绞股蓝多糖在制备防治老年痴呆药物或者保健品中的应用 【技术领域】
本发明涉及绞股蓝多糖在制备防治老年痴呆药物或者保健品中的应用。
背景技术
老年痴呆症，又称阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白(β-amyloid，β-AP)沉积，神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFT)，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑(senileplaque，SP)的形成。目前尚无特效治疗或逆转疾病进展的治疗药物。也是四大常见的神经退行性疾病之一(其它三种为亨廷顿氏病、卢伽雷氏症、帕金森氏病)。
老龄化趋势让老年性痴呆患者数量增多随着现代医学的发展，越来越多的老人变得年轻而又充满了活力。但是请不要忘记：在不久的将来，我国将进入老龄社会。同时伴随着一个不可忽视的问题——老年痴呆症的发病率在逐年增高。
调查发现：我国北方患老年痴呆的平均年龄为75、76岁，患血管性痴呆的年龄多在68岁左右。65岁以上人群中患重度老年痴呆的比率达5％以上，而到80岁，此比率就上升到15-20％。
老年痴呆症是影响老年人健康的顽症。美国《普通精神病学文献》提供的资料显示，全世界60岁以上老年人中约有10％患有此病。据世界卫生组织和国际老年痴呆症协会统计，目前全球有超过1800万名老人患老年痴呆症。预计到2020年，全球老年痴呆症患者将达3400万人。
绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb)Makino，英文名称Fiveleaf Gynostemma Herb，为葫芦科(Gucurbitceae)绞股蓝属(Gynastemma)多年生攀缘草质藤本植物，又名七叶胆、公罗锅底。全世界有16种和3变种，我国有15种和3变种，我国绞股蓝属植物资源丰富，多数种尚未深入研究和利用。绞股蓝是我国中药的宝贵财富，素有“南方人参”之称，在日本被称作“福音草”，是世界自九十年代兴起的四大保健药品之一。
绞股蓝以全草供药食兼用，中医认为，绞股蓝味苦、性寒，具有清热解毒、补气、止咳、祛痰之功能。我国民间应用绞股蓝益寿强身历史悠久，产区群众在夏季采其茎叶煎水作清凉饮料。现代药理研究和临床应用证明，绞股蓝在调节机体免疫力，抗突变，抗肿瘤，抗氧化，调节营养中枢神经，心血管保护等多个方面具有较好的生物活性，并且绞股蓝提取物口服没有毒副作用。
目前对绞股蓝的研究主要集中于其中的皂苷成分，而对绞股蓝多糖的研究较少，并未见将绞股蓝多糖用于治疗老年痴呆的有关报道。
【发明内容】
针对上述现有技术，本发明提供了绞股蓝多糖的一种新用途，即绞股蓝多糖在制备防治老年痴呆药物或者保健品中的应用。
应用时，可以以绞股蓝多糖为活性成分制成组合物，组合物的形式可以为注射剂、口服制剂、外用制剂中的任一种。优选口服制剂。
应用时，可以根据不同制剂的具体要求，以一定量的纯品绞股蓝多糖或一定纯度的绞股蓝多糖制品作为活性成分制备成各种药物组合物，辅以药学上可接受的各种载体，这些药学可接受的载体可以是在现有技术中广泛用于药物中的各种载体。所述的药物组合物可以按现有技术已知的方法如混合、制粒、压片来制备。所述的药物组合物还可以包括各种药学使用的任选辅助组分，如香味剂、着色剂、甜味剂等。
经检测，绞股蓝多糖是以鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖为主要组分的杂多糖。本发明的发明人利用绞股蓝多糖进行了细胞和动物实验，实验结果表明：绞股蓝多糖对神经细胞β-淀粉样蛋白损伤具有明显的保护作用，对老年痴呆小鼠模型具有明显的防治作用。进一步表明，绞股蓝多糖对老年痴呆的病理、病理生理变化具有良好的改善作用，对神经细胞损伤具有良好的保护和修复作用，预示着绞股蓝多糖在制备防治老年痴呆药物或者保健品中具有很大的开发应用前景。
本发明在对绞股蓝多糖进行了系统的分离纯化的基础上，得到了绞股蓝多糖GPS-3，并研究了其对老年痴呆的防治作用，为绞股蓝多糖在老年痴呆疾病中的应用提供实验依据。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1：提取绞股蓝多糖，步骤如下：
绞股蓝药材破碎后，称取200g，加入1000ml乙醇回流提取两次，每次1h，过滤并挥干乙醇，加入2L水，100℃提取3次，每次0.5h，合并上清液，减压浓缩，离心除去沉淀，上清液加3倍体积的乙醇，4℃过夜，离心，沉淀用乙醇、无水乙醇、丙酮各洗一次，50℃干燥5小时，得绞股蓝粗多糖12.8g，为棕黑色粉末状固体。
将上述粗多糖溶解配成质量浓度为5％的水溶液，加无水氯化钙至2％，室温搅拌2h，然后离心除去果胶酸钙沉淀，上清液加H2O2，使H2O2的终浓度到5％(质量体积比)，用氢氧化钠溶液调节pH到8.5-9，室温搅拌5h，离心，弃沉淀，上清加入3倍体积的乙醇，4℃过夜，离心，乙醇、无水乙醇、丙酮依次洗涤沉淀，干燥，得精制绞股蓝多糖。
取精制绞股蓝多糖0.5g，加入约100ml蒸馏水，经0.45μm滤膜过滤。采用Q SepharoseFast Flow柱，AKTA通道上样，上样后先用蒸馏水洗脱2个柱体积，然后采用氯化钠进行梯度洗脱，流速1ml/min，紫外检210nm检测，收集多糖部分GPS-3。然后将其浓缩后上Superdex 200柱，用0.15mol/L氯化钠洗脱，流速0.5ml/min，紫外210nm检测，收集多糖部分，再分别经sephadex G-25脱盐，冷冻干燥，即得均一多糖GPS-3。
实施例2：绞股蓝多糖对神经细胞β-淀粉样蛋白损伤的保护作用
取孕13.5-14天的Wistar大鼠，颈椎脱臼处死。
无菌条件下分离、取出胚胎，在无菌培养皿中，于解剖显微镜下分离，获取神经细胞。置于二氧化碳培养箱中，37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养48h后进行分组实验。
神经细胞在96孔板中培养48小时后，分别加入5mg/ml实施例1制备的绞股蓝多糖，使绞股蓝多糖的终浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml，设正常对照组。
培养12小时后，每孔加入β-淀粉样蛋白培养液，使β-淀粉样蛋白的终浓度为1μmol/L，37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养36小时后，进行测定。
结果表明，绞股蓝多糖对神经细胞β-淀粉样蛋白损伤有明显保护作用，其保护作用随作用浓度的增大而增大，200μg/ml以上可以拮抗β-淀粉样蛋白对神经细胞的损伤作用。β-淀粉样蛋白是老年痴呆发病的重要物质基础，绞股蓝多糖对这种损伤的保护作用表明，绞股蓝多糖可以有效用于老年痴呆的预防和治疗。
实施例3：绞股蓝多糖对东莨菪碱所致小鼠记忆障碍模型的作用
1、实验材料：
1.1实验药物：
绞股蓝多糖：通过实例1方法制备
脑复康：0.4g/片，天津金世制药有限公司。
氢溴酸东莨菪碱注射液：上海禾丰制药有限公司
1.2实验动物：雄性昆明种小鼠，体重(20±2)g，购自山东大学实验动物中心，合格证号：SCXK(鲁)20030004。
1.3试剂和仪器：
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、蛋白质试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。YYE50小鼠跳台仪，北京医科大学仪器厂生产。
2模型与分组给药
2.1分组方法：实验分为6组，正常组、模型组、脑复康组(0.2g/kg)、给药组(0.1g/kg、0.2g/kg、0.4g/kg)，每组10只小鼠。
2.2给药方法：绞股蓝多糖、脑复康均用生理盐水溶解，每天上午灌胃给药，正常组和模型组只给生理盐水，连续灌胃20天，末次给药1h后，除正常组外，其他各组组皮下注射东莨菪碱3.0mg/kg，对照组皮下注射等体积地蒸馏水。10min后，采用跳台法测定小鼠记忆成绩。跳台测试结束后，迅速取脑组织，称重、冰浴下用生理盐水制成10％匀浆。按试剂盒说明测定GSH-PX、SOD活力和MDA含量。
3实验结果
表1 各组小鼠跳台错误次数的比较(x±s)
注：*与模型组比较P＜0.05，**与模型组比较P＜0.01
从上表数据中可以看出，模型组小鼠跳台错误次数明显高于对照组，与模型组比较，绞股蓝多糖组小鼠跳台错误次数均明显减少，且有一定剂量效应关系。说明绞股蓝多糖能显著改善东莨菪碱引起的小鼠学习记忆障碍。
表2绞股蓝多糖对小鼠脑组织GSH-PX、SOD活性及MDA含量的影响(x±s)
注：*与模型组比较P＜0.05，**与模型组比较P＜0.01
从上表数据中可以看出，绞股蓝多糖各组的GSH-PX、SOD活性均比模型组显著升高，MDA含量显著低于模型组，且呈现出剂量依赖关系。说明绞股蓝多糖能减低小鼠脑中MDA含量，提高GSH-PX、SOD活性，具有改善东莨菪碱学习记忆障碍小鼠记忆能力的效果。
实施例4：绞股蓝多糖片剂的制备
主要由绞股蓝多糖及辅料组成，其中辅料可以是填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂中的部分或全部，辅料的用量不超过绞股蓝多糖重量的8倍。
优选的制片处方：以重量份计，
绞股蓝多糖 100份
填充剂 100份
速崩剂 90份
粘合剂 80份
润滑剂 6份
其中：填充剂可以是磷酸氢钙、糊精或乳糖；速崩剂可以是L-HPC或干淀粉；粘合剂可以是PVP溶液或淀粉浆；润滑剂是硬脂酸镁。
片剂的生产工艺是：按处方量，称取绞股蓝多糖，加入填充剂、速崩剂，混合均匀，然后加入处方量的粘合剂混合制成湿粒，低温40-65℃干燥，再加入润滑剂混合均匀，压片，最后用高分子衣料(如HPMC、EC、MC)包薄膜衣。