4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9 —三氮杂十一烷二酸的钙配合物 本发明涉及4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸的钙配合物及其盐，含有这些配合物的药物，制备用于降低由重金属引起的影响的该药物及其制备方法。
在药物中，各种配位化合物特别是用于治疗重金属中毒、缺铁疾病以及用于制备显影诊断用的药物。
在EP71564中，描述了用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)钆(III)配合物的麦格鲁明(meglumine)盐作为NMR层面X线照相术的造影剂。商品名为Magnevist(R)的含该复合物的制剂作为第一NMR造影剂得到了全球范围内的认可。这种造影剂经静脉注射后在细胞外分散，并且经肾小球分泌由肾脏排出。实际上未观察到通过完整的细胞膜。Magnevist最适用于病理部位(例如炎症、肿瘤)的造影术。
含DTPA或Ca—DTPA的化合物临床上还用于金属中毒。铁配合物通常用于缺铁性贫血，而放射性同位素配合物(例如99mTc—DT-PA)用于闪烁法。
当用作NMR和X线诊断造影剂时，EP405704建议，这些化合物在肾外排出，因而适合于肝、胆囊和胃肠道造影术。
这些已知的配合物及其盐在其临床应用中会引起相容性和/或配合物体内稳定性的问题。迄今为止还不能有利地将重金属元素本身用作X线造影剂的成分，因为这些化合物的相容性是不令人满意的。对于到目前为止所建议的和用于核旋转层面X线照相术的顺磁物质来说，其在动物试验中的有放剂量和毒性剂量的差距比较小。
因此，需要能降低由重金属所造成地影响的药物。
本发明的目的是有效地制备这种化合物和药物，以及提供其制备方法。通过权利要求书中特征化的主题可以达到该目的。
已经发现，4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸的钙配合物(Ca—EOB—DTPA)及其盐特别适用于制备可降低由重金属引起的影响的药物。尤其是，Ca—EOB—DTPA适合于除去肝脏中沉积的重金属。
术语EOB—DTPA可以使用下列同义语，即各种对映体(4S或4R)形成或其任何混合物。
Ca—EOB—DTPA能够出人意料地消除金属沉积，例如在重金属中毒后从体内、特别是从肝脏中排除。如实施例中所述，通过服用Ca—EOB—DTPA可以降低肝和肾中锌的含量。
此外还发现，将Ca—EOB—DTPA加至用于NMR诊断的Gd—EOB—DTPA中可以降低肝脏和骨中钆的含量(参见实施例)。通过对动物模型的药物动力学检查表明Ca—EOB—DTPA…与GdEOB—DTPA类似—出人意料地主要通过肝脏消除了(参见实施例)。由于消极加入的同样3倍量的Ca—DTPA没有进入肝脏，因而是特别出人意料的。因此加入Ca—EOB—DTPA还从肝脏中定量消除了非配位结合的钆。
因此，本发明涉及4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸的钙配合物以及这些配合物与生理相容的无机和/或有机阳离子的盐，这些阳离子是例如钠、钾、麦格鲁明、乙醇胺、二乙醇胺、吗啉、葡糖胺、二甲基葡糖胺、赖氨酸、精氨酸和/或鸟氨酸。
本发明还涉及用Ca—EOB—DTPA及其盐制备药物制剂、特别是抗重金属中毒的解毒药的用途。制备本发明化合物
从4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸—五叔丁基酯[如EP405704A2(实施例8)所述]开始制备本发明化合物。
首先将该五酯与三氟乙酸反应制备游离的配位剂。按照EP71564、EP130934和DE—OS3401052专利说明书中公开的方法从该配位剂制备本发明的配合物。
通过与氢氧化钙溶液反应将此配位剂转化为钙配合物(Ca—EOB—DTPA)。然后，如果需要，用无机和/或有机碱或氨基酸将所存在的酸基上的氢原子取代。
在这种情况下，用无机碱(例如氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)如钠、钾或锂盐和/或有机碱如伯、仲和叔胺(例如乙醇胺、葡糖胺、N—甲基—和N，N—二甲基葡糖胺)以及碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸进行中和。
由于该配合物含有3个游离酸基，它可以形成既含无机阳离子、又含有机阳离子作为抗衡离子的中性混合盐。
可以通过例如下述方法实现这一目的，即将此配位剂在水悬浮液或溶液中与氧化钙或钙盐反应，得到所需元素的氧化物或盐，用1/3或2/3量的所需有机碱中和，分离所形成的配位盐，任意地进行纯化，然后与所需量的无机碱混合，以完全中和。加碱的顺序也可以反过来。
通过Gd—EOB—DTPA与DTPA的钙配合物在升高的温度下反应，可以制备由Ca—EOB—DTPA与Gd—EOB—DTPA组成的混合物。通过再配合，可以得到所需Ca—EOB—DTPA配合物与Gd—EOB—DFPA的混合物。在该方法中也可以进行上述中和。
可以按照本领域已知的方法制备本发明的药物，即将本发明配位化合物—任意地加入盖仑制剂常用的添加剂—悬浮或溶解于含水介质中，然后任意地将此悬浮液或溶液灭菌。适合的添加剂是例如生理上无害的缓冲液(例如三甲胺)、电解质(例如氯化钠)和抗氧剂(例如抗坏血酸)。
如果本发明药物的悬浮液或溶液需要是肠道服用的或用于其他目的的水溶液或生理盐溶液，则将其与一种或多种盖仑制剂常用的辅剂混合，这些辅剂是例如甲基纤维素、乳糖或甘露糖醇和/或表面活性剂(例如卵磷脂、吐温(R)或Myri(R))和/或改善味觉的调味物质(例如香精油)。
原则上甚至可以不分离该配位盐，即制备本发明的药物。但是一定要采取具体的保护以保证螯合，这样在本发明的盐和盐溶液中实际上就不存在有毒性作用的未配合金属离子。
本发明药物含有1μmol/l—1mol/l配位盐，优选0.5mmol/l—250mmol/l，一般的剂量为0.005—2mmol/kg体重，优选50μmol/kg—500μmol/kg。该药物经肠道和非肠道施用。
因此，本发明还涉及这些化合物和药物的上述制备方法。
下列实施例用于更详细地解释本发明的目的。
实施例制备4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸钙配合物三钠盐
方法1a)4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9三氮杂十一烷二酸
将3.64g 4—(4—乙氧基苄基)3，6，9—三(羧化甲基)3，6，9—三氮杂十一烷二酸—五叔丁基酯(其制备方法参见EP0405704A2，Schering AG，Berlin，实施例8a)溶于25ml三氟乙酸。将其在室温搅拌1小时，与150ml乙醚混合，吸滤出沉淀。于40℃真空干燥该沉淀，然后将其溶于200ml水中，并与2g阴离子交换剂Amberlite IRA67一起搅拌15分钟。将其过滤，并将此溶液与0.5g活性炭一起搅拌30分钟。滤出活性炭，将其冻干3次以除去残余的三氟乙酸，得到1.2g所需化合物，为白色粉末。
分析(相对于无水物质)：
计算值：C52.36％ o6.31％ N7.97％
实测值：C52.21％ H6.39％ N7.84％b)4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氯杂十一烷二酸钙配合物三钠盐
将4.22g 4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸(8mmol)在100ml水中与0.59g(8mmol)氢氧化钙混合。搅拌15分钟，同时将其与24ml 1N氢氧化钠溶夜混合。将所得溶液经膜过滤器过滤以除去少量悬浮物质，然后冻干。得到4.9g白色粉末状的所需化合物，其中水含量为9.4％。
分析(相对于无水物质)：计算值：C 43.74％ H 4.47％ Ca 6.35％ N 6.65％ Na 10.92％实测值：C 43.91％ H 4.60％ Ca 6.27％ N 6.61％ Na 10.62％
熔点：至300℃该配合物仍不熔化。
旋光率：[α]D＝+7.2°(c＝1.0，在甲醇中)c)4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸钙配合物麦格鲁明盐
如果用24ml 1N甲基葡糖胺溶液代替实施例b中的氢氧化钠溶液，则可以得到相应的三麦格鲁明盐。
方法2
另一种方法是从4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸—五叔丁基酯开始，在该方法中，不分离配体4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸，而是在溶液中同样地将其进一步转化为4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸钙配合物三钠盐：
将21.4g(26.5mmol)4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸—五叔丁基酯在150ml甲醇中的溶液与16ml 15N氢氧化钠溶液一起回流5小时。
在旋转蒸发器上真空除去甲醇，与190ml水混合，在搅拌下分批加入足够量的阳离子交换剂IR—120，直到pH达到3.0。滤出离子交换剂，用水洗涤该残余物并纯化滤液。
将如此得到的4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸—钠盐溶液与1.96g氢氧化钙混合，通过加入40％氢氧化钠溶液将PH调至10.2。在室温将该溶液与活性炭一起搅拌1小时，然后用硝酸纤维素滤膜(0.2μm)过滤。
冻干后，得到17.84g 4—(4—乙氧基苄基)—3，6，9—三(羧化甲基)—3，6，9—三氮杂十一烷二酸钙配合物的三钠盐，为白色粉末，其中水含量为7.5％。
其他分析数据与第一种方法的值一致。
制备Gd—EOB—DTPA和Ca—EOB—DTPA混合物的方法
将20ml 250μmol/ml(5000μmol)Gd—EOB—DTPA水溶液与20ml1μmol/ml(20μmol)CaNa3—DTPA水溶液混合。在121℃加热处理20分钟后，观察到在20μmolCa—EOB—DTPA、4980μmol Gd—EOB—DTPA和20μmol Gd—DTPA中准完成了再配合。
下列实施例是该新化合物作用方式的具体实施例。
药物动力学：给雄性大鼠静脉内注射25μmol/kg剂量的14C—标记的Ca—EOB—DTPA/Na3。在注射后24小时在不同时间测量各器官血液中的浓度。在另一组动物中分别测定腹膜注射最多7天的尿和粪中排出的量。
血液中的浓度迅速下降，其半衰期为8分钟。0.45L/kg的分布体积表明聚积在细胞内，可能是在肝细胞内。
用药后24小时，只有4.2％剂量保留在体内，而在肾和肝中的值最高。
从粪中排除了2/3剂量，在尿中收集到1/3。
所观测到的值非常相似或与Gd配合物实际上一致(G.schuhmann—Giampieri，H.schmitt—Willich，W.—R.press，C.Ncgishi，H.—J.Qeinmann，和U.Speck，Radiolgy，1992,183,59)。
通过静脉注射Ca—EOB—DTPA降低生物体中金属的浓度：
锌的例子
以200μmol/kg的剂量给雄性大鼠静脉内注射Ca—EOB—DT-PA/Na3水溶液，2天后通过ICP—AES测定肝和肾中锌的浓度。器官浓度 zn [μmol/g] 肝注射前 5.3注射 Ca-EOB-DTPA后 4.4 肾注射前 0.9注射 Ca-EOB-DTPA后 0.5注射Ca—EOB—DTPA/Na3降低了肝和肾中锌的金属浓度。
在此方面，已知的解毒药Ca—DTPA/Na3是无效的，因为该物质不通过肝细胞。
通过在NMR造影剂中加入Ca—EOB—DTPA降低生物体中金属的浓度：Gd—EOB—DTPA的例子
以250μmol/kg的剂量给雄性大鼠静脉内注射Gd—EOB—DTPA/Na2水溶液(溶液A、B、C、D)，7天后通过ICP—AES测定骨和肝中Gd的浓度。溶液A不含任何添加剂，而B、C、D中加入了不同浓度的Ca—EOB—DTPA/Na3
溶液A： 0mg/ml
溶液B： 0.1mg/ml
溶液C： 0.5mg/ml
溶液D： 1.0mg/mlGd含量 A B C D[nmol/g]肝 1.12±0.014 1.14±0.028 0.90±0.13 0.79±0.15骨 1.51±0.08 1.39±0.13 1.04±0.12 0.67±0.09通过加入Ca配合物，明显降低了肝和骨中Gd的浓度。这种发现是非常有利的，因为已经在生物体中所剩较少量的Gd也会引起配合禁忌反应。由于新的Ca配合物实际上还出人意料地同时进入了肝细胞，因而可以保证将从配合物中可能释出Gd的影响减至最小。
Ca—EOB—DTPA改善了Gd—EOB—DTPA的消除速度，并且可以降低生物体中毒性金属的浓度。