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神经生长因子的药物制剂
    本发明所属技术领域

    本发明涉及神经生长因子的药物制剂。本发明还涉及适合冻干的神经生长因子制剂。

    与本发明相关的背景技术

    许多多肽和蛋白质调节细胞的生长和存活；这种分子被称为“生长因子”。生长因子的实例包括表皮生长因子(EGF)，酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，睫状神经营养因子(CNTF)，和神经生长因子(NGF)。其中，NGF是首先被识别和定性的(Levi-Montalcini，R.，et al.，J.Exp.Zool.，116：321，1951)。

    NGF促进某些类型的神经元细胞的存活和活性。另外，NGF还促进未成熟神经元细胞分化为后有丝分裂神经元。

    从小鼠颌下腺得到的NGF的纯化致使能识别包含三个亚单位α，β和γ的复合物。NGF的所有神经营养活性被假定存在于β亚单位--分子量约为13,000Da的118个氨基酸蛋白质(Varon，S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，57：1782-1789，1967；Greene，L.A.，et al.，Neurobiol.，1：37-48，1971)中。在溶液中，β亚单位形成分子量约为26,500Da的二聚体。

    NGF已被认为对治疗外围和中枢神经系统的某些变性疾病是有效的。人们还认为使用NGF有利于治疗某些疾病，如NGF不足，其受体失常，或在其传输过程中的变化或细胞间作用导致神经元功能减退、萎缩甚至细胞死亡。这些疾病包括遗传的感觉和运动性神经病，遗传性及偶发性系统退化，肌萎缩性(脊髓)侧索硬化，帕金森病和阿尔茨海默病(Goedert，M.，et al.，Mol.Brain Res.，1：85-92，1986；Mobley，W.C.，et al.，Soc.Neurosci.Abstr.，13：186，1987；Mobley，W.C.，et al.，Soc.Neurosci.Abstr.，4：302，1988；Hefti，F.，et al.，Ann.Neurol.，20：275-281，1986)。在暴露于某些毒素之后，NGF还被认为可以减少神经元细胞死亡；所说毒素如6-羟基-多巴胺(Aloe，L.，Arch.Ital.Biol.，113：326-353，1975)，长春花碱和秋水仙碱(Menesini-Chen，M.G.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5559-5563，1977；Johnson，E.M.，Brain Res.，141：105-118，1978)和辣椒碱(Otten，U.，Nature，301：515-577，1983)。

    NGF mRNA在与记忆和学习有关的区域，即海马中的高表现度说明NGF的临床应用对治疗痴呆是有效的(Kaisho，Y.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，174：379-385，1991)。已有报道说，在心室内使用NGF可以防止轴切开之后基本前脑胆碱能神经元的死亡，说明在受伤之后，NGF可以有效地促进细胞存活(Hefti，F.，，Neurosci.，6：2l55-2162，1986；Williams，L.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：9231-9235，1986；Kromer，L.，Science，235：214-216，1987)。

    治疗中使用NGF仍有很大问题，这些问题牵涉1)保持NGF的生物活性，因为它在制备、纯化或存储过程中可能被改变，以及2)使用NGF--相对大的亲水分子，只有使用能够充分有效的量才能达到活化部位。象其它蛋白质一样，NGF地生物活性依赖于其二级和三级结构。NGF的β亚单位具有三个二硫键，它们被认为对生物活性是极为重要的(Kanaya，E.，et al.，Gene，83：65-74，1989；Iwane，M.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，171：116-122，1990；Hu，G.-L.and Neet，K.E.，Gene，70：57-65，1988)。另外，任何蛋白质的变性，都会使生物活性NGF的有效作用减少。因此，在生产和储存以及给药期间必须保持蛋白质的完整性。在升高温度时蛋白质特别易于降解。

    低温一般可减少蛋白质降解。然而，在室温(即约25℃)储存蛋白质比在冷冻温度(约4℃)储存蛋白质更经济。因此，制剂的稳定性对储存在室温和冷冻在约4℃都是需要的。

    除了稳定性问题外，如许多其它蛋白质一样，NGF与表面形成非特定结合。这种非特定结合可以产生于许多材料上包括玻璃和塑料，例如聚乙烯和聚丙烯塑料。这些材料可以是小瓶，管子，注射器，可插入灌注器械形式；或在生产、储存或给药期间可接触NGF的其它任何表面。

    使用蛋白质如NGF作为治疗剂时的其它困难是体内难以吸收和被胃酸降解。因此，通常口服给药是不适合的。为了克服这种吸收障碍，就需要采用注射和输液的形式。

    当治疗部位易于接近时，可采用注射形式。然而，如果治疗部位相当不易接近，如CNS，则对于长期给药来讲，输液的形式更实用。但是，由于各种并发症，这些给药方式已经不实用。例如，通过在大脑中插入NGF泵可进行连续输液，但是长时间暴露在体温下会引起蛋白质的降解。而且，由于时间长了，会因为蛋白质吸附于泵腔而造成额外的损失。

    除了与NGF给药有关的问题外，还存在着从生产到给药长时间储存的问题。冻干是长期储存生物蛋白质，防止降解、凝聚和/或非特定吸附的的方法之一。然而，冻干方法本身存在着困难。由于在冻干过程中液体体积的减少，有效盐浓度显著增加并会使蛋白质变性，从而使再组合时有效治疗活性降低。另外，在冷冻过程中冰晶的形成会引起变性，并且减少生物活性的NGF的有效量。因此，制剂必须能防止盐浓度的波动和减少冰晶形成。

    本发明的目的

    本发明目的之一是提供NGF水剂，该制剂在约4℃-40℃温度范围内至少保持其活性1个月。

    本发明另一个目的是提供一种在冻干和再组合后仍保持其活性的NGF制剂。

    本发明再一个目的是提供在溶液中储存生物活性NGF的方法。

    本发明的概述

    本发明提供能存储在低于室温，室温和较高温度而蛋白质在量和活性方面基本上没有损失的稳定的神经生长因子制剂。该制剂为含有以下物质的水溶液：

    (a)神经生长因子；

    (b)任意地，生物上可接受的水溶性载体；

    (c)足量的生物上可接受的盐以保持等渗性；

    (d)缓冲剂以保持该制剂的pH约为4.5-6.0；和

    (e)水。

    另一方面，本发明提供适于冻干的NGF药物制剂。

    本发明适于冻干的药物制剂为含有以下物质的水溶液：

    (a)神经生长因子；

    (b)生物上可接受的膨胀剂；

    (c)缓冲剂以保持该制剂的pH约为5.5-6.5；

    (d)任意地，生物上可接受的水溶性载体；和

    (e)水。

    本发明进一步的具体实例是其中水已基本被除去的冻干制剂。用再生载体--任意地包括生物上可接受的载体--进行再组合，本发明冻干制剂适于给药予需要治疗的病人。

    本发明还提供了在约4℃至约40℃温度下在本发明水剂中储存NGF的方法。

    本发明另一具体实例是使用有疗效量的本发明NGF制剂的治疗人类神经元功能障碍的方法。

    本发明的最佳实施例

    NGF稳定的肠外剂量形式的开发需要考虑大量因素，包括给药途径，吸附作用，及与生产设备和可能的传输器械的兼容性。进一步要考虑的是在低于、等于和高于环境温度情况下NGF在水剂中的稳定性。本发明一个具体实例是水溶液中的NGF制剂在一定的温度范围，特别是高于室温(至少约40℃)情况下表现出稳定性。该制剂含有NGF水溶液，盐和缓冲剂，pH值从约4.5至约6.0。该制剂可以进一步任意地含有载体。各组分的这种结合惊人地为该溶液提供了有益的特性，特别是有益于高温下的稳定性的特性。还提供了适于冻干的NGF制剂。本发明还提供了存储NGF的方法。

    这里所用的“生物上可接受的”是指在体内没有逆生物学效果的物质。“室温”指约22℃至约25℃之间。“体温”指约36℃至40℃之间。“可冻干制剂”是说可冻干至湿度小于2％并在重建时初始NGF生物活性至少保留约70％的NGF水剂。“等渗”是指具有与血清近似相同渗透压的溶液，约300毫摩尔每升。“载体”是任何生物上可接受的乳化剂，分散剂，表面活性剂，或减少NGF对表面吸附的蛋白质。

    “NGF”表示任何形式的表现生物活性并结合到NGF受体的神经生长因子，优选β亚单位神经生长因子。术语NGF还包括结合到NGF受体和保留NGF生物活性的杂交和修饰形式的NGF。修饰形式的NGF包括融合蛋白质如Iwai，S.，et al.，Chem.Pharm.Bull.，34：4724-4730，1986和Kanaya，E.，et al.，Gene，83：65-74，1989中所述的那些，以及在保持为提供治疗活性的足够的NFG活性和与受体结合性的同时，发生某些氨基酸的去除和替换的NGF的杂交产物和片段。

    优选NGF形式为人类NGF(hNGF)。最优选的hNGF形式是重组hNGF(rhNGF)。获得适用于本发明制剂的NGF的方法是现有技术中已知的，例如，适当的rhNGF可以通过杆状病毒表达系统(Barnett，J.，et al.，Exp.Neurol.，110：11-24，1990；EPO 370，171)，酵母表达系统(Kanaya，E.，et al.，Gene，83：65-74，1989)，哺乳动物细胞(CHO)表达系统(Iwane，M.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，171：116-122，1990)，或COS表达系统(Bruce，G.，et al.，Neurobiol.Aging，10：89-94，1989)生产。NGF至少应该纯度为65％；优选纯度至少为85％；更优选至少95％；最优选至少98％。用于本发明制剂中的被分离的NGF的纯度可用银染色SDS-PAGE法或其它现有技术中已知方法测定。

    在提供的NGF水剂中NGF是以有效治疗量存在的。优选的NGF量为约0.0001至约0.125％水剂重量，它对应于约1至约1250μg/ml。较优选的NGF量是约0.001至约0.10％(10至1000μg/ml)水剂重量。更优选的NGF量是约0.01至约0.10％(100至1000μg/ml)水剂重量。最优选的NGF量是约0.01至约0.05％(100至500μg/ml)水剂重量。

    NGF水剂任意地包括载体。该制剂中载体的存在减少或防止NGF对各种表面的吸附。对载体的需要依赖于水剂中NGF的浓度。当NGF浓度充分高(大于约500μg/ml)时，会有足够的NGF保留在溶液中，从而抵销了由于表面吸附作用而损失的那些带来的影响。适当的载体包括(但不仅限于)多乙氧基醚如Tween80，poloxamers如PluronicF68，和蛋白质如血清白蛋白。优选的载体为蛋白质。人血清白蛋白(HSA)是特别优选的。NGF对载体的重量比为约0.0001∶1至约1∶1。更优选的重量比为约0.01∶1至约1∶1。最优选的NGF对载体的重量比为约0.01∶1至约0.5∶1。因此，当用HSA作为载体时，HSA的优选浓度从约0.1至约1.25％wt(即1-12.5mg/ml)水剂。优选的制剂是HSA/水剂重量为约0.3-0.7％。更优选的是HSA/水剂重量为约0.4-0.6％。最优选的制剂是HSA/水剂重量为约0.5％。

    NGF制剂还含有足量的生物上可接受的盐以保持流体张力。盐的作用也是为了将NGF保留于溶液中。优选地，在生理学可接受的范围之内，该NGF制剂含有充足的盐使得对人血或脊髓液是等渗的。优选的盐是氯化钠(NaCl)，但也可以用其它的生物学可接受的盐，如氯化钾(KCl)，氯化钙(CaCl2)和氯化镁(MgCl2)。盐可以是一种，也可以是几种盐的组合。优选的制剂含有约0.5至1.0％(即5至10mg/ml)水剂重量的盐。较优选的制剂含有约0.6至0.9％制剂重量的盐。更优选的制剂含有约0.7至0.9％水剂重量的盐。最优选的制剂含有约0.87％(即8.7mg/ml)水剂重量的盐。

    NGF制剂进一步含有生物上可接受的缓冲剂以在存储期间保持其pH值。我们还发现NGF在低pH时更稳定。优选的稳定NGF制剂是用生物上可接受的缓冲剂缓冲至pH值约4.5-6.0，更优选约5.0-5.4。该制剂最优选pH为5.2。优选的缓冲剂为柠檬酸，但是其它能保持pH在所需范围内的缓冲剂也可使用。其它适宜的缓冲剂包括乙酸/乙酸盐和马来酸/马来酸盐。优选的缓冲剂用量根据所用缓冲剂的类型和其缓冲能力来确定。缓冲剂的用量要足以保持制剂的最终pH在优选pH范围内。稳定的NGF制剂中的缓冲剂的优选浓度为水剂重量的0.01-0.3％(0.1-3.0mg/ml)，更优选的浓度为水剂重量的0.1-0.25％(1.0-2.5mg/ml)，最优选的缓冲剂的浓度为水剂重量的0.2％(2.0mg/ml)。

    制剂中含有的水量要足以使制剂组分达到适合的浓度。

    优选的稳定NGF水剂含有约1-1250μg/ml NGF，1-12.5mg/ml HSA，5-10mg/ml NaCl，0.2-3.0mg/ml柠檬酸和水，其中制剂的pH被调至约4.5-6.0，更优选约5.0-5.4。最优选的NGF水剂含有约10-500μg/mlNGF，5mg/ml HSA，8.7mg/ml NaCl，2.1mg/ml柠檬酸和水，其中pH被调至约5.2。

    本发明冻干制剂特别适于NGF的长期储存，特别是在高温情况下。本发明冻干制剂含有NGF，生物上可接受的膨胀剂，缓冲剂以保持制剂的pH约5.5-6.5，任意的生物上可接受盐，生物上可接受的水溶性载体和水。

    在冻干制剂中的NGF与其在水剂中的浓度相同。膨胀剂提供一种使基质在冷冻干燥过程中或冷冻干燥之后保持一致的机械载体。一种或多种糖可用作膨胀剂。这里所用糖包括(但是不限于)单糖，寡糖和多糖。适宜的糖的实例包括(但是不限于)果糖，葡萄糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，葡聚糖。糖还包括糖醇类如甘露糖醇，山梨糖醇，肌醇，半乳糖醇，木糖醇和阿拉伯糖醇。根据本发明，糖的混合物也可以使用。

    优选的膨胀剂包括糖的结合物。优选的膨胀剂为蔗糖和山梨糖醇的结合物。不被理论所束缚，蔗糖被认为在冻干之后能形成非晶形玻璃体，通过在刚性玻璃体中形成NGF分子扩散使得蛋白质的潜在稳定性提高(如防止凝聚)。冻干之后由于水的损失被用糖替代，这一点也有助于提高稳定性。通过氢键糖分子而不是水分子结合到蛋白质上。当以1∶1重量比与蔗糖(它具有玻璃转换温度-36℃)混合时，甘露糖醇将制剂的玻璃转换温度提高5℃到-31℃。这就大大缩短了冻干时主要干燥步骤的时间，而且仍然能够形成非晶形玻璃制剂基质，因此被认为在大规模生产中是很有优势的。其它具有这些性质的膨胀剂也可以替代这些糖中的一或二种。

    本发明要被冻干的制剂优选具有比不被冻干或再组合制剂高的pH值。在本发明可冻干制剂中的膨胀剂(糖)一般在高pH值时更稳定。冻干前制剂的pH值优选在约5.5至约6.5之间。更优选的可冻干NGF制剂的pH值在约5.8至约6.2之间。最优选的可冻干NGF制剂的pH值约为6.0。当蔗糖作为膨胀剂存在时，可冻干制剂的pH值优选为约6.0。因为在酸性pH下，蔗糖--非还原二糖被水解成还原糖D-果糖和D-葡萄糖。对于可冻干NGF组合物来说柠檬酸盐是最优选的缓冲剂，但其它生物上可接受的缓冲剂也可以使用，如马来酸盐。优选不用乙酸盐作缓冲剂，因为在冻干过程中乙酸有挥发的趋势。应该认识到，有可能需要用酸或碱调节最终pH值。由于约6.0的较高pH值造成的NGF水剂的长期稳定性的任何损失都可以通过被冻干的NGF的稳定性的增加而得到弥补。

    理想地，由于缓冲剂成分依次在冻干期间结晶出来，因此对缓冲剂的选择要考虑到潜在的pH变化。比如，用磷酸盐缓冲剂，碱成分比酸成分有更高的低共熔点。因此，它第一个结晶出来，且pH值下降。柠檬酸盐缓冲剂是优选的，因为它被认为其两种(酸和碱)缓冲剂成分具有几乎相同的低共熔点，结果，在温度下降时只有很小的pH值波动。其它适宜的缓冲剂应该具有相同的组分或相似的低共熔点。

    冻干制剂还可包括生物上可接受的盐。这些盐可以选择与水剂中相同的盐，在冻干制剂中以与在水剂中相同的浓度或低于该浓度存在。由于在冻干期间盐的浓度可能增加，因此需要减少冻干剂中盐的浓度以防止蛋白质变性。冻干制剂中盐浓度的减少可以在再组合期间得到补偿，进而提供具有足够等渗度的适宜给药予患者的最终制剂。

    任意地，冻干制剂含有生物上可接受的水溶性载体。用在本发明冻干制剂中的载体和载体的浓度与适宜用在本发明水剂中的载体和载体浓度相同。

    优选的冻干制剂含有约1-1250μg/ml NGF，15-45mg/ml蔗糖，15-45mg/ml甘露糖醇，任意的7-9mg/ml NaCl，和0.1-0.7mg/ml柠檬酸，pH在约5.5-6.5。最优选的冻干NGF制剂含有100-1250μg/mlNGF，30mg/ml蔗糖，30mg/ml甘露糖醇，5mg/ml人血清白蛋白，任意的8.7mg/ml NaCl，和0.3mg/ml柠檬酸。该冻干制剂最优选的pH约为6.0。

    本发明冻干制剂被冻干为残留湿度小于2％，然而在较高或较低的湿度时保持NGF生物活性的制剂也是可以实现的。

    优选的冻干制剂含有0.001-1.25份神经生长因子，30-90份糖，和小于1份的水。

    冻干的NGF制剂可以用稀释剂进行再组合，稀释剂中可能需要含有缓冲剂如柠檬酸和盐如氯化钠，以便所得再组合制剂与液体水剂相似，即1-1250μg/ml NGF，1-12.5mg/ml HSA，5-10mg/ml NaCl，0.2-3.0mg/ml柠檬酸，1.5-30mg/ml蔗糖和1.5-30mg/ml甘露糖醇，pH5.2。

    本发明冻干的NGF制剂还可用作药包的成分以提供稳定冻干NGF的简便和经济的方式，该方式可以用适当的载体迅速和容易地再组合给需要治疗的病人使用。除冻干的NGF制剂外，本发明药包还包含再组合载体。该再组合载体包含灭菌水和足量的盐以使最后的再组合制剂基本等渗。该再组合载体还包含其它缓冲剂。该药包中的再组合载体的总量应该能充分达到对适于需要治疗的患者的最终给药NGF浓度。在本发明优选实例中提供了含有两个小瓶的药包。一个小瓶盛着本发明灭菌的冻干NGF制剂，另一个盛着灭菌的再组合载体。使用药包时，要将适当量的再组合载体装入盛有冻干NGF制剂的小瓶中。冻干制剂溶解之后，再组合制剂可以立即用于病人。

    由于本发明再组合制剂的长期稳定性，制备足够的再组合制剂以获得多倍剂量是可能的。

    本发明制剂可用于治疗患有对NGF疗法敏感病的患者。典型地，这些制剂是无菌的，并且适于静脉，肌内，非肠道和内脑室(intracerebroventricular)给药。这种疗法可用于治疗神经元机能障碍包括神经元损伤或NGF敏感神经元退化。NGF特别适于治疗由于中枢胆碱能神经元的损失引起的疾病如阿尔茨海默病。NGF用于治疗阿尔茨海默病和其它形式的痴呆被公开在EP 0 370 171中。

    用作治疗痴呆的本发明制剂可以各种途径给药，这取决于具体的应用。最适宜的途径取决于涉及的用途和患者。

    为了克服由于脑血障碍引起的困难，可将NGF通过直接静脉注射或经过药物包覆植入或用泵给药到CNS。其它给药途径是经过内脑室插管装置进行连续灌注。另外，NGF与载体分子如转铁蛋白的结合对于穿透脑血障碍可能是必要的。

    NGF的有效治疗量约为每天0.001-0.5mg，优选约每天0.01-0.10mg，最优选约每天0.02-0.06mg。给药的精确剂量和方式将取决于许多因素，如给药途径和接受治疗患者的严重程度。

    分析方法

    用反相HPLC对NGF的定性和定量

    NGF的定性和定量通过用反相HPLC(Hewlett Packard HP 1090Liquid Chromatograph)分析装在4-6mm×25cm L Dynamax(RaininInstrument Co.，Woburn，MA，USA)300 A 5μm分析反相柱中的100μl样品进行的，该柱具有Dynamax 300 A 5μm 4.6mm ×1.5cm保护柱和定在220nm的二极管分析UV检测仪。流动相是(A)0.1％三氟乙酸的水和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈，其中梯度为在45分钟内流速0.5ml/min压力1700-2000psi和室温下从25％(B)到60％(B)。

    NGF的定性通过将样品的保留时间与从同一批NGF得到的新制备校准的标准NGF的保留时间进行比较。样品中NGF的定量通过与用已知浓度的连续稀释得到的标准曲线比较进行计算。

    用ELISA测定NGF的浓度(μg/ml)

    NGF的浓度也用ELISA测定。分析标准和样品一式三份。每盘包括完整的NGF标准曲线和没有NGF的参考空白。

    将100μl包衣抗体(抗rhNGF培养的小鼠单克隆24C1)加入到一个96井分析盘的每个井中后，将盘在Saran wrap中用湿纸巾覆盖，并在冰箱2-8℃培养过夜。将井到空，用Wheaton自补型针管按250μl/井冲洗缓冲液(含有500mM Tris，2M氯化钠，缓冲至pH7)洗涤3次，并拍干。接着将200μl保护缓冲液(1％牛血清白蛋白)加入到每个井中以阻断非特异性位点，每个井中加入50μl样品并将该盘在室温最少培养1小时同时在平台振荡器上混合。将这些井再到空并拍干，加入50μl标准和样品溶液。然后将盘盖住并在室温培养2小时。将盘中的井再倒空，用冲洗缓冲液洗涤4次并拍干。在每个井中加入50μl生物素化抗体(抗rhNGF上升的鼠单克隆8Cl)，将盘盖住培养2小时。将盘中井倒空，用上述方法洗涤和干燥，再在每个井中加入50μl辣根过氧化物酶共轭的抗生蛋白链霉素。将盘盖住，在室温且在一个平台振荡器上混合的同时培养20分钟。将该盘用洗涤缓冲剂洗涤5次。在每个井中加入50μl邻苯二胺(OPD)培养基缓冲液，将盘盖住，在暗处培养1小时。

    用Vmax Kinetic Microplate(Molecular Devices，MountainView)读数器测定每个井的吸收。对于每个井，在650nm的背景吸收要从450nm的峰值吸收中减去以得到净吸收。通过比较NGF标准曲线来确定样品中NGF的浓度。

    NGF活性的测定

    用PC-12生物鉴定来测定NGF的生物活性。PC-12生物鉴定是基于暴露于NGF之后的PC-12嗜铬细胞瘤细胞(Greene，Trends Neurosci.，7：91，1986)的代谢活性的增加。PC-12细胞的代谢活性是通过3-[4，5二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴(C18H16N5Br)(MTT)的细胞摄入来测量的，吸收后，该物质被细胞脱氢酶转化成不可溶的细胞内蓝色晶体。

    96井盘中的每个井都盛有50μl RPMI-1640介质(Sigma)，内有约30,000个PC-12细胞。每个样品和标准经连续稀释被制成每毫升RPMI-1640中带有0.2％牛血清蛋白(BSA)和0.006-400ng rhNGF的溶液。然后在每个井中加入每种溶液50μl以得到每毫升0.003-200ng NGF浓度，并一式三份测定每个浓度。在37℃和5％CO2中放置该盘2天后，在每个井中加入10μg MTT，并将该盘继续培养4小时。将一定体积的20％SDS的50％二甲基甲酰胺(DMF)(pH4.7)加入，然后用透明纸包裹该盘，密封在塑料包中，并在37℃培养过夜。第二天用Vmax读盘计在575nm处读取盘的数据。样品曲线的ED50与标准曲线的ED50的比值提供了两种制备物的相对效力的测量。

    实施例1

    NGF制剂

    制备含有1，10，100，和1000μg/ml rhNGF，5mg/ml HSA，8.7mg/ml氯化钠，2.1mg/ml柠檬酸和制备10ml制剂所需充足的水的水剂，用缓冲剂调节至pH5.2。在约70％总体积内溶解柠檬酸和盐后，用NaOH/HCl调节pH值。轻微搅拌的同时加入HSA和NGF，接着加水达到所需体积。将该水剂通过0.2μMillipore Millex-GV过滤器过滤。

    用来制备水剂的rhNGF用杆状病毒表达载体在昆虫细胞内的表达，并通过离子交换和反相色谱纯化，如Barnett，J.，et al.，Exp.Neurol.，110：11-24，1990中所述。

    实施例2

    NGF水剂在5℃和25℃的稳定性

    将实施例1的100μg/ml NGF制剂的250μl等份在5℃和25℃(RT)存放于聚乙烯滴瓶中6个月。对这些样品进行RP-HPLC，ELISA和生物鉴定分析(如上所述)，表明6个月之内没有蛋白质损失(表1)。

    表1.用RP-HPLC，ELISA和PC-12生物鉴定

    测量NGF在5℃和25℃的稳定性

               RP-HPLC  RP-HPLC  RP-HPLC  RP-HPLC   RP-HPLC   ELISA    生物鉴定存储           ％LS   ％LS   ％LS   ％LS    ％LS      ％LS     相对效力温度(℃)        1周      2周     3个月    4个月     6个月     6个月    6个月5℃            99±2    99±6    96±4    100±3    101±3    100±6   106±14R.T.(22-25℃)  99±2    91±5    95±5    103±3    99±5     104±13  123±3(RP-HPLC数表示平均值±2-4次重复过程的标准偏差。生物鉴定数表示平均值±3次测定的95％置信限。)

    实施例3

    在37℃存放于聚乙烯导管中的各种制剂的稳定性

    将含有从1至1000μg/ml rhNGF(如实施例1所述得到)的NGF制剂的250μl等份在37℃存放在不透射线的聚乙烯导管(内径0.030英寸，外径0.048英寸)中4周。结果列于表2，表明蛋白质含量(RP-HPLC测量结果)或NGF活性(PC-12生物鉴定)无明显损失。

    表2.用RP-HPLC和PC-12生物鉴定测量37时

    聚乙烯导管内NGF制剂的稳定性[NGF]          ％LS     ％LS      ％LS      ％相对效力在时间零点     1周      2周       4周          4周(μg/ml)     RP-HPLC  RP-HPLC    RP-HPLC   PC-12生物鉴定1.0          104±3    87±6     85±3       101±3410.0         94±14    92±4     100±1      118±45100.0        102±4    95±6     95±2       129±341000.0       107±2    92±4     86±3       108±33(RP-HPLC数表示平均值±2-4次重复过程的标准偏差。生物鉴定数表示平均值±3次测定的95％置信限。)

    实施例4

    NGF制剂在各种传输器械中的稳定性

    将实施例1的100μg/ml NGF制剂各等份分别装入Infusaid Model600可植入注入泵(Shiley-Infusaid Inc.，Norwood，MN)和Medtonics Sychromed可植入注入泵(Medtronics Inc.Minneapolis，MN)或Alzet Model 2ML 4微渗透注入泵(Alza Corp.，Palo Alto，CA)。将上述泵放入37℃水浴中，使制剂开始从泵流出。在4周的时间内每周收集一次样品，用RP-HPLC，ELISA和PC-12生物鉴定分析蛋白质的含量和活性。

    表3中的数据表明没有观察到NGF的浓度和活性有明显减弱。

    表3.在37℃，一个月内，NGF制剂在各种传输器械中的稳定性

             ％LS      ％LS    ％LS    ％LS     ％相对效力

             1周       2周      4周      4周          4周传输系统   RP-HPLC   RP-HPLC  RP-HPLC   ELISA     PC-12生物鉴定InfusaidModel600    91±3     101±3   112±4   90±11      100±36可植入泵MedtronicsSynchromed  109±2    92±2    91±3    97±4        90±6可植入泵Alzet 2ML4渗透微泵    96±3     95±7    90±5     n.d.         n.d.(RP-HPLC数表示平均值±2-4次重复过程的标准偏差。生物鉴定数表示平均值±3次测定的95％置信限。)n.d.＝没有测定。

    实施例5

    在pH4-10时NGF制剂稳定性的研究

    用实施例1的方法制备含有100μg/ml NGF，1mg/ml HSA和9mg/ml氯化钠，并用缓冲剂调节pH值从4至10的水剂，并通过0.2μ过滤器(Millex-GV，Millipore Corp.)消毒过滤。pH4-5的制剂用乙酸盐缓冲，pH6-10的制剂用Tris缓冲。1ml等份被送入聚乙烯滴端小瓶中，然后同时在室温(23-25℃)和37℃下培养。在各时间点取出样品，用RP-HPLC分析。第一批反应率常数，代表溶液中NGF的损失，作为pH值的函数被画出。结果发现，溶液中NGF降解速率在pH值小于约4.5和大于约6.0时增加。最稳定是在pH5.2时。

    实施例6

    NGF制剂的稳定性作为载体浓度的函数

    对载体的类型和数量进行了试验以确定其对NGF稳定性的作用。制备实施例1的100μg/ml水剂和含有其它载体的水剂，列于表4。每种制剂均通过0.2μMillipore Millex-GV过滤器消毒过滤。各种制剂中的NGF的稳定性是通过在37℃在聚乙烯滴瓶中培养NGF组合物来确定。2周后取出样品，用RP-HPLC分析蛋白质含量。

    表4.在37℃培养2周，各种NGF制剂的稳定性

    赋形剂    数量(％w/v)    2周的％LS

     明胶        1.0           64±9人血清白蛋白     0.1           48±7人血清白蛋白     0.5           99±2人血清白蛋白     1.0           31±36  Tween 80       0.2           77±9Pluronic F-68   0.02           65±5(RP-HPLC数表示平均值±2-4次重复过程的标准偏差。)

    实施例7

    用于冻干的NGF制剂

    在室温下制备含有100μg/ml NGF，30mg/ml蔗糖，30mg/ml甘露糖醇，5mg/ml HSA和0.3mg/ml柠檬酸的NGF水剂，并用NaOH调节pH至6.0。在约70％总体积中溶解柠檬酸和糖后，调节pH，轻柔搅拌的同时加入HSA和NGF，加水使体积达到要求。

    实施例8

    NGF制剂的冻干方法

    对实施例7制剂中NGF水剂的冻干稳定性进行测试。根据实施例7制备的NGF制剂的1ml等份被放置在5ml的I型玻璃小瓶中，并用冻干塞盖住。将盛放有该制剂的小瓶放入冷冻干燥箱(FTS Systems Inc.)内，在开始冷冻之前将其平衡在5℃。然后将箱内温度降至-40℃，在-40℃浸泡2小时后，将箱内排空，吹入氮气控制压力在80-100毫托(mτ)。以每小时4℃的速率升高温度直到达到最终干燥温度25℃。进入循环近30小时后，达到产物的最终湿度在1％和2％之间。

    将冷冻干燥的粉末存放在5℃下，3天后用1ml由8.7mg/ml氯化钠和1.1mg/ml柠檬酸组成的稀释剂在室温下再组合，用缓冲剂调节至pH5.2。用RP-HPLC分析样品的NGF浓度，发现冻干之后没有蛋白质损失。

    实施例9

    在2-8℃，NGF制剂存放在玻璃小瓶中的稳定性研究

    用实施例1所用方法，只是将每批量增加到1.5升，制备含有100或1000μg/ml rhNGF的水剂。将各4.2mL等份放入类型I燧石玻璃小瓶中，用带特氟隆表面的丁基橡胶塞子塞紧，存放于2-8℃。下列表5所示的结果表明，蛋白质含量(RP-HPLC和ELISA测得)或NGF活性(PC-12生物鉴定测得)没有明显损失。

    表5.用RP-HPLC，ELISA和PC-12生物鉴定测量

    NGF制剂存放在2-8℃时的稳定性

             RP-HPLC   RP-HPLC    ELISA    PC-生物鉴定

              ％LS+     ％LS+     ％LS+       ％LS+标称[NGF]     初始     12个月    12个月      12个月100μg/ml    103±1    101±1    102±3      l02±l51000μg/ml   102±1    101±1    108±3      102±20

    用反相HPLC对NGF定性和定量

    在实施例9中，所用方法如下：

    用反相HPLC(Hewlett Packard HP1090液相色谱仪)，配有4-6mm×250mm Bakerbond Wide-Pore Butyl(C4)300A孔径(J.T.Baker Inc.Phillipsburg NJ，USA)和设在210nm的二极管UV检测仪，对100μl样品进行分析从而获得NGF的定性和定量结果。流动相是(A)0.2％三氟乙酸的水和(B)缓冲液(A)的60％乙腈，其中梯度变化为在65分钟内，流速1.0mL/分钟，在室温和110巴压力下从29％(B)到75％(B)。

    因此，使用了上述的在分析方法之下所描述的HPLC程序。