一种细菌源蛋白酶抑制剂新基因及其表达与应用.pdf

一种细菌源蛋白酶抑制剂新基因及其表达与应用。本发明公开了一种新的细菌源蛋白酶抑制剂基因DNA序列及其编码的蛋白质序列，发明涉及细菌抗虫性关键基因和酶，属于基因工程和蛋白质工程领域。该发明基因DNA序列及其编码的氨基酸序列为伯氏嗜线虫致病杆菌中的首次报道。该基因表达的蛋白质对蛋白酶活性具有明显的抑制作用。生物活性测定表明该基因编码的蛋白质能降低桃蚜生殖率，提高桃蚜死亡率，有好的抗虫功能。本发明将为生物农药的研制和转基因抗虫植物提供新基因，在害虫治理领域具有良好的应用前景。该基因及其编码的蛋白质也能用于医药和生化领域。

1.  一种分离的编码蛋白酶抑制剂的多核苷酸分子SEQ ID NO.1，所述的多核苷酸分子包括与下列条件之一基本相符合的核苷酸序列：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；部分SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列并具有相似功能的片断。

2.  根据权利要求1所述的分离的蛋白酶抑制剂多核苷酸分子，其中所述的多核苷酸分子包含与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列基本相符合或部分符合的核苷酸序列。

3.  一种蛋白质，该蛋白质包括氨基酸序列SEQ ID No.2。

4.  根据权利要求3所述的蛋白酶抑制剂，其中蛋白酶抑制剂包括与SEQ ID No.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。

5.  一种表达载体或一种宿主细胞，其特征在于它含有基本及部分如权利要求1-2所述的DNA序列。

6.  一种重组微生物，该重组微生物的特征在于它由权利要求1-2中任何一个的多核苷酸分子转化得到并表达该多核苷酸分子，或根据权利要求1-5重组的微生物，该重组微生物的特征在于它含有与SEQ ID NO.1基本及部分相符合的多核苷酸分子或该多核苷酸分子表达与SEQ ID No.2基本及部分相符合的氨基酸序列。

7.  一种药物组合物，其特征在于，它含有如权利要求1-5所述的蛋白酶抑制剂或如权利要求6所述的重组微生物或工程菌株的发酵液。该组合物被用于制备蛋白酶抑制剂类的生物杀虫药剂或应用于医药和生化领域。

8.  一种生产蛋白酶抑制剂的方法，包括在适合于编码蛋白酶抑制剂的多核苷酸分子表达的条件下培养一种根据权利要求6所述的微生物以及回收、提纯表达蛋白酶抑制剂的方法。

9.  一种杀死有害昆虫的方法，所述的方法包括将根据权利要求6所述的重组微生物及其表达产物的有效剂量与一种可接受的农用载体混合的方式应用到害虫治理中。

10.  一种由根据权利要求1-2的任一个的多核苷酸分子转化并表达该多核苷酸分子的植物。所述的植物可以是易受有害昆虫摄食而造成损害的任何具有农业、林业、园艺或装饰价值的植物。该基因可作为目的基因导入植物，提高植物抗虫性或进行植物品种性状改良等。

一种细菌源蛋白酶抑制剂新基因及其表达与应用
技术领域
本发明公开了一种蛋白酶抑制剂基因DNA序列及其编码的蛋白质序列，属于基因工程和蛋白质工程领域。本发明涉及微生物抗虫性关键基因和酶，也涉及蛋白酶抑制剂在医学和生物化学等领域中的研究、生产和应用。
背景技术
蛋白酶抑制剂基因在农业、医药领域的应用已经越来越受到人们的重视。蛋白酶抑制剂基因不但可以直接用于生产生物农药，而且可以用于转基因植物来提高植物的抗虫性；蛋白酶抑制剂对哺乳动物安全性好，没有环境污染和在农产品中的残留问题，能提供一类安全，有效治理虫害的新途径；蛋白酶抑制剂基因也可以用于治疗胰腺炎、抗肿瘤、防治脑血管疾病等医药方面。
生物源蛋白酶抑制剂广泛存在于植物、微生物和动物中，是一类抑制蛋白酶活性的蛋白质。根据与蛋白酶抑制剂相结合的蛋白酶活动中心氨基酸种类的不同，蛋白酶抑制剂基因家族可划分为4类：丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、金属蛋白酶抑制剂基因、半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因、天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因。
目前，国内外对蛋白酶抑制剂研究主要集中于动植物中，而对微生物源蛋白酶抑制剂的研究则很少。近年来，昆虫病原线虫共生菌的研究及其应用越来越受到人们的关注。昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌，属肠杆菌科。现已描述的共生菌有两个属：嗜线虫致病杆菌属(Xenorhabdus)和发光杆菌属(Photorhabdus)。在昆虫病原线虫-共生菌复合体对昆虫的致病作用中，起主要作用的是共生菌。当线虫进入昆虫体内后，即在昆虫血腔内释放共生菌，共生菌大量繁殖并分泌包括蛋白酶抑制剂在内的多种蛋白质，在短时间内使昆虫死亡。由于这类蛋白具有高效、杀虫谱广和杀虫迅速等诸多优点，从共生菌中克隆蛋白酶抑制剂基因用于生物农药的研制和转基因抗虫作物的开发，以延缓害虫对很多现有抗虫基因，如Bt基因的抗性具有重要价值。本发明在伯氏嗜线虫致病杆菌中首先发现了蛋白酶抑制剂基因，在现有蛋白酶抑制剂大多数来自植物和动物的情况下，增添了一种来源于微生物的新型蛋白酶抑制剂基因。
发明内容
本发明包括以下内容：
1.本发明提供一种分离的编码蛋白质的多核苷酸分子SEQ ID NO.1，所述的多核苷酸分子包括与SEQ ID NO.1基本相符合的核苷酸序列以及与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列部分相符合并具有相似功能的片断。
2.本发明提供一种蛋白质，所述的蛋白质包含与SEQ ID No.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。
3.本发明提供一种表达载体或宿主细胞，其特征在于它含有基本及部分相符合的SEQ ID NO.1序列。
4.一种重组微生物或工程菌株，该重组微生物的特征在于它含有以上1-2所述的基本及部分相符合的多核苷酸分子转化得到并表达该多核苷酸分子，或根据权利要求3所述的重组微生物，该重组微生物的特征在于它表达的蛋白质含有与SEQ ID No.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。
5.一种药物组合物，其特征在于它含有以上1-4所述的重组微生物或工程菌株的发酵液或产物。该组合物被用于制备蛋白酶抑制剂类的生物杀虫药剂或应用于医药和生化领域。
6.一种生产蛋白酶抑制剂的方法，包括在适合于编码蛋白酶抑制剂的多核苷酸分子表达的条件下培养一种以上1-5所述的微生物以及回收和提纯重组微生物表达蛋白质的方法。
7.一种杀死有害昆虫的方法，所述的方法包括将SEQ ID NO.1作为目的基因导入原核表达系统，构建具有杀虫功能的工程菌株，将有效剂量的以上1-6所述的重组微生物及其表达产物与一种可接受的农用载体混合的方式应用到害虫治理中。
8.一种以上1-3的任何一个的多核苷酸分子转化并表达该多核苷酸分子的植物，所述的植物可以是易受有害昆虫摄食而造成损害的任何具有农业、林业、园艺或装饰价值的植物。该基因可作为目的基因导入植物，提高植物抗虫性，进行植物品种改良；而且填补了该类蛋白酶抑制剂在植物虫害防治领域的空白。
9.本发明得到的基因及其编码抑制剂蛋白质也可以应用于医药和生化领域，用于蛋白质工程，生产蛋白酶抑制剂制品等。
文中涉及核苷酸序列的地方使用“基本相符”这一术语是想包含那些不会造成编码的蛋白质发生改变的核苷酸序列的变化.此外，使用这一术语还想包含那些在特殊体系中需用来增加表达但这些变化不会导致编码的蛋白质生物活性降低的序列上的其它变化。文中涉及氨基酸序列的地方使用“基本相符”这一术语是想包含那些不会导致蛋白酶抑制剂生物活性降低的氨基酸序列上的变化.这些变化可能包括保守的氨基酸替代等。
有益效果
1.本发明公开了一种蛋白酶抑制剂基因(XbPI-1基因)及其所编码的蛋白质。该蛋白酶抑制剂基因为伯氏嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)中的首次报道，本发明将为蛋白酶抑制剂的应用如转基因抗虫植物以及环境友好型生物农药的开发提供新基因。该基因可作为目的基因导入原核表达系统，构建具有杀虫功能的工程菌株或用于转基因抗虫作物的开发。有望应用于生物途径生产蛋白酶抑制剂。该基因及其编码的抑制剂蛋白也可以用于医药和生化领域中蛋白酶抑制剂的生产和应用。
2.本发明提供的XbPI-1基因具有抑制蛋白酶活性的功能。生物活性测定表明该基因编码的蛋白质对桃蚜有很强的毒杀作用。
3.XbPI-1基因及其编码产物也可用于蛋白质工程，生产蛋白酶抑制剂，或用于医学、生化领域。
附图说明
图1：重组表达蛋白质对桃蚜死亡率(％)的影响。对照1：磷酸缓冲液；处理1：纯化表达蛋白质；对照2：未诱导的菌体粗提液；处理2：诱导4h的菌体粗提液。
图2：重组表达蛋白质对桃蚜繁殖数的影响。对照1：磷酸缓冲液；处理1：纯化表达蛋白质；对照2：未诱导的菌体粗提液；处理2：诱导4h的菌体粗提液。
下面将引用非限定性实例和附图对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实例1
选用本实验室采集、筛选的伯氏嗜线虫致病杆菌“BJFS”过夜培养的菌液提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增。回收PCR产物与pMD18-Tvector连接转化感受态细胞DH5α，将转化完成的菌液接种于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取阳性菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养液中，200rpm/min培养约9h，提取质粒，用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI进行双酶切鉴定，将鉴定过的克隆送去测序。从大量序列测序结果中，获得了蛋白酶抑制剂基因。本发明基因(XbPI-1)DNA序列SEQ ID NO.1为伯氏嗜线虫致病杆菌中的首次报道，该基因的序列完整，包括完整的启动子和终止子序列。BLAST的结果证明：从伯氏嗜线虫致病杆菌“BJFS”中得到的基因为一新的蛋白酶抑制剂基因。该基因编码产物对蛋白酶活性具有明显的抑制作用，在害虫治理如转基因抗虫植物或医药和生化领域具有良好的应用前景。
实例2
上述获得的伯氏嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)蛋白酶抑制剂基因XbPI-1的DNA序列SEQ ID NO.1，其编码的蛋白质含有119个氨基酸，SEQ IDNO.2。经在数据库中比较，蛋白酶抑制剂基因XbPI-1编码的蛋白质与数据库中Xenorhabdus nematophila、Photorhabdus sp.Az29的蛋白酶抑制剂基因的氨基酸序列相似性分别为77％、60％，与Photorhabdus luminescens subsp.Erwiniachrysanthemi、Pectobacterium chrysanthemi的氨基酸序列相似性均小于60％。
实例3
根据实施例1得到的XbPI-1基因全长序列，使用pQE30UA表达载体，将实施例1中得到的PCR产物电泳回收，回收的基因片段与pQE30UA表达载体于16℃条件下，连接2h，转化大肠杆菌M15感受态细胞，涂布于LB固体培养基(含Amp和Kana抗生素)，得到的抗性菌落，挑取抗性菌落经液体LB培养基培养，分别做PCR初步鉴定，提取质粒测序，确定构建的表达载体读码框正确。
实例4
按照实施例4构建的工程菌株，进行表达研究。经过转化子筛选、SDS-PAGE检测、蛋白的提纯、活性测定等实验，证明该基因表达产物具有蛋白酶抑制剂活性，而且生物活性测定结果表明该表达蛋白质对桃蚜生殖和死亡率有显著影响，因此，XbPI-1基因具有很好的抗虫功能，在害虫治理上具有良好的应用前景。
实例5
重组表达的蛋白酶抑制剂蛋白质对桃蚜的生物活性：实例5对桃蚜的生物活性测定包括2个对照和2个处理，5个重复，对照1为磷酸缓冲液(pH：7.4)；对照2为未诱导菌株提取物；处理1为纯化表达蛋白质；处理2为诱导表达4h菌株提取物。每个处理50头桃蚜。从实验当日起，第5天观察记录桃蚜的死亡率、繁殖数，并做统计分析，实验结果用平均死亡率和平均繁殖数来表示。平均死亡率的计算方法为：(对照或处理的总死亡虫数/对照或处理的总试虫基数)×100％；平均繁殖数的计算方法为：对照或处理的总繁殖数/对照或处理的重复基数。试验结果见附图1和附图2。
结果表明：处理组的桃蚜死亡率均显著高于对照组桃蚜的死亡率(图1)；处理组的桃蚜平均繁殖数均显著低于对照组的繁殖数(图2)。生物活性测定结果表明该抑制剂蛋白质对桃蚜的生长和繁殖有很强抑制作用，该抑制剂蛋白也能显著提高桃蚜的死亡率。因此，XbPI-1基因具有很好的抗虫功能，在害虫治理如转基因抗虫植物上具有良好的应用前景。
综上所述，本发明公开了一种蛋白酶抑制剂基因(XbPI-1基因)及其所编码的蛋白质。该基因为伯氏嗜线虫致病杆菌中的首次报道，该基因表达的重组蛋白酶抑制剂对蛋白酶具有明显的抑制作用；本发明实例证明该基因表达的重组蛋白质能降低桃蚜的生殖率，提高蚜虫的死亡率。生物活性测定结果表明XbPI-1基因具有很好的抗虫功能，XbPI-1基因可作为目的基因导入原核或其他表达系统，构建具有杀虫功能的工程菌株或将该基因作为目的基因导入植物，来进行植物品种改良，提高植物的抗虫性。因此XbPI-1基因在害虫治理如转基因抗虫植物上具有良好的应用前景。除以上用途外，该基因也有望用于生物途径生产蛋白酶抑制剂，应用于医学和生化等领域。
序列表
SEQ ID NO.1：
ATGTTTTCTCTTTTTTTGATTGGAGGATGTATGGCGAGTAGTTTGAGACTTCCTGAACCAG
CTGAACTGAAAGGGTTATGGCAGCTATCAGATGGAAATCAGGTATGCAGTATTGAATTAA
CGGATACCCGTTTGCCTGAGGGGTCCATTTGGGCGCTGAAAGGTGATTCTTGCCTGACCG
AACTGATGAGGAACCCTGTAAAGGGCTGGCGTCCTACACCTGATGGTATCACTTTGACTG
ACGATGATGGCAATAGTCTGGCCTTTTTTGGTCATGAGTCCGAGCAATGGGTGGCATACC
TTGTTGATGGGCGGGAACTCGTTATGACATTCAGTGGCACGCATTCTGTGACAAAGTAA
SEQ ID NO.2：
MFSLFLIGGCMASSLRLPEPAELKGLWQLSDGNQVCSIELTDTRLPEGSIWALKGDSCLTELMRNPVKG
WRPTPDGITLTDDDGNSLAFFGHESEQWVAYLVDGRELVMTFSGTHSVTK