疏水药物肿瘤靶向传递的磁性纳米载体及其制备方法 【技术领域】
本发明属于生物医用高分子材料与纳米生物技术领域，具体涉及一种疏水性药物肿瘤靶向传递的磁性纳米载体及其制备方法。
背景技术
癌症仍然是最恐怖的疾病之一，是人类生命的主要威胁。在美国癌症是85岁以下人死亡的主要原因，首次超过心脏病成为头号杀手。这个令人担忧的统计数据不是因为癌症的发生率提高了，而是因为心脏病引起的死亡下降了近一半而与癌症相关的死亡数量几乎保持不变。大多数癌症的传统标准疗法---化疗甚至在50多年的研究后仍然并不总是成功的，因为传统化疗无选择地传递毒性抗癌药物至肿瘤和正常器官及组织，因此会对正常器官和组织产生严重的毒副作用。
低水溶性是许多药物和抗癌剂的内在性质，尤其因为它们中许多属于大的多环化合物。疏水性、水溶性差的药物的临床治疗应用存在许多严重的问题，如口服给药时吸收差、生物利用度低、血液半衰期短；静脉给药时不溶药物形成的聚集体可以导致血管栓塞，引起呼吸系统的严重副作用；药物聚集体的形成还可以导致药物沉积位点的局部药物浓度过高，引起局部毒性和低的全身生物利用度。水溶性差的药物有如此严重的问题，导致一些主要的药厂在药物筛选过程中很早就排除水溶性差的化合物。据估计，通过高通量筛选鉴定的40％的候选药物由于它们差的水溶性而被丢弃，未能进入制剂开发阶段。
双亲性的嵌段共聚物在水溶液中可以自组装成核-壳型结构的聚合物胶束，亲水嵌段形成外壳，疏水嵌段形成内核。近年来，聚合物胶束作为一种新型的药物纳米载体已经引起了广泛关注，由于它可以大大改进药物的药代动力学，提高治疗效率。聚合物胶束的核-壳型结构对于药物传递应用具有显著优势：第一，疏水性药物被包裹在胶束核内，实现了水不溶性药物的增溶作用；第二，聚合物胶束可以延长药物的血液半衰期，因为PEG防止了调理作用，有效地减少了胶束被网状内皮系统(RES)的吸收；第三，它们小的尺寸(10～100nm)使得它们适于注射和由肿瘤组织脉管系统渗漏而引起的增强透过性和保留(enhancedpermeability and retention，EPR)效应。大多数肿瘤具有正常组织或器官所没有的独特的病理生理学特征，如大量的血管发生引起高脉管系统、有缺陷的脉管结构、受损的淋巴排出/回收系统以及许多血管通透性因子的大量产生。该现象称为脂类和大分子的增强透过性和保留(enhanced permeability and retention，EPR)效应，在实体瘤中普遍存在。实体瘤的EPR效应是肿瘤特有的少数几个特征之一，正成为抗肿瘤药物传递的金标准(gold standard)。
磁性氧化铁纳米粒子(γ-Fe2O3、Fe3O4)在磁分离、超高密度磁记录介质、催化以及生物医学领域都有着广泛的应用。尤其在生物医学领域，磁性氧化铁纳米粒子在体内和体外都有广泛应用，体内应用主要集中在药物靶向传递、细胞标记、示踪和成像(MRI)检测、肿瘤的磁流体过热治疗；而体外应用主要集中在病毒、寡核苷酸、DNA和蛋白质的超灵敏检测和分离。
目前已有大量聚合物胶束包裹药物的相关报道，但是利用聚合物胶束同时包裹磁性氧化铁纳米粒子和药物的报道很少，还未见利用嵌段共聚物MePEG-PLGA所形成的聚合物胶束包裹磁性氧化铁纳米粒子和药物的相关报道。
【发明内容】
本发明的目的在于构建一种用于疏水性药物肿瘤靶向传递的磁性纳米载体及该载体的制备方法。
本发明所述的是一种用于疏水药物肿瘤靶向传递的磁性纳米载体，由双亲性嵌段共聚物胶束包裹超顺磁性Fe3O4纳米粒子组成，双亲性嵌段共聚物具有核-壳型结构，其在水溶液中自发形成聚合物胶束，亲水嵌段形成胶束外壳，疏水嵌段形成胶束内核，Fe3O4纳米粒子被装载于胶束内核中，用于药物地磁靶向传递，同时用于体内磁共振成像(MRI)，所得磁性纳米载体中Fe3O4纳米粒子的质量含量为5～20％。
前面所述的双亲性嵌段共聚物为甲氧基聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(MePEG-PLGA)，数均分子量为8～30kD，其中亲水嵌段为甲氧基聚乙二醇(MePEG)，具有生物相容性，数均分子量为2～5kD；疏水嵌段为聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)，可生物降解，数均分子量为3～28kD，混旋丙交酯(D，L-Lactide，简写为LA)与乙交酯(Glycolide，简写为GA)摩尔比为1～4∶1(LA∶GA＝1～4∶1)。甲氧基聚乙二醇与丙交酯、乙交酯的用量比例为：甲氧基聚乙二醇∶丙交酯∶乙交酯＝1～2∶1～4∶1。
本发明所构建的用于疏水性药物肿瘤靶向传递的磁性纳米药物载体，主要有以下优点：
(1)双亲性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(MePEG-PLGA)目前主要是通过本体聚合法合成，反应温度高，散热困难，所得聚合产物分子量分布宽；我们采用改进的溶液聚合法合成该共聚物，反应温度低且容易控制，引发剂及单体分散均匀，所得聚合产物分子量分布窄，利用了四种不同的有机溶剂沉淀剂——甲醇、正己烷、正己烷/无水乙醚(V/V＝4∶1)或无水乙醚来沉淀聚合产物，产物多分散性(PDI)都在1.4以下；
(2)本发明制备的磁性纳米载体主要用于疏水性药物的传递，疏水性药物可被包裹在聚合物胶束的疏水内核中，有望解决疏水性药物的溶解性问题，并且由于药物载体的疏水内核是可生物降解的，可以实现药物的缓慢释放，减少给药次数从而降低药物使用量；
(3)本发明所提供的磁性纳米载体尺寸为20～100nm，可以通过肿瘤组织的EPR效应使药物在肿瘤组织富集并长时间停留，实现药物的被动靶向传递，提高药物的生物利用度，减小药物对正常组织的伤害；
(4)本发明提供的磁性纳米载体内装载了成簇的超顺磁性Fe3O4纳米粒子，因此可以实现药物的磁靶向传递，减小药物对正常组织的毒副作用，同时由于超顺磁性Fe3O4纳米粒子为磁共振成像的负性造影剂，可用于体内肿瘤组织的磁共振成像(MRI)。
本发明所阐述的用于疏水性药物肿瘤靶向传递的磁性纳米药物载体的构建方法包括以下步骤：
1.疏水性超顺磁性Fe3O4纳米粒子的合成，参照文献J.Am.Chem.Soc.2004，126，273-279所述的高温分解法合成5～18nm、高度单分散、粒径均一的Fe3O4纳米粒子，其形貌如附图1；
2.双亲性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(MePEG-PLGA)(Mn＝8～30kD，LA与GA的摩尔比为1～4∶1)胶束药物载体的合成：
通过改进的溶液聚合法来合成该嵌段共聚物，具体描述为：在N2保护下，以辛酸亚锡[Sn(Oct)2]作为催化剂(0.05～0.205mL)，甲氧基聚乙二醇(MePEG)作为大分子引发剂(2～10g)，通过混旋丙交酯(D，L-Lactide)(1.25～10g)、乙交酯(Glycolide)(1～2g)在甲苯(40～60mL)中的开环聚合反应来制备得到多分散性好的MePEG-PLGA嵌段共聚物。再通过四种不同的有机溶剂沉淀剂---甲醇、正己烷、正己烷/无水乙醚(V/V＝4∶1)或无水乙醚来沉淀嵌段共聚物，所得沉淀用二氯甲烷溶解，抽滤，然后将滤液加入60～80℃热水中除去二氯甲烷，最后真空干燥，即得到具有窄分子量分布(PDI都在1.4以下)的MePEG-PLGA嵌段共聚物粉末；
3.通过溶剂蒸发法实现双亲性嵌段共聚物MePEG-PLGA胶束对Fe3O4磁性纳米粒子的装载：将10～20mg MePEG-PLGA嵌段共聚物与1.3～2.7mg超顺磁性Fe3O4纳米粒子共同溶解于1～2mL四氢呋喃(THF)中，所得溶液缓慢加入到10～20mL高纯水中，超声，减压旋转蒸发除去残留的四氢呋喃，同时将溶液浓缩至4～10mL，依次过0.45μm、0.22μm滤膜，再通过冷冻干燥，即可得到用于疏水药物肿瘤靶向传递的磁性纳米载体。
【附图说明】
图1：通过高温分解法合成的高度单分散、粒径均一约为8nm的Fe3O4纳米粒子的TEM图；
图2：嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(MePEG-PLGA)纳米载体的核磁共振(1H NMR)图谱，图谱中给出了各氢原子的归属；
图3：用于疏水性药物肿瘤靶向传递的磁性纳米载体的TEM图，嵌图为用2％磷钨酸溶液负染色后一个单个胶束的TEM图。
【具体实施方式】
下面给出粒径约为8nm超顺磁性Fe3O4纳米粒子的制备方法、双亲性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(MePEG-PLGA)通过改进的溶液聚合法的合成方法以及用于疏水性药物肿瘤靶向传递的磁性纳米载体构建方法的具体实施方式，以便本专业技术人员更好地理解本发明，因此该专业的技术人员根据上述发明内容所做出的非本质的改进和调整也应属于本发明保护范围。
1.粒径约为8nm的超顺磁性Fe3O4纳米粒子的制备方法
实施例1：
向高纯N2(纯度≥99.999％，长春巨洋气体有限责任公司)保护的三口瓶内加入乙酰丙酮铁[Fe(acac)3](1×10-3mol<物质的量>，纯度≥97％，西格玛奥德里奇公司)，1，2-十二二元醇(5×10-3mol，纯度≥90％，西格玛奥德里奇公司)，油酸(3×10-3mol，分析纯，天津市光复精细化工研究所)，油胺(3×10-3mol，纯度≥70％，西格玛奥德里奇公司)混合，苄醚(10mL，纯度99％，西格玛奥德里奇公司)，磁力搅拌。混合物200℃条件下加热2h；然后停通N2，再在约300℃条件下加热至1h，停止加热，冷却至室温。
向三口瓶中加入20mL无水乙醇，14000rpm离心20min，弃上清；向黑色沉淀中加入25μL油酸，25μL油胺，5mL正己烷，使黑色沉淀重新溶解，6000rpm离心10min，弃沉淀；向上清加入10mL乙醇，10000rpm离心20min，弃上清，黑色沉淀用3.5mL正己烷重新分散，转入样品瓶内密封，4℃低温保存，其中含有超顺磁性Fe3O4纳米粒子80～100mg。
通过透射电镜表征，所合成的超顺磁性Fe3O4纳米粒子为高度单分散、粒径均一(约8nm)(附图1)。
2.通过改进的溶剂蒸发法合成嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(MePEG-PLGA)
实施例2：
预先向接有冷凝管的三口瓶内通入高纯N2(纯度≥99.999％，长春巨洋气体有限责任公司)，使三口瓶内充满N2。
称取MePEG(Mn＝2000g/mol，西格玛奥德里奇公司)2.0g，混旋丙交酯(D，L-Lactide，≥99.5mol％，北京元生融科技有限公司)5.0g，乙交酯(Glycolide，≥99.5mol％，北京元生融科技有限公司)1.0g，混旋丙交酯与乙交酯的物质的量比为4∶1，加入N2保护的三口瓶内，加入50mL甲苯，0.205mL辛酸亚锡[Sn(Oct)2，～95％，西格玛奥德里奇公司]，混合物N2保护下加热至甲苯回流(约111℃)，反应进行10h。停止加热，终止反应。向三口瓶内加入100mL甲醇沉淀产物，向沉淀加入60mL二氯甲烷，使其溶解，所得溶液抽滤，将得到的滤液加入60～80℃热水中，除去二氯甲烷，最后经真空干燥得到嵌段共聚物MePEG-PLGA粉末，产物经凝胶渗透色谱(GPC)分析，数均分子量为13217Da，多分散性为1.361。
实施例3：
预先向接有冷凝管的三口瓶内通入高纯N2(纯度≥99.999％，长春巨洋气体有限责任公司)，使三口瓶内充满N2。称取MePEG(Mn＝2000g/mol，西格玛奥德里奇公司)2.0g，混旋丙交酯(D，L-Lactide，≥99.5mol％，北京元生融科技有限公司)5.0g，乙交酯(Glycolide，≥99.5mol％，北京元生融科技有限公司)1.0g，混旋丙交酯与乙交酯的物质的量比为4∶1，加入N2保护的三口瓶内，加入50mL甲苯，0.05mL辛酸亚锡[Sn(Oct)2，～95％，西格玛奥德里奇公司]，混合物N2保护下加热至甲苯回流(约111℃)，反应进行9h。停止加热，终止反应。向三口瓶内加入100mL正己烷沉淀产物，向沉淀加入60mL二氯甲烷，使其溶解，所得溶液抽滤，将得到的滤液加入60～80℃热水中，除去二氯甲烷，最后经真空干燥得到嵌段共聚物MePEG-PLGA粉末，产物经凝胶渗透色谱(GPC)分析，数均分子量为9925Da，多分散性为1.329。
实施例4：
预先向接有冷凝管的三口瓶内通入高纯N2(纯度≥99.999％，长春巨洋气体有限责任公司)，使三口瓶内充满N2。称取MePEG(Mn＝2000g/mol，西格玛奥德里奇公司)2.0g，混旋丙交酯(D，L-Lactide，≥99.5mol％，北京元生融科技有限公司)5.0g，乙交酯(Glycolide，≥99.5mol％，北京元生融科技有限公司)1.0g，混旋丙交酯与乙交酯的物质的量比为4∶1，加入N2保护的三口瓶内，加入50mL甲苯，0.05mL辛酸亚锡[Sn(Oct)2，～95％，西格玛奥德里奇公司]，混合物N2保护下加热至甲苯回流(约111℃)，反应进行9h。停止加热，终止反应。向三口瓶内加入100mL正己烷与无水乙醚(v/v＝4∶1)混合物沉淀产物，向沉淀加入60mL二氯甲烷，使其溶解，所得溶液抽滤，将得到的滤液加入60～80℃热水中，除去二氯甲烷，最后经真空干燥得到嵌段共聚物MePEG-PLGA粉末，产物经凝胶渗透色谱(GPC)分析，数均分子量为9728Da，多分散性为1.291。
经核磁共振(1H NMR)表征，产物具有嵌段共聚物MePEG-PLGA的结构(附图2)。
其中：a.3.39ppm左右：对应于MePEG的末端-OCH3；
b.3.65ppm左右：对应于MePEG的-CH2-；
c.5.2ppm左右：多重峰，对应于D，L-丙交酯的-CH-；
d.1.55ppm左右：双重峰，对应于D，L-丙交酯重复单元的-CH3；
e.4.8ppm左右：多重峰，对应于乙交酯的-CH2-。
实施例5：
预先向接有冷凝管的三口瓶内通入高纯N2(纯度≥99.999％，长春巨洋气体有限责任公司)，使三口瓶内充满N2。称取MePEG(Mn＝2000g/mol，西格玛奥德里奇公司)2.0g，混旋丙交酯(D，L-Lactide，≥99.5mol％，北京元生融科技有限公司)5.0g，乙交酯(Glycolide，≥99.5mol％，北京元生融科技有限公司)1.0g，混旋丙交酯与乙交酯的物质的量比为4∶1，加入N2保护的三口瓶内，加入50mL甲苯，0.05mL辛酸亚锡[Sn(Oct)2，～95％，西格玛奥德里奇公司]，混合物N2保护下加热至甲苯回流(约111℃)，反应进行9h。停止加热，终止反应。向三口瓶内加入100mL无水乙醚沉淀产物，向沉淀加入60mL二氯甲烷，使其溶解，所得溶液抽滤，将得到的滤液加入60～80℃热水中，除去二氯甲烷，最后经真空干燥得到嵌段共聚物MePEG-PLGA粉末，产物经凝胶渗透色谱(GPC)分析，数均分子量为10244Da，多分散性为1.307。
3.用于疏水性药物肿瘤靶向传递的磁性纳米载体构建方法的具体实施方式
实施例6：
嵌段共聚物MePEG-PLGA 10mg、Fe3O4磁性纳米粒子1.3mg共同溶解于1mL四氢呋喃(THF)中，所得溶液缓慢加入高纯水(VTHF:VH2O=1:10)]]>中，超声，减压旋转蒸发除去有机溶剂，同时将溶液浓缩，依次过0.45μm、0.22μm滤膜，即可得用于疏水药物肿瘤靶向传递的磁性纳米药物载体溶液。
磁性纳米药物载体经透射电镜(TEM)观察，可以看到成簇的Fe3O4磁性纳米粒子被装载进嵌段共聚物形成的胶束内核中，纳米载体尺寸均一性较好，大小为20～100nm，其中粒径为40～60nm的纳米载体占70～80％；嵌图中负染色实验证实了磁性纳米药物载体具有核-壳型结构，成簇的Fe3O4磁性纳米粒子周围的白色环状圈即为即为MePEG-PLGA嵌段共聚物(附图3)。