主要局限于CD122hiMP细胞，并为IL-15非依赖性的。
[0024]图5A和5B表明，在体内针对IL-2/IL-2单克隆抗体复合物的MP CD8+细胞增殖不需要CD25。
[0025]图6A、6B、6C、6D和6E显示了利用不同的IL-2/IL-2单克隆抗体复合物进行的T细胞亚组的选择性刺激。
[0026]图7A、7B、7C和7D显示了在体内用IL-2/IL-2单克隆抗体复合物刺激MP CD8+细胞的要求。
[0027]图8A、8B、8C和8D显示了用细胞因子/单克隆抗体复合物进行的T细胞刺激的特征。
[0028]图9A和9B表明，JES6-5和S4B6 IL-2单克隆抗体结合IL-2上的相似位点，这些位点与JES6-1的结合位点截然不同。
[0029]图10A和10B显示了IL-2/IL-2单克隆抗体复合物在体外的作用。
[0030]图11A和11B表明，注射S4B6和JES6-1IL-2单克隆抗体的混合物阻止MP CD8+细胞和CD4+CD25+细胞这二者的增殖。
[0031]图12A和12B表明，IL-2单克隆抗体的F(ab′)2片段不如完整IL-2单克隆抗体有效。
[0032]图13表明，在MP CD8+细胞诱导增殖方面IL-2/IL-2单克隆抗体复合物明显比IL-2-抗体融合蛋白更有效。
[0033]图14A和14B表明，IL-7/IL-7单克隆抗体复合物可以在胸腺中有效诱导T细胞发展。
[0034]图15A、15B和15C表明，IL-7/IL-7单克隆抗体复合物可有效诱导幼稚T细胞的稳态扩增。
[0035]图16表明，IL-7/IL-7单克隆抗体复合物可驱动幼稚和记忆T细胞这二者的扩增。
[0036]图17表明，IL-7/IL-7单克隆抗体复合物的增殖活性需要抗IL-7单克隆抗体的Fc部分。
[0037]图18A和18B表明，衰老与支持幼稚T细胞稳态增殖能力的严重衰减有关，该能力可使用IL-7/IL-7单克隆抗体复合物得到恢复。
[0038]图19A、19B、19C、19D和19E表明，可溶性IL-15Rα在体外增强IL-15介导的淋巴细胞增殖。
[0039]图20A、20B、20C和20D表明，可溶性IL-15Rα在体内增强IL-15介导的供体淋巴细胞增殖。
[0040]图21A、21B、21C和21D表明，可溶性IL-15Rα增强IL-15介导的宿主淋巴细胞增殖。
[0041]图22表明，对于在体内条件下增强IL-15，IL-15Rα-Fc比IL-15Rα更好。
[0042]图23A和23B表明，针对由IL-15Rα固定化的IL-15的增殖不能被可溶性IL-15Rα-Fc阻断。
[0043]图24A和24B表明，可溶性IL-2Rα抑制IL-2介导的增殖。
[0044]图25A和25B显示了IL-15在体外的存活。
[0045]图26表明，人sIL-15Rα-Fc增强小鼠MP CD8+细胞对小鼠和人IL-15这二者的反应。
[0046]图27显示了利用IL-15/sIL-15-Rα-Fc复合物在IL-15Rα-/-宿主中进行的刺激。
[0047]图28A、28B和28C显示了sIL-15Rα-Fc对于针对小鼠和人IL-15的反应的阻止作用。
发明详述
[0048]一般地讲，本发明涉及通过给予其需要的哺乳动物受试者含有能够结合细胞因子的抗体的组合物或含有细胞因子和细胞因子受体的组合物治疗疾病的方法。本发明还涉及如下治疗疾病的方法：在给药前使抗体与细胞因子复合，并将细胞因子抗体复合物给予哺乳动物受试者。本发明还涉及如下治疗疾病的方法：在给药前使细胞因子与细胞因子受体复合，并将细胞因子/细胞因子受体复合物给予哺乳动物受试者。提供一种如下在哺乳动物受试者中改善免疫功能的方法：给予能够结合细胞因子的抗体或与抗体复合的细胞因子，由此增加细胞因子在哺乳动物受试者中的生物活性。提供一种如下在哺乳动物受试者中改善免疫功能的方法：给予含有与细胞因子受体复合的细胞因子的组合物，由此增加细胞因子在哺乳动物受试者中的生物活性。提供一种治疗疾病的方法，所述疾病包括但不限于肿瘤疾病、自身免疫病、感染性疾病或由放疗或细胞毒性药物治疗或原发性或继发性免疫缺陷或衰老引起的淋巴细胞减少。细胞因子抗体复合物可为细胞因子和结合细胞因子的抗体，例如单克隆抗体。细胞因子/细胞因子受体复合物可为例如白介素15/白介素15受体α复合物。
[0049]一方面，通过增加细胞因子的生物活性在哺乳动物受试者中改善免疫功能的方法扩增哺乳动物受试者中的造血细胞群，例如T细胞群、B细胞群或NK细胞群或其组合。提供一种如下治疗病症的方法：给予其需要的哺乳动物受试者能够结合白介素2的抗体或与抗体复合的白介素2。该抗体可为单克隆抗体。白介素2的生物活性的增加可用于治疗如本文所述的疾病。增加的白介素2活性可以扩增T细胞群、B细胞群或NK细胞群，或者更具体地说，扩增CD8+T细胞群，或扩增CD8+T细胞群和CD4+T调节细胞群，或扩增CD4+T调节细胞群，并阻止CD8+T细胞的扩增。造血细胞扩增可在哺乳动物受试者的体内或离体进行。
[0050]提供一种如下治疗疾病的方法：给予其需要的哺乳动物受试者能够结合细胞因子的抗体或与抗体复合的细胞因子。该抗体可为单克隆抗体。细胞因子的生物活性的增加可用于治疗如本文所述的疾病。增加的细胞因子活性可扩增T细胞群、B细胞群或NK细胞群，或者更具体地说，细胞因子的生物活性可扩增幼稚T细胞(幼稚CD4T细胞和CD8T细胞这二者)或记忆T细胞(幼稚CD4T细胞和CD8T细胞这二者)或其组合。
[0051]用于T淋巴细胞的生长因子白介素2(IL-2)有时也可以是抑制性的。本发明为以下事实提供了一种解释：在注射IL-2特异性单克隆抗体(IL-2mAb)后体内的CD8+T细胞增殖增加。本发明证实，IL-2mAb通过形成免疫复合物增加既有IL-2的生物活性，从而增强CD8+细胞的增殖。当与重组IL-2组合时，某些IL-2/IL-2mAb复合物使CD8+细胞在体内大规模(＞100倍)扩增，而另一些选择性刺激CD4+T调节细胞。因此，不同的细胞因子/抗体复合物可用于选择性加强或抑制免疫应答，并可用于疾病治疗。
[0052]本文使用的术语“约”在指示可检测值如量、时间长度等时，意指包括指定值的±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％、再更优选±0.1％的变量，这些变量也适于实施所公开的方法。
[0053]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常所理解的含义。尽管可使用类似或等同于本文所述的任何方法和材料实施本发明的检验，但本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下的术语。
[0054]“有效减轻或消除疾病或防止其发生或复发的量”是指在治疗病症后改善患者的结果或存活的治疗化合物的量，所述病症例如为肿瘤疾病、自身免疫病、细胞减少性放疗或化疗或感染性疾病，所述量以患者检验数据、存活数据、肿瘤标记水平的提升或抑制、基于遗传谱的下降的易感性或与环境因素的接触来检测。
[0055]“淋巴细胞”是指在循环中的细胞群，包括但不限于T细胞、B细胞或天然杀伤(NK)细胞。
[0056]“T细胞增殖”是指T细胞的一个或多个亚群响应由细胞因子或淋巴因子提供的细胞信号的生长和扩增。T细胞增殖可在体内或离体发生。T细胞亚群包括但不限于CD8+T细胞、CD4T调节细胞(T调节细胞)或天然杀伤(NK)细胞。
[0057]“细胞因子抗体复合物”或“细胞因子/细胞因子受体复合物”是指通过如在抗体-抗原或配体-受体结合相互作用中的静电相互作用结合抗体或其细胞因子受体的细胞因子或淋巴因子。抗体分子可以为IgG分子或其片段。抗体片段可以包括抗体分子的至少Fc部分。
[0058]“细胞因子”是指控制免疫系统细胞中的许多关键性相互作用的可溶性介导物。细胞因子包括多组胞内信号转导肽和糖蛋白。大部分在遗传上和结构上彼此类似。每种细胞因子都由特定细胞类型在多种刺激物影响下而分泌，并对靶细胞的生长、活动、分化和/或功能产生特征性作用。总而言之，细胞因子不仅调节免疫和炎性系统，而且涉及伤口愈合、造血作用、血管生成和许多其它过程。该术语包括所有的各种细胞因子，与其结构和通用命名无关。例如，该术语包括“淋巴因子”(即由淋巴细胞产生的细胞因子)以及“单核因子”(即由单核细胞产生的细胞因子)。细胞因子是指对细胞发挥多种作用(例如诱导生长或增殖)的众多因子中的任一种。可单独或组合用于实施本发明的细胞因子的非限制性实例包括白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素21(IL-21)、I型干扰素、干扰素-α、干扰素-β、II型干扰素、干扰素-γ、干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素1α(IL-1α)、白介素11(IL-11)、MIP-1a、白血病抑制因子(LIF)、c-kit配体、血小板生成素(TPO)和flt3配体。本发明还包括药物组合物，其中一种或多种细胞因子或一种或多种抗体能够结合细胞因子或其组合。细胞因子可由几个供应商商购，例如Genzyme(Framingham，Mass.)、Genentech(South San Francisco，Calif.)、Amgen(Thousand Oaks，Calif.)或R&D Systems(Minneapolis，Minn.)。尽管不总是明确说明，但拟在本发明的精神和范围内使用与野生型或纯化的细胞因子(例如重组生产的或其突变蛋白)具有类似生物活性的分子。
[0059]“细胞因子受体”是指识别并结合细胞因子的受体分子。该术语意在包括可溶性细胞因子受体以及结合细胞的细胞因子受体。在某些实施方案中，该术语是指白介素15受体α，其结合白介素15。该术语还意在包括修饰的细胞因子受体分子(即“变体细胞因子受体”)，包括具有细胞因子受体氨基酸和/或核酸序列的置换、缺失和/或添加的那些分子。因此，该术语意在包括野生型以及重组的、合成产生的和变体细胞因子受体。“细胞因子受体”是指本领域中结合一种或多种细胞因子的所有人细胞因子受体，其如下文定义，包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-1、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、I型干扰素、II型干扰素、IFN-α、IFN-β或IFN-γ的受体。
[0060]“改善哺乳动物受试者中的免疫功能”是指采用本发明组合物的治疗成功减轻和消除哺乳动物受试者中的疾病或防止其发生或复发的能力。疾病包括但不限于肿瘤疾病、自身免疫病或感染性疾病，或者其中改善的免疫功能提供以下疗效：扩增造血细胞群，或由放疗或细胞毒性药物治疗或哺乳动物受试者中的原发性或继发性免疫缺陷或衰老引起的细胞减少改善造血细胞恢复。例如，用于治疗或预防肿瘤疾病的组合物和制剂包括细胞因子抗体或细胞因子抗体复合物或细胞因子/细胞因子受体复合物，其可用于干涉肿瘤诱导；保持或改善免疫功能，例如一般地或在化疗过程中增加造血细胞群；以及例如增强肿瘤浸润淋巴细胞的活性；和/或在癌症患者中减轻化疗诱导的NK-细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞的细胞毒性的抑制以及淋巴细胞致有丝分裂反应性。
[0061]关于本发明的细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物的“增加生物活性”和“生物活性的”是指在造血细胞群(例如T细胞群)中特异性结合并发信号的细胞因子或淋巴因子分子扩增T细胞亚群的能力。“增加生物活性”还可以指在非造血细胞群(如上皮细胞或肝细胞)中特异性结合和发信号的细胞因子分子，例如I型干扰素或II型干扰素。通过本发明的细胞因子抗体复合物或细胞因子/细胞因子受体复合物增加细胞因子的生物活性包括扩增T细胞群的能力，包括但不限于扩增CD8+T细胞和CD4+T调节细胞，扩增CD8+T细胞，或扩增CD4+T调节细胞并阻止CD8+T细胞的扩增，或扩增CD4+和CD8+细胞，或扩增幼稚T细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞这二者)或记忆T细胞或其组合。因此，给予本发明的化合物或药剂可在哺乳动物受试者中防止或延迟、减轻或阻滞或抑制与肿瘤疾病、自身免疫病、细胞耗竭性放疗或化疗或感染性疾病相关的症状或病症的发展。
[0062]干扰素分子被分类为异质细胞因子家族，该家族最初基于其诱导针对病毒感染的细胞抗性的能力而被鉴别(Diaz等，J.Interferon.Cytokine Res.，16：179-180，1996)。例如，“I型干扰素”干扰素α/β包括干扰素α家族的许多成员(干扰素α1、α2、ω和τ)以及干扰素β。就其调节其生产的具体机制而言，“II型干扰素”(例如干扰素γ)与I型不同。而干扰素α/β的生产在病毒感染时在许多细胞类型中被最有效地诱导，干扰素-γ主要在造血系统的细胞如T-细胞或天然杀伤细胞中在分别被抗原或细胞因子刺激时生产。这两个干扰素系统在功能上对疾病治疗和抗病毒防御宿主不是多余的。
[0063]IL-15的受体由3条链组成：α、β和γc，α链是IL-15独有的，而β(CD122)和γc(CD132)链与IL-2的受体共有(Kovanen和Leonard.，Immunol Rev 202：67-83，2004)。CD122以最高水平在正常小鼠中的大部分(约70％)MP CD8细胞上表达，以低但显著的水平在幼稚CD8和MP CD4细胞上表达；实际上没有CD122在幼稚CD4细胞上表达(Zhang等，Immunity 8(5)：591-99，1998)。为了反映CD122的表达模式，IL-15被证实是CD122hi MP CD8细胞的更新和存活所必需的。因此，IL-15-小鼠的产生揭示，这些小鼠没有CD122hi MP CD8细胞(Kennedy等，JExp Med 191(5)：771-780，2000)。没有CD122hi MP CD8细胞似乎反映出没有细胞存活，而不是发育缺陷，因为过继转移到IL-15-小鼠中的CD122hi MP CD8细胞不能增殖和快速消失(Judge等，J Exp Med 196(7)：935-46，2002)。应当指出的是，还发现为CD122hi的NK细胞强烈依靠IL-15存活。因此，和CD122hi MP CD8细胞一样，NK细胞在IL-15-小鼠中显著减少(Kennedy等，J.Exp.Med.191：771-780，2000)。IL-15-小鼠还显示出50％的幼稚CD8细胞数减少，表明IL-15对维持幼稚CD8细胞存活起显著作用(Kennedy等，J Exp Med191(5)：771-780，2000；Berard等，J Immunol 170(10)：5018-26，2003)。和CD8细胞不同，幼稚和MP CD4细胞的稳态在IL-15-小鼠中不受显著影响(Kennedy等，J Exp Med 191(5)：771-780，2000)。
[0064]以下发现也指示出IL-15对记忆CD8细胞的直接作用：如在IL-15转基因小鼠中的情况，IL-15过表达增加CD122hi MP CD8细胞的总数(Marks-Konczalik等，Proc Natl Acad Sci USA 97(21)：11445-50，2000；Fehniger等，J Exp Med 193(2)：219-31，2001)。对于通过γc受体发信号的其它细胞因子，IL-15有可能通过上调抗凋亡分子如Bcl-2支持记忆CD8细胞的存活。IL-15触发的信号转导途径似乎经STAT5传播，并受SOCS-1负调节。因此，在表达组成型活化形式的STAT5的转基因小鼠中(Burchill等，J Immunol 171(11)：5853-64，2003)，甚至更引人注目的是在其中SOCS-1的负面作用被废除的小鼠如IFNγ-SOCS-1-小鼠中(Ilangumaran等，J Immunol 171(5)：2435-45)，MPCD8细胞数增加。在两种情况下，幼稚CD8细胞似乎表现出对IL-15的敏感性增加，这使这些细胞经历自发增殖和随后分化为MP细胞，这种转变取决于由与自身肽/MHC配体接触产生的TCR信号转导(Ilangumaran等，J Immunol 171(5)：2435-45；Davey等，J Exp Med 202(8)：1099-108，2005)。
[0065]尽管IL-15被认为是可溶性细胞因子，但其在体内条件下以和IL-15Rα链结合的细胞相关形式被提呈。首先以人细胞系观察到IL-15Rα用于提呈IL-15的重要作用(Dubois等，Immunity 17(5)：537-47，2002)。在小鼠中的随后工作表明，IL-15和IL-15Rα均需要由相同细胞合成，表明IL-15在胞质中与IL-15Rα链预结合，然后在细胞表面上表达(Burkett等，J Exp Med 200(7)：825-34，2004)。这种独特的提呈模式解释了以下悖论：转移至IL-15Rα-小鼠的MP CD8细胞不能响应于Poly I:C进行旁观者增殖(Lodolce等，J Exp Med 194(8)：1187-94，2001)。该模型还解释了为什么IL-15R-小鼠没有MP CD8细胞，并证实了作者最初的观点：识别IL-15需要IL-15Rα(Lodolce等，Immunity9(5)：669-76，1998)。应当指出的是，IL-15Rα链在许多细胞类型上表达，包括T细胞和APC，并易于在活化这些细胞时被上调，尽管看起来只有非T细胞合成IL-15(Doherty等，J Immunol 156(2)：735-41，1996)。尽管IL-15Rα表达对用于IL-15提呈的APC的强制性作用是明显的，但还不清楚CD8细胞表达IL-15Rα的原因。因此，IL-15Rα的T细胞表达对于CD8细胞识别IL-15很大程度上是不必要的，在CD8细胞上仅表达IL-15R的β和γ链就足以满足记忆CD8细胞对IL-15的正常响应(Lodolce等，J Exp Med 194(8)：1187-94，2001；Burkett等，Proc NatlAcad Sci USA 100(8)：4724-9，2003)。IL-15Rα在CD8细胞上的功能仍是个谜，但其可能涉及可溶性IL-15向其它T细胞的反向提呈(Dubois等，Immunity 17(5)：537-47，2002)，或者可能包括增强APC的活化(Budagian等，J Biol Chem 279(40)：42192-201，2004)。
[0066]在正常条件下，IL-15基础水平可能通过合成IL-15和IL-15Rα这二者的DC组成型生产IL-15来确定(Burkett等，J Exp Med200(7)：825-34，2004)。因为IL-15的生产被IFN(尤其是IFN-I)有效诱导，所以产生的疑问是IFN-1的背景生产是否保持IL-15的基础水平。为支持该想法，IFN-I受体缺陷型小鼠具有的CD122hi MP CD8细胞数不及正常B6小鼠中存在的该细胞数的一半，在对IFN-I和IFN-γ均无响应的STAT-I-小鼠中甚至明显存在CD122hi MP CD8细胞的进一步缺失。
[0067]造血系统由执行不同功能的不同细胞类型组成。其不同功能有许多需要细胞表面受体的协调运动，所述细胞表面受体包括离子通道、协调细胞-细胞相互作用的粘附表面分子以及细胞因子受体。尽管它们有不同的功能活性，但一般认为所有的造血细胞都由多能骨髓造血干细胞发育而来。业已表明，这些干细胞表达称为CD34的表面标记。在分化过程中，干细胞在几个特定造血细胞谱系的每一个中产生祖细胞。然后祖细胞经历一系列形态和功能改变，产生在功能上成熟的定向造血细胞。
[0068]在由造血细胞执行的功能中，某些细胞类型专一地涉及免疫性。例如，包括T细胞、B细胞和天然杀伤(NK)细胞在内的淋巴细胞在免疫应答中是效应子。单核细胞和粒细胞(即嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)在非特异性防御形式中起作用。淋巴细胞、单核细胞和粒细胞被统称为白血球或白细胞。另一方面，其它造血细胞执行与免疫系统无关的功能。例如，红细胞参与气体转运，而血小板系的细胞参与血液凝集。
[0069]T细胞和B细胞识别抗原，并产生免疫应答。T细胞通过称为T细胞受体(TCR)的杂二聚化表面受体识别抗原。TCR与一系列统称为CD3复合物的多肽结合。B细胞通过表面免疫球蛋白(Ig)识别抗原，表面免疫球蛋白也是分泌性分子。另外，已在T细胞和B细胞中鉴定出大量共刺激性表面受体，其在抗原诱导的活化当中增强细胞活化。
[0070]除了T细胞抗原受体/CD3复合物(TCR/CD3)之外，由介导活化信号的T细胞表达的其它分子包括但不限于CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD18、CD27、CD28、CD43、CD45、CD152(CTLA-4)、CD154、MHC I类分子、MHC II类分子、CDw137(4-1BB)、CDw150等(Barclay等，The Leucocyte Antigen Facts Book，1997，第2版，Academic Press；Leucocyte Typing，1984，Bernard等(编辑)，Springer-Verlag；Leukocyte Typing II，1986，Reinherz等(编辑)，Springer-Verlag；Leukocyte Typing III，1987，McMichael(编辑)，OxfordUniversity Press；Leukocyte Typing IV，1989，Knapp等(编辑)，OxfordUniversity Press；CD Antigens，1996，关于人白细胞分化抗原的第六次国际会议)。与TCR/CD3一起起作用的细胞表面抗原在本领域经常被称为共受体。
[0071]已针对所有前述T细胞表面抗原产生特异性抗体。结合前述T细胞表面受体的其它分子包括结合抗原的抗体衍生物，例如可变区、肽、超抗原及其天然配体，例如针对CD2的CD58(LFA-3)、针对CD4的HIV gp120、针对CD27的CD27L、针对CD28或CD152的CD80或CD86、针对CD11a/CD18的ICAM1、ICAM2、ICAM3以及针对CDw137的4-1BBL。
[0072]由B细胞表达的活化分子包括但不限于表面Ig、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD40、CD45、CD80、CD86和ICAM1。同样，这些分子的天然配体和针对这些分子的抗体以及抗体衍生物可用于将活化信号传递给B细胞。
[0073]“肿瘤疾病”、“癌症”、“恶性疾病”、“实体瘤”或“过度增殖障碍”作为同义术语使用，是指以不受控的、异常的细胞增殖、受侵染细胞局部或通过血流和淋巴系统传播至机体其它部分的能力(即转移)以及众多特征性结构和/或分子特征中的任一种为特征的众多疾病中的任一种。“癌性”或“恶性细胞”或“实体瘤细胞”被理解为具有特定结构特性、不能分化并能够侵袭和转移的细胞。“肿瘤疾病”或“癌症”是指哺乳动物中存在的所有类型的癌症或肿瘤或恶性肿瘤，包括癌症、肉瘤、淋巴瘤和白血病。实例是乳癌、肺癌、胃癌和食道癌、脑癌和神经系统癌、头颈癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、结肠癌、生殖泌尿系统癌、膀胱癌、泌尿系统癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤和皮肤附件癌、黑素瘤、间皮瘤、内分泌系统癌。(参见DeVita等(编辑)，2001，Cancer Principlesand Practice of Oncology，第6版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA；该参考文献在所有场合均整体引入本文作为参考)。
[0074]“转移”是指如上定义的肿瘤细胞，其传播至其它器官或同一器官的远处。
[0075]“癌症相关的”是指核酸及其表达或缺失、或蛋白及其水平或活性或缺失与目标细胞中的恶性肿瘤发生的关系。例如，癌症可以与在正常健康细胞中不表达或以低水平表达的特定基因的表达相关。相反，癌症相关基因可以为在恶性细胞中(或在经历转化的细胞中)不表达的基因，或者相比于其在正常健康细胞中的表达在恶性细胞中以较低水平表达的基因。
[0076]在癌症背景下，术语“转化”是指正常细胞经历的改变，正常细胞因此而变成恶性的。在真核细胞中，术语“转化”可用于描述在细胞培养物中正常细胞向恶性细胞的转变。
[0077]“增殖细胞”是那些积极进行细胞分裂并以指数规律生长的细胞。“细胞增殖控制的丧失”是指已失去细胞周期控制的细胞特性，细胞周期控制通常确保细胞分裂的适当限制性。失去这些控制的细胞在没有刺激信号的情况下以比正常速率快的速率增殖，且对抑制信号不响应。
[0078]“晚期癌症”是指不再局限于原发性肿瘤部位的癌症，或者按照美国癌症联合委员会(AJCC)为III期或IV期的癌症。
[0079]“良好耐受(的)”是指不存在由于治疗而发生的或会影响治疗决策的健康状态的不利改变。
[0080]“转移”是指肿瘤(例如人实体瘤或泌尿生殖器恶性肿瘤)细胞在注射入哺乳动物脂肪垫和/或免疫缺陷小鼠的循环中时能够在免疫缺陷小鼠的肺、肝脏、骨或脑中建立继发性肿瘤损伤。
癌症治疗
[0081]细胞因子抗体复合物或细胞因子/细胞因子受体复合物可用于治疗疾病(例如肿瘤疾病)的方法。“实体瘤”包括但不限于肉瘤、黑素瘤、癌症或其它实体瘤癌症。
[0082]“肉瘤”是指由象胚胎结缔组织这样的物质构成的肿瘤，一般由嵌入在纤维状或均匀物质中的紧密堆积的细胞组成。肉瘤包括但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy氏肉瘤、脂肉病、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞性肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着性出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、延森肉瘤、卡波西肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白色肉瘤、恶性间充质瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液性囊肿肉瘤、滑膜肉瘤和毛细管扩张性肉瘤。
[0083]“黑素瘤”是指由皮肤和其它器官的黑素细胞系统产生的肿瘤。黑素瘤包括例如肢端雀斑样痣黑素瘤、无黑素性黑素瘤、良性青少年黑色素瘤，Cloudman氏黑素瘤、S91黑素瘤、哈-帕二氏黑素瘤、青少年黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、甲下黑素瘤和浅表扩散性黑素瘤。
[0084]“癌瘤”是指由上皮细胞构成的恶性新生长物，其往往浸润周围组织和引起转移。示例性的癌包括例如腺泡癌、腺泡状癌、腺囊癌、囊性腺样癌、腺瘤癌、肾上腺皮质癌、蜂窝状癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinomabasocellulare)、类基底癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、髓样癌、胆管细胞癌、绒膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎癌、髓样癌、表皮样癌(epiermoidcarcinoma)、腺样上皮癌、外生型癌、溃疡性癌(carcinoma ex ulcere)、纤维癌、胶样癌(gelatiniform carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、粒层细胞癌、毛母质癌、血癌、肝细胞癌、胡尔特尔细胞癌、玻璃样癌、肾上腺样癌，幼稚性胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher癌、库尔奇茨基细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticularcarcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑素癌、软癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucouscarcinom)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、乳突状癌、门脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、髓样癌(pultaceouscarcinoma)、肾脏肾细胞癌、贮备细胞癌、肉瘤性癌、施耐德癌、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭状细胞癌、海绵体癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、毛细血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、毛细血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性癌(carcinomatuberosum)、结节性癌(tuberous carcinoma)、疣状癌和绒毛状癌。
[0085]“白血病”是指造血器官的进行性、恶性疾病，一般以白细胞及其前体在血液和骨髓中的不正常增殖和发育为特征。白血病在临床上一般基于以下几项来分类：(1)疾病的持续时间和特征-急性或慢性；(2)涉及的细胞类型；髓样(骨髓性)、淋巴样(淋巴源性)或单核细胞性；和(3)血液中异常细胞数的增加或不增加-白血性或非白血性(亚白血性)。白血病包括例如急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、白细胞不增多白血病、白血性白血病、嗜碱细胞白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸细胞白血病、格罗斯白血病、毛细胞白血病、成血细胞白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴白血病、成淋巴细胞白血病、淋巴细胞白血病、淋巴源性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞型白血病、小原粒型白血病、单核细胞白血病、成髓细胞白血病、髓细胞白血病、髓性粒细胞白血病、髓细胞单核细胞白血病、内格利白血病、浆细胞白血病(plasma cellleukemia)、浆细胞白血病(plasmacytic leukemia)、前髓细胞白血病、里德尔细胞白血病、希林白血病、干细胞白血病、亚白血性白血病和未分化细胞白血病。
[0086]其它癌包括例如霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺脑岛瘤、恶性类癌、膀胱癌，癌变前皮肤损伤、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性血钙过多、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮癌和前列腺癌。抗体细胞因子复合物的治疗应用
[0087]如在本领域中广为理解的，生物特异性捕获试剂包括结合细胞因子或淋巴因子的抗体、抗体的结合片段(例如具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其任何片段或亲和体(Affibody，Teknikringen 30，Box 700 04，Stockholm SE-10044，Sweden；参见美国专利第5,831,012号，该专利整体并在所有场合引入本文作为参考))。根据预期用途，它们还可以包括特异性结合另一生物分子的受体和其它蛋白质。
[0088]“抗体”指包含来自免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其片段，其特异性结合和识别抗原。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分型为κ或λ，重链被分型为γ、μ、α、δ或ε，其又分别限定了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区对结合的特异性和亲和性最关键。
[0089]杂合抗体和杂合抗体片段包括具有全长重链和轻链的完整抗体分子，或者其任何片段，例如包含Fc区的抗体片段。具有如本文描述的可变区和来自多个物种的恒定区的嵌合抗体也是适合的。参见例如美国申请号200300222440。
[0090]最初，选择可以针对其产生抗体的预定靶标。用于产生针对靶标的单克隆抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。此类技术的实例包括但不限于涉及展示文库、xeno或humab小鼠、杂交瘤等的那些技术。靶标包括能够展现出抗原性并且通常是蛋白质或者蛋白质多糖的任何物质。实例包括受体、酶、激素、生长因子、肽等。应当理解的是，不仅天然抗体适于根据本文公开内容使用，而且针对预定目标的工程化抗体和抗体片段也是适合的。
[0091]可以实施本文陈述技术的抗体(Ab)包括单克隆抗体和多克隆抗体，以及包含Fc区的抗体片段，例如双功能抗体、抗体轻链、抗体重链和/或来自噬菌体或者噬菌粒展示技术的抗体片段。首先，从最初的物种得到初始抗体。更具体地说，需要对靶抗原具有特异性的初始物种抗体的轻链、重链或这二者的可变部分的核酸或氨基酸序列。初始物种是用于产生抗体或抗体文库的任何物种，例如大鼠、小鼠、兔、鸡、猴、人等。用于产生和克隆单克隆抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。得到所需抗体后，使用CDR的任何可能定义(例如仅Kabat、仅Chothia、Kabat和Chothia组合以及本领域技术人员已知的任何其它定义)，将可变区(VH和VL)分成组件部分(即构架(FR)和CDR)。一旦已得到组件部分，就需要选择合适的靶物种构架。一个实施方案涉及将来自初始物种抗体序列的每个个体构架区与来自靶物种的可变氨基酸序列或基因序列比对。用于比对的检索程序在本领域众所周知，例如BLAST等。例如，如果靶物种是人，那么可以在任何合适的参考数据库中找到此类氨基酸序列或基因序列(种系或重排的抗体序列)的来源，所述数据库例如为Genbank、NCBI蛋白质数据库(http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、VBASE、人抗体基因数据库(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc)和免疫球蛋白Kabat数据库(http://www.immuno.bme.nwu.edu)或其翻译产物。如果基于核苷酸序列进行比对，那么应分析选定基因，以确定该子集中的哪些基因与初始物种抗体具有最近的氨基酸同源性。预期与数据库中的其它序列相比接近较高程度的同源性的氨基酸序列或基因序列可以根据本文描述的步骤进行利用和操作。此外，具有较低同源性的氨基酸序列或基因所编码的产物在根据本文描述的步骤操作和选择时对预定靶抗原表现出特异性时，可以利用所述氨基酸序列或基因。在某些实施方案中，可接受的同源性范围大于约50％。应理解的是，靶物种可不为人。
[0092]“治疗”是指在癌症的治疗或减轻或预防中的任何成功标志，包括任何客观或者主观参数，例如症状的减轻、缓和、减小或者使疾况对患者更耐受；延缓退化或者衰退的速率；或者使退化终点不令人虚弱。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括医生检查的结果。因此，术语“治疗”包括给予本发明的化合物或药剂，以预防或延迟、减轻、或阻滞或抑制与疾病相关的症状或病症的发展，所述疾病例如为肿瘤疾病、自身免疫病、细胞耗竭性放疗或化疗或感染性疾病。术语“疗效”是指在受试者中疾病、疾病症状或疾病副作用的减轻、消除或预防。
[0093]在某些实施方案中，“与…组合”、“联合治疗”和“组合产品”是指对患者同时给予第一种治疗剂和本文使用的化合物。在联合给药时，每种组分都可以同时给予或者在不同时间点以任何顺序相继给予。因此，每种组分都可以单独地但是以足够接近的时间给予，以便提供所需疗效。已知癌症治疗药物或自身免疫治疗药物与本发明药物组合物的“伴随给药(concomitant administration)”是指将所述药物和抗体或细胞因子抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物于使已知药物和本发明组合物都具有疗效的时间给药。这样的伴随给药可包括相对于本发明化合物的给药同时(即在同一时刻)、之前或之后给予癌症治疗药物或自身免疫治疗药物。本领域一般技术人员不难确定用于本发明的具体药物和组合物的适宜给药时间、顺序和剂量。
[0094]使用本发明的方法“治疗”疾病(例如肿瘤疾病、自身免疫病、细胞耗竭性放疗或化疗或感染性疾病)包括防止面临疾病的风险增加但还没有经历或表现出感染症状的个体的症状出现、抑制感染症状(减慢或阻滞其发展)、缓解感染症状或副作用(包括姑息疗法)和减轻感染症状(引起恢复)。
[0095]“剂量单位”是指适于作为待治疗的特定个体的单位剂量的物理离散单位。每个单位都可以含有预定量的活性化合物，其经计算与所需要的药物载体协同产生需要的疗效。剂量单位形式的规格可由以下几项决定：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定疗效，和(b)本领域中配制此类活性化合物所固有的限制。
[0096]在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下，“同一的”或者“同一性”百分率是指两种或更多种序列或子序列相同，或者具有相同氨基酸残基或者核苷酸的特定百分率(即在比较窗或指定区域内为了最大对应而进行比较和比对时，在指定区域(例如编码本文描述的细胞因子、抗体或细胞因子受体的核苷酸序列，或本文描述的细胞因子、抗体或细胞因子受体的氨基酸序列)内约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，该百分率使用BLAST或者BLAST2.0序列比较算法以下文描述的默认参数检测，或者通过手工比对和目测来检测(参见例如NCBI网站)。然后将此类序列说成是“基本上同一的”。该术语还指或者可以应用于测试序列的互补体(compliment)。还术语还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如下所述，优选算法可顾及空位等。优选地，在长约至少25个氨基酸或核苷酸的区域内，或者更优选在长为50-100个氨基酸或核苷酸的区域内，存在同一性。
[0097]对于序列比较，通常一个序列用作参比序列，测试序列与其比较。在使用序列比较算法时，将测试和参比序列输入计算机，随后指定坐标，如有必要，指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定备选参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列同一性百分率。
[0098]本文所用的“比较窗”包括参比选自20-600个、通常约50个-约200个、更通常约100个-约150个连续位置数中的任一个的区段，其中在最佳比对两个序列后，可以将序列与相同连续位置数的参比序列比较。用于比较的序列比对方法在本领域众所周知。例如可以通过Smith和Waterman，Adv.App，.Math，2：482，1981的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443，1970的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444，1988的相似性检索方法、通过这些算法的计算机实现(Wisconsin遗传软件包，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过手工比对和目测(参见例如Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，1995增补)，进行用于比较的序列最佳比对。
[0099]适于确定序列同一性百分率和序列相似性的算法的优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等，Nuc.AcidsRes，25：3389-3402，1977和Altschul等，J.Mol.Biol，215：403-410，1990。使用BLAST和BLAST 2.0，用本文描述的参数，确定核酸和蛋白质与本发明实施方案的序列同一性百分率。用于进行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括过鉴定查询序列中长度W的短字节首先鉴定高得分序列对(HSP)，所述短字节在与数据库序列中相同长度的字节比对时匹配或满足一定的正值阈值得分T。T被称为邻近字节得分阈值(Altschul等，出处同上)。这些初始邻近字节命中结果用作启动搜索以寻找含有它们的更长HSP的种子。字节命中结果沿着每个序列以两个方向延伸，直到累积比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的赏分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用记分矩阵计算累积得分。在发生以下情况时停止每个方向上的字节命中结果延伸：累积比对得分从其最大获得值下降量X；由于一个或多个负记分残基比对的积累，累积得分达到0或以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)利用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4作为默认值，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3、期望值(E)10的默认值，BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915，1989)使用比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4，并比较两条链。
[0100]术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及应用于天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。
[0101]“氨基酸”是指天然和合成氨基酸，以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即结合氢、羧基、氨基和R基团的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指所具有结构与氨基酸的一般化学结构不同但是以类似于天然氨基酸的方式起作用的化合物。
[0102]氨基酸在本文可以通过它们的通常已知的三字母符号或者通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可以由它们通常被接受的单字母密码指示。
[0103]“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列这二者。关于特定核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或者基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当所述核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，所以许多功能上相同的核酸编码任一给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中密码子指定丙氨酸的每个位置，都可以将该密码子改变成任一所述对应密码子，而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的其中一种。在本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG以外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)都可以经修饰以产生功能上相同的分子。因此，对于表达产物而言，在每个所述序列中都暗含编码多肽的核酸的每个沉默变异，但对于实际的探针序列并非如此。
[0104]关于氨基酸序列，技术人员公认，在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或少量氨基酸的核酸、肽、多肽或者蛋白质序列的个别替代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域众所周知。此类保守修饰的变体在作为本发明实施方案的多态性变体、种间同源物和等位基因之外，但不排除以上多态性变体、种间同源物和等位基因。
[0105]以下八组各自含有相互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(1984))。
[0106]可以按照不同的组织化水平描述大分子结构，如多肽结构。关于该组织化的一般性论述，参见例如Alberts等，Molecular Biologyof the Cell，第三版，1994以及Cantor和Schimmel，BiophysicalChemistry Part 1：The Conformation of Biological Macromolecules(1980)。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽内的局部有序的三维结构。这些结构通常称作结构域，例如酶结构域、胞外结构域、跨膜结构域、孔结构域和胞质尾结构域。结构域是多肽的组成部分，其形成多肽的紧密单位，通常长15-350个氨基酸。示例性结构域包括具有酶活性的结构域，例如激酶结构域。典型的结构域由较低组织化的区域组成，如β片层和α螺旋序列段。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”是指通过独立三级单位的非共价结合形成的三维结构。各向异性术语也称作能量术语。
[0107]特定核酸序列还暗含“剪接变体”。同样，由核酸编码的特定蛋白暗含由该核酸的剪接变体编码的蛋白。“剪接变体”如其名所示，是基因的可变剪接产物。在转录后，初始核酸转录物可以被剪接，使得不同的(可变的)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制不同，但是包括外显子的可变剪接。该定义还包括通过连读转录从同一核酸得到的可变多肽。该定义包括剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式。
[0108]“重组”当用于指示例如细胞或核酸、蛋白或载体时，表示已通过引入异源核酸或蛋白或者改变天然核酸或蛋白而修饰的细胞、核酸、蛋白或载体，或者该细胞来自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不存在的基因，或者表达以别的方式异常表达、表达不足或者根本不表达的天然基因。
[0109]短语“严格杂交条件”是指这样的条件：在该条件下探针将与其靶序列(通常在核酸的复杂混合物中)杂交，但是不与其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会不同。较长的序列在较高温度特异性杂交。关于核酸杂交的详尽指引见于Tijssen，“Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Probes，”Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid assays，1993。通常，选择在限定离子强度、pH下比特定序列的热解链点(Tm)低约5-10℃的严格条件。Tm是平衡时有50％的与靶互补的探针与靶序列杂交(由于靶序列过量存在，所以在Tm下，平衡时50％的探针被占据)的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。还可以加入去稳定剂如甲酰胺实现严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号为至少两倍背景，优选10倍背景杂交。示例性严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃温育，或者5×SSC，1％SDS，在65℃温育，用0.2×SSC和0.1％SDS于65℃洗涤。
[0110]在严格条件下彼此不杂交的核酸如果其编码的多肽基本相同，那么所述核酸仍然基本相同。例如，这在使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时发生。在此情况下，核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。示例性“中等严格杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中在37℃杂交，并在1×SSC中于45℃洗涤。阳性杂交是至少两倍背景。一般技术人员容易认识到，可使用备选的杂交和洗涤条件提供相似严格性的条件。用于确定杂交参数的其它指引在许多参考文献中提供，例如Ausubel等，出处同上。
[0111]对于PCR，低严格扩增以约36℃的温度为代表，尽管退火温度可根据引物长度在约32℃至48℃之间变动。对于高严格性PCR扩增，约62℃的温度是典型的，尽管高严格性退火温度可根据引物长度和特异性在约50℃至约65℃的范围内。高和低严格性扩增的典型循环条件包括90℃-95℃下30秒至2分钟的变性期，持续30秒至2分钟的退火期，和约72℃下1-2分钟的延伸期。低和高严格性扩增反应的方案和指引提供于例如Innis等，PCR Protocols，A Guide toMethods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.，1990。
[0112]“药学上可接受的赋形剂”是指用于制备通常安全、无毒并需要的药物组合物的赋形剂，包括兽用以及人类药物用途可接受的赋形剂。这些赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者就气雾剂组合物而言为气体。
[0113]“药学上可接受的盐和酯”是指药学上可接受的并具有所需药理学特性的盐和酯。此类盐包括当化合物中存在的酸性质子能够与无机碱或者有机碱反应时可形成的盐。合适的无机盐包括与碱金属(例如钠和钾、镁、钙和铝)形成的那些盐。合适的有机盐包括与有机碱如胺碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N甲基葡糖胺等)形成的盐。此类盐还包括与无机酸(例如盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如乙酸、柠檬酸、马来酸以及烷烃磺酸和芳烃磺酸，如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由化合物中存在的羧基、磺酰氧基和磷酸氧基基团形成的酯，例如C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或单酸单酯或二盐或二酯；类似地，当存在两个以上的酸性基团时，这些基团中的一些或全部可以成盐或酯化。本发明中命名的化合物可以未成盐或者未酯化形式存在，或以成盐和/或酯化形式存在，并且此类化合物的命名意在包括初始(未成盐的和未酯化的)化合物及其药学上可接受的盐和酯。而且，本发明中命名的某些化合物可以以一种以上的立体异构体形式存在，并且此类化合物的命名意在包括所有单一立体异构体和此类立体异构体的所有混合物(无论是外消旋的还是非外消旋的)。
[0114]“药学上可接受的”、“生理学上耐受的”和其语法变型表达在指组合物、载体、稀释剂和试剂时，可互换使用，并代表该物质能够给予人，而不产生会阻止给予组合物的程度的不合需要的生理效应。
[0115]“治疗有效量”是指在给予受试者以治疗疾病时足以实现对该疾病的治疗的量。
[0116]除提到时以外，“受试者”或“患者”可以互换使用，并指哺乳动物，如人类患者和非人灵长类动物，以及实验动物，例如兔、大鼠和小鼠，以及其它动物。因此，本文使用的术语“受试者”或“患者”是指可给予组合物的任何哺乳动物患者或受试者。在本发明的某些实施方案中，患者罹患肿瘤疾病、自身免疫病、细胞耗竭性放疗或化疗、感染性疾病或导致疾病抵抗性下降的疾病，例如HIV。在本发明的示例性实施方案中，为了鉴定按照所述方法用包含一种或多种细胞因子抗体复合物的药物组合物治疗的受试患者，用可接受的筛选方法确定受试者中现有疾病或病症的状态、或者与已靶定或怀疑的疾病或病症有关的风险因素。这些筛选方法包括例如确定受试者是否患有疾病的检查。这些和其它常规方法允许临床医生选择需要治疗的受试者。
[0117]从同一家族和/或同一家族成员选择合适的候选构架区后，将来自初始物种的CDR移植到杂合构架区中产生重链和轻链可变区中的任一个或两个。对于以上的任一方面，具有杂合可变链区域的杂合抗体或杂合抗体片段的组装可以使用本领域技术人员已知的常规方法完成。例如，可以通过寡核苷酸合成和/或PCR产生编码本文描述的杂合可变区(即基于目标物种的构架区和来自初始物种的CDR)的DNA序列。还可以使用合适的限制酶从初始物种抗体分离编码CDR区的核酸，并通过用合适的连接酶连接将核酸连接到目标物种构架中。或者，可以通过定向诱变改变初始物种抗体的可变链的构架区。
[0118]由于杂种由对应于每个构架区的多个候选者的选择构建，因此存在许多可服从符合本文所述原则的构建的序列组合。因此，可以组装杂种文库，其具有含有个体构架区的不同组合的成员。此类文库可以是序列的电子数据库集合或杂种的物理集合。
[0119]优选使用合成寡核苷酸完成物理抗体或抗体片段文库的组装。在一个实例中，设计具有重叠区的寡核苷酸，使它们可以退火，并被聚合酶补平，例如采用聚合酶链式反应(PCR)。进行多个步骤的重叠延伸，以便产生VL和VH基因插入片段。设计那些与人恒定区具有重叠区的片段，使它们可以通过重叠延伸融合，以产生全长轻链和Fd重链片段。轻链和Fd重链区可以通过重叠延伸连接在一起，以产生1个被克隆到展示载体中的Fab文库插入片段。还可以使用用于组装人源化文库基因的备选方法。例如，可以使用连接酶链式反应(LCR)方法由重叠的寡核苷酸组装文库。Chalmers等，Biotechniques，30-2：249-252，2001。
[0120]可以产生多种形式的抗体片段，并将其克隆到合适的载体中，以产生杂合抗体文库或者杂合抗体片段文库。例如，可将可变基因克隆到按读框含有必要恒定区的剩余部分的载体中。可被克隆的额外片段的实例包括完整轻链、重链的Fc部分或者含有轻链和重链Fc编码序列这二者的片段。
[0121]任何选择展示系统都可以协同根据本文公开内容的文库一起使用。用于分离大文库的目标成员的选择方案是本领域已知的，以噬菌体展示技术为代表。此类系统(其中不同的肽序列展示在丝状噬菌体表面上)已经证明可用于产生抗体片段(和编码它们的核苷酸序列)的文库，用于体外选择和扩增结合靶抗原的特定抗体片段。Scott等，Science，249：386，1990。编码VH和VL区的核苷酸序列连接到编码前导信号的基因片段，所述前导信号将这些序列导向大肠杆菌的周质空间，结果所得抗体片段(通常作为与噬菌体外壳蛋白的融合体(例如pIII或者pVIII))展示在噬菌体表面上。或者，抗体片段展示在λ噬菌体或T7壳体(噬菌体)外面。基于噬菌体的展示系统的优点在于，因为它们是生物系统，所以仅通过在细菌细胞中生长含有所选文库成员的噬菌体就可以扩增所选文库成员。此外，因为编码多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上，所以测序、表达和随后的遗传操作都相对直接。构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法在本领域众所周知。McCafferty等，Nature，348：552，1990；Kang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363，1991。
[0122]本发明还涉及特异性结合本发明的细胞因子或淋巴因子的抗体和T细胞抗原受体(TCR)。本发明的抗体包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM和IgY。本文所用的术语“抗体”(Ab)意在包括完整抗体，包括单链完整抗体，及其抗原结合片段。最优选地，抗体为结合人抗原的本发明抗体片段，包括但不限于单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、含有Fc结构域的片段以及包含VL或VH结构域的片段。抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体来自人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。
[0123]结合抗原的抗体片段，包括单链抗体，可以包含单独的或与以下的全部或部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。本发明还包括特异性结合本发明多肽的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及人单克隆抗体和人多克隆抗体。本发明还包括本发明抗体的抗独特型抗体。
[0124]本发明的抗体可为单特异性的、双特异性的、三特异性的或更高的多特异性的。多特异性抗体可以是对本发明多肽的不同表位特异性的，或者可以是对本发明多肽以及异源组合物(例如异源多肽或固相支持材料)这二者特异性的。参见例如WO 93/17715；WO92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等，J.Immunol.147：60-69，1991；美国专利号5573920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648，每个文献均整体并在所有场合引入本文作为参考；Kostelny等，J.Immunol.148：1547-1553，1992。
[0125]本发明的抗体可以按照被抗体识别或特异性结合的本发明多肽的表位或部分来描述或指定。表位或多肽部分可如本文描述指定，例如依据N末端和C末端位置、连续氨基酸残基的大小来指定。还可以排除特异结合本发明的任何表位或多肽的抗体。因此，本发明包括特异性结合本发明多肽的抗体，并且允许排除所述抗体。
[0126]本发明的抗体还可以按照它们的交叉反应性来描述或指定。包括不结合本发明多肽的任何其它类似物、直向同源物或同源物的抗体。本发明还包括不结合与本发明多肽的同一性小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％(使用本领域已知的和本文描述的方法计算)的多肽的抗体。本发明还包括仅结合由在严格杂交条件(如本文所述)下与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽的抗体。本发明的抗体还可以按照它们的结合亲和性来描述或指定。优选的结合亲和性包括具有的解离常数或Kd小于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M和10-15M的结合亲和性。
[0127]形成细胞因子抗体复合物的细胞因子抗体具有的用途包括但不限于本领域已知的纯化、检测和靶向本发明多肽的方法，包括在体外和在体内的诊断和治疗方法。例如，抗体用于定性和定量地测量生物样品中的本发明多肽的水平的免疫测定中。参见例如Harlow和Lane，出处同上，该文献整体并在所有场合引入本文作为参考。
[0128]本发明的抗体可以单独使用，或与其它组合物组合使用。抗体还可以与异源多肽在N末端或C末端重组融合，或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至多肽或其它组分。例如，抗体可以重组融合或缀合至细胞因子或淋巴因子分子。例如，本发明的抗体可以重组融合或缀合至可用作检测测定中的标记的分子和效应子分子，例如异源多肽、药物或毒素。参见例如WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624、美国专利号5,314,995和EP 0396387，每个文献都整体并在所有场合引入本文作为参考。
[0129]可通过本领域已知的任何合适的方法制备针对本发明的细胞因子或淋巴因子的抗体。例如，本发明的细胞因子或淋巴因子或其抗原性片段可给予动物，以便诱导产生含多克隆抗体的血清。术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来自单个克隆(包括任何真核、原核或者噬菌体克隆)的抗体，而不是产生它的方法。可以使用本领域已知的各种各样的技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术。
[0130]杂交瘤技术包括本领域已知的技术，以及在Harlow和Lane，出处同上；Hammerling等，Monoclonal Antibodies And T-CellHybridomas，563-681，1981中教导的技术，所述参考文献整体在此引入作为参考。可以使用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)的酶通过蛋白水解剪切产生Fab和F(ab′)2片段。
[0131]或者，可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术或者通过合成化学，使用本领域已知的方法产生细胞因子或淋巴因子的抗体。例如，可以使用本领域已知的多种噬菌体展示方法制备本发明的抗体。在噬菌体展示方法中，功能抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。通过用抗原(通常为被结合或捕获到固体表面或珠的抗原)直接选择，从所有组成成分或者组合抗体文库(例如人或鼠)选择具有所需结合特性的噬菌体。用于这些方法的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13，其具有重组融合到噬菌体基因III或者基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括在Brinkman等，J.Immunol.Methods 182：41-50，1995；Ames等，J.Immunol.Methods 184：177-186，1995；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24：952-958，1994；Persic等，Gene 187：9-18，1997；Burton等，Advances in Immunology 57：191-280，1994；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236：WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727和5,733,743中公开的方法，每个文献均整体并在所有场合引入本文作为参考。
[0132]如在以上参考文献中所描述的，在噬菌体选择后，可以从噬菌体分离抗体编码区，并用于产生完整抗体，包括人抗体，或者任何其它所需的抗原结合片段，并在任何希望的宿主中表达，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。例如，可使用本领域已知的方法，使用重组产生含有抗体Fc区的抗体片段的技术。例如，还可使用本领域已知的方法，例如在WO 92/22324；Mullinax等，BioTechniques 12：864-869，1992；和Sawai等，AJRI 34：26-34，1995；和Better等，Science 240：1041-1043，1988中公开的方法，使用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术。
[0133]可以用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括在美国专利号4,946,778和5,258,498中描述的技术，每个专利都整体并在所有场合引入本文作为参考；Huston等，Methods in Enzymology，203：46-88，1991；Shu，L等，PNAS 90：7995-7999，1993；和Skerra等，Science 240：1038-1040，1988。对于某些用途，包括人体中抗体的体内应用和体外检测测定，可以优选使用嵌合的、人源化的或者人抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如Morrison，Science 229：1202，1985；Oi等，BioTechniques 4：214，1986；Gillies等，J.Immunol.Methods，125：191-202，1989；和美国专利号5,807,715。可以使用多种技术人源化抗体，所述技术包括CDR移植(EP 0239400；WO 91/09967；和美国专利号5,530,101和5,585,089)，镶嵌或重塑(EP 0592106；EP 0519596；Padlan E.A.，Molecular Immunology，28：489-498，1991；Studnicka等，Protein Engineering 7：805-814，1994；Roguska等，PNAS 91：969-973，1994)和链改组(美国专利号5,565,332)。通过本领域已知的多种方法，包括上述噬菌体展示方法，可以制备人抗体。另参见美国专利号4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；和WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO96/33735和WO 91/10741，这些文献每个都整体并在所有场合引入本文作为参考。
[0134]本发明还包括重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)本发明的细胞因子或淋巴因子的抗体。抗体可对非本发明的细胞因子或淋巴因子的抗原为特异性的。例如，通过将本发明的多肽融合或缀合至对特定细胞表面受体特异性的抗体，抗体可以用于在体外或体内将本发明的细胞因子或淋巴因子靶向特定细胞类型。使用本领域已知的方法，融合或者缀合至本发明多肽的抗体还可以用于体外免疫测定法和纯化方法中。参见例如Harbor等，出处同上；和WO 93/21232；EP 0439095；Naramura等，Immunol.Lett.39：91-99，1994；美国专利号5,474,981，该文献整体并在所有场合均引入本文作为参考；Gillies等，PNAS 89：1428-1432，1992；Fell等，J.Immunol.146：2446-2452，1991。
[0135]本发明还包括组合物，其包含与抗体Fc区的抗体结构域或其部分融合或缀合的本发明的细胞因子或淋巴因子。与本发明多肽融合的抗体部分可以包括铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域或者完整结构域或其部分的任何组合。使用本领域已知的方法，本发明的细胞因子或淋巴因子可以融合或缀合至上述抗体部分，以增加多肽的体内半衰期或者用于免疫测定。多肽还可以融合或缀合至上述抗体部分，以形成多聚体。例如，融合本发明多肽的Fc部分可以通过Fc部分之间的二硫键合形成二聚体。通过融合多肽与IgA和IgM的部分可以得到更高的多聚体形式。使本发明的细胞因子抗体复合物融合或缀合到抗体部分的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,336,603、5622929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,112,946、EP 0307434、EP 0367166、WO 96/04388、WO 91/06570，每个文献均整体并在所有场合引入本文作为参考；Ashkenazi等，PNAS，88：10535-10539，1991；Zheng等，J.Immunol，154：5590-5600，1995；和Vil等，PNAS，89：11337-11341，1992。
[0136]本发明还涉及用作本发明的细胞因子或淋巴因子的激动剂的抗体。例如，本发明包括活化细胞因子或淋巴因子的受体的抗体。这些抗体可用作受到配体介导的受体活化影响的全部或少于全部的生物活性的激动剂。抗体可以被指定为含有本文公开的特定活性的生物活性的激动剂。上述抗体激动剂可以使用本文已知的方法制备。参见例如WO 96/40281；美国专利号5,811,097，每个文献均整体并在所有场合引入本文作为参考；Deng等，Blood 92：1981-1988，1998；Chen等，Cancer Res.，58：3668-3678，1998；Harrop等，J.Immunol，161：1786-1794，1998；Zhu等，Cancer Res.，58：3209-3214，1998；Yoon等，J.Immunol，160：3170-3179，1998；Prat等，J.Cell.Sci.，111：237-247，1998；Pitard等，J.Immunol.Methods，205：177-190，1997；Liautard等，Cytokinde，9：233-241，1997；Carlson等，J.Biol.Chem.，272：11295-11301，1997；Taryman等，Neuron，14：755-762，1995；Muller等，Structure，6：1153-1167，1998；Bartunek等，Cytokinem，8：14-20，1996。如上文讨论，使用本领域技术人员众所周知的技术，又可以使用针对转移细胞上的细胞因子或淋巴因子的抗体产生抗独特型抗体，其“模拟”作为本发明实施方案的多肽。(参见例如Greenspan等，FASEBJ.7：437-444，1989和Nissinoff，J.Immunol.147：2429-2438，1991)。例如，结合并竞争性抑制多肽多聚化和/或作为本发明实施方案的多肽与配体的结合的抗体可用于产生“模拟”多肽多聚化和/或结合结构域的抗独特型抗体，结果，结合并中和多肽和/或其配体。此类中和性抗独特型抗体或者此类抗独特型抗体的Fab片段可用于治疗方案，以中和多肽配体。例如，此类抗独特型抗体可用于结合作为本发明实施方案的多肽和/或结合其配体/受体，由此阻断其生物活性。
[0137]转移细胞或感染细胞上的细胞因子受体或巨噬细胞上的Fc受体的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”分别用于指使用体外和体内受体结合或信号转导测定鉴定的抑制、激活或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗剂以及它们的同系物和模拟物。
[0138]“调节剂”包括抑制剂和激活剂。抑制剂是例如结合、部分或全部阻断刺激、减小、防止、延迟活化、失活、脱敏或下调细胞受体上的细胞因子或淋巴因子的活性的物质，例如拮抗剂。激活剂是例如结合、刺激、增加、打开、活化、促进、增强激活、敏化或上调细胞受体上的细胞因子或淋巴因子的活性的物质，例如激动剂。调节剂包括例如改变细胞因子或淋巴因子受体与以下物质的相互作用的药剂：结合活化剂或抑制剂、受体的蛋白质，包括蛋白质、肽、脂类、糖类、多糖或上述物质的组合，例如脂蛋白、糖蛋白等。调节剂包括天然细胞因子或淋巴因子的遗传修饰形式，例如具有改变的活性，以及天然和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。用于抑制剂和活化剂的这些测定包括例如对表达细胞因子或淋巴因子受体的细胞应用推定的调节剂化合物，然后如本文所述测定对细胞因子或淋巴因子信号转导的功能效应。将用潜在活化剂、抑制剂或调节剂处理的、包含受体的样品或者测定与没有抑制剂、活化剂或调节剂的对照样品比较，以检查活化或抑制程度。对照样品(未用抑制剂处理)可被指定为100％的相对受体活性值。当相对于对照的受体活性值为约80％、任选50％或者25-0％时，实现受体抑制。当相对于对照的受体活性值为110％、任选150％、任选200-500％或者1000-3000％以上时，实现受体活化。
[0139]分子结合细胞因子或淋巴因子受体的能力可以通过例如推定配体结合测定板上包被的活化受体免疫粘附素的能力来确定。通过比较与非活化受体的结合来确定结合特异性。
[0140]在一个实施方案中，可以通过固定配体或受体测定与细胞因子或淋巴因子受体结合的抗体。例如，测定可以包括将融合His标签的细胞因子或淋巴因子受体固定在Ni活化的NTA树脂珠上。抗体可以加入合适的缓冲液中，并且在给定温度下将珠子温育一段时间。在洗涤除去未结合的物质后，可以用例如SDS、具有高pH的缓冲液等释放结合蛋白，并分析。
重组抗体和受体的表达
[0141]通常通过重组表达产生针对细胞因子或淋巴因子的嵌合抗体、人源化抗体和人抗体和受体，例如细胞因子抗体复合物和细胞因子受体复合物。重组多核苷酸构建体通常包括与抗体链的编码序列有效连接的表达控制序列，包括天然结合的或者异源的启动子区。优选地，表达控制序列是载体中的真核启动子系统，其能够转化或者转染真核宿主细胞。一旦载体已经掺入到合适宿主中，就将宿主保持在适于高水平表达核苷酸序列的条件下，并收集和纯化交叉反应抗体。参见美国申请号20020199213，该文献整体并在所有场合引入本文作为参考。
[0142]这些表达载体通常可以在宿主生物中作为游离体或者作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标记，例如，氨苄青霉素抗性或者潮霉素抗性，以允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞。
[0143]大肠杆菌是一种尤其可用于克隆本发明的DNA序列的原核宿主。诸如酵母的微生物也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)是优选的酵母宿主，合适的载体根据需要具有表达控制序列、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。诱导型酵母启动子尤其包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
[0144]哺乳动物细胞是用于表达编码免疫球蛋白和细胞因子受体或其片段的核苷酸区段的优选宿主。参见Winnacker，From Genes ToClones，VCH Publishers，NY，1987。本领域已经开发了许多能够分泌完整异源蛋白质的合适的宿主细胞系，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、多种COS细胞系、HeLa细胞系、L细胞系和骨髓瘤细胞系。优选地，细胞是非人的。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子，和必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。Queen等，Immunol.Rev.89：49，1986。优选的表达控制序列是来自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。Co等，JImmunol.148：1149，1992。
[0145]或者，抗体和细胞因子受体编码序列可被掺入到转基因中，用于导入转基因动物的基因组中，并随后在转基因动物的乳汁中表达。参见例如美国专利号5,741,957、5,304,489和5,849,992，每个所述专利均整体并在所有场合引入本文作为参考。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子有效连接的轻链和/或重链的编码序列。
[0146]根据细胞宿主的类型，含有目标DNA区段的载体可以通过众所周知的方法转移到宿主细胞中。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂转染、生物导弹法或基于病毒的转染可以用于其它细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括使用聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(一般参见Sambrook等，Molecular Cloning)。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到受精的卵母细胞中，或者可以掺入到胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞的细胞核转移到去核卵母细胞中。
[0147]一经表达，就从培养基和宿主细胞纯化抗体和受体的收集物。可以根据本领域的标准方法纯化抗体和受体，所述方法包括HPLC纯化、柱层析、凝胶电泳等等。通常，抗体链与信号序列一起表达，并由此释放入培养基。然而，如果抗体链不被宿主细胞天然分泌，则可以用温和去污剂处理释放抗体链。然后通过常规方法纯化抗体链，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和层析至固定化靶、柱层析、凝胶电泳等(一般参见Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.，1982)。
[0148]以上方法产生编码对选定靶具有特异性亲和性的抗体链的核酸序列文库。核酸文库通常具有至少5、10、20、50、100、1000、104、105、106、107、108或109个不同成员。通常，单个成员不占文库中总序列的25％或50％以上。通常，至少25％、50％、75％、90％、95％、99％或99.9％的文库成员编码对靶分子具有特异性亲和性的抗体链。就双链抗体文库而言，分别编码重链和轻链的核酸区段对被认为是文库成员。核酸文库可以以游离形式、作为任何载体的组分存在，或者作为载体的组分被转染入宿主细胞中。
[0149]可以表达核酸文库，以产生对靶标具有特异性亲和性的多克隆抗体文库。从核苷酸文库的组成确定此类文库的组成。因此，此类文库通常具有至少5、10、20、50、100、1000、104、105、106、107、108或109个具有不同氨基酸组成的成员。通常，单个成员不占文库中全部多肽的25％或50％以上。抗体链文库中对靶标具有特异性亲和性的抗体链的百分率通常低于编码抗体链的对应核酸的百分率。该差异是由于并非所有多肽都折叠成适合结合的结构这一事实，尽管它们具有合适的一级氨基酸序列来支持适当的折叠。在某些文库中，至少25％、50％、75％、90％、95％、99％或99.9％的抗体链对靶分子具有特异性亲和性。再有，在多链抗体文库中，认为每种抗体(例如Fab或完整抗体)都是文库成员。就对靶标的精细结合特异性和亲和性而言，不同的抗体链彼此不同。一些此类文库包括结合相同抗原上的不同表位的成员。某些此类文库包括结合相同抗原但不彼此竞争的至少两个成员。
[0150]由以上方法产生的多克隆人抗体文库与人抗体的天然群体的差别在于该文库中高亲和性结合体的高百分率，以及该文库通常不显示出与天然群体中存在的相同抗体多样性。该文库中降低的多样性是由于非人转基因动物，其提供不包括所有人免疫球蛋白基因的来源物质。例如，某些多克隆抗体文库没有具有λ轻链的抗体。作为本发明实施方案的某些多克隆抗体文库具有由少于10、20、30或40种VH基因编码的抗体重链。作为本发明实施方案的某些多克隆抗体文库具有由少于10、20、30或40种VL基因编码的抗体轻链。
修饰的抗体和受体
[0151]本发明还包括针对细胞因子或淋巴因子的修饰的抗体和受体，用于增加T细胞群和治疗疾病。
[0152]“修饰的抗体”是指以化学方式或通过分子工程为不同形式而优化的抗体和抗体片段，包括但不限于双功能抗体、三功能抗体或双特异性抗体、PEG化衍生物、来源于分子进化以增强亲和性、稳定性或化合价的变体。修饰的抗体还包括已通过例如缺失、添加或取代抗体部分而修饰的形式，例如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例如，可通过缺失恒定区并用意在增加抗体的半衰期(例如血清半衰期)、稳定性或亲和性的恒定区取代其而修饰抗体。
[0153]细胞因子/抗体复合物或细胞因子/细胞因子受体复合物可用于修饰给定生物反应或产生某种生物反应(例如募集效应细胞)。不能将药物部分理解为限于常规的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括例如酶促活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素α；或者生物反应调节物，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-4(“IL-4”)、白介素-6(“IL-6”)、白介素-7(“IL-7”)、白介素-15(“IL-15”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或者其他生长因子。其它衍生物可以包括抗体融合蛋白，其具有细胞凋亡诱导部分如TRAIL的、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体，以及具有报告分子，例如萤光素酶或荧光探针，以及纳颗粒，用于非侵入性成像或将有效载荷分子靶向具有肿瘤负荷及微小转移(micro-metastases)和肉眼可见转移(macro-metastases)的部位。
[0154]在本发明的某些实施方案中，细胞因子/抗体复合物或细胞因子/细胞因子受体复合物例如可以偶联或者缀合到一种或多种治疗性或者细胞毒性部分。本文所用的“细胞毒性部分”仅指在接近细胞或被细胞吸附时抑制细胞生长或者促进细胞死亡的部分。在这方面合适的细胞毒性部分包括放射性试剂或者同位素(放射性核素)、化学毒性剂(例如分化诱导剂、抑制剂和小化学毒性药物、毒素蛋白质及其衍生物)以及核苷酸序列(或者它们的反义序列)。因此，作为非限制性实例，细胞毒性部分可以是化学治疗剂、光活化毒素或放射性试剂。
[0155]通常，可以通过任何合适的技术，适当考虑药物代谢动力学稳定性和对患者的总体毒性减小的需要，将治疗剂缀合至细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物，例如单独的或与另一种治疗剂组合的细胞因子抗体复合物。单独的或与另一种治疗剂组合的细胞因子或淋巴因子可以直接或者间接(例如经连接基)偶联到合适的抗体部分。细胞因子或淋巴因子和抗体在每种均具有能够与对方反应的官能团时，它们之间可能进行直接反应。例如，亲核基团，如氨基或巯基，能够与含有羰基的基团(如酐或酰基卤)或含有良好离去基团(例如卤化物)的烷基反应。或者，可以使用合适的化学连接基。连接基可以作为间隔臂使抗体与药剂远离，以避免干扰结合能力。连接基还可以用于增加部分或抗体上的取代基的化学反应性，从而增加偶联效率。化学反应性的增加还可以利于各部分或各部分上的官能团的使用，要不然该使用应是不可能的。
[0156]合适的连接化学包括马来酰亚胺基接头和烷基卤接头(其与抗体部分上的巯基反应)和琥珀酰亚胺基接头(其与抗体部分上的伯胺反应)。在免疫球蛋白上存在若干伯胺和巯基，并且可以在重组免疫球蛋白分子中设计额外的基团。对本领域技术人员显而易见的是，多种同官能和杂官能的双官能或多官能试剂(例如在Pierce Chemical Co.，Rockford，III的目录中描述的那些)可用作连接基。例如，可通过氨基、羧基、巯基或氧化的糖类残基实现偶联(参见例如美国专利号4,671,958)。
[0157]作为备选偶联方法，细胞毒性剂可以偶联到作为本发明实施方案的抗体和细胞因子抗体复合组合物，例如通过糖基化位点上氧化的糖类基团，如美国专利号5,057,313和5,156,840中所述。将抗体和抗体组合物偶联到细胞毒性或成像部分的又一个备选方法是使用非共价结合对，例如链霉抗生物素蛋白/生物素或亲和素/生物素。在这些实施方案中，所述对的一个成员共价偶联至抗体部分，结合对的另一个成员共价偶联到细胞毒性或成像部分。
[0158]在细胞因子、淋巴因子或细胞毒性部分于没有本发明的免疫缀合物的抗体部分时更有效的情况下，可能需要使用连接基，其在内化入细胞期间或内化入细胞时是可切割的，或者其在胞外环境中随时间变化逐渐可切割。已经描述了许多不同的可切割的连接基。由这些连接基胞内释放细胞毒性部分物质的机制包括通过下列方法进行切割：还原二硫键(例如美国专利号4,489,710)、照射光不稳定键(例如美国专利号4,625,014)、水解衍生化氨基酸侧链(例如美国专利号4638045)、血清补体介导的水解(例如美国专利号4,671,958)和酸催化的水解(例如美国专利号4,569,789)。
[0159]可能需要将一种以上的治疗剂、细胞因子、淋巴因子或细胞毒性和/或成像部分偶联到细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物。通过多衍生化抗体，可以同时实现若干治疗性和/或细胞毒性策略，抗体可用作一些显影技术的造影剂，或者治疗性抗体可以经标记用于显影技术示踪。在一个实施方案中，将细胞毒性部分的多个分子偶联到一个抗体分子。在另一个实施方案中，一种以上类型的部分可以偶联到一种抗体。例如，治疗部分(如细胞因子或淋巴因子)可以与化学毒性或放射毒性部分一起缀合到抗体，以增加化学毒性疗法或放射毒性疗法的有效性，以及降低得到期望疗效必需的剂量。不管具体实施方案，具有一个以上部分的免疫缀合物可以以多种方法制备。例如，一个以上的部分可以直接偶联到抗体分子，或者可以使用提供用于连接的多个位点的接头(例如树状聚体)。或者，可以使用能够容纳一个以上细胞毒性部分的载体。
[0160]如上面所解释的，载体可以以多种方式携带药剂，包括直接或者通过连接基共价键合和非共价结合。合适的共价键载体包括蛋白质，如白蛋白(例如美国专利号4,507,234)、肽和多糖，如氨基葡聚糖(例如美国专利号4,699,784)，它们的每一个都具有用于连接部分的多个位点。载体还可以通过非共价结合(如非共价键合)或者通过例如囊化在脂质体囊泡中(例如美国专利号4,429,008和4,873,088)携带药剂。囊化载体尤其可用于化学毒性治疗实施方案，因为它们可允许治疗组合物随时间变化而逐渐释放化学毒性部分，同时将其在靶细胞附近浓缩。
[0161]用作细胞毒性部分的优选放射性核素是适于药理学给药的放射性核素。此类放射性核素包括123I、125I、131I、90Y、211At、67Cu、186Re、188Re、212Pb和212Bi。碘和砹同位素是用于本发明的治疗性组合物中的更优选的放射性核素，因为关于它们的使用已积累了大量文献。尤其优选131I和其它β辐射放射性核素，它们具有几毫米的有效射程。利用若干已知缀合试剂中的任一种，包括非水溶性碘化试剂(Iodogen)、3-[211At]砹代苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、3-[131I]碘代苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIB)和5-[131I]碘代-3-吡啶甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIPC)，可以将123I、125I、131I或211At缀合至用于组合物和方法中的抗体部分。任何碘同位素都可以用于所述碘代试剂。通过核医学领域中技术人员已知的适宜螯合剂可以将其它放射性核素缀合至细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物。
[0162]优选的化学毒性剂包括小分子药物，如氨甲蝶呤以及嘧啶和嘌呤类似物。优选的化学毒素分化诱导剂包括佛波酯和丁酸。化学毒性部分可以通过化学接头直接缀合至细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物，或者可以囊化在载体中，载体又可以偶联至细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物。
[0163]用作细胞毒性部分的优选毒素蛋白包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素、志贺氏菌毒素、美洲商陆抗病毒蛋白和医学生物化学领域已知的其它毒素蛋白。由于这些毒素物质可以在患者中(特别是如果静脉内注射的话)引起不希望的免疫应答，所以优选将它们囊化在载体中，用于偶联至细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物。
[0164]免疫毒素的细胞毒性部分可为细胞毒性药物，或者为细菌或者植物来源的酶促活性毒素或此类毒素的酶促活性片段(“A链”)。使用的酶促活性毒素及其片段是白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、莫迪素A链(modeecin A chain)、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素。在另一个实施方案中，将抗体缀合至小分子抗癌药物。使用多种双官能蛋白质偶联剂制备单克隆抗体和此类细胞毒性部分的缀合物。此类试剂的实例是SPDP、IT、亚氨酸酯的双官能衍生物(如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二叠氮化合物(如二(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮鎓衍生物(如二-(对-二重氮鎓苯甲酰基))-乙二胺、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸亚苄酯)和二-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。毒素的裂解部分可以结合至抗体的Fab片段。
[0165]有利地，特异性结合细胞因子或抗体的外部结构域的细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物可以缀合到蓖麻毒蛋白A链。更有利地，将蓖麻毒蛋白A链去糖基化，并通过重组方式产生。制备蓖麻毒蛋白免疫毒素的有利方法描述于Vitetta等，Science 238，1098，1987，该文献整体引入本文作为参考。
[0166]术语“接触的”当应用于细胞时，在本文中用于描述抗体、抗体组合物、细胞毒性剂或部分、基因、蛋白和/或反义序列被递送到靶细胞或靠近靶细胞放置的方法。该递送可以在体外或在体内，并可涉及使用重组载体系统。
[0167]另一方面，本发明的特征在于细胞因子/抗体复合物或细胞因子/细胞因子受体复合物或其片段，它们缀合至治疗部分，如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或者放射性毒素。此类缀合物在本文被称作“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或者细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、倍癌霉素、肥皂草素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin didne)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。
[0168]用于形成免疫缀合物的适宜治疗剂包括但不限于抗代谢物(例氨甲喋呤、6-巯嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、亚硝脲氮芥(BSNU)和罗氮芥(CCNU)、环磷酞胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前称作道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称作放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。在优选实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或者放射毒性剂。在另一个实施方案中，治疗剂是免疫抑制剂。在再一个实施方案中，治疗剂是GM-CSF。在又一个实施方案中，治疗剂是阿霉素(doxorubicin)(adriamycin)、顺铂、硫酸博来霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、羟基脲或蓖麻毒蛋白A。
[0169]细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物还可以与放射性毒素如放射性碘缀合，以产生细胞毒性放射性药物，用以治疗例如癌症。细胞因子/抗体复合物或细胞因子/细胞因子受体复合物可用于修饰给定生物反应，不能将药物部分理解为限于常规的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括例如酶促活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素γ；或者生物应答调节物，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-4(“IL-4”)、白介素-6(“IL-6”)、白介素-7(“IL-7”)、白介素-15(“IL-15”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或者其他生长因子。
[0170]用于将此类治疗部分缀合至抗体的技术是众所周知的。参见例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of DrugsIn Cancer Therapy”，载于Reisfeld等编辑，Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，243-56页，1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，载于Controlled Drug Delivery，第2版，Marcel Dekker，Inc.，Robinson等编辑，623-53页，1987；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，载于Monoclonal Antibodies ′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等编辑，475-506页，1985；“Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”，载于Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy，Baldwin等编辑，Academic Press，303-16页，1985，和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates”，Immunol Rev.，62：119-58，1982。
细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物的用途
[0171]本文鉴定的每个细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物，例如刺激T细胞群扩增的细胞因子抗体复合物，可以多种方式使用。以下描述应被理解为示例性的，并利用已知技术。
[0172]细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物可用于使用基于抗体的技术测定生物样品中的蛋白水平。例如，可以用经典免疫组织学方法研究组织中的蛋白质表达。Jalkanen等，J.Cell.Biol.101：976-985，1985；Jalkanen等，J.Cell.Biol.105：3087-3096，1987。用于检测蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫测定法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，包括酶标记，如葡萄糖氧化酶和放射性同位素或其它放射性药剂，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)，以及荧光标记，如荧光素和罗丹明，和生物素。
[0173]除了测定生物样品中的分泌蛋白水平以外，蛋白或抗体组合物还可以通过成像在体内检测。用于蛋白质体内成像的抗体标记或标志包括通过X射线照相术、NMR或ESR可检测的那些。对于X射线照相术，合适的标记包括放射性同位素，如钡或铯，其发出可检测的放射，但是对受试者没有明显伤害。NMR和ESR的适宜标志包括具有可检测的特征自旋的那些标志，如氘，其可以通过标记相关scFv克隆的营养物而掺入到抗体中。
[0174]向哺乳动物中导入(例如肠胃外、皮下或腹膜内)已用合适的可检测成像部分标记的蛋白质特异性抗体或抗体片段，所述可检测成像部分例如为放射性同位素(例如131I、112In、99mTc)、放射不透物质或可通过核磁共振检测的物质。在本领域中要理解的是，受试者的大小和所用成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。就放射性同位素部分而言，对于人类受试者，注射的放射性量通常为约5-20毫居里99mTc。然后，标记的抗体或抗体片段将优先积累在含有特定蛋白质的细胞位置。体内肿瘤成像描述于Burchiel等，Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer 13，1982。
[0175]此外，细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物可用于治疗疾病。例如，可以对患者施用本发明的细胞因子抗体复合组合物，以期增强T细胞群扩增、抑制多肽(例如致癌基因)的活性、激活多肽活性(例如通过结合受体)、通过与膜结合受体竞争游离配体(例如用于减轻炎症的可溶性TNF受体)降低膜结合受体的活性或者引起所需响应(例如血管生长)。
[0176]同样，细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物也可用于治疗疾病。例如，给予针对本发明多肽的抗体可以结合和减少多肽的过量产生。同样，给予抗体可以激活多肽，例如通过结合与膜受体结合的多肽。
治疗方案
[0177]本发明提供药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物，用于治疗疾病，例如肿瘤疾病、自身免疫病、细胞耗竭性放疗或化疗或感染性疾病。某些组合物包括多种(例如两种或更多种)细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物的组合。
[0178]在预防疾病应用中，将药物组合物或药物给予对疾病或病症(例如肿瘤疾病、自身免疫病、细胞耗竭性放疗或化疗或感染性疾病)易感或面临所述疾病或病症风险的患者，其给予量足以消除或降低疾病或病症的复发风险、减轻严重性或延迟疾病发生，包括该疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症和在该疾病发展期间呈现的中间病理表型。在治疗应用中，将组合物或者药物给予疑似患有或已患有该疾病的患者，其给予量足以治愈或至少部分阻止该疾病的症状(生物化学的、组织学的和/或行为的)，包括其并发症和该疾病发展中的中间病理表型。足够完成治疗或者预防治疗的量定义为治疗上或预防上有效的剂量。在预防和治疗方案中，通常将药剂以几个剂量给药，直到已实现了足够的抗增殖反应。通常，监视抗增殖反应，并且如果抗增殖反应开始减弱则给予重复剂量。
有效剂量
[0179]用于治疗本文所述疾病(例如肿瘤疾病、自身免疫病、细胞耗竭性放疗或化疗或感染性疾病)的细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物(例如针对细胞因子或淋巴因子的抗体)的有效剂量随许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶标部位、患者的生理状态(无论患者是人还是动物)、给予的其它药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。治疗剂量需要逐步滴定，以优化安全性和功效。
[0180]对于用抗体给药，剂量范围为约0.0001-100mg/kg宿主体重，更通常0.01-5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案需要每两周1次或每月1次或者每3-6个月1次进行给药。在某些方法中，同时给予具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在该情况下，施用的每种抗体的剂量都属于所示范围内。抗体通常在多个时刻给药。单次剂量之间的间隔可以为每周1次、每月1次或每年1次。间隔还可以是不规则的，如通过测量患者的血液抗体水平来指示。在某些方法中，调节剂量，以实现1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在某些方法中，为25-300μg/ml。或者，抗体可以作为缓释制剂给药，在该情况下，需要较低频率的给药。剂量和频率随患者中抗体的半衰期而变化。一般而言，人抗体显示出最长的半衰期，接着是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。给药的剂量和频率可根据治疗是预防性还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时期内以相对不频繁的间隔给予相对低的剂量。某些患者在他们的余生持续接受治疗。在治疗性应用中，有时在相对短的间隔内需要相对高的剂量，直到疾病的发展减慢或终止，并优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善。之后，可以给予患者预防方案。
[0181]编码免疫原的核酸的剂量对每名患者约10ng-1g、100ng-100mg、1μg-10mg或30-300μg DNA的范围内。感染性病毒载体的剂量在每剂10-100或更多的病毒体之间变化。
给药途径
[0182]用于诱导免疫应答以治疗疾病(例如肿瘤疾病、自身免疫病、细胞耗竭性放疗或化疗或感染性疾病)的细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物，例如细胞因子/抗体复合物或细胞因子/细胞因子受体复合物，可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内途径给予，用于作为靶向脑病变的抗体制剂的吸入剂预防性治疗，和/或用于治疗性治疗。细胞因子抗体复合组合物的最常用给药途径为皮下，尽管其它途径可能同样有效。第二种最常用的途径是肌内注射。该类型的注射最通常在臂或腿肌肉中进行。在某些方法中，将药剂直接注射到已累积沉积物的特定组织中，例如颅内注射。对于抗体给药，优选肌内注射或静脉输注。在某些方法中，将特定治疗性抗体直接注射入颅内。在某些方法中，抗体作为缓释组合物或者装置如MedipadTM装置给予。
[0183]细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物可以任选地与其它药剂组合给予，所述其它药剂在治疗包括多种免疫相关疾病在内的疾病时至少部分有效。对于向脑的肿瘤转移，药剂还可以与增强药剂穿过血脑屏障(BBB)的其它药剂一起给予。
制剂
[0184]用于诱导免疫应答以治疗疾病(例如肿瘤疾病、自身免疫病、细胞耗竭性放疗或化疗或感染性疾病)的细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物，通常作为包含活性治疗剂(即连同多种其它药学上可接受的组分)的药物组合物给予。(参见Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，1980)。优选形式取决于预期的给药模式和治疗应用。根据所需的制剂，组合物还可以包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其被定义为常用于配制用于动物或人类给药的药物组合物的溶媒。对稀释剂进行选择，以便不影响组合的生物活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank′s溶液。此外，药物组合物或制剂还可以包括其它载体、佐剂或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。
[0185]药物组合物还可以包括大的缓慢代谢的大分子如蛋白质、多糖如壳多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如乳胶官能化的SepharoseTM、琼脂糖、纤维素等)、聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂类聚集体(例如油滴或脂质体)。此外，这些载体可以用作免疫刺激剂(即佐剂)。
[0186]对于肠胃外给药，为本发明实施方案的组合物可以作为在生理学上可接受的稀释剂和药物载体中的可注射剂型的溶液或悬浮液给药，所述药物载体可为无菌液体，如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，组合物中可以存在辅助物质，如增湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的其它组分是石油、动物、植物或合成来源的那些组分，例如花生油、大豆油和矿物油。通常，二元醇如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，尤其对于注射溶液而言。抗体可以以贮库注射或植入制剂的形式给予，所述贮库注射或植入制剂可以以允许活性成分持续释放的方式配制。示例性组合物包含在水性缓冲液中以5mg/mL配制的单克隆抗体，所述缓冲液由50mM L组氨酸、150mM NaCl组成，用HCl调节到pH 6.0。
[0187]通常将组合物制备成可注射的液体溶液剂或混悬剂；也可以制备适于注射前溶解或悬浮在液态溶媒中的固体形式。制剂还可以如上所述被乳化或囊化在脂质体或微粒(如聚交酯、聚乙交酯或共聚物)中，用于增强佐剂作用。Langer，Science 249：1527，1990和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28：97-119，1997。本发明的药剂可以以贮库注射或者植入制剂的形式给予，所述贮库注射或者植入制剂可以以允许活性成分持续或脉冲释放的方式配制。
[0188]适于其它给药方式的其它制剂包括经口、鼻内和经肺制剂、栓剂和经皮应用。
[0189]对于栓剂，粘合剂和载体包括例如聚亚烷基二醇类或甘油三酯类；此类栓剂可由含有0.5％-10％、优选1％-2％范围内的活性成分的混合物形成。口服制剂包括赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采取溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉末剂的形式，并含有10％-95％、优选25％-70％的活性成分。
[0190]局部应用可以导致经皮或者皮内递送。通过共给予药剂与霍乱毒素或其脱毒衍生物或亚基或其它相似的细菌毒素可以促进局部给药。Glenn等，Nature 391：851，1998。通过将组分用作混合物或经化学交联得到的连接分子，可以实现共给予。
[0191]或者，使用皮肤贴剂或者使用传输体(transferosome)可以实现经皮递送。Paul等，Eur.J.Immunol.25：3521-24，1995；Cevc等，Biochem.Biophys.Acta 1368：201-15，1998。
[0192]药物组合物通常配制为无菌的、几乎等渗的，并且完全符合美国食品药品管理局的所有药品生产质量管理规范(GMP)的条例。毒性
[0193]优选地，本文描述的细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物的治疗有效剂量将提供治疗益处，而不产生显著毒性。
[0194]通过细胞培养或者实验动物的标准药学方法，例如，通过确定LD50(群体的50％致死剂量)或者LD100(群体的100％致死剂量)来确定本文描述的蛋白毒性。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数。从这些细胞培养测定法和动物研究得到的数据可用于配制用于人体无毒的剂量范围。本文描述的蛋白质剂量优选位于循环浓度范围内，该范围的循环浓度包括基本没有或没有毒性的有效剂量。根据使用的剂型和利用的给药途径，剂量可以在该范围内变动。可以由个体医师根据患者的病症选择确切的制剂、给药途径和剂量。(参见例如Fingl等，1975，载于：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章)。药盒
[0195]药盒也在本发明范围内，其包含细胞因子/抗体复合组合物或细胞因子/细胞因子受体复合组合物(例如单克隆抗体、人序列抗体、人抗体、多特异性和双特异性分子)和使用说明书。药盒还可以含有至少一种其它试剂，或者一种或多种其它的人抗体(例如具有互补活性的人抗体，其在抗原中结合的表位与第一种人抗体不同)。药盒通常包括指出药盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在药盒上或与药盒一起提供的或附随药盒的任何书面或记录的材料。
示例性实施方案
实施例1
在注射重组小鼠IL-2后在小鼠中的T细胞增殖
[0196]先前的研究已表明，MP CD8+细胞在体内的更新可通过注射IL-2或IL-2mAb增加(图1)。对于IL-2，通过稀释染料CFSE(图1A、B)或掺入溴脱氧尿苷(BrdU)(图2)检测的体内CD8+细胞增殖在注射重组小鼠IL-2(rmIL-2)后显著，并很大程度上局限于MP CD8+细胞，对宿主和过继转移的纯化的CD8+细胞均如此。相比之下，以CD122和CD44的低表达限定的幼稚T细胞的刺激最小(图2)。证实了先前的发现，在注射IL-2mAb(具体地说为抗小鼠IL-2mAb S4B6)后发生甚至更高的增殖(图1和2)。Ku等，Science 288：675，2000；Kamimura等，J Immunol 173：6041，2004。该作用还见于IL-15-/-宿主，被CD122mAb阻断(图1A)，证实用于增殖的效应子细胞因子不是IL-15，但仍然经由CD122刺激。Ku等，Science 288：675，2000；Kamimura等，JImmunol 173：6041，2004。
[0197]图1显示了IL-2或IL-2mAb对体内MP CD8+细胞的刺激。将CFSE标记的纯化的Thy1.1MP(CD44hiCD122hi)CD8+T细胞静脉内(iv)转移至(A)野生型(WT)或IL-15-/-小鼠，然后每日1次接受腹膜内(ip)注射PBS、rmIL-2、S4B6 IL-2mAb或IL-2mAb加CD122mAb，或(B)野生型IL-2+/-或IL-2-/-小鼠，接着每日1次注射S4B6 IL-2mAb或对照mAb。在第7天通过流式细胞术分析供体细胞。数字代表分裂的(CFSElo)供体Thy1.1+CD8+细胞的百分率。在该图和后续图中的所有数据都代表至少2个独立的实验。
[0198]图2显示了响应于IL-2或IL-2mAb的MP CD8+细胞体内增殖。(A)将纯化的Thy1.1标记的MP CD44hiCD122hiCD8+T细胞静脉内(iv)转移至正常B6(Thy1.2)小鼠。随后，宿主小鼠在1周内每日1次接受腹膜内(ip)注射的PBS、1.5μg rmIL-2或0.5mg S4B6 IL-2mAb。为检测T细胞更新，最后3天在饮用水中给予BrdU。在7天后分离淋巴结(LN)和脾细胞，并通过流式细胞术分析。数字代表供体Thy1.1+CD8+细胞的百分率(上行)或BrdU+细胞的百分率(下行)。
实施例2
响应于细胞因子抗体复合物的T细胞增殖在IL-2-/-小鼠中被消除或在IL-2+/-小鼠中被减少
[0199]出乎意料的发现是，在过继转移时IL-2mAb对MP CD8+细胞的刺激在IL-2-/-宿主中被消除，在IL-2+/-宿主中被相当程度地降低(图1B)。因此提示，尽管报告了S4B6 IL-2mAb在体外的中和功能，但其在体内可能通过形成免疫复合物增加既有IL-2的生物活性而起作用。Zurawski等，J Immunol 137：3354，1986。为评价该可能性，我们使用每日1次注射IL-2和IL-2mAb的方案。所获得的过继转移和宿主MP CD8+细胞的增殖相比于用单一IL-2或IL-2mAb给药所观察到的增殖急剧增强(图3A)，并导致在第7天时在脾和LN中MP CD8+细胞的总数大幅(＞100倍)增加，这些器官明显增大(图3B)。IL-2和IL-2mAb的组合方案还使另一个CD122hi群(即NK(CD3-NK1.1+DX5+)细胞)的总数显著(20-30倍)增加，但对包括MP CD44hiCD4+细胞和B220+B细胞在内的其它细胞的作用极微(图3A、3B)。转移的幼稚CD8+细胞的增殖相对低，提示IL-2/IL-2mAb组合很大程度上作用于预先存在的CD122hi细胞，而不是作用于幼稚CD122lo前体(图4A)。增殖与IL-15无关，因为在转移至IL-15-/-宿主时出现相当的数据(图4B)。还存在对已初免的病毒特异性CD8+细胞的强刺激(图3C)，表明CD122hiCD8+细胞的增殖适用于限定抗原(Ag)特异性记忆细胞以及MP细胞。关于后者，增殖未导致CD25上调，且未被CD25-/-MP CD8+细胞损害，表示刺激仅经由IL-2Rβγ(CD122)而非IL-2Rαβγ发生(图5)。
[0200]图3表明组合的IL-2和IL-2mAb在体内显著地选择性扩增MP和抗原(Ag)特异性记忆CD8+T细胞。(A)将CFSE标记的MPCD8+T细胞转移至B6小鼠，之后每日1次ip注射PBS、rmIL-2、S4B6IL-2mAb或rmIL-2加IL-2mAb。检验来自淋巴结(LN)的供体和宿主细胞于第7天时显示的标记。对脾细胞获得相对应的结果。(B)来自(A)中小鼠的供体和宿主CD44hiT细胞的脾和LN总细胞数(+SD，2只小鼠/组)。来自注射小鼠的两个代表性脾和LN的照片示于右侧。(C)将CFSE标记的Ag(LCMV)特异性记忆CD8+T细胞转移至B6小鼠，接着如上所述每日注射1次。在第7天通过流式细胞术分析供体细胞。数字表示分裂(CFSElo)细胞的百分率(A左列，C)。
[0201]图4表明，CD8+T细胞针对IL-2/IL-2mAb复合物的增殖很大程度上局限于CD122hiMP细胞，是IL-15非依赖性的。制备CFSE标记的纯化的MP CD8+T细胞(A左列和B)或幼稚CD44loCD8+T细胞(A右列)，并转移至WT小鼠(A)或IL-15-/-小鼠(B)。然后，每日1次ip给予注射PBS、1.5μg rmIL-2、50μg S4B6 IL-2mAb或1.5μgrmIL-2加50μg IL-2mAb。在第7天通过流式细胞术分析供体细胞。数字表示分裂(CFSElo)细胞的百分率。
[0202]图5表明，针对IL-2/IL-2mAb复合物的MP CD8+细胞体内增殖不需要CD25。(A)用CFSE标记由WT B6小鼠纯化的Thy1.1标记的MP CD122hiCD44hiCD8+T细胞，并转移至正常B6(Thy1.2)小鼠，然后该小鼠每隔1天1次接受ip注射1.5μg rmIL-2加50μg S4B6IL-2mAb。在过继转移后第7天，通过流式细胞术分析LN和脾细胞在总CD3+(左侧)、供体Thy1.1+CD3+(中间)和宿主Thy1.1-CD3+细胞(右侧)上的CD25表达。(B)用CFSE标记由WT(左列)或CD25-/-(右列)小鼠纯化的Thy1.2-标记的MP CD8+T细胞，并转移至Thy1.1标记的正常B6.PL小鼠，然后每隔1天1次对该小鼠ip注射PBS、1.5μgrmIL-2、50μg S4B6IL-2mAb或1.5μg rmIL-2加50μg IL-2mAb。在过继转移后第7天，通过流式细胞术分析LN和脾细胞。数字表示分裂(CFSElo)细胞的百分率。
实施例3
T细胞亚组响应于单克隆抗体特异性的细胞因子抗体复合物的增殖
[0203]在1周内每日1次注射预混合的2∶1摩尔比率的IL-2对IL-2mAb获得近于最佳的CD122hiCD8+细胞扩增(图7A箭头，图7B)。以该比率，即便单次注射IL-2/IL-2mAb复合物也引起相当可观的CD122hiCD8+细胞扩增(图7C)。基于在T细胞转移前的多个时间注射IL-2/IL-2mAb复合物的结果，确定IL-2/IL-2mAb复合物的生物半衰期相对较短，即＜4小时(图7D)。
[0204]除了S4B6IL-2mAb之外，我们还用另一种抗小鼠IL-2mAb JES6-5H4(JES6-5)加rmIL-2(图6A)和抗人IL-2mAb MAB602加重组人IL-2(rhIL-2)(图6B)观察到等同增殖。在与IL-2复合时，这3种mAb(S4B6、JES6-5和MAB602)的每一个都在过继转移时引起CD122hiCD8+细胞显著扩增(图6A、6B)以及宿主CD122hi细胞(包括MP CD8+细胞和NK细胞这二者)的强烈选择性扩增。
[0205]令人感兴趣的是，用第三种抗小鼠IL-2mAb JES6-1A12(JES6-1)获得的结果完全不同(图6A)。IL-2/JES6-1复合物引起的CD122hi CD8+细胞增殖比单独的IL-2低，表明JES6-1阻止对IL-2的体内应答。然而，JES6-1加IL-2注射导致不同IL-2反应群(即CD25+CD4+细胞)的适度增殖(图6C、D)。这些细胞主要为Foxp3+，因此类似于T调节细胞。还用注射其它IL-2mAb观察到这些细胞扩增，尽管该作用因CD122hiCD8+细胞的巨大扩增而相形见绌(图6E)。
[0206]图6显示了不同的IL-2/IL-2mAb复合物对T细胞亚组的选择性刺激。将CFSE标记的MP CD8+T细胞转移至B6小鼠，接着(A、B)如在图3A中一样每日1次ip注射对照mAb IL-2(在A中为rmIL-2、在B中为rhIL-2)、IL-2mAb或IL-2加IL-2mAb。使用的IL-2mAb为(A)抗小鼠S4B6、JES6-5或JES6-1，或(B)抗人MAB602。(C)将MP CD8+T细胞转移至B6小鼠，接着如上每日1次注射对照mAbrmIL-2、IL-2mAb或rmIL-2加IL-2mAb。检验来自脾的供体和宿主细胞于第7天所显示的标记。(D)在最后3天给予(C)中处理的小鼠在饮用水中的BrdU。显示了为BrdU+的CD3+CD4+CD25+Foxp3hi细胞的百分率(+SD，2只小鼠/组)。(E)来自(C)中小鼠脾中的CD4+CD25+和MP CD8+细胞的总细胞计数。在条棒顶部的数字表示MP CD8+对CD4+CD25+细胞的比率。在第7天分析小鼠(A-E)。数字表示分裂(CFSElo)细胞的百分率(A、B、C左列)。
[0207]图7显示了用IL-2/IL-2mAb复合物在体内刺激MP CD8+细胞的要求。(A)用CFSE标记纯化的Thy1.1标记的MP CD8+T细胞，并转移至B6小鼠，然后该小鼠每日1次接受滴定剂量(0-1000μg)的S4B6IL-2mAb加固定浓度(1.5μg)的rmIL-2的注射。在过继转移后第7天，通过流式细胞术分析LN和脾细胞。箭头表示注射2∶1摩尔比率的IL-2对IL-2mAb(即在没任一种试剂过量的情况下)观察到的增殖。(B)对纯化的CFSE标记的MP CD8+细胞的接受者每日1次给予滴定剂量的2∶1摩尔比率的rmIL-2/S4B6IL-2mAb复合物，以1.5μg rmIL-2加8μg S4B6IL-2mAb开始，并以5倍稀释度向下滴定。在过继转移后第7天，通过流式细胞仪分析LN和脾细胞。(C)在过继转移后的不同时间点对纯化的CFSE标记的MP CD8+细胞的接受者给予ip注射1.5μg rmIL-2加8μg S4B6IL-2mAb：0，无rmIL-2加S4B6；1，在第0天rmIL-2加S4B6；2，在第0和4天rmIL-2加S4B6；3，在第0、2和4天rmIL-2加S4B6；7，每日1次注射rmIL-2加S4B6。所有小鼠都在过继转移后第7天被处死，通过流式细胞术分析LN和脾细胞。(D)在T细胞过继转移前的72小时、48小时、24小时、4小时或30分钟，或于时间点0过继细胞转移的同时，对纯化的CFSE标记的MP CD8+细胞接受者给予1次注射1.5μg rmIL-2(●)或1.5μgrmIL-2加50μg S4B6IL-2mAb(■)。在该图中的所有数据都表示为最大增殖的百分率，其中最大增殖被设定为100％，而其它值相对于该值计算。
实施例4
可结合IL-2上的不同位点的单克隆抗体
[0208]以上结果提示，S4B6和相关mAb可不同于JES6-1结合IL-2上的位点。IL-2/IL-2mAb夹心ELISA测定为该可能性提供了直接支持(图9)。如在体内一样，JES6-1在体外经CD122(IL-2Rβγ)完全阻止正常和CD25-/-MP CD8+细胞对IL-2的应答(图8A、8B)。然而，对于体内CD4+CD25+T调节细胞，JES6-1/IL-2复合物能够诱导对表达高亲和性IL-2Rαβγ的细胞(即CD25+CD3活化的幼稚CD8+细胞)弱但显著的体外刺激(图10)；这些细胞对IL-2非常敏感，并易于被CD25mAb抑制。因此，JES6-1mAb明显结合IL-2位点，该位点对与CD122相互作用至关重要，但对结合CD25(IL-2Rαβγ)不那么关键。相比之下，S4B6不能抑制(或增强)MP CD8+细胞在体内对IL-2的应答(图8A、8B)，但强烈抑制CD3活化的CD8+细胞的IL-2应答(图10)。因此，S4B6结合部分阻断与CD25结合但不阻止与CD122结合的IL-2位点。要注意的是，在不与外源IL-2复合时，JES6-1和S4B6mAb的混合物使体内T细胞增殖近于消除，对于MP CD8+细胞和T调节细胞均如此(图11)，这进一步提示S4B6和JES6-1识别IL-2上的不同位点。
[0209]图8显示了细胞因子/mAb复合物的T细胞刺激的特征。(A、B)由WT(A)或CD25-/-(B)小鼠纯化的MP CD8+细胞与滴定浓度的2∶1摩尔比率的rmIL-2加S4B6mAb(S4B6，■)或rmIL-2加JES6-1mAb(JES6-1，▲)一起培养3天；使用可溶性IL-2加不相关mAb作为对照(对照，●)。通过在最后16小时加入[3H]-胸苷检测增殖。(C)将纯化的CFSE标记的MP CD8+细胞转移至B6小鼠，然后每隔1天1次给予该小鼠ip注射对照mAb、rmIL-4、IL-4mAb(MAB404或11B11)或rmIL-4加IL-4mAb。在第7天分析小鼠。数字表示分裂(CFSElo)细胞的百分率。(D)用1000cGy辐射B6小鼠，并iv注射未分离的和T-缺失的B6BM细胞，接着每日ip注射PBS、rmIL-2、S4B6IL-2mAb或rmIL-2加S4B6IL-2mAb。在过继转移后第8天通过流式细胞术分析脾细胞。显示了未分离的BM接受者的CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞的平均细胞数(+SD，2只小鼠/组)。在注射T-缺失的BM时，没有发生T细胞数的恢复。
[0210]图9表明JES6-5和S4B6IL-2mAb结合IL-2上的相似位点，其不同于JES6-1的结合位点。(A)使用标准IL-2夹心ELISA检测滴定浓度的rmIL-2，该ELISA采用结合板的未缀合JES6-1作为捕获mAb，采用生物素化JES6-5作为检测mAb，所述滴定浓度以200pg/ml开始，并以4倍稀释度向下滴定。使用缀合链霉抗生物素蛋白的辣根过氧化物酶连同底物邻苯二胺定量检测mAb的结合，并检测450nm的吸光度(参见材料和方法)。(B)使用作为捕获mAb的JES6-1加固定浓度(200pg/ml)的rmIL-2修改(A)中的ELISA方法。然后，以滴定浓度(5倍稀释度，以100μg/ml开始)向各孔加入纯化的未缀合的竞争剂mAb，以检测这些mAb是否能阻止生物素化JES6-5检测mAb的结合。所用的竞争剂mAb为对照mAb JES6-1、JES6-5或S4B6IL-2mAb。然后如上所述检测样品。
[0211]图10显示了IL-2/IL-2mAb复合物在体外的作用。将来自B6小鼠的纯化的MP CD8+细胞(A左列)或被板结合的抗CD3mAb活化的总CD8+细胞(CD3活化的CD8+；A右列和B)与滴定浓度的2∶1摩尔比率的rmIL-2加S4B6mAb(S4B6/IL-2，中间列)或rmlL-2加JES6-1mAb(JES6-1/IL-2，下方)一起培养3天；可溶性IL-2加不相关mAb用作对照(IL-2，顶部)。还将固定浓度(10μg/ml)的不相关对照mAb(+对照，●)、CD25mAb(+CD25，■)或CD122mAb(+CD122，▲)加入各孔。(B)将如在(A)中制备的CD3活化的CD8+细胞与滴定浓度的2∶1摩尔比率的rmIL-2加S4B6mAb(S4B6，■)或rmIL-2加JES6-1mAb(JES6-1，▲)一起培养3天；可溶性IL-2加不相关mAb用作对照(对照，●)。增殖通过在最后16小时加入[3H]-胸苷检测。
[0212]图11表明，注射S4B6和JES6-1IL-2mAb的混合物阻止MP CD8+细胞和CD4+CD25+细胞这二者的增殖。(A)用CFSE标记来自WT B6小鼠的纯化的Thy1.1标记的MP CD122hiCD44hi CD8+T细胞，并转移至正常B6(Thy1.2)小鼠，然后对该小鼠每天1次ip注射PBS、50μg S4B6IL-2mAb、50μg JES6-1IL-2mAb或50μg S4B6IL-2mAb连同50μg JES6-1IL-2mAb的组合。在过继转移后第7天，通过流式细胞术分析LN和脾细胞。数字表示分裂(CFSElo)细胞的百分率。(B)在7天后处死如在(A)中处理的小鼠，并通过流式细胞术(左侧)分析和定量(右侧)(内源)CD4+CD25+细胞。数字表示象限中的CD4+CD25+细胞的百分率。右侧的数据是指为CD25hi的CD4+细胞的百分率。
实施例5
IL-2加F(ab′)2单克隆抗体片段的复合物的刺激性远低于IL-2加完整单克隆抗体的复合物
[0213]还不清楚为何IL-2/IL-2mAb复合物在体内如此有效。先前有报道，与抗体结合可增加IL-2还有IL-4在体内的半衰期，但除了诱导NK细胞介导的肿瘤排斥适度增加以外，没有提到IL-2/IL-2mAb复合物对T细胞的作用。Sato等，Biotherapy 6：225，1993；Finkelman等，J Immunol 151：1235，1993；Courtney等，Immunopharmacology 28：223，1994。还有报道指除去抗IL-2mAb的Fc部分不改变IL-2的增加的半衰期，不降低增加的NK细胞介导的抗肿瘤活性。Sato等，BiolPharm Bull 17：1101，1994。相比之下，对于本文报告的CD122hi MPCD8+细胞的显著扩增，F(ab′)2mAb片段所具刺激作用远不如完整mAb(图12)，提示该复合物经mAb Fc区结合细胞。该表现可能异乎寻常地有效，并解释了为什么IL-2/IL-2mAb复合物在体内远比在体外更具刺激性。
[0214]图12表明，IL-2mAb的F(ab′)2片段远没有完整IL-2mAb有效。(A)用CFSE标记来自B6小鼠的纯化的Thy1.1-标记的MPCD122hiCD44hiCD8+T细胞，并转移至正常B6(Thy1.2)小鼠，然后该小鼠每隔1天接受1次ip注射PBS、1.5μg rmIL-2、50μg完整S4B6IL-2mAb、1.5μg rmIL-2加50μg完整S4B6 IL-2mAb、50μg F(ab′)2S4B6IL-2mAb或1.5μg rmIL-2加50μg F(ab′)2S4B6IL-2mAb。7天后，通过流式细胞术分析LN和脾细胞。数字表示分裂(CFSElo)细胞的百分率。(B)比较F(ab′)2S4B6IL-2mAb和完整S4B6IL-2mAb在体外抑制rmIL-2驱动的IL-2-敏感细胞系CTLL-2增殖的能力。在固定浓度(100ng/ml)的rmIL-2和滴定剂量的F(ab′)2S4B6IL-2mAb(■)或完整S4B6IL-2mAb(●)存在下，将CTLL-2细胞以2×104个细胞/孔培养48小时。显示了IL-2mAb结合位点对rmIL-2分子的比率。就IL-2结合位点而言，1μg F(ab′)2S4B6IL-2mAb(MW约100kD)等于1.5μg完整S4B6IL-2mAb(MW约150kD)。在培养阶段的最后24小时加入[3H]-胸苷检测增殖。
[0215]IL-2/IL-2mAb复合物的刺激作用还适用于IL-4和IL-4mAb的复合物(图8C)以及IL-7和IL-7mAb的复合物(图16)。因此，在注射这些细胞因子/mAb复合物后的CD8+细胞增殖远比用单独的细胞因子或mAb高。
[0216]对于S4B6和相关抗体，注射IL-2/IL-2mAb复合物在临床上有可能用于肿瘤免疫疗法和在骨髓(BM)移植后扩增T细胞数。为支持此后一观点，给予辐射小鼠未分离的BM细胞，然后IL-2/S4B6注射过程表明成熟T细胞(尤其是CD8+细胞)数早在转移后1周就快速恢复(图8D)。相反，IL-2和JES6-1或相关mAb扩增CD4+T调节细胞可用于治疗自身免疫病。
实施例6
IL-2/IL-2mAb复合物显示出明显高于共价连接的IL-2-Ab重组融合蛋白的生物活性
[0217]在90年代早期介绍了细胞因子/mAb复合物，此后它们仅受到短暂关注，推测是因为伴随出现由共价连接Ab的细胞因子组成的重组融合蛋白(Davis和Gillies，Cancer Immunol Immunother 52：297-308，2003；Cruz等，Clin Exp Med 4：57-64，2004)。因为细胞因子/mAb复合物的生物活性增加很大程度上被认为反映出细胞因子半衰期增加，所以重组融合蛋白因为其生产的便利性和通用性而受益。因此构建融合蛋白，由此将IL-2、GM-CSF或IL-12与抗半抗原mAb共价连接，以促进体内寿命延长，或与和肿瘤抗原反应的mAb共价连接，由此将细胞因子导向肿瘤部位(Davis和Gillies，Cancer ImmunolImmunother 52：297-308，2003；Cruz等，Clin Exp Med 4：57-64，2004；Lode等，Pharmacol Ther 80：277-292，1998)。在过去的13年中产生并研究了至少2种Ab-IL-2融合蛋白(Davis和Gillies，Cancer ImmunolImmunother 52：297-308，2003；Cruz等，Clin Exp Med 4：57-64，2004；Lode等，Pharmacol Ther 80：277-292，1998)。在小鼠中的研究表明，这些融合蛋白显示出明显好于单独的Ab或细胞因子或没有共价连接的混合物的杀肿瘤活性(Davis和Gillies，Cancer Immunol Immunotger52：297-308，2003；Cruz等，Clin Exp Med 4：57-64，2004；Lode等，Pharmacol Ther 80：277-292，1998)。然而，除了表明杀肿瘤活性需要CD8细胞和NK细胞以外，融合蛋白对T细胞亚组的体内直接作用很大程度上被忽略了。
[0218]尽管人们可能预期在体内条件下融合蛋白的生物活性与细胞因子/mAb复合物的生物活性相同，但还得直接对比这些构建体。为此，我们最近由Sherie Morrison博士(UCLA，CA)处获得了Ab-IL-2融合蛋白，用于和IL-2/mAb复合物比较。称为抗DNS-IgG3-IL-2的重组融合蛋白由共价连接嵌合Ab的Fc末端的人IL-2组成，所述嵌合Ab含有人IgG3恒定区和对半抗原丹酰(5-二甲基氨基萘1-磺酰氯，DNS)特异性的小鼠可变区(Harvill等，J Immunol 157：3165-3170，1996)。因为在小鼠中不存在DNS，所以该融合蛋白应类似于细胞因子/mAb复合物系统保持。检测抗DNS-IgG3-IL-2融合蛋白在小鼠中的体内半衰期为约7小时(Harvill等，J Immunol 157：3165-3170，1996)，这类似于IL-2/mAb复合物的半衰期(Sato等，Biotherapy 6：225-231，1993)，稍高于另一Ab-IL-2融合蛋白ch14.18-IL-2的半衰期(Kendra等，Cancer ImmunolImmunother 48：219-229，1999)。在体外条件下，所有这些试剂都显示出类似于游离rIL-2的IL-2活性(Gillies等，ProcNatl Acad Sci USA 89：1428-32；Harvill和Morrison，Mol Immunol33：1007-1014，1996)。
[0219]为直接比较抗DNS-IgG3-IL-2融合蛋白与IL-2/IL-2mAb复合物的生物活性，由B6.PL小鼠纯化CFSE标记的MP CD8细胞，注射入未受辐射的B6小鼠组别中，然后对该小鼠注射PBS、rhIL-2、融合蛋白或等摩尔剂量的复合物。因为融合蛋白用人IL-2构建，所以使rhIL-2结合抗人IL-2mAb(MAB602)产生复合物，我们表明该复合物对诱导小鼠MP CD8细胞增殖非常有效(图6B)。引人注目的是，和由对照rhIL-2/MAB602复合物诱导的有效的供体细胞增殖不同，显示出预期IL-2活性的抗DNS-IgG3-IL-2融合蛋白在促进供体细胞增殖方面有效性极低；实际上融合蛋白没有游离rhIL-2好(图13)。该发现强有力地表明，IL-2/mAb复合物表现出显著高于类似融合蛋白的体内生物活性。
[0220]图13表明，IL-2/mAb复合物明显比Ab-IL-2融合蛋白更有效。将CFSE标记的Thy-1.1记忆表型(MP)CD8细胞转移至正常B6小鼠中，然后每隔1天1次注射PBS、1μg rhIL-2、1μg rhIL-2+5μgMAB602或等摩尔的(约10μg)抗DNS-IgG3-IL-2融合蛋白，然后在开始实验后7天分析宿主LN中的供体CD8细胞的CFSE谱(左侧)。通过使CTLL-2细胞与等摩尔滴定浓度的rhIL-2或抗DNS-IgG3-IL-2融合蛋白温育检测IL-2活性(右侧)。
实施例7
IL-7/IL-7单克隆抗体复合物扩增幼稚T细胞的能力
[0221]IL-7是小的(MW：约25Kd)I型细胞因子，与IL-2、IL-4、IL-9、IL-15和IL-21属于相同细胞因子家族(Fry和Mackall，J Immunol174：6571-76，2005；Sugamura等，Annu Rev Immunol 14：179-205，1996)。在1988年最初发现了IL-7支持B细胞祖先生长的能力，该基因由骨髓(BM)基质细胞系克隆(Namen等，Nature 333：571-73，1988；Namen等，J Exp Med 167：988-1002，1988)。随后认识到IL-7的嗜T细胞功能，这始于以下发现：IL-7在胸腺中促进αβ和γδTCR亚组的T细胞祖先的生长和分化(Conlon等，Blood 74：1368-73，1989；Watanbe等，IntImmunol 3：1067-75，1991)，以及用产生的IL-7-和IL-7受体(R)-缺陷型小鼠证实了这些作用(Peschon等，J Exp Med 180：1955-60，1994；vonFreeden-Jeffry等，J Exp Med 181：1519-26，1995)。在这些突变小鼠中对B和T细胞发育的严重损害证实了IL-7在B和T淋巴细胞生成中的非多余性作用。尽管如此，不同物种之间IL-7依赖性的差异明显，因为具有IL-7R缺陷的免疫缺陷人类患者严重缺乏T细胞，但具有正常B细胞数(vonFreeden-Jeffry等，J Immunol 161：5673-5680，1998；Puel等，Nat Genet 20：394-97，1998；vonFreeden-Jeffry等，Immunity 7：147-154，1997；Schluns等，Nature Immunol 1：426-32，2000；Tan等，Proc Natl Acad Sci USA 98：8732-37，2001)。
[0222]成熟T细胞池的总体大小和组成受稳态机制调节。Surh等，Sem.Immunol.17：183，2005；Schluns等，Nat Rev Immunol.3：269，2003；Jameson Nat Rev Immunol.2：547，2002。恒定数量的幼稚T细胞的存活需要由与自我MHC/肽配体和IL-7接触获得信号，而由与IL-7和IL-15接触获得的信号是恒定数量的记忆T细胞存活所必需的。Surh等，Sem.Immunol 17：183，2005；Schluns等，Nat Rev Immunol.3：269，2003；Jameson Nat Rev Immunol.2：547，2002。调节T细胞池的整体大小的稳态机制的存在由以下发现显而易见：T细胞具有响应于T细胞(T)缺失而进行自发“稳态”扩增的能力。Ernst等，Immunity 11：173，1999；Goldrath等，Immunity 11：183，1999。而且，T细胞的稳态扩增依赖于IL-7和IL-15。因此，在没有IL-7的情况下，幼稚T细胞的稳态扩增不能发生，在没有IL-7和IL-15的情况下，记忆T细胞不能进行稳态扩增。Schluns等，Nat Immunol 1：426，2000；Tan等，Proc NatlAcad Sci 98：8732，2001；Tan等，J Exp Med 195：1523，2002；Goldrath等，J Exp Med 195：1515，2002。这些发现共同导致以下的现行范式：组成型产生的IL-7和IL-15基础水平支持有限数量的T细胞存活，在T细胞缺失时，IL-7和IL-15的基础浓度由无法利用增加，并驱动余下的T细胞进行稳态扩增。Surh等，Sem.Immunol.17：183，2005。应当强调的是，幼稚T细胞的存活和稳态扩增几乎专一地依赖于IL-7，而记忆T细胞的存活和稳态增殖可得到IL-7或IL-15支持，但最好得到IL-7和IL-15这二者的支持。Surh等，Sem.Immunol.17：183，2005；Schluns等，Nat Rev Immunol.3：269，2003；Jameson Nat Rev Immunol.2：547，2002。
[0223]为在体内有效，必须大量注射IL-7。例如，以足以使血液水平升高10-100倍的量注射IL-7达3周使人T细胞数增加仅3-7倍[Rosenberg，2006#1889]。因此，大部分给予的IL-7可能是因为短半衰期或不能达到淋巴组织中的适合部位而致生物活性有限。关于前者，几年前已表明，包括IL-7在内的若干γc细胞因子的半衰期可通过结合特异性抗细胞因子mAb而增加[Sato，1993#1805；Courtney，1994#1895；Finkelman，1993#1775；Valenzona，1998#1896；Klein，1995#1876]。然而，对于IL-2，我们最近已表明，与IL-2mAb的结合对体内的活性细胞因子具有的作用远比仅由细胞因子半衰期增加贡献的作用显著[Boyman，2006#1835；Kamimura，2006#1840]。在该报告中，我们表明，IL-7/IL-7mAb复合物在激发前B细胞和前T细胞扩增方面远优于游离IL-7。这些复合物还强烈作用于突变CD4+和CD8+T细胞，并使幼稚和记忆T细胞在正常的T细胞填满条件下均经历有效的稳态扩增。
[0224]IL-7/IL-7mAb复合物可增强或恢复胸腺生成作用。注射rhIL-7/IL-7mAb(M25)复合物的B6小鼠胸腺具有比注射PBS的B6小鼠高15-20％的细胞密度，大部分来自CD4/CD8双阳性(DP)细胞数的升高(图14)。为更好地评价对胸腺生成作用的影响，对具有非常小的胸腺(10、11)的IL-7-/-小鼠组别注射rhIL-7/M25复合物、单独的rhIL-7或PBS。间隔3天两次注射1.5μg rhIL-7加15μg M25使IL-7-/-小鼠的胸腺极大增大，至第7天时显示细胞密度增加50-100倍；相反，注射单独的1.5μg rhIL-7仅诱导细胞数相对较小地增加2-3倍(图14)。分析胸腺细胞的CD4-CD8-(DN)群揭示，注射rhIL-7/M25复合物诱导在IL-7-/-小鼠中严重缺失的CD25+CD44-DN3和CD25-CD44-DN4细胞选择性出现；注射单独的1.5μg rhIL-7没有恢复这些细胞(图14A)。由rhIL-7/M25复合物诱导的胸腺生成作用恢复是短暂的，因为注射的IL-7-/-小鼠的胸腺在注射该复合物后至第3周时回到细胞减少状态(图14B，左侧)。应当指出的是，与对胸腺的显著影响相反，注射rhIL-7/M25复合物仅使IL-7-/-小鼠的脾细胞密度增加2倍。
[0225]为评价rhIL-7/M25复合物的相对生物活性，在7天内给IL-7-/-小鼠注射2次中等剂量(1+5μg)的rhIL-7/M25复合物和滴定剂量(1、10和100μg)的游离rhIL-7。引人注目的发现是，由1μg结合M25的rhIL-7诱导的胸腺增大等同于通过注射100μg游离rhIL-7激发的胸腺大小(图14B，右侧)。
[0226]图15-18提供了IL-7/IL-7mAb复合物的生物活性相对于IL-7增加的进一步的证据。图15表明，IL-7/IL-7mAb(M25)复合物诱导幼稚T细胞的稳态增殖。为评价IL-7/M25复合物诱导成熟T细胞扩增的能力，将CFSE标记的CD45同类系B6.CD45.1LN细胞过继转移至未受辐射的正常B6小鼠中。然后用rhIL-7/M25复合物(1.5+7.5μg，7天内3次)注射这些宿主，分析供体细胞的命运；对照宿主仅接受PBS、rhIL-7或M25。要指出的是，尽管供体B和T细胞在对照宿主中不增殖，但注射rhIL-7/M25复合物诱导大部分供体CD8+细胞增殖4-5轮，约一半的供体CD4+细胞增殖1轮，供体B220+B细胞几乎没有增殖(图15A)。鉴于缓慢的增殖步伐，即使在正常T细胞填满宿主中，rhIL-7/M25复合物也可能响应于自我MHC/肽配体而引起供体T细胞的“稳态”增殖。与该观点相一致，在没有MHC I类分子的情况下(即在TAP-1-/-宿主中)，rhIL-7/M25诱导的两个测试的幼稚TCR转基因CD8+细胞系(P14和OT-1)的增殖和幼稚CD8+细胞的增殖很大程度上被废止。此外，注射rhIL-7/M25复合物使幼稚T细胞在不支持供体幼稚T细胞稳态增殖的IL-7-/-宿主中进行稳态增殖(图15B)。在此，对照注射等剂量的单独rhIL-7不能激发供体T细胞增殖(图15B)。最后，rhIL-7/M25通过直接增大IL-7R诱导供体T细胞增殖，因为在抗IL-7RαmAb A7R34与该复合物共注射时增殖被完全废止。
[0227]关于内源IL-7在淋巴细胞减少的宿主中的稳态增殖(12、13)，注射rhIL-7/M25复合物使CD4+细胞增殖远比CD8+细胞弱。因为小鼠(m)IL-7R以比rmIL-7稍低的亲和力结合rhIL-7，所以我们检验rmIL-7/M25复合物对CD4+细胞的作用。要指出的是，rmIL-7/M25复合物显示出比rhIL-7/M25复合物高2-3倍的生物活性，并显著诱导供体CD4+和CD8+细胞亚组在正常B6宿主中有效增殖(图15C)。当以较高剂量注射rhIL-7/M25复合物时，还用这些复合物观察到CD4+和CD8+细胞亚组的增殖。扩增也适用于宿主T细胞，因为在这些宿主中幼稚T细胞池的大小增加约3倍。如前报道，在注射IL-7+M25复合物的小鼠的脾和骨髓中观察到B细胞前体大量扩增。Finkelman等，JImmunol 151：1235，1993。
[0228]图16表明，rhIL-7+M25(IL-7/mAb)复合物可驱动幼稚和记忆T细胞这二者的扩增。在扩增记忆(CD44hi)CD8细胞方面，IL-7/mAb复合物几乎与IL-2/mAb复合物等效，但在诱导幼稚(CD44lo)CD8细胞扩增方面，IL-7/mAb远比IL-2/mAb有效。还发现IL-7/mAb复合物诱导幼稚和记忆CD4细胞的稳态增殖，但速率低于CD8细胞(图15C)。在实验方法中，将CFSE标记的B6.Thy-1.1幼稚(CD44lo)和纯化的记忆(CD44hi)CD8细胞注射入正常B6小鼠中，然后每隔1天1次对宿主注射PBS、IL-7+M25(1.5+15μg)或IL-2+S4B6(1.5+15μg)。在细胞注射后7天，在针对Thy-1.1和CD8染色宿主脾细胞后通过流式细胞术分析供体T细胞。显示了门控供体CD8细胞的CFSE谱。由LN获得类似数据。
[0229]图17表明，抗IL-7mAb M25的Fc部分对其与IL-7复合时的增强作用是必需的。除去M25的Fc部分破坏了IL-7+M25复合物诱导幼稚T细胞扩增的大部分能力。在实验方法中，将CFSE标记的B6.Thy-1.1LN细胞注射入正常B6小鼠中，然后每隔1天1次对宿主注射PBS、IL-7+M25(1.5+15μg/注射)或IL-7+M25Fab(1.5+15μg/注射)。在细胞注射后7天，在针对Thy-1.1、CD4和CD8染色宿主LN细胞后通过流式细胞术分析供体T细胞。显示了门控供体CD4和CD8细胞的CFSE谱。由脾获得类似数据。
[0230]图18显示了IL-7/mAb复合物恢复随着衰老而明显的幼稚T细胞稳态缺陷的能力。在年轻个体中的成熟T细胞池主要由幼稚细胞组成。衰老没有显著改变总数和CD4+对CD8+细胞的比率，但与在幼稚细胞中具有补偿性减少的记忆细胞的比例逐渐增加相关。HodesImmunol.Rev.160：5，1997；Miller Vaccine 18：1654，2000；Linton等，Nat.Immunol.5：133，2004。尽管还不知道幼稚和记忆细胞表现的年龄相关性改变的确切原因，但最简单的想法是，这是幼稚细胞的胸腺产量降低连同持续一生的、抗原驱动的幼稚细胞向记忆细胞的转变的反映。然而，该观点可能过于简单化，因为可能有多种机制促使幼稚T细胞随衰老丧失。一个可能的促成因素可为缺少调节成熟T细胞池的存活和整体大小的稳态机制。我们最近已发现了衰老与支持幼稚T细胞稳态的先天能力严重衰退相关的证据。该缺陷似乎是IL-7相关性的，但其不是缘于IL-7产量的下降。相反，IL-7向T细胞的提呈似乎存在问题。尽管该缺陷的确切原因还有待研究，但我们描述了逆转年龄诱导的支持幼稚T细胞稳态的能力衰退的新方法。
[0231]图18表明，外源游离IL-7是无效力的，但IL-7/mAb复合物可有效恢复老龄小鼠的稳态缺陷。在图18A中显示了衰老与支持幼稚T细胞稳态的能力缺陷相关这一事实。在此，业已表明，淋巴细胞减少宿主支持稳态扩增的能力在约1岁时开始衰落，并在16月龄时严重受损。为确定是否可以修复老年小鼠无力支持幼稚T细胞的稳态扩增，检验注射游离IL-7和IL-7/mAb复合物的作用。如在图18B中所示，注射IL-7/mAb复合物能够完全修复老年宿主的缺陷，而注射游离IL-7无效。
[0232]图18表明，衰老与支持幼稚T细胞稳态增殖的能力的严重衰退有关，该能力可使用IL-7连同抗IL-7mAb复合物恢复。(A)支持幼稚T细胞稳态的能力随年龄衰落。辐射(600cGy)多个年龄(1.5-22个月)的B6小鼠组，并注射1×106个CFSE标记的年轻(2个月)B6.Thy1.1小鼠的LN细胞，7天后分析供体T细胞的CFSE谱。显示了宿主LN的结果；由宿主脾获得类似数据。每组均由2-3只小鼠组成。(B)使用IL-7-mAb复合物有效恢复稳态缺陷。FACS分拣的幼稚(CD44lo)B6.Thy-1.1T细胞被CFSE标记，并注射入辐射过的年轻(2个月)和老年(16个月)B6小鼠中。每隔1天1次给小鼠注射rhIL-7或rhIL-7加M25(抗hIL-7mAb)复合物，在细胞注射后第7天分析供体T细胞的CFSE谱。每只小鼠注射1.5μg剂量的rhIL-7；将相同剂量的rhIL-7与15μg M25温育至少30分钟，并作为rhIL-7加M25复合物一起注射。显示了每个小组中采用2-3只小鼠的3个独立实验的代表性CFSE谱。
实施例8
通过结合可溶性IL-15Rα将IL-15转变为超激动剂
[0233]IL-15在体内通常作为结合IL-15Rα的细胞缔合性细胞因子被提呈。我们在此表明，可溶性IL-15的生物活性在与重组可溶性IL-15Rα相互作用后被大幅改善；在注射后，可溶性IL-15/IL-15Rα复合物快速诱导记忆表型CD8+细胞和NK细胞的强且选择性的扩增。这些发现暗示，IL-15Rα与IL-15结合可产生构象变化，该变化加强T细胞上的βγc受体的IL-15识别。IL-15Rα结合的增强作用可以解释为什么IL-15一般用作细胞缔合性细胞因子。值得注意的是，采用可溶性细胞因子IL-2的结果相当不同；因此，与可溶性IL-2Rα结合显著抑制IL-2功能。
[0234]在小鼠的某些细胞，即记忆表型(MP)CD8+T细胞和NK细胞，对IL-15高度敏感(Kennedy等，J Exp Med 191：771-80，2000；Judge等，J Exp.Med 196：935-46，2002；Fehniger和Caligiuri，Blood97：14-32，2001；Becker等，J Exp Med 195：1541-48，2002；Zhang等，Immunity 8：591-99，1998；Waldmann，T.A.，J Clin Immunol 22：51-56，2002；Zeng等，J Exp Med 201：139-48，2005；Van Belle和Grooten，ArchImmunol Ther Exp(Warz)53：115-26，2005；Schluns等，Int J BiochemCell Biol 37：1567-71，2005)。MP CD8+细胞显示出高水平的CD44，和NK细胞一样，也显示出CD122(IL-2Rβ)高表达，CD122(IL-2Rβ)是IL-15和IL-2这二者的受体的组分(Waldmann，T.A.，J Clin Immunol22：51-56，2002)。对于静止细胞，对这二种细胞因子的响应性受双链受体βγc的控制，βγc由β链(CD 122)加通用的γ链γc组成，γc控制胞内信号转导。
[0235]IL-15通常不以可溶性形式分泌(Van Belle和Grooten，ArchImmunol Ther Exp(Warz)53：115-26，2005；Schluns等，Int J BiochemCell Biol 37：1567-71，2005；Nguyen等，J Immunol 169：4279-87，2002)，但保持在细胞表面上，结合独特的受体IL-15Rα，尤其是树突细胞(DC)上的受体(Dubois等，Immunity 17：597-47，2002；Burkett等，J Exp Med200：825-34，2004；Burkett等，Proc Natl Acad Sci USA 100：4724-29，2003；Schluns等，Blood 103：988-994，2004；Zaft等，J Immunol175：6428-35，2005；Sandau等，J Immunol 173：6537-6541，2004)。然后，结合细胞的IL-15被反向提呈给T细胞和NK细胞，并由这些细胞上的βγc受体识别；这些识别保持细胞存活和间歇性增殖。
[0236]IL-15Rα在提呈内源IL-15方面起强制性作用。因此，和IL-15-/-小鼠(1)一样，IL-15Rα-/-小鼠没有CD122hi CD8+细胞和NK细胞(Lodolce等，Immunity 9：669-76，1998)，推测是因为在IL-15R-/-小鼠中合成的IL-15不能离开胞质。尽管如此，IL-2Rβγc+细胞可在没有IL-15Rα的情况下响应于可溶性重组形式的IL-15增殖(Lodolce等，JExp Med 194：1187-94，2001)。而且，在某些条件下，IL-15Rα可为抑制性的。因此，据报告用可溶性重组形式的IL-15Rα注射小鼠抑制NK细胞增殖(Nguyen等，J Immunol 169：4279-87，2002)，以及在体内抑制某些T依赖性免疫应答(Ruckert等，Eur J Immunol 33：3493-3503，2003；Ruckert等，J Immunol 174：5507-15，2005；Wei等，J Immunol 167：577-82，2001；Ruchatz等，J Immunol 160：5654-5660，1998)，在体外加入sIL-15Rα可阻止细胞系对IL-15的响应(Ruckert等，J Immunol174：5507-15，2005；Wei等，J Immunol 167：577-82，2001；Ruchatz等，J Immunol 160：5654-5660，1998；Budagian等，J Biol Chem 279：40368-75，2004；Mortier等，J Immunol 173：1681-1688，2004；Eisenman等，Cytokine 20：121-29，2002)。不管这些发现，有其它报告指sIL-15Rα(Giron-Michel等，Blood 106：2302-10，2005)还有IL-15Rα的可溶性sushi结构域(Mortier等，J Biol Chem，2005，纸质版前的电子版)可增强人细胞系的IL-15应答。
实施例9
IL-15/IL-15Rα复合物在体外的刺激作用
[0237]为检验可溶性IL-15的刺激功能是否被结合sIL-15Rα改变，将纯化的MP CD44hiCD122hiCD8+细胞与小鼠IL-15±共价连接人IgG1的Fc部分的小鼠sIL-15Rα(sIL-15Rα-Fc)在体外培养。对于单独的IL-15，半最大应答需要约30ng/ml，＜10ng/ml的应答可忽略(图19A、19B)。在此，值得注意的发现是，据CFSE稀释(图19A)或[3H]-胸苷掺入(图19B)检测，补充低浓度IL-15(例如5ng/ml)和sIL-15Rα-Fc导致MP CD8+细胞的强增殖应答。采用单独的sIL-15Rα-Fc没有发生增殖(图19B)，加入sIL-15Rα-Fc不能改变MP CD8+细胞对不同细胞因子IL-2的响应(未显示数据)。对于IL-15，我们没能发现sIL-15Rα-Fc通过在体外增强IL-15的半衰期而起作用的证据(图25)。
[0238]由于细胞因子的浓度有限，加入sIL-15Rα-Fc一般将IL-15应答改善6-9倍。加入sIL-15Rα-Fc还相当程度地改善CD122hiNK细胞的IL-15应答(图19C)，但对表达中间水平的CD122的MP(CD44hi)CD4+细胞相对无效(图19C)。出乎意料的是，sIL-15Rα-Fc加IL-15导致典型的幼稚CD44loCD122loCD8+细胞显著增殖，尽管仅采用了高浓度IL-15(图19C)。
[0239]对于MP CD8+细胞，对单独的可溶性IL-15和IL-15加sIL-15Rα-Fc的响应仅通过βγc受体介导。因此，响应通过加入CD122mAb消除(图19D)，采用来自IL-15Rα-/-小鼠的MP CD8+细胞与正常MP CD8+细胞一样高(图19E)。
[0240]作为二聚化分子，sIL-15Rα-Fc可通过提呈交联形式的该细胞因子增强IL-15活性。然而，酶切割的sIL-15Rα-Fc单体片段在增大IL-15响应方面不如二聚化分子有效(图19A、19B)。实际上，在限制条件下，采用受体单体的响应略微高于采用Fc二聚体(图19B)。还不明了为何受体单体比二聚体更有效，但就空间理由而言单体/IL-15复合物可更有效地结合βγc受体。
[0241]图19A、19B、19C、19D和19E表明，可溶性IL-15Rα增大IL-15介导的体外淋巴细胞增殖。(A)用CFSE标记纯化的MP(CD44lo)CD8+T细胞，并以5×104个细胞/孔与5ng/mlIL-15培养。如所示，将1μg/ml sIL-15Rα-Fc(二聚体)或sIL-15Rα(单体)加入培养物。在第4天评价CFSE稀释度。显示了代表性数据。(B)将纯化的MP CD8+T细胞与滴定量的IL-15加固定浓度的可溶性受体(1μg/ml)(顶部)或滴定量的可溶性受体加固定浓度的IL-15(10ng/ml)(底部)培养。数据显示了在第3天时一式三份培养物的[3H]-胸苷掺入的平均水平(±SD)。(C)如所示将纯化的幼稚(CD44lo)CD8+T细胞、MP CD8+T细胞、NK细胞或MP CD4+T细胞与IL-15培养。以1μg/ml加入可溶性IL-15Rα-Fc。在第3天评价CFSE稀释度。(D)如在(B)中一样，只是如所示加入10μg/ml的抗CD122抗体。(E)将来自野生型Ly5.2和IL-15Rα-/-/Ly5.1小鼠的MP CD8+T细胞混合在一起，用CFSE标记，并如所示培养。在第3天检测Ly5.1-(野生型)和Ly5.1+(IL-15Rα-/-)细胞上的CFSE稀释度。
[0242]以上数据是指小鼠IL-15和小鼠可溶性IL-15Rα。相当相似的数据适用于人IL-15/IL-15Rα。因此，通过加入人sIL-15Rα-Fc相当程度地增强小鼠MP CD8+细胞针对人或小鼠IL-15的应答(图26)。加入人IL-15Rα单体甚至更有效。注意，对于小鼠IL-2Rβγc应答，人IL-15相当程度上比小鼠IL-15弱(Eisenman等，Cykotine 20：121-29，2002)。
[0243]图25A和25B显示出体外IL-15存活。(A)将纯化的CFSE标记的MP CD8+T细胞加入含5ng/ml(顶部，灰色)、100ng/ml(底部)单独的IL-15或5ng/ml IL-15加1μg/ml sIL-15Rα-Fc(顶部，实线)的培养物中。这些培养物或者新鲜制备(新鲜)，或者在加入T细胞前于37℃放置48小时(48小时预培养物)。(B)如对(A)一样，只是T细胞与取自“48小时预培养物”的上清液(上清液)和已排空上清液而没有洗涤的后述培养物(孔底部)培养。解释：实验表明，IL-15的生物活性(单独培养的)在于37℃培养48小时的过程中没有显著衰落，因此使sIL-15Rα-Fc不可能仅通过延长IL-15的半衰期起作用。此外，转移至排空孔(孔底部)的细胞没有增殖提示，增强可溶性受体的活性没有反映经受体结合孔的塑料底的IL-15的交联提呈。
[0244]图26表明，人sIL-15Rα-Fc增强小鼠MP CD8+细胞对小鼠和人IL-15的应答。将5×104个细胞/孔的CFSE标记的纯化的MP CD8+T细胞与100ng/ml人IL-15或5ng/ml的鼠IL-15一起培养。如所示，将1μg/ml的人sIL-15Rα-Fc加入培养物。在培养3天后评价CFSE稀释度。注意，与CTLL(其表达IL-15Rα加βγc)正相反，小鼠MP CD8+细胞对小鼠IL-15的应答比人IL-15更好。Eisenman，J.等，Cytokine 20：121-129，2002。
实施例10
体内应答
[0245]为证实先前的发现(Judge等，J Exp.Med 196：935-46，2002；Zhang等，Immunity 8：591-99，1998)，在iv注射CFSE标记的MP CD8+细胞后用IL-15ip注射小鼠使约50％的供体细胞分裂1-2次(图20A)。然而，在共注射sIL-15Rα-Fc时，实际上所有供体细胞都分裂，＞95％的细胞分裂3次以上(相比之下，单独注射的IL-15为＜5％)；相反，注射单独的sIL-15Rα-Fc对增殖没有影响。sIL-15Rα-Fc增强MP CD8+细胞对IL-15应答的能力还适用于抗原特异性记忆CD8+细胞，即抗原初免的P14TCR转基因CD8+细胞(图20B，顶部)。MP CD4+细胞的IL-15应答也有增强(图20B，底部)。
[0246]对于MP CD8+细胞，IL-15滴定实验表明，当有限剂量的IL-15与sIL-15Rα-Fc共注射时，对IL-15的体内应答增加约50倍(图20C、20D)。因为类似的数据适用于转移至IL-15Rα-/-宿主的T细胞，所以不需要内源IL-15Rα(图27)。
[0247]以上数据适用于CFSE标记的供体细胞。对于宿主细胞，注射IL-15或单独的sIL-15Rα-Fc对细胞数几乎没有影响。相比之下，两次注射IL-15加sIL-15Rα-Fc至初始注射后第3天使宿主MP CD8+细胞和NK细胞总数显著增加，脾明显增大(图21A、21B)。同样，对于注射IL-15加sIL-15Rα-Fc，根据BrdU掺入检测的增殖远高于单独的IL-15(图21C)。
[0248]IL-15Rα-/-小鼠没有CD122hiMPCD8+细胞和NK细胞(Lodolce等，Immunity 9：669-76，1998)，推测是因为没有IL-15Rα排除了内源IL-15的提呈。如在图21D中所示，用IL-15和sIL-15Rα-Fc的混合物注射IL-15Rα-/-小鼠快速恢复宿主NK1.1+DX5+NK细胞和CD122hi MP CD8+细胞数；单独的IL-15在所用剂量无效。
[0249]以上的体内作用适用于与二聚化IL-15Rα-Fc复合的IL-15。为确定是否需要Fc组分，在体内条件下检验用没有Fc的单体IL-15Rα产生的IL-15复合物诱导MP CD8+细胞增殖的能力。引人注目的是，尽管在体外条件下单体IL-15/sIL-15Rα复合物诱导的MP CD8+细胞增殖高于二聚化IL-15/IL-15Rα-Fc复合物(图19A)，但在体内条件下的情况相反(图22)。因此，与二聚化IL-15/sIL-15Rα-Fc复合物的有效活性相反，缺失Fc部分的单体IL-15/sIL-15Rα复合物表现出仅稍好于游离IL-15的体内活性(图22)。因此，看起来受体的Fc部分对该复合物的体内活性很重要。
[0250]图20A、20B、20C和20D表明，可溶性IL-15Rα在体内增大IL-15介导的供体淋巴细胞增殖。(A)将CFSE标记的T细胞iv转移至C57BL/6(B6)接受者中。在转移后第1和2天，给予接受者ip注射PBS、单独的sIL-15Rα-Fc(7μg)、单独的IL-15(1.5μg)或sIL-15Rα-Fc加IL-15(分别为7μg和1.5μg，其代表1∶2摩尔比率)。在第4天检测脾中供体细胞的CFSE稀释度。显示了门控MP CD8+细胞的代表性数据。(B)如在(A)中一样，只是转移的细胞来自LCMV-免疫小鼠(顶部)和正常小鼠(底部)。(C)将CFSE标记的MP CD8+T细胞转移至正常B6宿主；1天后，用所示剂量的IL-15与或不与sIL-15Rα-Fc注射宿主；改变sIL-15Rα-Fc的剂量，使得注射2∶1摩尔比率的IL-15对sIL-15Rα-Fc。显示了注射后2天在脾中的供体MP CD8+细胞的CFSE谱。(D)编辑(C)的数据。对于A、B和C，显示的数据代表每组2只小鼠，也代表2个独立实验。
[0251]图21A、21B、21C和21D表明，可溶性IL-15Rα增大IL-15介导的宿主淋巴细胞增殖。(A)如对图20A所述，在第1和2天对正常B6小鼠iv注射PBS、单独的sIL-15Rα-Fc、单独的IL-15或sIL-15Rα-Fc/IL-15。显示了在第3天由脾回收的CD8+MP T细胞、CD4+MP T细胞和NK细胞的总数。(B)如所示对(A)的脾拍照。(C)如在(A)中一样处理小鼠，只是在第1天还给予小鼠iv注射BrdU，并将BrdU置于饮用水中，直至处死。显示了对MP CD8+、幼稚CD8+、MP CD4+和NK细胞的BrdU染色。(D)在第1、3、5和7天对IL-15Rα-/-小鼠iv注射PBS、IL-15(0.6μg)或IL-15(0.6μg)/sIL-15Rα-Fc(1μg)。数据显示了于第9天的脾细胞染色。对于B、C、D，显示了代表性数据。所有数据都代表至少2个独立实验。
[0252]图22表明，在体内条件下sIL-15Rα-Fc(二聚体)好于sIL-15Rα(单体)。将CFSE标记的Thy-1.1MP CD8细胞注射入正常B6宿主中，并注射1μg IL-15、1μg IL-15+5μg sIL-15Rα-Fc或1μgsIL-15Rα-Fc+10μg sIL-15Rα，然后于第3天分析。显示了由宿主脾回收的供体CD8细胞的CFSE谱。
[0253]图27显示了IL-15/sIL-15-Rα-Fc复合物在IL-15Rα-/-宿主中的刺激作用。将纯化的CFSE标记的MP CD8+T细胞iv转移至IL-15Rα-/-接受者中。在转移后第1天，给予接受小鼠ip注射PBS、单独的sIL-15Rα-Fc(10μg)、单独的IL-15(2μg)或sIL-15Rα-Fc加IL-15(分别为10μg和2μg)。在转移后第3天，收获脾细胞，通过流式细胞术分析评价CFSE稀释度。
实施例11
sIL-15Rα-Fc不能阻断内源IL-15的提呈
[0254]已知用LPS注射小鼠使非T细胞的体内内源IL-15(和IL-15Rα)合成短暂增加，结果使IL-15反应性CD122hi MP CD8+细胞的增殖速率短暂增加。Mattei等，J Immunol 167：1179，2001；Tough等，J Exp Med 185：2089，1997。该LPS诱导的旁观者增殖图解于图23A，其中在正常B6宿主中大部分供体MP CD8+细胞在接触LPS后第3天经历1-2次细胞分裂，这与在IL-15Rα-/-宿主中没有增殖显示出差异。值得注意的是，在注射LPS后注射sIL-15Rα-Fc不能减少增殖，即便采用每日注射sIL-15Rα-Fc(10μg/注射)也是如此。因此，注射sIL-15Rα-Fc不能阻断T细胞与结合内源IL-15Rα的内源IL-15接触。此外，对于IL-15Rα-/-宿主，sIL-15Rα-Fc明显不能补偿内源IL-15Rα的缺失，推测是因为后者是运输IL-15至细胞表面所必需的。
[0255]类似的发现适用于其中MP CD8+细胞在孔中培养的体外系统，所述孔首先用sIL-15Rα-Fc包被，然后用IL-15脉冲，接着彻底洗涤，以除去未结合的细胞因子(图23B)。因此，加入可溶性(未结合的)IL-15Rα-Fc作为阻断剂不能抑制由结合的IL-15Rα-Fc/IL-15复合物激发的增殖响应。相比之下，加入抗IL-15的多克隆抗体消除了增殖。
[0256]基于以上发现，IL-15分子仅具有用于与IL-15Rα相互作用的单一结合位点。一旦该位点通过在体内结合细胞上的内源IL-15Rα或在体外结合附着至塑料的IL-15Rα而被占据，就不能与外源sIL-15Rα-Fc发生相互作用，对IL-15向T细胞的提呈没有干扰。该情况没有解释为何sIL-15Rα可阻断细胞系对IL-15的响应((Ruckert等，J Immunol 174：5507-15，2005；Wei等，J Immunol 167：577-82，2001；Ruchatz等，JImmunol 160：5654-5660，1998；Budagian等，J Biol Chem279：40368-75，2004；Mortier等，J Immunol 173：1681-1688，2004；Eisenman等，Cytokine 20：121-29，2002)。在此，可能相关的是这些研究使用人或猿猴IL-15，而不是我们研究中的小鼠IL-15，这产生了IL-15的不同种间差异的可能性。有利于该观点的是，我们发现，对于MP CD8+细胞，小鼠CTLL细胞对小鼠IL-15的应答被小鼠sIL-15Rα-Fc增强(图28A)。相比之下，证实了其他人的发现(Ruckert等，J Immunol 174：5507-15，2005；Wei等，J Immunol 167：577-82，2001；Ruchatz等，J Immunol 160：5654-5660，1998；Budagian等，J Biol Chem279：40368-75，2004)，CTLL细胞对人IL-15的高应答(Eisenman等，Cytokine 20：121-29，2002)被小鼠sIL-15Rα-Fc强烈抑制(图28B)。加入sIL-15Rα-Fc不影响对作为对照的IL-2的CTLL应答(图28C)。
[0257]以上发现没有解释以下报道：鼠sIL-15Rα构建体对NK细胞增殖(Nguyen等，J Immunol 169：4279-87，2002)和抗原驱动的体内T细胞应答(Ruckert等，Eur J Immunol 33：3493-3503，2003；Ruckert等，J Immunol 174：5507-15，2005；Wei等，J Immunol 167：577-82，2001；Ruchatz等，J Immunol 160：5654-5660，1998)是抑制性的。此矛盾还有待解决，但令人感兴趣的是，幼稚OT-1TCR转基因CD8+细胞在体内针对特定肽的抗原特异性增殖反应没有因为共注射sIL-15Rα-Fc而被阻断，在注射sIL-15R和IL-15的混合物时，该反应被显著增强(图28D)。到目前为止，我们还没有使用阻断体内应答所需的非常大剂量的sIL-15Rα，即对于NK细胞增殖为400μg/注射(Nguyen等，J Immunol169：4279-87，2002)。此外，可能相关的是，显示sIL-15Rα在体内的抑制作用的研究使用在细菌中生长的构建体，而我们的构建体在哺乳动物细胞中生长。
[0258]图23A和23B表明，针对由IL-15Rα固定化的IL-15的增殖不能被可溶性IL-15Rα-Fc阻断。(A)将CFSE标记的T细胞iv注射入Thy1-同类系B6或IL-15Rα-/-宿主中。1天后，对小鼠ip注射PBS或500ng LPS。如所示，还由LPS注射日开始每日1次用10μgsIL-15Rα-Fc ip治疗小鼠。注射LPS后3天，处死小鼠，评价MP CD8+T细胞的CFSE稀释度。(B)用10μg/ml sIL-15Rα-Fc过夜预包被96孔板。然后洗涤板，并与1μg/mlIL-15于37℃温育1小时。此后，洗涤板，并一起加入5×104个MP CD8+T细胞和：1)10μg/ml sIL-15Rα-Fc，2)10μg/ml多克隆抗IL-15抗体，或3)对照介质；作为额外的对照，将游离IL-15(32ng/ml)加入某些孔。数据表示第3天时一式三份培养物的[3H]-胸苷掺入的平均水平(SD)。
[0259]图28A、28B和28C显示了sIL-15Rα-Fc对针对小鼠和人IL-15的应答的阻断作用。(A、B、C)将CTLL-2细胞与(A)鼠IL-15、(B)人IL-15或(C)鼠IL-2培养2天。如所示，培养物补加1μg/ml鼠sIL-15Rα-Fc。[3H]-胸苷在培养的最后24小时当中加入。数据表示一式三份培养物的[3H]-胸苷掺入的平均水平(±SD)。(D)在-1天将1百万个OT-1细胞(Thy1.1同类系的)iv过继转移至B6接受小鼠中。在第0天，用1百万个SIINFEKL脉冲的树突细胞iv接种小鼠。在第1-7天，每日1次给予接受小鼠ip注射PBS、单独的sIL-15Rα-Fc(5μg)、单独的IL-15(1μg)或sIL-15Rα-Fc加IL-15(分别为5μg和1μg)。在第8天，收集脾脏，计数，并通过流式细胞术分析评价供体OT-1细胞。数据显示了在没有细胞因子或受体治疗的情况下OT-1细胞的绝对数相对于接种的增加倍数。所有数据都代表至少2个独立实验。
实施例12
IL-2加IL-2Rα的刺激作用
[0260]结合可溶性IL-15Rα增强IL-15的生物活性，此观察结果产生了相应发现是否能适用于IL-2和IL-2Rα(CD25)的问题。如在图24中所示，明显不是这种情况。因此，加入可溶性小鼠IL-2Rα明显抑制MP CD8+细胞在体外对小鼠IL-2的增殖响应(图24A左侧，24B)。类似的抑制适用于响应于人IL-2和可溶性人IL-2Rα的MP CD8+细胞(小鼠)(图24A右侧)。
[0261]因此，尽管可溶性IL-15Rα加强IL-15的功能，但可溶性IL-2Rα阻断IL-2的功能。
[0262]图24A和24B表明，可溶性IL-2Rα抑制IL-2介导的增殖。(A)将纯化的CFSE标记的MP CD8+T细胞与所示浓度的鼠IL-2或人IL-2培养。如所示，向培养物加入2.5μg/ml的可溶性鼠IL-2Rα或可溶性人IL-2Rα。在第3天评价CFSE稀释度。显示了代表性数据。(B)在有或没有可溶性mIL-2Rα(2.5μg/ml)的情况下将纯化的MP CD8+T细胞与滴定量的鼠IL-2培养。数据显示了在第3天时一式三份培养物的[3H]-胸苷掺入的平均水平(±SD)。
实施例13
IL-15和IL-15Rα的可溶性复合物比单独的可溶性IL-15更具刺激性
[0263]得自以上实验的主要结论是IL-15和IL-15Rα的可溶性复合物在体内和体外均远比单独的可溶性IL-15更具刺激作用。由于没有对IL-15/IL-15Rα相互作用的结构性研究，人们仅可以推测该相互作用为何和如何加强IL-15功能。有几种可能性：
[0264]首先，IL-15Rα与IL-15的结合可能损害T细胞的IL-15内化作用，由此强化了经由βγc受体的信号转导。该观点符合某些细胞因子(例如IL-2)的内化用于削弱受体信号转导的报告(Chang等，J BiolChem 271：13349-55，1996)。然而，由于两个理由，我们不支持该可能性。首先，如果IL-15/sIL-15Rα复合物的强刺激作用反映出IL-15内化降低，那么人们预期会发现IL-15的受体CD122的内化伴随下降。然而，根据细胞表面下调所检测到，正好相反，即IL-15/sIL-15Rα复合物下调CD122比单独的IL-15更大(未显示数据)。对于IL-15/sIL-15Rα复合物阻止IL-15内化的第二个争论在于，如果是这种情况，那么我们用IL-2/sIL-2Rα应观察到类似的发现，但IL-2/sIL-2Rα并不是这样的。因此，IL-2/sIL-2Rα复合物的刺激作用远不如单独的可溶性IL-2，这与IL-15Rα/IL-15复合物比单独的IL-15更具刺激作用形成鲜明对比。
[0265]关于sIL-15Rα如何加强IL-15活性的第二种可能性在于，sIL-15Rα可能防止IL-15降解。此观点值得考虑，因为sIL-15Rα-Fc对IL-15功能的增强作用在体内比在体外更显著。在此，要指出的是，某些细胞因子与抗体或可溶性受体的结合可在体内延长细胞因子存活(Finkelman等，J Immunol 151：1235-44，1993；Ma等，J Pharmacol ExpTher 279：340-50，1996；Peters等，J Exp Med 183：1399-1406，1996；Rosenblum等，Cancer Res 45：2421-24，1985；Peleg-Shulman等，J BiolChem 279：18046-18053，2004；Kobayashi等，Cytokine 11：1065-75，1999)。因此，sIL-15Rα-Fc结合IL-15可增加IL-15的体内半衰期。然而，值得注意的是，我们未能观察到IL-15的体外半衰期增加。
[0266]根据上文，我们支持第三种可能性，即IL-15Rα通过诱导IL-15的构象改变改善IL-15的功能，所述构象改变增大与βγc受体的相互作用，由此将IL-15由激动剂改变为超激动剂。该模型与IL-15/IL-15Rα相互作用的亲和性远高于IL-2/IL-2Rα相互作用相一致(Fehniger和Caligiuri，Blood 97：14-32，2001；Van Belle和Grooten，ArchImmunol Ther Exp(Warz)53：115-26，2005)，并解释了为什么IL-15与IL-2不同而能如此好地用作细胞缔合性细胞因子。直接检验该观点显然要求结构性研究。在这方面，值得注意的是，IL-15和IL-15Rα之间的相互作用涉及在其它细胞因子/细胞因子受体复合物中不存在的独特的离子相互作用网络(Lorenzen等，J Biol Chem，2005，纸质版前的电子版)。还有待确定该独特的相互作用是否导致IL-15的构象变化。
[0267]有越来越多的证据表明，IL-15对T细胞存活和记忆产生具有有益作用，对在辐射和其它形式的细胞减少后恢复T细胞池也有潜力(Becker等，J Exp Med 195：1541-48，2002；Zhang等，Immunity8：591-99，1998；Waldmann，T.A.，J Clin Immunol 22：51-56，2002；Zeng等，J Exp Med 201：139-48，2005；Van Belle和Grooten，Arch ImmunolTher Exp(Warz)53：115-26，2005；Schluns等，Int J Biochem Cell Biol 37：1567-71，2005；Lodolce等，J Exp Med 194：1187-94，2001；Rubinstein等，J Immunol 169：4928-35，2002；Diab等，Cytotherapy 7：23-35，2005)。如本文所示，通过给予预制可溶性IL-15/IL-15R复合物可相当程度地增强IL-15作为治疗剂的生物活性。
实施例14
材料和方法
[0268]小鼠。C57BL/6(B6)、B6.Ly5.1、B6.Thy1.1和OT-1小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。IL-15Rα-/-小鼠(Lodolce等，Immunity 9：669-76，1998)由Averil Ma(University of California，SanFrancisco)惠赠，IL-7转基因(tg)小鼠(Mertshing等，Int Immunol 7：401-14，1995)由J.Andersson(Basel Institute，Switzerland)惠赠。P14TCR tg小鼠由J.Lindsay Whitton(Scripps Research Institute)惠赠。IL-15Rα-/-、IL-7tg、P14和OT-1TCR tg小鼠全部保持在B6背景下，对于某些实验，与B6.Ly5.1或B6.Thy1.1小鼠杂交。IL-15Rα-/-小鼠与IL-7tg小鼠杂交，以产生IL-7tg/IL-15Rα-/-小鼠。正如我们先前已用IL-7tg/IL-15-/-小鼠所描述的(Kieper等，J Exp Med 195：1533-39，2002)，IL-7tg/IL-15Rα-/-小鼠具有和IL-7tg小鼠类似的大量CD122hi MP CD8+T细胞。
[0269]重组蛋白。鼠sIL-15Rα-Fc、人sIL-15Rα-Fc和人IL-2Rα购自R&D systems(Minneapolis，MN)。单体sIL-15Rα和小鼠IL-2Rα作为预放行试剂购自R&D systems。单体sIL-15Rα通过酶消化二聚化sIL-15Rα产生。我们通过使用抗-IL-15Rα多克隆抗体(AF551和BAF551，R&D systems)的蛋白质印迹确认完全消化(数据未显示)。重组细胞因子(包括小鼠IL-15、人IL-15、小鼠IL-2、人IL-2、小鼠IL-4和小鼠GM-CSF)购自Ebioscience和/或R&D systems。
[0270]T细胞的分离和CFSE标记。为获得足够的细胞数，在大部分实验中，MP CD8+细胞由IL-7转基因小鼠制备。由来自IL-7tg小鼠的MP CD8+细胞检验的所有参数都与来自正常小鼠的细胞相同。此外，本文针对IL-15/sIL-15Rα-Fc复合物报告的主要发现用由正常小鼠制备的细胞在体内和体外也均观察到。用于体外或过继转移实验的MP CD8+T细胞分离自LN和脾，并通过细胞分拣纯化。简而言之，首先使用小鼠T细胞富集柱(MTCC-25，R&D systems，Minneapolis，MN)富集单细胞悬浮液的CD3+T细胞。富集的T细胞用抗体标记，并通过用于CD8+CD44hiT细胞的细胞分拣纯化。在某些实验中，我们使用类似的方案和分离的CD8+CD44lo、CD4+CD44hi、NK1.1+/DX5+细胞。使用BD FACSAria进行细胞分拣。常规检验分拣细胞的纯度，其超过98％。在某些实验中，总T细胞或OT-1细胞用作供体淋巴细胞。对于这些实验，来自脾和LN的细胞使用小鼠T细胞富集柱(MTCC-25)纯化。对于使用CFSE标记的细胞的实验，按照生产商的指引用1.5μm CFSE(Molecular Probes，Eugene，OR)标记T细胞。
[0271]抗原特异性CD8+T细胞的产生。在过继转移P14 TCR tgCD8+T细胞(其识别LCMV gp33肽)和LCMV感染后，我们产生抗原特异性记忆T细胞。简而言之，将5×104个P14TCR转基因CD8+T细胞过继转移给Thy1同类系IL-7tg接受小鼠。24小时后，小鼠接受2×105个菌落形成单位的LCMV Armstrong毒株。在病毒感染后2个月，使用小鼠T细胞富集柱(MTCC-25)分离T细胞，用CFSE标记，并过继转移至Ly5同类系接受小鼠。供体P14CD8+T细胞(Thy1.1)代表15-20％的供体CD8+T细胞(Ly5.2)群。
[0272]体外测定。所有培养都在补加10％FCS、谷氨酰胺、2-ME、非必需氨基酸和抗生素的RPMI 1640中进行。FACS纯化的T细胞和NK细胞如上所述分离。CTLL(CTLL-2)细胞得自ATCC(Manassas，VA)，并在补加鼠IL-2的RPMI培养基中培养。对于采用FACS纯化的淋巴细胞的实验，以每孔5×104个细胞的200μl溶液铺板在96孔板的每孔中。细胞因子和/或可溶性受体以在图或图例中所述的浓度加入。对于CD122封闭实验，我们使用纯化的抗CD122抗体(TM-β1(NA/LE)，BD Pharmingen)。对于封闭结合板的IL-15的实验，使用多克隆抗IL-15抗体(AF447，R&D systems)。采用CTLL细胞的实验如同FACS纯化的淋巴细胞的情况一样铺板，只是使用2×104个细胞/孔。对于采用[3H]-胸苷的增殖实验，如在图例中所示加入1μCi/ml。细胞在三个平行孔中培养。
[0273]体内测定。对于评价过继转移细胞增殖的实验，分离T细胞，并用CFSE标记(如上所述)，然后iv注射入Ly5或Thy1同类系接受小鼠中。在检测宿主细胞增殖的实验中，用BrdU(2mg)ip注射小鼠，然后使用先前所述方法保持饮用水中的BrdU(0.8mg/ml)(Judge等，J Exp.Med 196：935-46，2002)。对于细胞因子和可溶性受体的注射，IL-15和sIL-15Rα-FC一起于37℃温育20分钟。然后在注射入小鼠中之前用PBS将样品稀释至少10倍至500μl体积。在对照条件下，还将单独的细胞因子或受体于37℃温育20分钟。ip注射LPS(ALX-581-008，Alexis Biochemicals，San Diego，CA)的PBS溶液。对于免疫接种实验，如前所述通过培养骨髓细胞与GM-CSF和IL-4制备树突细胞(Rubinstein等，J Immunol 169：4928-35，2002)。用SIINFEKL肽于37℃脉冲树突细胞2小时，洗涤，并iv注射。
[0274]流式细胞术分析。使用标准方法通过流式细胞术分析来分析细胞。简而言之，用含有1％FCS和2mM EDTA的FACS缓冲液洗涤细胞，并用以下抗体组合染色：CD8-PerCP-Cy5.5、-APC或-APC-Cy7(53-6.7，eBioscience和BD Pharmingen)、CD49b-PE和-APC(DX5，eBioscience)、NK1.1-FITC和-PE(PK136，BD Pharmingen)、CD3-PE、-PerCP-Cy5.5、-PE-Cy7或-APC(145-2C11，eBioscience和BD Pharmingen)、CD3-Pacific Blue(500A2，BD Pharmingen)、CD4-PE、PE-Cy7或-APC(RM4-5，eBioscience和BD Pharmingen)、Ly5.1-FITC、-PE、-PE-Cy7和-APC(A20，eBioscience和BD Pharmingen)、Ly5.2-FITC、-PE、-PerCP-Cy5.5和-APC(104，eBioscience和BDPharmingen)、Thy1.1-FITC、PE、-PE-Cy7和-APC(HIS51，eBioscience)、Thy1.2-FITC、PE和-APC(53-2.1，eBioscience)、CD44-FITC-APC和-Alexa Fluor 405(IM7，eBioscience和Caltag Laboratories(Burlingame，CA))、CD 122-PE (TM-β1，BD Pharmingen)、B220-PerCP-Cy5.5(RA3-6B2，BD Pharmingen)和TCR Vα2-PE(B20.1，BD Pharmingen)。BrdU胞内染色用来自FITC或APC BrdU flow kit(559619和552598，BD Pharmingen)的试剂按照生产商的指引进行。使用BD LSR II数字流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)分析流式细胞术样品。数据使用FlowJo软件(Tree Star，San Carlos，CA)分析。
实施例15
材料和方法
[0275]小鼠。C57BL/6(B6)、B6.PL(Thy1.1-同类系的)、IL-2+/-和CD25+/-小鼠全部处于B6背景，购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。IL-7转基因(tg)小鼠和P14 tg小鼠均处于B6背景，与Thy1.1同类系背景育种。Kieper等，J Exp Med 195：1533，2002；Pircher等，Nature 351：482，1991。包括IL-15-/-小鼠在内的所有这些小鼠都处于B6背景，保持在我们的动物设施中，并于3-6月龄使用。IL-2-/-和CD25-/-小鼠由杂合子种畜繁殖，并通过在The Jackson Laboratory的站点提供的标准PCR法筛选。Judge等，J Exp Med 196：935，200。包括使用动物的实验得到TSRI的实验动物管理和使用会员会(Institutional AnimalCare and Use Committee)批准。
[0276]流式细胞术和细胞分拣。脾或合并的(腹股沟的、腋窝的、子宫颈的和肠系膜的)LN细胞的悬浮液按照标准方法制备，并针对FACS![]()
分析或使用含1％FCS和2mM EDTA的PBS和以下mAb(来自BD Biosciences，除非另有说明)分拣染色：缀合Alexa Fluor 405的B220(RA3-6B2，Caltag Laboratories)；缀合PerCP-Cy5.5的CD3(145-2C11)；缀合Alexa Fluor 405的CD4(RM4-5，Caltag Laboratories)；缀合PerCP-Cy5.5或APC-Cy7的CD8α(53-6.7)；缀合PE的CD8β(H35-17.2)；缀合FITC或PE的CD25(PC61.5)；缀合APC的CD44(IM7，eBioscience)；缀合APC的CD90.1(HIS51，eBioscience)；缀合FITC或PE的CD 122(TM-β1或5H4)；和缀合PE的Foxp3(FJK-16s，eBioscience)。按照生产商的推荐进行胞内Foxp3染色。简而言之，首先针对细胞表面标记染色细胞，然后使用2％多聚甲醛固定，并在胞内染色前使用皂苷透化。使用BD LSR II数字流式细胞仪分析流式细胞术样品。使用BD FACS Aria进行细胞分拣。在分拣后常规检验样品纯度，其超过98％。
[0277]在体内的T细胞转移以及细胞因子和抗体的给药。FACS![]()
分拣的记忆表型(MP)CD44hiCD122hiCD8+T细胞(＞98％纯度)得自指示处的野生型(WT)B6.PL、处于Thy1.1同类系背景的IL-7tg小鼠或CD25-/-小鼠的脾或合并的LN；关于测试的所有参数，来自IL-7tg小鼠的MP CD8+细胞与由正常B6(或B6.PL)小鼠制备的这些细胞的群体(小得多)无差别。以1-2×106个细胞/小鼠静脉内(iv)注射分拣的MPCD8+细胞。rmIL-2购自eBioscience，并按照生产商的推荐分拣。S4B6.1杂交瘤(大鼠IgG2a)得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在标准条件下在体外培养(参见下文)，分泌的mAb得自培养物上清液。为了比较，还由BD Biosciences购得S4B6 IL-2mAb。IL-2mAb JES6-1A12(大鼠IgG2a)和JES6-5H4(大鼠IgG2b)购自eBioscience。S4B6 IL-2mAb的F(ab′)2制备物由BD Biosciences定制，在非还原条件下在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以验证消化，并在体外检验它们中和rmIL-2的能力(图12B)。
[0278]在过继细胞转移当天开始，年龄和性别匹配的小鼠每日1次接受腹膜内(ip)注射PBS、同种型匹配的抗体(分别为大鼠IgG2a或大鼠IgG2b)、1.5μg rmIL-2、S4B6(50μg，除了图2以外)、50μg S4B6加10μg CD 122mAb(TM-β1)、50μg JES6-1A12、50μg JES6-5H4、1.5μg rmIL-2加S4B6(50μg，除了图8D以外)、1.5μg rmIL-2加50μgJES6-1A12或者1.5μg rmIL-2加50μg JES6-5H4。对于使用重组人IL-2(rhIL-2)的实验，rhIL-2和人IL-2mAb(MAB602，克隆5355)购自R&DSystems。如以上对rmIL-2的描述，小鼠每日1次ip注射同种型匹配的对照抗体(小鼠IgG2a)、1.5μg rhIL-2、50μg MAB602hIL-2mAb或者1.5μg rhIL-2加50μg MAB602 hIL-2mAb的混合物。对于使用rmIL-4的实验，rmIL-4购自eBioscience，并按照生产商的推荐储存。抗小鼠IL-4mAb MAB404(克隆30340，大鼠IgG1)得自R&D Systems，第二种抗小鼠IL-4mAb 11B.11(大鼠IgG1)由NCI BRB临床前储藏库(NCI BRB Preclinical Repository)(Rockville，MD)提供。如以上对IL-2的描述，小鼠每隔1日1次ip注射同种型匹配的对照抗体(大鼠IgG1)、1.5μg rmIL-4、50μg IL-4mAb或者1.5μg rmIL-4加50μg IL-4mAb的混合物。过继细胞转移后7天，如上所述通过流式细胞术分析脾和LN细胞。
[0279]抗原特异性记忆CD8+细胞的产生。Thy1.1标记的P14小鼠用作供体，该小鼠携带TCR tg CD8+细胞，识别淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)gp33-41表位。如前所述用补体加针对热稳定抗原的mAb(J11d)、CD4(RL172)和MHC-II mAb(28-16-8s)处理这些小鼠的脾细胞，以便获得约95％纯度的CD8+Thy1.1+细胞，该细胞约为90％Vα2+，并因此是TCR tg。Kosaka等，J Exp Med 176：1291，1992。然后以5×104个细胞/小鼠将这些纯化的细胞iv过继转移至B6(Thy1.2)小鼠，该小鼠在细胞转移后1天ip接受2×105个菌落形成单位的LCMV毒株Armstrong。然后维持小鼠超过2个月，以允许产生CD8+记忆细胞。在那时，如上所述通过补体加mAb，或者通过用于CD122hi CD44hiCD8+细胞的FACS![]()
分拣，由脾纯化CD8+细胞。然后CFSE标记含有约16-20％Thy1.1+Vα2+LCMV特异性记忆T细胞的纯化的CD8+细胞，并以10-15×106个细胞/小鼠过继转移至B6(Thy1.2)小鼠，该小鼠随后每日1次接受ip注射PBS、1.5μg rmIL-2、50μg S4B6IL-2mAb或1.5μg rmIL-2加50μg IL-2mAb。过继细胞转移后7天，如上所述通过流式细胞术分析脾和LN细胞。
[0280]体内细胞更新的检测。使用染料CFSE稀释或在饮用水中给予的溴脱氧尿苷(BrdU)(0.8mg/ml)掺入检测细胞在体内的增殖。Kieper等，J Exp Med 195：1533，2002；Tough等，J Exp Med 179：1127，1994。CFSE染色如下进行：将细胞以10-20×106个细胞/ml重悬浮在含有1％FCS的PBS中，并以1μl 5mM Vybrant CFDA SE细胞示踪物试剂盒(Molecular Probes)/ml细胞悬浮液于37℃染色10分钟，然后用含有1％FCS的冰冷PBS洗涤2次。使用来自BD Biosciences的FITCBrdU试剂盒按照生产商的推荐进行针对BrdU的胞内染色。
[0281]体外增殖。通过流式细胞仪分拣来自B6或CD25-/-小鼠的MP CD8+细胞。对于CD3活化的细胞，使用MACS![]()
CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)由年轻B6小鼠的合并LN纯化CD8+细胞；这些细胞具有＞95％的CD8+，由约90％的CD44lo幼稚细胞组成。或者，使用FACS![]()
纯化细胞，以获得＞99％纯度的CD44loCD8+细胞。然后使用结合板的CD3mAb(145-2C11，eBioscience)活化这些纯化的CD8+细胞。在指示处，将固定浓度(10μg/ml)的同种型匹配的对照mAb：CD25mAb(PC61.5，eBioscience)或CD 122mAb(TM-β1，BDBiosciences)加入细胞，然后将它们与IL-2/IL-2mAb复合物混合。将细胞以5×104个细胞/孔接种在96孔板中，将滴定浓度的rmIL-2加同种型匹配的对照mAb的复合物、rmIL-2加S4B6IL-2mAb的复合物或rmIL-2加JES6-1A12IL-2mAb的复合物加入各孔。rmIL-2/IL-2mAb复合物为精确的2∶1摩尔比率，以避免两种组分中的任一种过量。在标准条件(37℃，7％CO2，湿润气氛)下培养细胞3天。在最后16小时加入[3H]-胸苷(1μCi/ml)，用液体闪烁计数器(Harvester 96，Tomtec)检测[3H]-胸苷掺入评价细胞增殖。
[0282]骨髓重建。由正常B6小鼠获得骨髓(BM)细胞，使该细胞未被处理，或使用补体加针对CD4(RL172)和CD8(3.168)的mAb使该细胞缺失T细胞，这消除了BM中95％以上的成熟T细胞。以1000cGy辐射接受B6小鼠，然后分别iv注射5-10×106个未分离的或T细胞缺失的BM细胞。随后，每日1次给予ip注射PBS、1.5μg rmIL-2、8μg S4B6IL-2mAb或1.5μg rmIL-2加8μg S4B6 IL-2mAb。过继转移后8天，染色脾细胞，并通过流式细胞术分析。
[0283]酶联免疫吸附测定(ELISA)。使用eBioscience鼠IL-2ELISA试剂盒按照生产商的推荐进行标准IL-2夹心ELISA。简而言之，用纯化的JES6-1“捕获”mAb于4℃过夜包被平底96孔板。然后强力洗涤该板，此后将rmIL-2加入各孔，并于室温温育2小时。随后，强力洗涤该板，之后加入生物素化JES6-5“检测”mAb于室温达1小时。在指示处，将滴定浓度(5倍稀释度，以100μg/ml开始)的纯化的对照mAb、纯化的JES6-1、纯化的JES6-5或纯化的S4B6 IL-2mAb连同检测mAb一起加入。随后，强力洗涤板，然后加入缀合链霉抗生物素蛋白的辣根过氧化物酶，于室温达30分钟。然后使用底物邻-苯二胺显色样品，在用2N H2SO4终止反应后，用ELISA读取器(Spectramax Plus 384，Molecular Devices)于450nm分析。
[0284]当范围在本文用于物理特性(例如分子量)或化学特性(例如化学式)时，意欲包括范围和其中的具体实施方案的所有组合和子组合。
[0285]在本文件中援引或描述的每个专利、专利申请和出版物的公开内容都整体引入本文作为参考。
[0286]本领域技术人员会认识到，可对本发明的实施方案实施众多的改变和修改，并可以在不偏离本发明精神的情况下，实施这些改变和修改。因此，随附权利要求意欲涵盖所有这些等同的变化，这些等同的变化属于本发明的真正精神和范围。