抗CD27抗体.pdf

实施方案描述

本发明涉及特异性识别由CD27基因编码的含有未结合半乳糖的O-连接糖链的多肽(在后文中称为“CD27”)的细胞外区域并与该细胞外区域结合的单克隆抗体。CD27基因可以是任何编码CD27的基因。例如，CD27基因可以是含有SEQ ID NO：1所显示的核苷酸序列的基因。此外，本发明的CD27基因包括在严紧条件下与由SEQ ID NO：1所显示的核苷酸序列构成的DNA杂交，并也编码具有CD27功能的多肽的基因等。

在本发明中，在严紧条件下杂交的DNA是指使用由SEQ ID NO：1所显示的核苷酸序列构成的DNA作为探针，通过集落杂交、噬菌斑杂交、Southern印迹杂交等获得的DNA。这种DNA的具体实例是可以通过在0.7到1.0mol/l氯化钠存在下，使用其上固定有包含核苷酸序列的集落或噬菌斑来源的DNA或PCR产物或寡DNA的滤膜或载玻片在65℃下进行杂交，然后在65℃下用0.1到2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液：150mmol/l氯化钠和15mmol/l柠檬酸钠)清洗滤膜或载玻片而鉴定的DNA。可以按照《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989))、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1987-1997))、《DNA克隆1：核心技术实用手段》(第二版)(DNA Cloning 1：Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，Oxford University(1995))等中描述的方法进行杂交。具体来说，能够在严紧条件下杂交的DNA包括与SEQ ID NO：1所显示的核苷酸序列具有至少60％或以上同源性、优选80％或以上同源性、更优选90％或以上同源性、最优选95％或以上同源性的DNA。

在编码真核生物蛋白的基因的核苷酸序列中，经常识别到遗传多态性。在本发明中使用的CD27基因也包括通过这种多态性在核苷酸序列中产生少量改变的基因。

CD27包括包含SEQ ID NO：2所显示的氨基酸序列的多肽；包含在SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列中缺失、取代或添加至少一个氨基酸的氨基酸序列的多肽；包含与SEQ ID NO：2所显示的氨基酸序列具有至少60％同源性、优选至少80％同源性、更优选至少90％同源性、最优选至少95％同源性的氨基酸序列，并具有CD27的功能的多肽；等等。

包含在SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，可以通过例如使用定点突变方法将定点突变引入包含SEQ ID NO：2所显示的氨基酸序列的多肽的编码DNA中来获得，所述定点突变方法描述在《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989))、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，1987-1997))、Nucleic Acids Research，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、Nucleic Acids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等中。被缺失、取代、或添加的氨基酸残基的数量没有具体限制，并且数量优选是1到几十个，例如1到20，更优选为1到几个，例如1到5。

除非另有指明，否则在本发明中描述的同源性数值可以是通过使用本领域技术人员已知的同源性搜索程序计算的数值。对于核苷酸序列来说，该数值可以通过在BLAST[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]等中使用缺省参数来计算，对于氨基酸序列来说，该数值可以通过在BLAST2[Nucleic Acids Res.，25，3389(1997)、Genome Res.，7，649(1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]等中使用缺省参数来计算。

作为缺省参数，G(开放式间隙的价值，cost to open gap)对于核苷酸序列来说是5，对于氨基酸序列来说是11；-E(扩展间隙的价值，cost to extend gap)对于核苷酸序列来说是2，对于氨基酸序列来说是1；-q(核苷酸错配的罚分(penalty for nucleotide mismatch))是-3；-r(核苷酸匹配的奖励(reward for nucleotide match))是；-e(预期值(expect value))是10；-W(字长(wordsize))对于核苷酸序列来说是11个残基，对于氨基酸序列来说是3个残基；-y(blast延伸的减少(X)的位数(dropoff(X)for blast extensions in bits))对于blastn来说是20，对于blastn之外的程序来说是7；-X(有间隙比对的X减少值的位数(Xdropoff value for gapped alignment in bits))是15；-Z(有间隙比对的最终X减少值的位数(final X dropoff value for gapped alignment in bits))对于blastn来说是50，对于blastn之外的程序来说是25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。

包含SEQ ID NO：2所显示的氨基酸序列的部分序列的多肽可以按照专业技术人员公知的方法进行制备。例如，它可以通过缺失一部分编码SEQ ID NO：2所显示的氨基酸序列的DNA，并对其中导入了含有DNA的表达载体的转化体进行培养来制备。此外，在由此制备的多肽或DNA的基础上，可以与上述相同的方式制备包含在SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列的多肽。

CD27的细胞外区域的实例包括对应于由参考文献[The Journal of Immunology，147，3165(1991)]等所预测的细胞外区域的1到171位的区域。

在本发明中，由CD27基因编码的、含有未结合半乳糖的O-连接糖链的多肽的细胞外区域，可以是含有未结合半乳糖的O-连接糖链的任何CD27。具体来说，细胞外区域的实例包括含有未结合半乳糖的O-连接糖链、并由SEQ ID NO：1所显示的核苷酸序列编码的CD27的细胞外区域。

术语“O-连接糖链”是指糖链通过蛋白的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的氨基酸残基的每个氨基酸侧链中包含的-OH基团进行连接的结构。在O-连接糖链中，具有连接到多肽的Ser或Thr的氨基酸侧链的-OH基团上的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的O-连接糖链，被称为“粘蛋白型糖链”。O-连接糖链的具体实例包括T抗原、唾液酸化T抗原、Tn抗原、唾液酸化Tn抗原等(表1)。

表1

(NeuNAc：N-乙酰神经氨酸)

在本发明中，术语“未结合半乳糖的O-连接糖链”是指其中半乳糖(Gal)没有结合到通过蛋白中Ser或Thr的氨基酸残基的-OH基团结合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上的O-连接糖链。具体来说，实例包括上面提到的Tn抗原和唾液酸化Tn抗原。未结合半乳糖的O-连接糖链是正常O-连接糖链合成途径中的中间体，并且一般在正常细胞产生的糖蛋白中很少发现，其表达在特定疾病例如癌症或肾病中得到证实。

在本发明的后文中，未结合半乳糖的O-连接糖链有时可以被称为异常糖链，异常糖链所结合的蛋白有时可以被称为糖链缺陷型蛋白，并且结合有异常糖链的CD27有时可以被称为糖链缺陷型CD27。

O-连接糖链所结合的多肽的氨基酸残基的实例，包括CD27蛋白的细胞外区域的氨基酸序列中的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的氨基酸残基。

此外，O-连接糖链所结合的多肽的氨基酸残基，可以使用测序软件例如NetOGlyc 3.1服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)，通过O-连接糖链的共有序列来验证。或者，具体的糖链结合位点可以通过含有O-连接糖链的糖蛋白的质谱(MS)分析来详细说明。

在本发明中，对于CD27蛋白上O-连接糖链所结合的多肽的氨基酸残基来说，CD27蛋白的氨基酸序列中任何Ser或Thr残基都可以被O-连接糖链连接。其优选实例包括含有选自下列至少一个氨基酸残基的糖链结合位点：SEQ ID NO：2所显示的CD27蛋白中的第118位Thr，第127位Ser，第129位Thr，第132位Ser，第133位Ser，第137位Ser，第143位Thr，第149位Ser，第156位Thr，第162位Thr，第173位Thr，第175位Ser和第176位Thr。

结合到每个CD27蛋白分子细胞外区域上的O-连接糖链的数量可以是任何数量，只要O-连接糖链结合到至少一个Ser或Thr残基上即可。对于O-连接糖链的数量没有限制。

作为用于获得表达本发明的含有未结合半乳糖的O-连接糖链的CD27(在后文中称为“糖链缺陷型CD27”)的细胞的方法，方法包含构建糖链缺陷型CD27表达细胞，所述方法通过将CD27编码DNA导入其中在O-连接糖链合成过程中，能够向连接到多肽的Ser/Thr上的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)添加Gal的酶、参与酶活性的蛋白、或参与尿苷5′-二磷酸-半乳糖(UDP-半乳糖)运输的蛋白的活性降低或缺失的细胞系中，从而获得糖链缺陷型CD27表达细胞。或者，表达具有未结合半乳糖的O-连接糖链的CD27的细胞，也可以通过用糖链切割酶例如唾液酸酶和半乳糖苷酶处理表达具有正常O-连接糖链的CD27的细胞来构建。

能够向结合到多肽的Ser或Thr上的GalNAc添加Gal的酶的具体实例可以包括β1，3-半乳糖基转移酶[The Journal of Biological Chemistry，277，178-186(2002)]等。参与向结合到多肽的Ser或Thr上的GalNAc添加Gal的酶的活性的蛋白实例包括Cosmc[Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，99，16613-16618(2002)]等，Cosmc是参与酶的蛋白质折叠的伴侣蛋白。

基于由于在能够向结合到多肽的Ser/Thr上的GalNAc添加Gal的酶、参与酶活性的蛋白、参与UDP-半乳糖运输的蛋白等的编码DNA中发生添加、缺失、取代等而引起酶活性降低或缺失这一事实，源自于IgA型肾病患者的CD27表达细胞可以用作CD27表达细胞。

参与UDP-半乳糖运输的蛋白的实例包括UDP-半乳糖转运蛋白等。其中UDP-半乳糖转运蛋白的活性降低或缺失的细胞系的实例包括Lec8细胞[Glycobiology，1，307-14(1991)]等。

在本发明中，表达糖链缺陷型CD27的细胞的实例包括在人体中天然存在的细胞、从人体中天然存在的细胞建立的细胞系、通过基因重组技术获得的细胞等。优选的是其中在O-连接糖链合成过程中，能够向连接到多肽的Ser/Thr上的GalNAc添加Gal的酶、参与酶活性的蛋白或参与UDP-半乳糖运输的蛋白的活性如上所述降低或缺失的细胞系，具有类似性质并在人体中天然存在的细胞等。

人体中天然存在的细胞的实例优选为其中在O-连接糖链合成过程中，能够向结合到多肽的Ser/Thr上的GalNAc添加Gal的酶、参与酶活性的蛋白或参与UDP-半乳糖运输的蛋白的活性降低或缺失的细胞系。这样的细胞的具体实例包括在患有IgA型肾病或癌症的患者体内表达CD27蛋白的细胞，例如在通过活组织检查等获得的免疫相关细胞或肿瘤细胞中表达CD27蛋白的细胞。

通过基因重组技术获得的细胞的实例包括通过构建其中在O-连接糖链合成过程中，向结合到多肽的Ser/Thr上的GalNAc添加Gal的酶、参与酶活性的蛋白或参与UDP-半乳糖运输的蛋白的活性降低或缺失的宿主细胞，然后将包含所需多肽的编码cDNA的表达载体导入宿主细胞而获得的糖链缺陷型CD27表达细胞。

宿主细胞的具体实例包括其中UDP-半乳糖转运蛋白的活性降低的Lec8细胞，或源自于其中由于β1，3-半乳糖基转移酶或参与酶活性的Cosmc伴侣蛋白的异常而导致酶活性降低或缺失的IgA型肾病患者的IgA抗体表达细胞。

此外，可以通过使用上述CD27表达细胞表达并纯化糖链缺陷型CD27蛋白，来构建糖链缺陷型CD27蛋白。

可以通过将CD27蛋白作为与另一种材料的融合蛋白进行表达，然后进行纯化，来获得糖链缺陷型CD27蛋白。与CD27蛋白融合的材料的实例包括多肽例如抗体恒定区、抗体Fc区、GST标签、组氨酸标签(也称为“His标签”)和Myc标签。融合蛋白可以使用亲和柱例如蛋白A、镍柱和特异性抗体柱进行分离和纯化。

本发明的单克隆抗体或抗体片段对如此获得的糖链缺陷型CD27细胞或糖链缺陷型CD27具有结合活性。

本发明的抗体或抗体片段与糖链缺陷型CD27多肽的细胞外区域的结合，可以通过下述方法验证，在所述方法中，表达特定抗原的细胞与针对特异性抗原的抗体的结合能力，通过例如常规的已知免疫检测方法、优选为荧光细胞染色方法等来证实。此外，它也可以通过常规的已知免疫检测方法的组合等来证实[《单克隆抗体——原理与实践》(第三版)(Monoclonal Antibodies-Principles and Practice，Third edition，Academic Press(1996))，《抗体实验手册》(Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，《单克隆抗体实验手册》(Monoclonal Antibody Experiment Manual，Kodansha Scientific(1987)]。

本发明的单克隆抗体包括由杂交瘤产生的抗体和由转化有含编码抗体的基因的表达载体的转化体产生的重组抗体。

可以通过例如制备上述表达糖链缺陷型CD27的细胞作为抗原，从使用抗原免疫的动物诱导具有抗原特异性的抗体产生细胞，并将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，来制备杂交瘤。可以通过培养杂交瘤或将杂交瘤细胞施用给动物以在动物中引起腹水肿瘤，并分离和纯化培养物或腹水，来获得抗糖链缺陷型CD27的抗体。

用抗原免疫的动物可以是任何动物，只要可以制备杂交瘤即可，并且适于使用的是小鼠、大鼠、仓鼠、兔等。此外，可以从这样的动物获得具有抗体产生活性的细胞，并且本发明的抗体包括由通过体外免疫后的细胞与骨髓瘤细胞的融合获得的杂交瘤所产生的抗体。

单克隆抗体是由单一克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体，只识别一个表位(也称为抗原决定簇)，并具有独特的氨基酸序列(一级结构)。

表位的实例包括被单克隆抗体识别并结合的单一氨基酸序列、由氨基酸序列构成的三维结构、结合糖链的氨基酸序列、由结合糖链的氨基酸序列构成的三维结构等。本发明的单克隆抗体的表位的实例包括糖链缺陷型CD27蛋白的三维结构。

本发明的单克隆抗体的实例包括任何单克隆抗体，只要它识别并也结合糖链缺陷型CD27的细胞外区域即可。单克隆抗体的具体实例包括单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030、KM4031等。

更具体来说，本发明的单克隆抗体的实例包括由杂交瘤KM4026产生的单克隆抗体KM4026、与单克隆抗体KM4026竞争与糖链缺陷型CD27的细胞外区域的结合的单克隆抗体、以及与糖链缺陷型CD27的细胞外区域中存在的与单克隆抗体KM4026结合的表位结合的单克隆抗体。

此外，本发明的单克隆抗体的实例包括由杂交瘤KM4027产生的单克隆抗体KM4027、与单克隆抗体KM4027竞争与糖链缺陷型CD27的细胞外区域的结合的单克隆抗体、以及与糖链缺陷型CD27的细胞外区域中存在的与单克隆抗体KM4027结合的表位结合的单克隆抗体。

此外，本发明的单克隆抗体的实例包括由杂交瘤KM4028产生的单克隆抗体KM4028、与单克隆抗体KM4028竞争与糖链缺陷型CD27的细胞外区域的结合的单克隆抗体、以及与糖链缺陷型CD27的细胞外区域中存在的与单克隆抗体KM4028结合的表位结合的单克隆抗体。

此外，本发明的单克隆抗体的实例可以包括由杂交瘤KM4030产生的单克隆抗体KM4030、与单克隆抗体KM4030竞争与糖链缺陷型CD27的细胞外区域的结合的单克隆抗体、以及与糖链缺陷型CD27的细胞外区域中存在的与单克隆抗体KM4030结合的表位结合的单克隆抗体。

此外，本发明的单克隆抗体的实例包括由杂交瘤KM4031产生的单克隆抗体KM4031、与单克隆抗体KM4031竞争与糖链缺陷型CD27的细胞外区域的结合的单克隆抗体、以及与糖链缺陷型CD27的细胞外区域中存在的与单克隆抗体KM4031结合的表位结合的单克隆抗体。

与本发明的单克隆抗体竞争的单克隆抗体的实例，具体来说包括对如上所述的多种单克隆抗体和糖链缺陷型CD27的细胞外区域中存在的表位具有竞争性反应的单克隆抗体。

此外，与本发明的单克隆抗体所结合的表位结合的单克隆抗体的实例，具体来说包括与糖链缺陷型CD27的细胞外区域中存在的被如上所述的多种单克隆抗体识别的表位结合的单克隆抗体。

根据《布达佩斯公约》，杂交瘤KM4030已经于2008年6月5日以FERM BP-10976保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心[International Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566)]。

重组抗体包括通过基因重组生产的抗体，例如人类嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体及其抗体片段。在重组抗体中，作为治疗剂，优选的是具有抗原结合活性、低免疫原性和延长的血液半衰期的重组抗体。

人类嵌合抗体是含有非人类动物的抗体的重链可变区(在后文中称为“VH”)和轻链可变区(在后文中称为“VL”)以及人类抗体的重链恒定区(在后文中称为“CH”)和轻链恒定区(在后文中称为“CL”)的抗体。

本发明的人类嵌合抗体可以如下产生。具体来说，可以通过从产生特异性识别糖链缺陷型CD27并与细胞外区域结合的单克隆抗体、或特异性识别糖链缺陷型CD27并与细胞外区域结合的单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA，将它们的每个插入到用于动物细胞的、含有人类抗体的CH和CL的编码DNA的表达载体中，从而构建用于表达人类嵌合抗体的载体，然后将载体导入到动物细胞中以表达抗体，来生产人类嵌合抗体。

对于人类嵌合抗体的CH来说，可以使用任何CH，只要它属于人类免疫球蛋白(在后文中称为“hIg”)即可，优选属于hIgG类别的，可以使用属于hIgG类别的任何一个亚类，例如hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。对于人类嵌合抗体的CL来说，可以使用任何CL，只要它属于hIg类别即可，并可以使用属于κ类别或λ类别的。

本发明的人类嵌合抗体的实例，包括其中抗体的VH是SEQ ID NO：25显示的氨基酸序列并且抗体的VL是SEQ ID NO：35显示的氨基酸序列的人类嵌合抗体，其中抗体的VH是SEQ ID NO：26显示的氨基酸序列并且抗体的VL是SEQ ID NO：36显示的氨基酸序列的人类嵌合抗体，其中抗体的VH是SEQ ID NO：27显示的氨基酸序列并且抗体的VL是SEQ ID NO：37显示的氨基酸序列的人类嵌合抗体，其中抗体的VH是SEQ ID NO：28显示的氨基酸序列并且抗体的VL是SEQ ID NO：38显示的氨基酸序列的人类嵌合抗体，以及其中抗体的VH是SEQ ID NO：29显示的氨基酸序列并且抗体的VL是SEQ ID NO：39显示的氨基酸序列的人类嵌合抗体。

此外，本发明的人类嵌合抗体的实例，包括其中抗体的VH包含由SEQ ID NO：40到42分别显示的CDR1到3的氨基酸序列、并且抗体的VL包含由SEQ ID NO：43到45分别显示的CDR1到3的氨基酸序列的人类嵌合抗体；其中抗体的VH包含由SEQ ID NO：46到48分别显示的CDR1到3的氨基酸序列、并且抗体的VL包含由SEQ ID NO：49到51分别显示的CDR1到3的氨基酸序列的人类嵌合抗体；其中抗体的VH包含由SEQ ID NO：52到54分别显示的CDR1到3的氨基酸序列、并且抗体的VL包含由SEQ ID NO：55到57分别显示的CDR1到3的氨基酸序列的人类嵌合抗体；其中抗体的VH包含由SEQ ID NO：58到60分别显示的CDR1到3的氨基酸序列、并且抗体的VL包含由SEQ ID NO：61到63分别显示的CDR1到3的氨基酸序列的人类嵌合抗体；以及其中抗体的VH包含由SEQ ID NO：64到66分别显示的CDR1到3的氨基酸序列、并且抗体的VL包含由SEQ ID NO：67到69分别显示的CDR1到3的氨基酸序列的人类嵌合抗体。

人源化抗体是其中源自非人类动物的抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到人类抗体的VH和VL的适当位置中的抗体，也被称为人类CDR移植抗体或重构抗体等。

本发明的人源化抗体可以通过如下方法生产：构建编码抗体可变区(在后文中称为“V区”)的cDNA，其中源自于非人类动物的、由产生本发明的特异性识别糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的单克隆抗体的杂交瘤生产的抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列，被移植到任何人类抗体的VH和VL的构架中(在后文中称为“FR”)。将它们每个插入到用于动物细胞表达的、含有人类抗体的CH和CL的编码基因的载体中，从而构建用于人源化抗体表达的载体，并将其导入到动物细胞中以表达和生产人源化抗体。

对于人类抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列来说，可以使用任何氨基酸序列，只要它们分别是源自于人类抗体的VH和VL的氨基酸序列即可。实例包括在数据库例如蛋白数据库(Protein Data Bank)中登记的人类抗体的VH和VL的氨基酸序列、在例如美国健康与人类服务部(Dept.Health and Human Services)(1991)的《免疫学重要的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)中描述的人类抗体的VH和VL的每个亚组FR的共有氨基酸序列，等等。

对于人源化抗体的CH来说，可以使用任何CH，只要它属于hIg类别即可，优选的是hIgG类别，并且可以使用属于hIgG类别的任何一个亚类，例如hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。对于人源化抗体的CL来说，可以使用任何CL，只要它属于hIg类别即可，并且可以使用属于κ类别或λ类别的。

本发明的人源化抗体的实例，包括其中抗体的VH的CDR1到3分别包含SEQ ID NO：40到42显示的氨基酸序列并且抗体的VL的CDR1到3分别包含SEQ ID NO：43到45显示的氨基酸序列的人源化抗体，其中抗体的VH的CDR1到3分别包含SEQ ID NO：52到54显示的氨基酸序列并且抗体的VL的CDR1到3分别包含SEQ ID NO：55到57显示的氨基酸序列的人源化抗体，其中抗体的VH的CDR1到3分别包含SEQ ID NO：58到60显示的氨基酸序列并且抗体的VL的CDR1到3分别包含SEQ ID NO：61到63显示的氨基酸序列的人源化抗体，其中抗体的VH的CDR1到3分别包含SEQ ID NO：64到66显示的氨基酸序列并且抗体的VL的CDR1到3分别包含SEQ ID NO：67到69显示的氨基酸序列的人源化抗体，等等。

此外，本发明的人源化抗体的具体实例包括下列人源化抗体：

对于抗体的VH的氨基酸序列来说，示例的是其中抗体的VH包含SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列，以及在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中第30位Ser、第48位Val、第49位Ser、第77位Asn、第93位Val、第97位Ala和第117位Thr被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的人源化抗体，和/或对于抗体的VL的氨基酸序列来说，示例的是其中抗体的VL包含SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列，以及在SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列中第21位Ile、第40位Pro、第58位Val、第85位Thr和第87位Tyr被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的人源化抗体。就此而言，被导入的修饰的数量没有限制。

例如，包含了下列人源化抗体：

其中抗体的VH包含在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中第30位Ser、第48位Val、第49位Ser、第77位Asn和第97位Ala被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的人源化抗体，

优选为其中抗体的VH包含在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中第48位Val、第49位Ser和第97位Ala被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的人源化抗体，

优选为其中抗体的VH包含在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中第30位Ser和第97位Ala被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的人源化抗体，等等。

通过上述氨基酸修饰获得的抗体的VH的氨基酸序列，包括其中在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中导入至少一个修饰的氨基酸序列，所述至少修饰选自Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr。

其中导入了7个修饰的VH的氨基酸序列的具体实例，包括在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中导入下列取代的氨基酸序列：Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr。

其中在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中导入了6个修饰的VH的氨基酸序列的具体实例，包括下列氨基酸序列：

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，等等。

其中在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中导入了5个修饰的VH的氨基酸序列的具体实例，包括下列氨基酸序列：

其中导入了Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

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其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

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其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

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其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，等等。

其中在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中导入了4个修饰的VH的氨基酸序列的具体实例，包括下列氨基酸序列：

其中导入了Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

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其中导入了Ile取代第48位Val、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

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其中导入了Asn取代第30位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

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其中导入了Asn取代第30位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

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其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Gly取代第77位Asn和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Gly取代第77位Asn和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Gly取代第77位Asn和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

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其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser和Gly取代第77位Asn的氨基酸序列，等等。

其中在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中导入了3个修饰的VH的氨基酸序列的具体实例，包括下列氨基酸序列：

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val和Ala取代第49位Ser的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val和Gly取代第77位Asn的氨基酸序列，

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其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser和Gly取代第77位Asn的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Ala取代第49位Ser和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Gly取代第77位Asn和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Gly取代第77位Asn和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Gly取代第77位Asn和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser和Gly取代第77位Asn的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Gly取代第77位Asn和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Gly取代第77位Asn和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Gly取代第77位Asn和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser、Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Gly取代第77位Asn、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，等等。

其中在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中导入了2个修饰的VH的氨基酸序列的具体实例，包括下列氨基酸序列：

其中导入了Asn取代第30位Ser和Ile取代第48位Val的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser和Ala取代第49位Ser的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser和Gly取代第77位Asn的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Asn取代第30位Ser和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val和Ala取代第49位Ser的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val和Gly取代第77位Asn的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser和Gly取代第77位Asn的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Gly取代第77位Asn和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Gly取代第77位Asn和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Gly取代第77位Asn和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Thr取代第93位Val和Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Thr取代第93位Val和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr的氨基酸序列，等等。

其中在SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列中导入了1个修饰的VH的氨基酸序列的具体实例，包括下列氨基酸序列：

其中导入了Asn取代第30位Ser的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第48位Val的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第49位Ser的氨基酸序列，

其中导入了Gly取代第77位Asn的氨基酸序列，

其中导入了Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

其中导入了Thr取代第97位Ala的氨基酸序列，

其中导入了Val取代第117位Thr的氨基酸序列。

对于抗体的VL来说，可以提到的是在SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列中第21位Ile、第40位Pro、第58位Val、第85位Thr和第87位Tyr被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。

优选的是其中在SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列中第40位Pro、第58位Val和第87位Tyr被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。

通过上述氨基酸修饰获得的VL的氨基酸序列，包括其中在SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列中导入至少一个修饰的氨基酸序列，所述修饰选自Leu取代第21位Ile、Leu取代第40位Pro、Ile取代第58位Val、Ala取代第85位Thr和Phe取代第87位Tyr的氨基酸修饰。

其中导入了5个修饰的VL的氨基酸序列，包括其中在SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列中导入下列取代的氨基酸序列等：Leu取代第21位Ile、Leu取代第40位Pro、Ile取代第58位Val、Ala取代第85位Thr和Phe取代第87位Tyr。

其中在SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列中导入了4个修饰的VL的氨基酸序列的具体实例，包括下列氨基酸序列：

其中导入了Leu取代第40位Pro、Ile取代第58位Val、Ala取代第85位Thr和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile、Ile取代第58位Val、Ala取代第85位Thr和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile、Leu取代第40位Pro、Ala取代第85位Thr和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile、Leu取代第40位Pro、Ile取代第58位Val和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile、Leu取代第40位Pro、Ile取代第58位Val和Ala取代第85位Thr的氨基酸序列，等等。

其中在SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列中导入了3个修饰的VL的氨基酸序列的具体实例，包括下列氨基酸序列：

其中导入了Leu取代第21位Ile、Leu取代第40位Pro和Ile取代第58位Val的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile、Leu取代第40位Pro和Ala取代第85位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile、Leu取代第40位Pro和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile、Ile取代第58位Val和Ala取代第85位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile、Ile取代第58位Val和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile、Ala取代第85位Thr和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第40位Pro、Ile取代第58位Val和Ala取代第85位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第40位Pro、Ile取代第58位Val和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第58位Val、Ala取代第85位Thr和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，等等。

其中在SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列中导入了2个修饰的VL的氨基酸序列的具体实例，包括下列氨基酸序列：

其中导入了Leu取代第21位Ile和Leu取代第40位Pro的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile和Ile取代第58位Val的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile和Ala取代第85位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第21位Ile和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第40位Pro和Ile取代第58位Val的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第40位Pro和Ala取代第85位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第40位Pro和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第58位Val和Ala取代第85位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第58位Val和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第85位Thr和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，等等。

其中在SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列中导入了1个修饰的VL的氨基酸序列的具体实例，包括下列氨基酸序列：

其中导入了Leu取代第21位Ile的氨基酸序列，

其中导入了Leu取代第40位Pro的氨基酸序列，

其中导入了Ile取代第58位Val的氨基酸序列，

其中导入了Ala取代第85位Thr的氨基酸序列，

其中导入了Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，等等。

此外，本发明的人源化抗体的具体实例，包括其中可变区的H链包含SEQ ID NO：96显示的氨基酸序列和/或可变区的L链包含SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列的人源化抗体，其中可变区的H链包含SEQ ID NO：101显示的氨基酸序列和/或可变区的L链包含SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列的人源化抗体，其中可变区的H链包含SEQ ID NO：103显示的氨基酸序列和/或可变区的L链包含SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列的人源化抗体，其中可变区的H链包含SEQ ID NO：105显示的氨基酸序列和/或可变区的L链包含SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列的人源化抗体，其中可变区的H链包含SEQ ID NO：107显示的氨基酸序列和/或可变区的L链包含SEQ ID NO：97显示的氨基酸序列的人源化抗体，等等。

人类抗体最初是人体中天然存在的抗体，但是它也包括从基于遗传工程、细胞工程和发育工程技术的最新进展制备的人类抗体噬菌体文库或产生人类抗体的转基因动物获得的抗体。

人体中存在的抗体可以如下制备：例如分离人类外周血淋巴细胞，通过用EB病毒等感染使其永生化，然后对它进行克隆，从而获得能够生产抗体的淋巴细胞，对这样获得的淋巴细胞进行培养，并从培养上清液中纯化抗体。

人类抗体噬菌体文库，是其中通过将从人类B细胞制备的编码抗体的基因插入到噬菌体基因中，而在噬菌体表面上表达抗体片段例如Fab和scFv的文库。表达具有所需抗原结合活性的抗体片段的噬菌体，可以利用它与固定有抗原的基体的结合活性作为指标，从文库中回收。抗体片段可以通过遗传工程技术进一步转变为含有两条完整的H链和两条完整的L链的人类抗体分子。

产生人类抗体的转基因动物是其中人类抗体基因被整合到细胞中的动物。具体来说，产生人类抗体的转基因动物可以如下制备：将编码人类抗体的基因导入到小鼠ES细胞中，将ES细胞移植到另一只小鼠的早期胚胎中，然后使其发育。人类抗体可以从产生人类抗体的转基因非人类动物如下制备：通过通常在非人类哺乳动物中进行的杂交瘤制备方法获得产生人类抗体的杂交瘤，将获得的杂交瘤进行培养，并在培养上清液中形成和积累人类抗体。

在构成上述的抗体或抗体片段的氨基酸序列中，其中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入或添加、但仍与上述抗体或其片段具有相似活性的抗体或其抗体片段，也包括在本发明的抗体或其抗体片段中。

被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸数量是一个或多个，没有具体的限制，但是它在通过已知方法例如定点突变方法有可能缺失、取代、或添加的范围内，定点突变方法描述在《分子克隆》(第二版)(Molecular Cloning，Second Edition)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)、Nucleic Acids Research，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、Nucleic Acids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等中。例如，数量为1到几十个，优选为1到20，更优选为1到10，最优选为1到5。

上述抗体的氨基酸序列中“一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入或添加”的表述意义如下。即，它意味着在该序列和一个或多个氨基酸序列中的任选位置上，存在着一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入或添加。此外，缺失、取代、插入或添加可以同时发生，被取代、插入或添加的氨基酸可以是天然类型或非天然类型的。天然类型的氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。

可互相取代的氨基酸的优选实例显示在下面。同样组中的氨基酸可以互相取代。

A组：亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，缬氨酸，正缬氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，O-甲基丝氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，环己基丙氨酸

B组：天冬氨酸，谷氨酸，异天冬氨酸，异谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸

C组：天冬酰胺，谷氨酰胺

D组：赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸，2，4-二氨基丁酸，2，3-二氨基丙酸

E组：脯氨酸，3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸

F组：丝氨酸，苏氨酸，高丝氨酸

G组：苯丙氨酸，酪氨酸

抗体的效应子活性包括ADCC活性、CDC活性、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)活性、调理作用效应等。它可以通过各种方法控制。

用于控制效应子活性的方法的实例包括控制结合到抗体Fc区的糖链的方法、对抗体Fc区中的氨基酸残基进行氨基酸修饰的方法等。

控制结合到抗体Fc区的糖链的方法的实例包括通过消除IgG抗体第297位的糖链降低ADCC或CDC活性的方法[Molecular Immunology，32，1311，(1995)，WO2008/030564]，通过减少半乳糖与抗体Fc区的结合降低CDC活性的方法等。

此外，控制结合到抗体Fc区的糖链的方法的实例，包括生产含有在连接到IgG抗体Fc区第297位的天冬酰胺上的N-连接糖链中、在结合到糖链结合的基部的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)上的不含岩藻糖的糖链的抗体的方法(US7,214,775和US6,946,292)，生产含有结合有对分GlcNAc的糖链的抗体的方法[Nature Biotechnology，17，176，(1999)]，生产含有在非还原末端结合有半乳糖(Gal)的糖链的抗体的方法[Hum.Antibod.Hybridomas，5，143-151.(1994)]，等等。

对抗体Fc区中的氨基酸残基进行氨基酸修饰的方法的实例，包括通过抗体Fc区的氨基酸修饰控制效应子活性的方法(J.B.C.，277，26733-26740，2002，US6,737,056，US7,297,775，US2007/0020260和WO2005/070963)，通过抗体Fc区域的相应亚类之间的结构域交换控制效应子活性的方法(WO2007/011041)等。

本发明的抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、scFv、双链抗体、dsFv等。

本发明的抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、scFv、双链抗体、dsFv、包含CDR的肽等。

Fab是具有大约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中在通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(在H链的第224位切开氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中，H链的大约一半N-端侧和整个L链通过二硫键结合在一起。

本发明的Fab可以通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理特异性识别本发明的糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的单克隆抗体来生产。此外，Fab也可以通过将编码抗体的Fab的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，并将载体导入到原核生物或真核细胞中以表达Fab来生产。

F(ab′)₂是分子量约为100,000并具有抗原结合活性的抗体片段，其包含通过用酶木瓜蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的在铰链位置结合的两个Fab区。

本发明的F(ab′)₂可以通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理特异性识别本发明的糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的单克隆抗体来生产。此外，所述F(ab′)₂也可以通过用硫醚键或二硫键连接下面描述的Fab′来生产。

Fab′是分子量约为50,000并具有抗原结合活性的抗体片段，其通过在上述F(ab′)₂的铰链区处切开二硫键而获得。

本发明的Fab′可以使用还原剂二硫苏糖醇，由特异性识别本发明的糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的F(ab′)₂生产。此外，Fab′也可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产。

scFv是VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其中使用了适当的肽接头(在后文中称为“P”)将一条链VH和一条链VL连接在一起，并且是具有抗原结合活性的抗体片段。

本发明的scFv可以通过获得特异性识别糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA，将DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv来生产。

双链抗体是其中scFv被二聚体化并具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。

本发明的双链抗体可以通过获得特异性识别糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA使得P的氨基酸序列长度是8个或以下的残基，将DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双链抗体，来生产。

dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽，通过半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。用半胱氨酸残基取代的氨基酸残基，可以按照Reiter等(Protein Engineering，7，697-704(1994))显示的方法，根据抗体的三维结构评估进行选择。

本发明的dsFv可以通过获得获得特异性识别糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv来生产。

含CDR的肽通过包含VH或VL的CDR的一个或多个区域来构成。含多个CDR的肽可以直接或通过适合的肽连接物相连。

本发明的含CDR的肽，可以通过构建特异性识别糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的编码DNA，将DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达肽，来生产。

含有CDR的肽也可以通过化学合成方法来生产，例如Fmoc方法(芴基甲氧基羰基方法)、tBoc方法(叔丁氧基羰基方法)。

本发明的抗体包括抗体结合物，其中特异性识别糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的单克隆抗体或其抗体片段通过化学或遗传方法与药剂、蛋白、放射性同位素等连接。

本发明的结合物可以通过将药剂、蛋白、放射性同位素等化学连接到本发明的特异性识别糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的单克隆抗体或其抗体片段的H链或L链的N-端侧或C-端侧、抗体或抗体片段的适合的取代基或侧链上、抗体或抗体片段中的糖链上等，来生产[《抗体工程手册》，Antibody Engineering Handbook，Osamu Kanemitsu主编，Chijin Shokan出版(1994)]。

此外，结合物也可以如下遗传方法生产：将特异性识别糖链缺陷型CD27蛋白并与细胞外区域结合的单克隆抗体或其抗体片段的编码DNA与编码待结合蛋白的其他DNA连接在一起，将DNA插入到表达载体中，并将表达载体导入到原核生物或真核生物宿主细胞中。

药剂包括化疗剂、治疗性抗体、免疫刺激剂、具有高分子量的药剂等。

蛋白包括细胞因子、生长因子、毒性蛋白等。

此外，待结合到抗体或其抗体片段上的药剂可以是药物前体的形式。本发明中的药物前体是受到肿瘤环境中存在的酶的化学修饰、并被转化成具有损害肿瘤细胞的活性的物质的药剂。

化疗剂包括任何化疗剂，例如烷基化剂、亚硝基脲剂、代谢拮抗剂、抗癌性抗生素物质、来源于植物的生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素疗法药剂、激素拮抗剂、芳香化酶抑制剂、P糖蛋白抑制剂、铂复合物衍生物、M期抑制剂和激酶抑制剂。化疗剂的实例包括氨磷汀(Ethyol)、顺铂，达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、mecloretamin(氮芥子气)、链脲佐菌素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、阿霉素(亚德里亚霉素)、阿霉素脂质体(Doxyl)、表柔比星、吉西他滨(Gemsal)、柔红霉素、柔红霉素脂质体(Daunozome)、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春花碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌氮芥、紫杉醇(泰克索(Taxol))、多烯紫衫醇(泰素帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉曲滨、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基喜树碱(SN38)、5-氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司那、伊立替康、nogitecan、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、羟基脲、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、戊制菌素、哌泊溴烷、链脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、硫替哌、尿嘧啶氮芥、长春瑞宾、苯丁酸氦芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼(易瑞沙)、伊马替尼(STI 571)、埃罗替尼、Flt3抑制剂、VEGFR抑制剂、FGFR抑制剂、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安丫啶、全反式视黄酸、沙利度胺、阿那曲唑、法曲唑、来曲唑、依西美坦、硫代苹果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢霉素、雷帕霉素、氢化可的松、蓓萨罗丁(Targretin)、他莫昔芬、地塞米松、孕激素物质、雌激素物质、阿那曲唑(瑞宁得)、来普隆、阿司匹林、吲哚美辛、塞来考昔、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代苹果酸金、马来酸氯苯吡胺、氯苯那敏、氯马斯汀、维A酸、蓓萨罗丁、砷、voltezomib、别嘌呤醇、吉妥单抗、伊莫单抗、131托西莫单抗、塔革雷汀、ONTAK、奥唑米星、克拉霉素、甲酰四氢叶酸、异环磷酰胺、酮康唑、氨基苯乙哌啶酮、苏拉明、氨甲蝶呤、美登醇及其衍生物。

将化疗剂与抗体结合的方法包括其中化疗剂与抗体的氨基通过戊二醛连接的方法，其中化疗剂的氨基与抗体的羧基通过水溶性碳二亚胺连接的方法，等等。

治疗性抗体包括针对其中与抗体的结合诱导了凋亡的抗原的抗体、针对参与肿瘤的病态形成的抗原的抗体、调节免疫功能的抗体、以及与病态部位中血管形成相关的抗体。

其中与抗体的结合诱导了凋亡的抗原包括分化簇(在后文中称为“CD”)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、II类人类白细胞抗原(HLA)、EGFR，等等。

调节免疫功能的抗体的抗原包括CD4、CD40、CD40配体、B7家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4)、B7家族分子的配体(CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、BTLA)、OX-40、OX-40配体、CD137、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族分子(DR4、DR5、TNFR1、TNFR2)、诱导TNF相关的凋亡的配体受体(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受体家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子κB配体(RANK)的受体激活剂、RANK配体、CD25、叶酸受体4、细胞因子[白介素-1α(后文中自介素称为“IL”)、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、转化生长因子(TGF)β、TNFα，等等]、这些细胞因子的受体、趋化因子(SLC、ELC、I-309、TARC、MDC、CTACK等)以及这些趋化因子的受体。

在病态部位抑制血管形成的抗体的抗原包括内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、EGF、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素(EPO)、TGFβ、IL-8、ephilin、SDF-1等。

免疫刺激剂可以是任何被称为免疫佐剂的天然产物。增强免疫原的药剂的实例包括β-1，3-葡聚糖(香菇多糖，裂裥菌素)、α-半乳糖苷神经酰胺(KRN7000)、真菌粉末(picibanil，BCG)和真菌提取物(云芝多糖(krestin))。

具有高分子量的药剂包括聚乙二醇(在后文中称为“PEG”)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯-马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羟丙基甲基丙烯酰胺等。通过将这些具有高分子量的化合物与抗体或抗体片段结合，预期发生下列效应：(1)改进对抗各种不同化学、物理或生物因子的稳定性，(2)显著延长在血液中的半衰期，(3)免疫原性、抗体生产的抑制等的消失[Bioconjugate Drug，Hirokawa Shoten(1993)]。例如，用于将PEG结合到抗体上的方法，包括使抗体与PEG修饰反应物进行反应的方法[Bioconjugate Drug，Hirokawa Shoten(1993)]。PEG修饰反应物包括赖氨酸的ε-氨基的修饰剂(日本公开的未经审查的专利申请No.178926/86)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修饰剂(日本公开的未经审查的专利申请No.23587/81)、精氨酸的胍基的修饰剂(日本公开的未经审查的专利申请No.117920/90)等。

细胞因子或生长因子可以是任何细胞因子或生长因子，只要它增强了细胞例如NK细胞、巨噬细胞和嗜中性细胞即可。例子包括干扰素(在后文中称为“INF”)-α、INF-β、INF-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。

毒性蛋白包括篦麻毒素、白喉毒素、ONTAK等，还包括在蛋白中导入突变以便控制毒性的毒性蛋白。

放射性同位素包括¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、⁶⁴Cu、¹⁹⁹Tc、⁷⁷Lu、²¹¹At等。放射性同位素可以通过氯胺-T方法直接与抗体相连。此外，也可以将螯合放射性同位素的物质与抗体相连。螯合剂包括甲基苯甲基二亚乙基-三胺五乙酸(MX-DTPA)等。

在本发明中，用于本发明的抗体可以与一种或多种其他药剂组合施用，并也可以组合使用放射性辐照。其它的药剂包括上面描述的化疗剂、治疗性抗体、免疫刺激剂例如细胞因子等。

放射性辐照包括光子(电磁)辐照例如X-射线或γ-射线、粒子辐照例如电子束、质子束或重粒子束，等等。

在组合给药的方法中，药剂可以与本发明中使用的抗体同时给药，或者药剂可以在本发明中使用的抗体给药之前或之后给药。

本发明中的检测方法、测定方法、检测试剂、测定试剂或诊断试剂，包括其中通过标记本发明的抗体而使用了特定标记物的方法。标记物包括在通用免疫检测或测量方法中使用的标记物，实例包括酶例如碱性磷酸酶、过氧化物酶和萤光素酶，发光材料例如吖啶酯和洛粉碱，荧光材料例如荧光素异硫氰酸酯(FITC)和三甲基罗丹明(RITC)等。

下面，将对本发明的抗体的制备方法进行更详细描述。

1.单克隆抗体的生产方法

(1)抗原的制备

按照下列步骤，通过将包含编码全长或部分长度CD27的cDNA的表达载体导入其中在O-连接糖链合成过程中能够向连接到多肽的Ser/Thr上的GalNAc添加Gal的酶、参与酶活性的蛋白或参与UDP-半乳糖运输的蛋白的活性降低或缺失的酵母、昆虫细胞、动物细胞等中，可以获得作为抗原的糖链缺陷型CD27或表达糖链缺陷型CD27的细胞。此外，可以从各种在细胞膜上或在培养基中表达大量糖链缺陷型CD27的人类来源的培养细胞、人类组织等纯化糖链缺陷型CD27，从而制备抗原。或者，可以制备具有糖链缺陷型CD27的部分序列的合成肽并用作抗原。此外，也可以通过向从不具有糖链添加能力的原核生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)表达和纯化的CD27体外添加糖链来获得糖链缺陷型CD27。

同样地，可以通过将包含全长或部分长度CD27的编码cDNA的表达载体导入具有正常的O-连接糖链合成过程的宿主细胞(例如酵母、昆虫细胞或动物细胞)中，并从如此获得的细胞纯化含有正常O-连接糖链的CD27蛋白，来获得表达含有正常O-连接糖链的CD27的细胞。

如上获得的糖链缺陷型CD27、含有正常O-连接糖链的CD27蛋白或表达细胞，可用于筛选所需抗体和验证获得的抗体对抗原的反应性。

本发明中使用的多肽可以通过使用在《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1987-1997))等中描述的方法根据下述方法，例如在宿主细胞中表达编码多肽的DNA来生产。

首先，通过将全长cDNA导入到适合的表达载体的启动子下游而制备重组载体。这时，如果需要，可以制备具有适当长度、含有基于全长cDNA的多肽的编码区的DNA片段，该DNA片段可以代替上述的全长cDNA使用。接下来，通过将重组载体导入适合表达载体的宿主细胞，可以获得产生多肽的转化体。

宿主细胞可以是任何细胞，只要它具有添加O-连接糖链的能力并能够表达目的基因即可，并包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。

表达载体包括能够在供使用的宿主细胞中自主复制的载体，或者能够整合到染色体中、在适当位置含有适当启动子以使得编码多肽的DNA能够被转录的载体。

当使用原核生物例如大肠杆菌作为宿主细胞时，优选情况下，重组载体可以在原核生物中自主复制，并含有启动子、核糖体结合序列、在本发明中使用的DNA以及转录终止序列。重组载体还可以含有调控启动子的基因。

表达载体包括例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(都由Roche Diagnostics制造)、pKK233-2(Pharmacia制造)、pSE280(Invitrogen制造)、pGEMEX-1(Promega制造)、pQE-8(QIAGEN制造)、pKYP10(日本公开的未经审查的专利申请No.110600/83)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene制造)、pTrs30[从大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[从大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[从大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备，日本公开的未经审查的专利申请No.221091/85]、pGKA2[从大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备，日本公开的未经审查的专利申请No.221091/85]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pGEX(Pharmacia制造)、pET系统(Novagen制造)、pME18SFL3，等等。

可以使用任何启动子，只要它能够在供使用的宿主细胞中起作用即可。实例包括源自于大肠杆菌、噬菌体等的启动子，例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子和T7启动子。此外，也可以使用人工设计和修饰的启动子，例如其中两个Ptrp串联连接的启动子、tac启动子、lacT7启动子和letI启动子。

此外，上述的重组载体优选为质粒，其中作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间的间距被调整到适当的距离(例如6到18个核苷酸)。在本发明所用的多肽的编码DNA的核苷酸序列中，核苷酸能够适当地安排，以获得适合在宿主中表达的密码子，使得目的多肽的生产率可以提高。此外，尽管上述重组载体中的转录终止序列对于表达基因来说不是必需的，但在优选情况下，将转录终止序列布置在紧邻结构基因的下游

宿主细胞包括属于大肠杆菌属(Escherichia)的微生物，其实例包括大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌DH5α，等等。

任何导入重组载体的方法都可以使用，只要它是用于将DNA导入到上述宿主细胞中的方法即可，实例包括在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)中描述的使用钙离子的方法、Gene，17，107(1982)和Molecular & General Genetics，168，111(1979)等中描述的方法。

当动物细胞被用作宿主细胞时，表达载体包括例如pcDNAI、pcDM8(从Funakoshi获得)、pAGE107[日本公开的未经审查的专利申请No.22979/91；Cytotechnology，3，133(1990)]、pAS3-3(日本公开的未经审查的专利申请No.227075/90)、pCDM8[Nature，329，840，(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen制造)、pREP4(Invitrogen制造)、pAGE103[J.Biochemistry，101，1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(WO 97/10354)等等。

可以使用任何启动子，只要它能够在动物细胞中起作用即可。实例包括细胞肥大病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的启动子、SV40早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子等。此外，人类CMV的IE基因的增强子可以与启动子一起使用。

宿主细胞可以是任何宿主细胞，只要它是其中在糖链合成过程中能够向结合到多肽的Ser/Thr上的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)添加Gal的酶、参与酶活性的蛋白或参与尿苷5′-二磷酸-半乳糖(UDP-半乳糖)运输的蛋白的活性降低或缺失的细胞系即可。具体来说，宿主细胞可以是Lec8突变体[ACS Symp.Ser.128，214(1980)]，其是不含UDP-半乳糖转运蛋白的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。

此外，即使细胞没有参与糖链合成过程的酶活性或转运蛋白活性的缺陷，也可以使用其中酶例如UDP-半乳糖转运蛋白(也称为UDP-半乳糖转运体，UGALT)或核心1合酶、糖蛋白-n-乙酰半乳糖胺3-β-半乳糖基转移酶(C1GALT1，也称为核心1β-3-gal-t，t合酶)或C1GALT1特异性伴侣蛋白1(c1galt1c1，也称为核心1β-3-半乳糖基转移酶特异性分子伴侣(COSMC)，C1GALT2)的功能，或转运蛋白的功能降低或缺失的细胞株。

其中参与糖链合成过程的酶的活性或转运蛋白的活性没有缺失的细胞的实例，包括Namalwa细胞、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HBT5637(日本公开的未经审查的专利申请No.299/88)等。

用于抑制基因功能的方法的实例包括反义方法、核酶方法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96，1886(1999)]、同源重组方法[《小鼠胚胎操作实验指南》(第二版)(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual，Second Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)，《基因定向实用方法》(Gene Targeting，A Practical Approach)，IRL Press at Oxford University Press(1993)]、RNA-DNA寡核苷酸(RDO)方法、RNA干扰(RNAi)方法[Nature，391，806，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，15502，(1998)，Nature，395，854，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96，5049，(1999)，Cell，95，1017，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，1451，(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，13959，(1998)，Nature Cell Biol，2，70，(2000)]、使用反转录病毒的方法、使用转座子的方法[Nature Genetics，25，35，(2000)]，等等。

任何导入重组载体的方法都可以使用，只要它是用于将DNA导入到动物细胞中的方法即可，实例包括电穿孔[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸钙方法(日本公开的未经审查的专利申请No.227075/90)、脂转染方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]，等等。

作为基因的表达方法，除了直接表达之外，还可以按照《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中描述的方法进行分泌生产、融合蛋白表达等。当在真核生物来源的细胞中进行表达时，可以获得添加有糖或糖链的多肽。

在本发明中使用的多肽可以通过将如此获得的转化体在培养基中进行培养，以在培养基中形成和积累多肽并从培养物中回收它来生产。在培养基中培养转化体的方法按照在宿主培养中常用的方法来进行。

当用含有可诱导的启动子作为启动子的重组载体转化的微生物被培养时，如果需要，可以向培养基加入诱导剂。例如，当对使用lac启动子的重组载体转化的微生物进行培养时，可以向培养基加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等，或者当对使用trp启动子的重组载体转化的微生物进行培养时，可以向其中加入吲哚丙烯酸等。

当使用动物细胞作为宿主细胞获得的转化体被培养时，培养基包括常用的RPMI 1640培养基[The Journal of the American Medical Association，199，519(1967)]、Eagle’s MEM培养基[Science，122，501(1952)]、Dulbecco’s修改的MEM培养基[Virology，8，396(1959)]以及199培养基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950)]、其中添加了胎牛血清等的培养基，等等。培养一般在存在5％CO₂的情况下，在pH 6到8和30到40℃下进行1到7天。如果必要，在培养过程中可以向培养基添加例如卡那霉素或青霉素的抗生素。

因此，在本发明中使用的多肽，可以通过按照通用的培养方法，对源自于微生物、动物细胞等的转化体进行培养，所述转化体包含其中插入了本发明使用的多肽的编码DNA的重组载体，从而形成和积累多肽，然后从培养物中回收多肽，来进行生产。

对于基因的表达方法来说，除了直接表达之外，还可以按照《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中描述的方法进行分泌生产、融合蛋白表达等。

生产多肽的方法包括在宿主细胞中进行细胞内表达的方法、从宿主细胞进行细胞外分泌的方法、在宿主细胞膜外膜上生产的方法，等等。适合的方法可以通过改变使用的宿主细胞和产生的多肽的结构来选择。

当在宿主细胞中或宿主细胞膜外膜上生产多肽时，使用Paulson等的方法[J.Biol.Chem.，264，17619(1989)]、Lowe等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，8227(1989)，Genes Develop.，4，1288(1990)]、日本公开的未经审查的专利申请No.336963/93和WO94/23021中描述的方法等，可以将基因产物主动分泌到细胞外。

此外，按照日本公开的未经审查的专利申请No.227075/90中描述的方法，利用使用二氢叶酸还原酶基因的基因扩增系统，能够增加产量。

多肽可以例如如下所述从上述培养物中分离和纯化。

当多肽以溶解状态在细胞内表达时，细胞在培养后通过离心回收，悬浮在水性缓冲液中，然后使用超声发生器、French压力器、Manton Gaulin匀浆器、珠磨机(dynomill)等进行破碎，以获得无细胞提取物。将无细胞提取物进行离心以获得上清液，并可以通过对上清液使用通用的酶分离和纯化技术来获得纯化的制备物，这些技术例如为溶剂抽提，使用硫酸铵等进行盐析，脱盐，用有机溶剂沉淀，使用树脂例如二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖凝胶、DIAION HPA-75(Mitsubishi Chemical制造)进行阴离子交换层析，使用树脂例如S-琼脂糖凝胶FF(Pharmacia制造)进行阳离子交换层析，使用树脂例如丁基-琼脂糖凝胶或苯基-琼脂糖凝胶进行疏水层析，使用分子筛进行凝胶过滤，亲和层析，层析聚焦，电泳例如等点聚焦，等等，它们可以单独或组合使用。

当多肽通过形成包涵体在细胞内表达时，细胞以同样的方式回收、破碎和离心，多肽的包涵体作为沉淀级份被收集。将收集的蛋白的包涵体用蛋白变性剂进行溶解。通过对溶解的溶液进行稀释或透析，使蛋白成为正常的三维结构，然后通过与上述相同的分离纯化方法获得多肽的纯化产品。

此外，本发明中使用的多肽可以通过化学合成方法来生产，例如Fmoc(芴基甲氧基羰基)方法或tBoc(叔丁氧基羰基)方法。此外，可以使用由Advanced ChemTech、Perkin-Elmer、Pharmacia、Protein Technology Instrument、Synthecell-Vega、PerSeptive、Shimadzu Corporation等公司制造的肽合成仪来化学合成。

(2)动物的免疫接种和抗体产生细胞的制备

使用上面制备的抗原免疫接种3到20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠，并从动物的脾脏、淋巴结或外周血收集抗体产生细胞。此外，当在上述动物中识别由于低的免疫原性而导致的足够的滴度增加时，可以使用CD27敲除的小鼠作为供免疫接种的动物。

免疫接种通过给动物皮下、静脉内或腹膜内注射抗原连同适合的佐剂(例如完全Freund′s佐剂，氢氧化铝凝胶与百日咳疫苗的组合等)来进行。当抗原是部分肽时，用载体蛋白例如BSA(牛血清白蛋白)、KLH(匙孔血蓝蛋白)等产生偶联物，将其用作抗原。

在第一次给药后，抗原的给药每一周或每两周内进行5到10次。在每次给药后的第三到第七天，从眼底收集血液样品，通过例如酶法免疫分析[《抗体实验指南》，Antibodies-A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等测试血清与抗原的反应性。在其血清中显示出针对用于免疫接种抗原的足够的抗体滴度的小鼠、大鼠或仓鼠，被用作抗体产生细胞的供应源。

在抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的融合中，在最后一次给药抗原后的第三到第七天，切除含有抗体产生细胞的组织例如来自被免疫接种的小鼠、大鼠或仓鼠的脾脏，以收集抗体产生细胞。当使用脾脏细胞时，将切除的脾脏置于MEM培养基中(Nissui Pharmaceutical)，用镊子打散，并离心(1200rpm，5分钟)。然后，丢弃上清液，加入Tris-氯化铵缓冲液(pH 7.65)1到2分钟以除去红细胞。在用MEM培养基洗3次后，提供了用于融合的抗体产生细胞。

(3)骨髓瘤细胞的制备

从小鼠获得的已建立的细胞系被用作骨髓瘤细胞。例子包括8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(源自于BALB/c小鼠)的骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology，18，1-7(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology，6，511-519(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature，276，269-270(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology，123，1548-1550(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature，256，495-497(1975)]，等等。将这些细胞系在8-氮杂鸟嘌呤培养基中传代培养[该培养基是将谷氨酰胺(1.5mM)、2-巯基乙醇(5×10^-5M)、庆大霉素(10μg/ml)和胎牛血清(FCS)加入到RPMI-1640培养基(在后文中称为“正常培养基”)中，并再加入8-氮杂鸟嘌呤(15μg/ml)]，并且在细胞融合之前将它们在正常培养基中传代培养3或4天，以确保在进行融合的当天细胞数量达到2×10⁷个或以上。

(4)细胞融合

将上述的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞用MEM培养基或PBS(1.83g磷酸氢二钠，0.21g磷酸二氢钾，7.65g氯化钠，1升蒸馏水，pH 7.2)进行充分清洗和混合，使抗体产生细胞∶骨髓瘤细胞的比率＝5-10∶1，然后离心(1200rpm，5分钟)。然后丢弃上清液，将沉淀的细胞群充分打散。向10⁸个抗体产生细胞中，在37℃下在搅拌下加入0.2到1mL2g聚乙二醇-1000(PEG-1000)、2mL MEM和0.7mL二甲亚砜的混合物溶液，每1或2分钟加入1到2mL MEM培养基数次，并加入MEM培养基使得总量为50mL。离心(900rpm，5分钟)后，将上清液丢弃，轻轻地将细胞打散，通过使用移液管吹吸，将细胞轻柔地悬浮在100mL HAT培养基中[该培养基是添加了次黄嘌呤(10^-4M)、胸腺嘧啶(1.5×10^-5M)和氨基蝶呤(4×10^-7M)的正常培养基]。将悬浮液以100μL/孔分配到96孔培养板上，在5％CO₂的培养箱中在37℃培养7到14天。

培养后，将部分培养上清液作为样品，通过下面描述的结合分析方法选择对含有本发明中使用的多肽的抗原具有反应性而对不包含多肽的抗原没有反应性的杂交瘤。

然后，通过有限稀释方法进行两次克隆[第一次使用HT培养基(其中除去了氨基蝶呤的HAT培养基)，第二次使用正常培养基]，选择显示出稳定的高抗体滴度的杂交瘤作为生产单克隆抗体的杂交瘤。

(5)单克隆抗体的制备

将在(4)中获得的产生抗CD27单克隆抗体的杂交瘤细胞，以2×10⁶到5×10⁷个细胞/动物的剂量通过腹膜内注射给药于8到10周龄的鲨肝油烷处理过的小鼠或裸鼠中(0.5ml 2，6，10，14-四甲基十五烷(鲨肝油烷)腹膜内注射，然后饲养2周)。杂交瘤在10到21天内发展成腹水肿瘤。从小鼠收集腹水液，离心(3,000rpm，5分钟)以除去固形物，用40到50％饱和的硫酸铵进行盐析，然后用辛酸沉淀，通过DEAE-琼脂糖凝胶柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱，收集IgG或IgM级份作为纯化的单克隆抗体。

抗体的亚类可以使用亚类分型试剂盒通过酶法免疫分析来确定。蛋白的量可以通过Lowry方法或280nm处的吸光度来测定。

(6)结合分析

通过将含有本发明使用的CD27多肽的编码cDNA的表达载体导入到大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等中而获得的导入了基因的细胞或重组蛋白、或从人类组织获得的纯化的多肽或部分肽，被用作抗原。当抗原是部分肽时，使用BSA(牛血清白蛋白)或KLH(匙孔血蓝蛋白)等制备结合物并使用。

在通过分配到96孔板中使这些抗原进入固相层后，在其中分配作为第一抗体的免疫动物的血清、产生单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液或纯化的抗体，并进行反应。在用PBS或PBS-0.05％Tween充分清洗后，在其中分配作为第二抗体的用生物素、酶、化学发光物质、放射性化合物等标记的抗免疫球蛋白抗体，并进行反应。在用PBS-Tween充分清洗后，对第二抗体的标记物质作出响应进行反应。

与如此获得的单克隆抗体竞争与CD27的细胞外区域结合的抗体，可以通过向上面提到的结合检测系统加入待测试抗体并进行反应，来制备。也就是说，与如此获得的单克隆抗体竞争与糖链缺陷型CD27的细胞外区域结合的单克隆抗体，可以通过进行当加入待测试抗体时单克隆抗体的结合被抑制的抗体的筛选来制备。

此外，与识别糖链缺陷型CD27并结合其细胞外区域的单克隆抗体所识别的表位结合的抗体，可以通过使用上面提到的结合检测系统鉴定获得的抗体的表位，并构建所鉴定到的表位的部分糖链结合肽或模拟表位三维结构的糖链结合肽，然后进行免疫接种来获得。

2.重组抗体的制备

作为重组抗体的生产实例，下面显示了用于生产人类嵌合抗体和人源化抗体的方法。

(1)表达重组抗体的载体的构建

表达重组抗体的载体是用于动物细胞的、其中插入了编码人类抗体的CH和CL的DNA，并通过将每个编码人类抗体的CH和CL的DNA克隆到动物细胞表达载体中来构建的表达载体。

人类抗体的C区可以是任何人类抗体的CH和CL。实例包括属于γ1亚类的CH、属于κ亚类的CL等。对于编码人类抗体的CH和CL的DNA来说，可以使用含有外显子和内含子的染色体DNA或cDNA。对于动物细胞的表达载体来说，可以使用任何表达载体，只要其中能够插入并表达编码人类抗体C区的基因即可。实例包括pAGE107[Cytotechnol.，3，133-140(1990)]、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987)]、pHSG274[Gene，27，223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.，78，1527(1981)]、pSG1βd2-4[Cytotechnol.，4，173(1990)]、pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.，13，79(1993)]，等等。用于动物细胞的表达载体的启动子和增强子的实例包括SV40早期启动子[J.Biochem.，101，1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960-968(1987)]、免疫球蛋白H链启动子[Cell，41，479(1985)]和增强子[Cell，33，717(1983)]，等等。

用于重组抗体表达的载体可以是其中抗体的H链编码基因和L链编码基因存在于分开的载体上的类型，也可以是其中两个基因存在于同一个载体上的类型(串联类型)。对于构建用于重组抗体表达的载体的容易性、导入动物细胞的容易性、以及动物细胞中抗体H链和L链的表达量之间的平衡来说，串联类型的表达重组抗体的载体更为优选[J.Immunol.Methods，167，271(1994)]。串联类型的用于表达重组抗体的载体的实例包括pKANTEX93(WO 97/10354)、pEE18[Hybridoma，17，559(1998)]，等等。

(2)源自非人类动物的抗体V区的编码cDNA的获得及氨基酸序列分析

编码源自非人类动物的抗体的VH和VL的cDNA可以按照下面的方式获得。

从产生源自非人类动物的抗体的杂交瘤细胞提取mRNA用于合成cDNA。将合成的cDNA克隆到载体例如噬菌体或质粒中以制备cDNA文库。通过使用编码非人类动物抗体的C区或V区的一部分的DNA作为探针，从文库中分离每个含有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。测定重组噬菌体或重组质粒上目的源于非人类动物抗体的VH和VL的全长核苷酸序列，并从核苷酸序列推导出VH和VL的全长氨基酸序列。

非人类动物可以是任何动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔，只要可以从其生产杂交瘤细胞即可。

从杂交瘤细胞制备总RNA的方法的实例，包括硫氰酸胍-三氟乙酸铯方法[Methods in Enzymology，154，3(1987)]等。从总RNA制备mRNA的方法的实例，包括固定化有寡聚(dT)的纤维素柱的方法[《分子克隆实验指南》(第二版)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]，等等。此外，用于从杂交瘤细胞制备mRNA的试剂盒的实例包括Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)、Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)，等等。

用于合成cDNA和制备cDNA文库的方法的实例，包括已知方法[《分子克隆实验指南》Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press New York(1989)，《分子生物学现代方法》Current Protocols in Molecular Biology，附录1-34]，使用可商购试剂盒的方法，例如用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScript^TM质粒系统(GIBCO BRL制造)、ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene制造)，等等。

其中插入使用从杂交瘤细胞提取的mRNA作为模板合成的cDNA、用于制备cDNA文库的载体，可以是任何载体，只要可以插入cDNA即可。实例包括ZAP Express[Strategies，5，58-61(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research，17，9494(1989)]、λzap II(Stratagene制造)、λgt10和λgt11[《DNA克隆实用方法》DNA Cloning：A Practical Approach，I，49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech制造)、λExCell和pT7T318U(Pharmacia制造)、pcD2[Molecular & Cellular Biology，3，280(1983)]、pUC18[Gene，33，103(1985)]，等等。

可以使用任何用于导入通过噬菌体或质粒载体所构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要cDNA文库可以被导入、表达并维持即可。实例包括XL 1-Blue MRF’[Strategies，5，81(1992)]、C600[Genetics，39，440(1954)]、Y1088和Y1090[Science，222：778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol，166，1(1983)]、K802[J.Mol.Biol，16，118(1966)]、JM105[Gene，38，275(1985)]，等等。

使用同位素或荧光标记的探针进行菌落杂交或噬斑杂交的方法，可用于从cDNA文库中筛选编码非人类动物来源的抗体的VH和VL的cDNA克隆[《分子克隆实验指南》(第二版)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。此外，编码VH和VL的cDNA，可以通过制备引物并使用从mRNA制备的cDNA或cDNA文库作为模板进行聚合酶链反应(在后文中称为“PCR”)，来制备[《分子克隆实验指南》(第二版)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，《分子生物学现代方法》，Current Protocols in Molecular Biology，附录1-34]。

cDNA的核苷酸序列可以如下确定：用适合的限制性酶等消化通过上述方法筛选的cDNA，将片段克隆到质粒例如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)中，通过常用的核苷酸分析方法例如Sanger，F.等的双脱氧方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)]进行反应，然后使用自动化核苷酸序列分析仪例如A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia制造)来分析序列。

获得的cDNA是否编码含有分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列，可以通过从测定的核苷酸序列估计出VH和VL的全长氨基酸序列，并将它们与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列进行比较[《免疫重要的蛋白序列》，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国健康与人类服务部，(1991)]，来验证。将含有分泌信号序列的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国健康与人类服务部，(1991)]进行比较，可以推导出分泌信号序列的长度和N-末端氨基酸序列，并且也可以知道它们所属的亚类。此外，VH和VL的每个CDR的氨基酸序列，可以通过将获得的氨基酸序列与已知抗体的VH和VL的氨基酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国健康与人类服务部，(1991)]进行比较来发现。

此外，通过使用VH和VL的全长氨基酸序列在任何数据库例如SWISS-PROT或PIR-Protein等中进行序列同源性搜索，例如按照BLAST方法[J.Mol.Biol，215，403(1990)]等，可以检查序列的新颖性。

(3)人类嵌合抗体表达载体的构建

将编码非人类动物的抗体的VH和VL的cDNA，克隆到上面2(1)中提到的重组抗体表达载体中人类抗体的CH或CL编码基因的上游，从而构建了人类嵌合抗体表达载体。例如，将每个编码非人类动物的抗体的VH和VL的cDNA与合成的DNA进行连接，所述合成的DNA含有非人类动物的抗体的VH或VL的3′-端核苷酸序列和人类抗体的CH或CL的5′-端核苷酸序列，并在两端具有适当的限制性酶的识别序列，并进行克隆，以便它们每个都以适当的形式表达在上面2(1)中提到的人源化抗体表达载体中编码人类抗体的CH或CL的基因的上游，从而构建了人类嵌合抗体表达载体。此外，使用在两端具有适当的限制性酶识别序列的合成的DNA，通过PCR扩增了编码非人类动物的VH或VL的cDNA，并将它们每个克隆到上面2(1)中提到的重组抗体表达载体中。

(4)人源化抗体V区的编码cDNA的构建

编码人源化抗体的VH或VL的cDNAs可以如下获得。首先，选择人类抗体的VH或VL中的架构区(在后文中称为“FR”)的氨基酸序列，在该序列中移植源自非人类动物的抗体的VH或VL中CDR的氨基酸序列。可以使用人类抗体的VH或VL中FR的任何氨基酸序列，只要它们来自人类即可。实例包括在数据库例如蛋白数据库(Protein Data Bank)等中登记的人类抗体的VH或VL中FR的氨基酸序列、在人类抗体的VH或VL中FR的亚类共有的氨基酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国健康与人类服务部，(1991)]，等等。为了抑制抗体的结合活性，选择与原始抗体的VH或VL中FR的氨基酸序列具有高度同源性(至少60％或以上)的氨基酸序列。然后，将原始抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列分别移植到人类抗体的VH或VL中FR的选定氨基酸序列中，以设计人源化抗体的每个VH或VL的氨基酸序列。通过考虑在抗体基因的核苷酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国健康与人类服务部，(1991)]中发现的密码子使用频率，将设计的氨基酸序列转化成DNA序列，设计了编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。根据设计的核苷酸序列，合成几个长度约为100个核苷酸的合成DNA，并使用它们进行PCR。在这种情况下，鉴于PCR反应的效率和可以合成的DNA的长度，优选在每个H链和L链中设计6个合成的DNA。

此外，通过在存在于两端上的合成的DNA的5’-末端引入适当的限制性酶的识别序列，可以将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA容易地克隆到在本部分2的(1)中构建的用于人源化抗体的表达载体中。在PCR后，将扩增产物克隆到质粒例如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)等中，按照在本部分2(2)中描述的方法测定核苷酸序列，从而获得了具有所需人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的编码DNA序列的质粒。

(5)人源化抗体V区的氨基酸序列的修饰

已经知道，当通过仅仅将非人类动物的抗体的VH和VL中的CDR简单地移植到人类抗体的VH和VL的FR中来生产人源化抗体时，它的抗原结合活性比来自非人类动物的原始抗体的抗原结合活性低[BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991)]。因此，据认为，不仅在CDR而且在FR中的几个氨基酸残基，与非人类动物来源的原始抗体的VH和VL中的抗原结合活性直接或间接相关，并且作为CDR移植的结果，这些氨基酸残基被改变成了人类抗体的VH和VL中FR的不同的氨基酸残基。为了在人-CDR移植的抗体中解决这个问题，在人类抗体的VH和VL中FR的氨基酸序列中，鉴定了直接与结合抗原相关的氨基酸残基、或通过与CDR中的氨基酸残基相互作用或通过维持抗体的三维结构间接地与结合抗原相关的氨基酸残基，并将其修饰成在非人类动物的原始抗体中发现的氨基酸残基，从而使已经降低的抗原结合活性增加[BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991)]。在人源化抗体的生产中，最重要的是如何有效地鉴定FR中与抗原结合活性有关的氨基酸残基，以便构建抗体的三维结构，并通过X-射线晶体学[J.Mol.Biol，112，535(1977)]、计算机模拟[Protein Engineering，7，1501(1994)]等进行分析。尽管抗体三维结构的信息在人源化抗体的生产中是有用的，但还没有建立起能够适用于任何抗体的生产人源化抗体的方法。因此，现在必须需要进行各种不同的尝试，例如，生产每个抗体的几种修饰抗体，并检验每种修饰抗体与其抗体结合活性之间的相关性。

人类抗体的VH和VL中FR的氨基酸序列的修饰可以使用各种不同的用于修饰的合成DNA，按照本部分2(4)中描述的PCR来进行。对于通过PCR获得的扩增产物来说，核苷酸序列按照本部分2(2)中描述的方法来测定，以便验证目的修饰是否已经发生。

(6)人源化抗体表达载体的构建

人源化抗体表达载体可以通过将构建的重组抗体的VH或VL的每个编码cDNA，克隆到在本部分2(1)中描述的用于表达人源化抗体的载体中人类抗体的CH或CL的每个编码基因的上游中来构建。

例如，当适合的限制性酶的识别序列被引入到在本部分2(4)和2(5)中构建人源化抗体的VH或VL中使用的合成DNA中位于两端的合成DNA的5’-末端中时，克隆能够进行，以便它们在本部分2(1)中描述的用于表达人源化抗体的载体中，在每个编码人类抗体的CH或CL的基因的上游中以适当的形式表达。

(7)重组抗体的瞬时表达

为了有效评估产生的各种不同的人源化抗体的抗原结合活性，可以使用在本部分2(3)和2(6)中描述的人源化抗体表达载体或其修改的表达载体来瞬时表达重组抗体。任何细胞都可以用作宿主细胞，只要宿主细胞能够表达重组抗体即可。一般来说使用COS-7细胞(ATCC CRL1651)，因为它的表达量高[Methods in Nucleic Acids Research，CRC Press，283(1991)]。将表达载体导入COS-7细胞的方法的实例，包括DEAE-葡聚糖方法[Methods in Nucleic Acids Research，CRC Press，283(1991)]、脂转染方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]，等等。

导入表达载体之后，在培养上清液中重组抗体的表达量和抗原结合活性，可以通过酶法免疫分析[在后文中称为“ELISA”；《单克隆抗体：原理和实践》(第三版)，Monoclonal Antibodies-Principles and practice，Third edition，Academic Press(1996)；《抗体实验指南》，Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；《单克隆抗体实验手册》，Monoclonal Antibody Experiment Manual，Kodansha Scientific(1987)]等来测定。

(8)重组抗体的稳定表达

稳定表达重组抗体的转化体，可以通过将本部分2(3)和(6)中描述的重组抗体表达载体导入到适合的宿主细胞中来获得。

将表达载体导入宿主细胞的方法的实例包括电穿孔[日本出版的未经审查的专利申请No.257891/90，Cytotechnology，3，133(1990)]等。

对于在其中导入重组表达载体的动物细胞来说，可以使用任何细胞，只要它是能够产生重组抗体的动物细胞即可。实例包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、两种中华仓鼠卵巢细胞CHO/dhFr-细胞(ATCC CRL9096)和CHO/DG44细胞[Somatic Cell and Molecular Genetics，12，555(1986)]、获得外源凝集素抗性的Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics，12，55(1986)]、其中1，6-岩藻糖基转移酶基因缺陷的CHO细胞(WO 05/35586)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662)等。除了上述宿主细胞之外，也可以使用其中导入的蛋白例如与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶、蛋白例如与其中岩藻糖的1-位通过α键连接到复合类型的N-糖苷连接的糖链中还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位上的糖链的修饰相关的酶、或与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的运输相关的蛋白的活性降低或缺失的宿主细胞，优选为WO 05/35586、WO 02/31140等中描述的其中缺陷了α1，6-岩藻糖基转移酶基因的CHO细胞。

在导入表达载体之后，按照在日本公开的未经审查的专利申请No.257891/90中公开的方法，通过在含有药剂例如硫酸G418(在后文中称为“G418”，由Sigma制造)等的用于动物细胞培养的培养基中进行培养，来筛选稳定地表达重组抗体的转化体。用于动物细胞培养的培养基的实例包括RPMI1640培养基(Invitrogen制造)、GIT培养基(Nissui Pharmaceutical制造)、EX-CELL301培养基(JRH制造)、IMDM培养基(Invitrogen)制造、杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen制造)、通过在这些培养基中加入各种不同的添加物例如胎牛血清(在后文中称为“FCS”)而获得的培养基，等等。通过将选出的转化体在培养基中进行培养，重组抗体可以生产并积累在培养上清液中。培养上清液中重组抗体的表达量和抗原结合活性可以通过ELISA等测定。此外，在转化体中，可以按照日本公开的未经审查的专利申请No.257891/90中公开的方法，通过使用dhfr扩增系统等来增加重组抗体的表达量。

可以通过使用蛋白A柱，从转化体的培养上清液中纯化重组抗体[《单克隆抗体：原理和实践》，Monoclonal Antibodies-Principles and Practice，Academic Press Limited(1996)；《抗体实验室指南》，Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)]。可以使用任何用于蛋白纯化的其他常规方法。例如，重组抗体可以通过凝胶过滤、离子交换层析、超滤等的组合来纯化。纯化的重组抗体的H链或L链或完整抗体分子的分子量可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(在后文中称为“SDS-PAGE”)[Nature，227，680(1970)]、Western印迹[《单克隆抗体：原理和实践》(第三版)，Monoclonal Antibodies-Principles and practice，Third edition，Academic Press(1996)；《抗体实验室指南》，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)]等来测定。

3.本发明的抗体或抗体片段的活性评估

本发明的纯化的抗体或抗体片段的反应特异性可以按照下列步骤进行评估。

使用表达正常糖链的细胞以及其中在O-连接糖链合成过程中，向结合到多肽的Ser/Thr上的GalNAc添加Gal的酶、参与酶活性的蛋白、或参与尿苷5′-二磷酸-半乳糖(UDP-半乳糖)运输的蛋白的活性降低或缺失的细胞系作为宿主，可以分别构建表达CD27编码核苷酸序列(SEQ ID NO：1)的CD27表达细胞。通过这种方式，可以构建表达具有正常的O-连接糖链的CD27的细胞以及表达糖链缺陷型CD27的细胞，并通过ELISA、荧光抗体技术[Cancer Immunol.Immunother.，36，373(1993)]等评估表达每种CD27的细胞系与纯化抗体的反应性。

或者，将CD27的细胞外区域以可溶形式例如融合蛋白表达在每种上面提到的宿主细胞中，并在适合条件下纯化，以制备保留了三维结构的相应CD27可溶性蛋白。融合蛋白的实例可以包括CD27蛋白与另一种多肽例如抗体恒定区(也称为Fc)、GST标签、组氨酸标签(也称为His标签)或Myc标签的融合物。融合蛋白可以使用亲和柱例如蛋白A、镍柱、特异性抗体柱等进行分离和纯化。纯化的CD27可溶性蛋白与纯化的抗体的反应性，可以通过表面等离子体共振(SPR)辅助的BIAcore^TM、ELISA、免疫沉淀等方法来测量[《单克隆抗体原理与应用》(第三版)，Monoclonal Antibodies-Principles and Practice，Third edition，Academic Press(1996)，《抗体实验室指南》，Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。

对表达糖链缺陷型CD27的培养的细胞系的细胞毒性活性，可以通过按照已知方法测量CDC活性、ADCC活性等，来进行评估[Cancer Immunol.Imrnunother.，36，373(1993)]。

4.使用本发明的特异性识别糖链缺陷型CD27并也与其细胞外区域结合的单克隆抗体或抗体片段诊断疾病的方法

可以通过使用本发明的抗体或抗体片段检测或定量糖链缺陷型CD27或表达多肽的细胞，来诊断与糖链缺陷型CD27相关的疾病。

与糖链缺陷型CD27相关的疾病可以是任何疾病，只要它是其中在体内发现了糖链缺陷型CD27多肽表达细胞的疾病即可。具体来说，它可以是IgA型肾病或癌症。癌症的实例可以包括源自B或T细胞分化过程的癌症，具体来说是各种非霍奇金氏淋巴瘤，其包括套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、浆细胞瘤等。

对于用于本发明的糖链缺陷型CD27多肽的检测或测量的活体样品没有具体限制，只要它可能含有多肽即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便物、组织液或培养基。

在与糖链缺陷型CD27相关的疾病中，例如IgA型肾病的诊断可以下述方式进行。

在从两个或多个健康人的活体收集活体样品后，通过采用免疫学手段使用本发明的抗体或抗体片段或其衍生物进行糖链缺陷型CD27多肽的检测或测量，来验证健康人活体样品中多肽的表达量。通过以同样方式也检测被测试人的活体样品中多肽的表达量，将表达量与健康人中的表达量进行比较。当被测试人中多肽的表达量与健康人相比增加时，可以诊断癌症阳性。

在与糖链缺陷型CD27相关的疾病中，例如癌症的诊断可以下述方式进行。

在从两个或多个健康人的活体收集活体样品后，通过采用免疫学手段使用本发明的抗体或抗体片段或其衍生物进行糖链缺陷型CD27多肽的检测或测量，来验证健康人活体样品中多肽的表达量。通过以同样方式也检测被测试人的活体样品中多肽的表达量，将表达量与健康人中的表达量进行比较。当被测试人中多肽的表达量与健康人相比增加时，可以诊断癌症阳性。

包含本发明的抗体或抗体片段或其衍生物的诊断试剂，还可以包含用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测依赖于所需诊断方法的反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲液、盐等。用于检测的试剂包括用于常规免疫检测或免疫测定法的试剂，例如抗体或其抗体片段、其衍生物、用于识别抗体、抗体片段或其衍生物的标记的第二抗体，以及对应标记的底物。

作为检测或测定本发明的糖链缺陷型CD27的量的方法，可以包括任何已知方法。例如，可以例举的是免疫检测方法或免疫测定法。

免疫检测或免疫测定法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体的量或抗原的量的方法。免疫检测或免疫测定法的实例是放射活性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、Western印迹法、物理化学手段(TIA、LAPIA和PCIA)等。

放射活性物质标记的免疫抗体方法(RIA)的实例包括这样的方法，其中使本发明的抗体或抗体片段与抗原或表达抗原的细胞进行反应，然后将进行了放射活性标记的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段与其进行反应，然后使用闪烁计数器等进行检测。

酶免疫测定法(EIA或ELISA)的实例包括这样的方法，其中使本发明的抗体或抗体片段与抗原或表达抗原的细胞进行反应，然后将进行了抗体标记的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段与其进行反应，然后通过分光光度计测量有色颜料，并且可以使用例如夹心ELISA。作为在酶免疫测定法中使用的标记物，可以使用已经描述的任何酶标记物(Eiji Ishikawa等主编的《酶免疫测定法》，Enzyme Immunoassay，由Igaku Shoin出版)。实例包括碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、萤光素酶标记、生物素标记等。

夹心ELISA是其中将抗体结合到固相上，捕获待检测或测量的抗原，并使另一种抗体与被捕获的抗原反应的方法。在ELISA中，制备了两种识别待检测或测量的抗原的抗体或其抗体片段，其中抗原识别位点是不同的，并将一种抗体或抗体片段预先吸附在板(例如96孔板)上，将另一种抗体或抗体片段用荧光物质例如FITC、酶例如过氧化物酶或生物素进行标记。使吸附有上述抗体的板与从活体分离的细胞或其破碎的细胞悬液、组织或其分解溶液、培养的细胞、血清、胸膜腔积液、腹水、眼溶液等进行反应，然后使其与标记的单克隆抗体或抗体片段反应，并进行与标记物质相对应的检测反应。当通过方法测量待测试样品中的抗原浓度时，可以从已知浓度的抗原的逐步稀释液制备的校正曲线计算出待测试样品中的抗原浓度。作为用于夹心ELISA的抗体来说，可以使用任何多克隆抗体和单克隆抗体，或者可以使用抗体片段例如Fab、Fab′和F(ab)₂。对于在夹心ELISA中使用的两种抗体的组合来说，可以使用识别不同表位的单克隆抗体或抗体片段的组合，或者可以使用多克隆抗体与单克隆抗体或抗体片段的组合。

荧光免疫测定法(FIA)包括文献中描述的方法[《单克隆抗体原理与应用》(第三版)，Monoclonal Antibodies-Principles and practice，Third Edition，Academic Press(1996)；《单克隆抗体实验手册》，Manual for Monoclonal Antibody Experiments，Kodansha Scientific(1987)]等。对于荧光免疫测定法的标记物来说，可以使用已经描述的任何已知荧光标记物(《荧光免疫测定法》，FluorescentImmunoassay，Akira Kawao，Soft Science)。实例包括FITC标记、RITC标记等。

发光免疫测定法可以使用《单克隆抗体原理与应用》(第三版)(Monoclonal Antibodies-Principles and practice，Third Edition，Academic Press(1996))、《单克隆抗体实验手册》(Manual for Monoclonal Antibody Experiments，Kodansha Scientific(1987))等中描述的方法来进行。对于用于发光免疫测定法的标记物来说，可以包含上面描述的任何已知发光标记物[《生物发光和化学发光》，Bioluminescence and Chemical Luminescence，Hirokawa Shoten；Rinsho Kensa，42(1998)]。实例包括吖啶酯标记，洛粉碱标记等也可以使用。

Western印迹是这样的方法，其中将抗原或表达抗原的细胞通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分级[《抗体实验指南》，Antibodies-A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，1988)]，将凝胶转印到PVDF膜或硝酸纤维素膜上，使膜与识别抗原的抗体或抗体片段进行反应，进一步使其与用荧光物质例如FITC、酶标记物例如过氧化物酶、生物素标记等标记的抗小鼠IgG抗体或抗体片段进行反应，并使标记物可视化以验证反应。Western印迹的实例如下所述。

在还原条件下，将其中表达具有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的多肽的细胞或组织溶解在溶液中，通过SDS-PAGE方法对每道0.1到30μg的蛋白量进行电泳。将电泳后的蛋白转移到PVDF膜上，并使其与含有1％BSA的PBS(在后文中称为“BSA-PBS”)在室温下反应30分钟进行阻断。此时，将本发明的单克隆抗体与其进行反应，用含有0.05％吐温20的PBS(在后文中称为“吐温-PBS”)清洗，并使其与过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体在室温下反应2小时。将其用吐温-PBS清洗，使用ECL^TM Western印迹检测试剂(由Amersham制造)等检测结合有单克隆抗体的条带，从而检测具有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的多肽。对于在Western印迹中用于检测的抗体来说，使用能够与不具有天然类型的三维结构的多肽结合的抗体。

具体来说，物理化学方法使用本发明的抗体或抗体片段来进行，通过将作为抗原的CD27与本发明的抗体或抗体片段进行反应以形成聚集体，并检测该聚集体。物理化学方法的其他实例包括毛细管方法、一维免疫扩散方法、免疫比浊法和乳胶免疫比浊法[《临床测试方法手册》，Handbook of Clinical Test Methods，Kanehara Shuppan，499(1988)]。

例如，在乳胶免疫扩散法中，可以使用载体、例如用抗体或抗原致敏的粒径约为0.1到1μm的聚苯乙烯乳胶，当使用相应的抗原或抗体进行抗原-抗体反应时，反应溶液中的散射光增加而透射光降低。当这样的变化作为吸光值或整体球体浊度被检测到时，就可以测量待测试样品中的抗原浓度等。

因为本发明的抗体或抗体片段能够结合糖链缺陷型CD27多肽的细胞外区域，因此它优选用于检测表达多肽的细胞。

为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，也可以使用利用FMAT 8100 HTS系统(Applied Biosystem)等的免疫荧光染色法。

免疫沉淀法是这样的方法，其中使表达多肽的细胞与本发明的单克隆抗体或抗体片段进行反应，然后加入对免疫球蛋白具有特异性结合能力的载体例如蛋白G-琼脂糖凝胶，使得抗原-抗体复合物沉淀。此外，可以执行下述方法。

将上述本发明的抗体或抗体片段固相化在用于ELISA的96孔板上，然后用BSA-PBS阻断。当抗体处于未纯化状态例如是杂交瘤细胞的培养上清液时，将抗小鼠免疫球蛋白或大鼠免疫球蛋白或蛋白A或G等的抗体预先吸附在用于ELISA的96孔板上，并用BSA-PBS阻断，然后向其分发杂交瘤细胞的培养上清液进行结合。在丢弃BSA-PBS并将残留物用PBS充分清洗后，与表达具有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的多肽的细胞或组织的溶解溶液进行反应。使用用于SDS-PAGE的样品缓冲液将免疫沉淀物从充分清洗的板中提取出来，并通过上述的Western印迹进行检测。

免疫细胞染色方法和免疫组织染色方法是免疫荧光染色方法(流式细胞术)，其中如果需要，将表达抗原的细胞或组织用表面活性剂或甲醇处理，以使抗体容易渗透到细胞或组织中，然后将本发明的抗体与其进行反应，然后将其进一步与进行过荧光标记例如FITC、酶标记物例如过氧化物酶或生物素标记的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段进行反应，并使标记物可视化并在显微镜下观察，或使细胞与荧光标记的抗体进行反应并通过流式细胞仪进行分析。这可以通过例如在文献中描述的方法来进行[《单克隆抗体原理与应用》(第三版)，Monoclonal Antibodies-Principles and practice，Third Edition，Academic Press(1996)，《单克隆抗体实验手册》(Manual for Experiments of Monoclonal Antibodies，Kodansha Scientific(1987)]。具体来说，因为本发明的抗体或抗体片段与糖链缺陷型CD27的细胞外区域的三维结构结合，因此它可以优选用于通过流式细胞术检测表达维持天然类型的三维结构的多肽的细胞。

此外，通过使用利用荧光抗体染色原理的FMAT8100HTS系统(由Applied Biosystems制造)，可以不用分离形成的抗体-抗原复合物与没有参与抗体-抗原复合物形成的游离抗体或抗原，来测量抗原的量或抗体的量。

5.使用本发明的与糖链缺陷型CD27多肽反应的单克隆抗体或抗体片段治疗疾病的方法

本发明的特异性识别糖链缺陷型CD27多肽并与其细胞外区域结合的单克隆抗体或抗体片段，可用于治疗与糖链缺陷型CD27多肽相关的疾病。

与糖链缺陷型CD27多肽相关的疾病可以是任何疾病，只要它是在体内检测到表达所述多肽的细胞的疾病即可。例如，它可以是IgA型肾病、癌症等。

此外，疾病也可以包含表现出由IgA型肾病的发展所引起的肾病综合征或肾衰的疾病。

癌症的实例可以包括源自造血器官的肿瘤(也称为血癌)或源自上皮细胞的实体癌症。

具体来说，血癌的实例包括白血病、淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤)、多发性骨髓瘤等。非霍奇金氏淋巴瘤的具体实例包括套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、浆细胞瘤等。

实体癌症的具体实例包括乳腺癌、子宫癌、结肠直肠癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、宫颈癌、小肠癌、前列腺癌、胰腺癌等。

本发明的治疗性药剂包括包含本发明的抗体或抗体片段作为活性成分的癌症治疗药剂。本发明的治疗药剂也包括具有效应子活性例如ADCC活性和CDC活性的癌症治疗药剂、通过凋亡诱导活性用于癌症的治疗药剂等。

因为本发明的抗体或抗体片段能够识别表达在细胞膜上的糖链缺陷型CD27多肽，因此它能够在体内识别表达糖链缺陷型CD27多肽的细胞。因此，在本发明的抗体或抗体片段中，其具有效应子活性的抗体或抗体片段能够在体内和体外损伤表达糖链缺陷型CD27多肽的细胞。此外，因为本发明的抗体或抗体片段能够在体内损伤并由此减少表达糖链缺陷型CD27多肽的细胞，因此它作为治疗性药剂特别有效。

包含本发明的抗体或抗体片段或其衍生物的治疗药剂可以仅仅是作为活性成分的抗体或抗体片段或其衍生物，并优选作为通过制药学技术领域众所周知的适合方法、通过将其与一种或多种可药用载体混合而生产的药物制剂提供。

优选情况下，选择在治疗中最有效的给药途径。实例包括口服给药和肠胃外给药，例如颊、气管、直肠、皮下、肌肉内或静脉内给药。在抗体或肽制剂的情况下，静脉内给药是优选的。剂型包括喷剂、胶囊、片剂、颗粒、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、软膏、胶带等。

适合于口服给药的药物制剂包括乳剂、糖浆、胶囊、片剂、粉末、颗粒等。液体制剂例如乳剂和糖浆可以使用水，糖类如蔗糖、山梨糖醇和果糖，二醇例如聚乙二醇和丙二醇，油例如芝麻油、橄榄油和大豆油，防腐剂例如对羟基苯甲酸酯，香料例如草莓香料和胡椒薄荷等作为添加剂来生产。胶囊、片剂、粉末、颗粒等可以使用赋形剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇，崩解剂例如淀粉和藻酸钠，润滑剂例如硬脂酸镁和滑石粉，粘合剂例如聚乙烯醇、羟丙基纤维素和明胶，表面活性剂例如脂肪酸酯，增塑剂例如甘油等作为添加剂来生产。

适合肠胃外给药的药物制剂包括注射剂、栓剂、喷剂等。注射剂可以使用载体例如盐溶液、葡萄糖溶液或其二者的混合物来制备。栓剂可以使用载体例如可可脂、氢化脂肪或羧酸来制备。喷剂可以使用抗体或抗体片段本身、或将其与不刺激患者的颊或气管粘膜并能通过将化合物分散成细小颗粒促进其吸收的载体一起使用来制备。载体包括乳糖、甘油等。根据抗体和载体的性质，生产药物制剂例如气溶胶和干粉是可能的。此外，成分例如用于口服制剂的添加剂也可以添加到肠胃外制剂中。

尽管给药的剂量或频率根据目标疗效、给药方法、治疗时间、年龄、体重等而变化，但它通常为每个成年人每天10μg/kg到8mg/kg。

下面将通过实施例对本发明进行描述；但是，本发明不限于下述实施例。

实施例1

含有未结合半乳糖的O-连接糖链的可溶性CD27细胞外结构域(在后文中称为“糖链缺陷型CD27”)的构建

(1)人类CD27基因的克隆

按照下列步骤，从购自Clontech的源自人类外周血的cDNA文库分离编码CD27的基因。通过制备50μL反应溶液进行PCR，所述反应溶液包含1倍浓度的BD Advantage PCR缓冲液(由Clontech制造)和1倍浓度的附带的dNTP、25ng源自人类外周血单核细胞的单链cDNA、0.2μmol/L CD27fw(SEQ ID NO：3)、0.2μmol/L CD27809B(SEQ ID NO：4)和1倍浓度的Advantage 2 PCR聚合酶混合物(由Clontech制造)。PCR在下列反应条件下进行：30个循环，每个循环由98℃下反应15秒和68℃下反应30秒构成。将反应溶液通过2％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用TOPO TA克隆试剂盒(由Invitrogen制造)按照随附的说明书将约1-kbp的PCR产物插入pCR-2.1载体中。用其中插入有PCR扩增片段的质粒转化大肠杆菌，并从相应的克隆制备质粒，然后进行DNA测序。获得了具有SEQ ID NO：1显示的DNA序列的pCR 2.1 CD27(图1)。

(2)其中克隆有具有人类CD27细胞外区域的基因的质粒的构建

按照下述PCR步骤分离了在C-端一侧移除了跨膜区的CD27的编码cDNA。向含有0.2mmol/L dNTP和1mmol/L氯化镁的反应溶液中加入1ng pCR 2.1 CD27、1μmol/L CD27-A(SEQ ID NO：5)、1μmol/L CD27-B(SEQ ID NO：6)和2.5单位KOD聚合酶(由Toyobo制造)，并将终体积调整到50μl，然后在下述反应条件下进行PCR：25个循环，每个循环由98℃下反应15秒和68℃下反应30秒构成。将反应溶液通过2％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)按照随附的说明书将约600-bp的PCR产物导入pCR-Blunt载体中。得到的其中克隆了具有人类CD27的细胞外区域的基因的质粒，被命名为pCRCD27axb(图2)。

(3)具有突变的人类IgG4Fc区的载体pBShCγ4SP的构建

使用如WO97/10354中所述的具有野生型IgG4亚类的C区编码cDNA的质粒pBShCγ4，构建了质粒pBShCγ4SP，其具有突变型人类IgG4亚类的C区，其在野生型人类IgG4亚类的C区(铰链区)中第108位Ser被Pro取代。已知该修饰导致通过IgG铰链区的二聚体化的稳定化(Molecular Immunology，30，105，1993)。制备了含有1ng质粒pBShCγ4作为模板的50μL反应溶液[10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁，0.001％明胶，200μM dNTP，0.5μM引物1(SEQ ID NO：7)，0.5μM引物2(SEQ ID NO：8)和2单位TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶]，然后使用GeneAmp PCR系统9700(由Perkin-Elmer制造)进行PCR：30个循环，每个循环由94℃下反应2分钟、55℃下反应2分钟和72℃下反应2分钟构成。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(由Qiagen制造)按照随附的说明书纯化反应溶液，用限制性酶EcoT14I(由Takara Bio制造)处理，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)按照随附的说明书回收扩增的片段。将质粒pBShCγ4用限制性酶EcoT14I切开，然后用碱性磷酸酶(由Takara Bio制造)进行处理以除去5′-端磷酸。类似，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒按照随附的说明书回收得到的质粒片段。将回收的扩增片段与源自质粒pBShCγ4的质粒连接，构建了包含所需cDNA的质粒pBShCγ4SP(图3)。

(4)包含人类IgG4Fc部分序列的cDNA的克隆

按照下面的PCR步骤扩增了在5′-端具有限制性酶BamHI位点并在3′-端具有限制性酶SalI位点的人类IgG4Fc的编码DNA片段。向含有0.2mmol/L dNTP和1mmol/L氯化镁的反应溶液中，加入25ng在部分(3)中构建的pBShCγ4SP、1μmol/L g4A(SEQ ID NO：9)、1μmol/L g4B(SEQ ID NO：10)和2.5单位KOD聚合酶(由Toyobo制造)，并将终体积调整到50μL，然后在下列反应条件下进行PCR：25个循环，每个循环由98℃下反应15秒和68℃下反应30秒构成。将反应溶液通过2％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)按照随附的说明书将约700-bp的PCR产物导入pCR-Blunt载体中。得到的质粒被命名为pCRIgG4FcBamHISalI(图4)。

(5)动物细胞表达载体pKANTEX XhoI/SalI的构建

将WO97/10354中描述的人源化抗体表达载体pKANTEX93用限制性酶XhoI(由Takara Bio制造)和SalI(由Takara Bio制造)消化，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)回收约9.8-kbp的质粒片段。使用DNA连接试剂盒(由Takara Bio制造)将回收到的DNA片段的5′和3′-端连接，然后使用得到的重组质粒DNA转化大肠杆菌DH5α(由Toyobo制造)。使用QIAprep Spin小量制备试剂盒(由Qiagen制造)从多个获得的氨苄青霉素抗性克隆分离重组质粒DNA，然后通过用限制性酶NotI(由Takara Bio制造)和KpnI(由Takara Bio制造)消化，验证抗体L链表达单元的排除。得到的质粒被命名为pKANTEX XhoI/SalI(图5)。

(6)表达可溶性CD27细胞外结构域的质粒pKANTEXCD27IgG4Fc的构建

将用NotI和BamHI消化部分(2)中构建的pCR2.1CD27axb所获得的约600-bp片段和用BamHI和SalI消化部分(5)中构建的pCRIgG4FcBamHISalI所获得的约700-bp的DNA片段，连接到用NotI和SalI消化部分(4)中构建的pKANTEX XhoI/SalI所获得的约8.8-kbp的DNA片段中，从而获得用于表达CD27-Fc的质粒pKANTEX CD27IgG4Fc(图6)。由上述质粒编码的可溶性CD27-Fc融合蛋白(在后文中通常称为“CD27-Fc”)的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO：12所述。将用该表达载体转化的大肠杆菌接种到100mL LB培养基中，培养过夜并收集，使用QIAfilter质粒中提试剂盒(由Qiagen制造)按照随附的方案纯化质粒。在纯化完成后，通过用限制性酶AatII消化将30μg质粒载体线性化。线性化后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，溶解在0.1倍浓度的TE缓冲液(1mM Tris HCl，0.1mM EDTA)中并测量DNA浓度。它被提供用于基因导入。

(7)CD27-Fc的表达

根据电穿孔方法[Cytotechnology，3，133(1990)]，按照下述方式将CD27-Fc表达质粒pKANTEX CD27IgG4Fc导入CHO/DG44细胞(Somatic Cell and Molecular Genetics，12，555(1986)，在后文中称为“DG44)或Lec8细胞。首先，将在基本培养基[Iscove修改的Dulbecco培养基(由Invitrogen制造)，其中添加有10％透析过的胎牛血清(由Invitrogen制造)、50μg/mL庆大霉素(由Nacalai Tesque制造)和1xHT增补剂(由Invitrogen制造)]中传代培养的DG44细胞，以8x10⁶个细胞/mL的密度悬浮在K-PBS缓冲液中[137mmol/L KCl、2.7mmol/LNaCl、8.1mmol/L Na2HPO4、1.5mmol/L KH2PO4、4.0mmol/L MgCl2的悬浮液]以制备细胞悬液。将10μg线性化的在部分(6)中构建的质粒pKANTEX CD27IgG4Fc与200μL(1.8x10⁶个细胞)细胞悬液混合。Lec8细胞的传代培养在不添加1xHT增补剂的基本培养基(在后文中称为“HT-培养基”)中进行。将细胞/DNA混合物转移到基因脉冲仪杯(Gene Pulser Cuvette)中(电极间距离：2mm，由Bio-Rad制造)，使用GenePulser(Bio-Rad)装置以0.35KV的脉冲电压和250μF的电容进行基因转移。将细胞悬液与HT-培养基[10mL Iscove修改的Dulbecco培养基(由Invitrogen制造)，其中添加有10％胎牛血清(由Invitrogen制造)和50μg/mL庆大霉素(由Nacalai Tesque制造)]混合，接种在75-cm²组织培养瓶(由Greiner制造)中，并在5％CO₂培养箱中在37℃下培养。培养三天后，向其添加G418(由Sigma制造)，使终浓度为0.5mg/mL，然后继续培养10天。10天后，将细胞在182-cm²组织培养瓶(由Greiner制造)中传代培养，然后继续培养至铺满。在铺满时用无血清的培养基EXCELL 301(由JRH Bioscience制造)更换培养基后，将细胞培养一周，收集培养上清液并按照下面的方法进行纯化。

(8)CD27-Fc的纯化

将从部分(7)获得的培养物的培养上清液以3000rpm在4℃下离心10分钟。回收得到的上清液并通过0.22-μm孔径的PES膜(由Asahi Techno Glass制造)过滤。在直径为0.8cm的柱中装入0.5mL Mab select(由Amersham Pharmacia Biotech制造)，然后将3.0mL纯水和3.0mL 0.2M硼酸-0.15M NaCl缓冲液(pH 7.5，在后文中称为“硼酸盐缓冲液”)顺序通过。此外，通过用2.0mL 0.1M柠檬盐酸缓冲液(pH 3.5)和1.5mL硼酸盐缓冲液相继清洗使介质平衡。接下来，将培养上清液通过柱子，然后用3.0mL硼酸盐缓冲液清洗。在清洗后，使用1.25mL 0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)将吸附到载体上的抗体洗脱。进行洗脱获得5个独立级份，各由250μL组成。接下来，将获得的纯化级份进行SDS-PAGE分析，并将所需蛋白的洗脱得到证实的级份合并，在4℃下对PBS透析过夜。在透析完成后，回收CD27-Fc溶液，并使用0.22-μm Millex GV(Millipore)进行除菌过滤。然后，使用Shimadzu UV-1700分光光度计测量吸光度(OD280nm)并计算CD27-Fc的浓度(取OD280nm＝1.0为0.68mg/mL；从εM＝134655和MW＝92840计算)。从源自相应宿主细胞的表达CD27-Fc的细胞的约300mL无血清培养上清液获得3.6mg源自Lec8的CD27-Fc和2.2mg源自CHO/DG44的CD27-Fc。对于相应的蛋白，洗脱级份的SDS-PAGE分析结果在图7中给出。

结果，在还原条件下，以DG44为宿主时观察到的CD27-Fc的分子量约为65kDa，以Lec8为宿主时分子量约为48kDa。另一方面，在非还原条件下，在分子量约为还原条件下获得的两倍高的位置处观察到各自的条带，从而证实CD27-Fc作为二聚体存在。

(9)糖链结构的验证

向16μL在PBS中稀释10倍的部分(8)的纯化CD27-Fc中，加入4μL 5倍浓度的SDS样品缓冲液，然后在90℃下处理5分钟，然后进行SDS-PAGE。使用5到20％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶e-PAGEL(由ATTO制造，目录号E-T520L)，在RAPID AS Mini-Slab电泳池(ATTO)中以20mA/凝胶的电流进行90分钟电泳。在PVDF膜(由Millipore Immobilon制造，目录号IPVH304F0)上的转移使用ATTO Holize转印仪以180mA进行90分钟。将转移后的膜浸泡在含有10％BSA的PBS中(在后文中称为“10％BSA-PBS”)，并使其在4℃保持静置以进行阻断。然后向其加入使用1％BSA-PBS制备的5μg/mL的抗RCAS1抗体克隆22-1-1(由MBL制造，目录号D060-3)，然后在室温下反应2小时。将膜用0.05％吐温-20-PBS(由Wako Pure Chemical制造，目录号167-11515)在室温下清洗30分钟，使其与在1％BSA-PBS中稀释2000倍的第二抗体过氧化物酶标记的兔抗小鼠免疫球蛋白抗体(由DAKO制造，目录号P0161)在室温下反应1小时。将膜用0.05％吐温-20-PBS在室温下清洗30分钟，然后使用ECL Western印迹检测试剂(由Amersham Pharmacia Biotech制造，目录号RPN2106)进行检测。结果在图8中给出。

从SDS-PAGE分析结果，显示出DG44来源的CD27-Fc的分子量大于Lec8来源的CD27-Fc的分子量，并且取决于宿主细胞DG44和Lec8，存在着与CD27-Fc结合的糖链结构的差异。

此外，抗RCAS1抗体22-1-1明显识别O-连接糖链的Tn抗原，并已知是抗Tn抗体[J.B.C.，278.22998-23007，(2003)]。作为抗Tn抗体的抗-RCAS-1抗体克隆22-1-1不与DG44来源的CD27-Fc结合，但是特异性结合Lec8来源的CD27-Fc。这证实了作为未结合半乳糖的O-连接糖链的Tn抗原，结合在由Lec8产生的CD27-Fc上。

实施例2

在细胞膜上表达CD27的CHO细胞的制备

(1)CD27表达质粒pKANTEX CD27的构建

从实施例1中构建的pCR2.1CD27，按照下面的PCR步骤构建了移除基因表达非必需的cDNA部分的cDNA片段。

通过制备50μL反应溶液进行PCR，所述反应溶液含有0.2mmol/LdNTP、1mmol/L氯化镁、1ng pCR2.1CD27、1μmol/L CD27-A(SEQ ID NO：5)、1μmol/L CD27-C(SEQ ID NO：13)和2.5单位KOD聚合酶(由Toyobo制造)。PCR在下列反应条件下进行：25个循环，每个循环由98℃反应15秒和68℃反应30秒构成。将反应溶液通过2％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)按照随附的说明书将约800-bp的PCR产物导入pCR-Blunt载体，从而获得具有SEQ ID NO：1中显示的DNA序列的pCR27axc(图9)。接下来，将用限制性酶NotI和SalI消化pCR27axc而获得的约780-bp的DNA片段连接到用限制性酶NotI和SalI消化实施例1中构建的pKANTEX XhoI/SalI而获得约8.9-kbp的DNA片段中，从而构建了用于表达CD27的质粒pKANTEX CD27(图10)。由该质粒编码的CD27核苷酸序列显示在SEQ ID NO：1中，从其翻译的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：2中。将用如此构建的表达载体转化的大肠杆菌接种到100mL LB培养基中，然后培养过夜。在培养完成后，回收细菌并使用QIAfilter质粒中提试剂盒(由Qiagen制造)按照随附的说明书纯化质粒。然后通过用限制性酶AatII消化将30μg质粒载体线性化。线性化后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，溶解在0.1倍浓度的TE缓冲液(1mM Tris HCl，0.1mM EDTA)中，测量DNA浓度并进行基因导入。

(2)CD27表达质粒pKANTEX CD27的导入

通过将在部分(1)中构建的CD27表达质粒pKANTEX CD27基因导入到Lec8细胞和CHO/DG44细胞中，建立了表达CD27的Lec8和DG44细胞。基因导入以与实施例1相同的方式进行，只是使用pKANTEXCD27作为被导入的质粒。将基因导入后的细胞悬浮在30mL HT培养基中，并将100μL/孔的细胞悬液接种到96孔板上，进行三份平行样。在接种后两天，将培养基用包含500μg/mL G418的传代培养基替换，然后培养10天。10天后，将培养基用含有50nM MTX(由Sigma Aldrich制造)的HT培养基代替，并获得MTX抗性细胞。源自Lec8的CD27表达细胞系被命名为CD27/Lec8-4，源自DG44的CD27表达细胞被命名为CD27/DG44-8。

(3)CD27表达细胞的验证

为了验证在部分(2)中构建的CD27表达细胞的CD27表达，使用流式细胞仪[FCM]进行了如下分析。

将1到5x10⁶个CD27表达细胞分配到15mL管(由Becton，Dickinson and Company制造)中，并以1500rpm离心5分钟。在丢弃上清液后，将残留物悬浮在含有50μL 1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液[在后文中称为“1％BSA-PBS”，由Kohjin Bio制造]中。向其加入作为第一抗体的10μL PC5标记的抗CD27小鼠单克隆抗体(由Beckman Coulter制造，目录号No.6607107)或10μL PC5标记的小鼠IgG1同种型对照(Beckman Coulter，目录号No.6607012)，然后在冰上的温度下反应60分钟。在反应完成后，将细胞用1mL 1％BSA-PBS清洗两次，悬浮在500μL 1％BSA-PBS中，并使用流式细胞仪(FCM，由Becton，Dickinson and Company制造)测量荧光强度。

结果显示在图11中。如图11中所示，证实了CD27/Lec8-4和CD27/DG44-8在细胞膜上表达基本上同样表达水平的CD27。

实施例3

用于含有未结合半乳糖的O-连接糖链的CD27的单克隆抗体(在后文中称为“抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体”)的构建

(1)免疫原制备

将50μg在实施例1中获得的Lec8产生的CD27-Fc与2mg氢氧化铝佐剂(《抗体实验指南》，Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，p99，1988)和1x10⁹个细胞的百日咳疫苗(由Chiba Serum Institute制造)一起，给药于4周龄雌性SD大鼠(n＝3)。在给药后两周，每周一次将50μg Lec8产生的CD27-Fc给药动物，一共三次。从动物的尾部静脉部分收集血液，并使用ABI8200细胞检测系统(由Applied Biosystems制造)或流式细胞仪(Cytomics FC500 MPL，由Beckman Coulter制造)通过荧光细胞染色测量获得的抗血清的结合活性。在最后一次免疫接种后三天，从显示出足够抗体滴度的小鼠取出脾脏。将脾脏在最低基本培养基(MEM，由Nissui Pharmaceutical制造)中切成小片，使用一副钳子将其打散并离心(1200rpm，5分钟)。加入Tris-氯化铵缓冲液(pH 7.6)对得到的沉淀级份处理1到2分钟，由此除去红细胞。将得到的沉淀级份(细胞级份)用MEM清洗三次，并用于随后的细胞融合。

(2)结合ELISA

将在实施例1中获得的Lec8产生的CD27-Fc和DG44产生的CD27-Fc在结合ELISA中分别用作抗原。然后，将5μg/mL每种CD27-Fc蛋白分配在96孔ELISA板(Greiner)中，以给出50μL/孔的浓度，并将其在4℃下放置过夜进行吸附。在将板清洗后，向板中加入100μL/孔的1％BSA-PBS，然后将其在室温下放置1小时，以便阻断剩余的活性基团。然后丢弃1％BSA-PBS，向板中分配50μL/孔的作为第一抗体的免疫动物抗血清或杂交瘤培养上清液，然后放置2小时。将板用0.05％聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯[相当于ICI的商品名吐温20，由Wako Pure Chemical制造]-PBS(在后文中称为“吐温-PBS”)清洗，并向板中加入50μL/孔的作为第二抗体的过氧化物酶标记的兔抗大鼠免疫球蛋白抗体(由Zymed制造)，然后将其在室温下放置1小时。将板用吐温-PBS清洗，并通过加入2，2-联氮双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵(ABTS)底物溶液[1mmol/L ABTS-0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH4.2)，0.1％H₂O₂]进行显色。使用读板器(Emax；Molecular Devices)测量吸光度(OD415nm)。

(3)荧光细胞染色(ABI8200细胞检测系统分析)

使用实施例2中构建的CD27/Lec8-4和CD27/DG44-8作为测定细胞。将在添加有50nM MTX和500ng/mL G418的传代培养基中传代培养的CD27/Lec8-4和CD27/DG44-8使用0.05％胰蛋白酶溶液(由Invitrogen制造)进行剥离，并以1x10⁴个细胞/100μL培养基/孔的密度接种在ABI8200黑色96孔板上，然后培养过夜。然后，将10μL/孔的作为第一抗体的免疫大鼠抗血清或杂交瘤培养上清液分配到板中，向其加入100μL/孔的作为第二抗体的ALEXA647标记的抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)抗体(由Invitrogen制造)，然后将其在暗处放置4小时。通过ABI8200细胞检测系统(由Applied Biosystems制造)测量由633He/Ne激光器激发的650到685nm的荧光。

(4)荧光细胞染色(流式细胞仪分析)

使用实施例2中构建的CD27/Lec8-4和CD27/DG44-8作为测定细胞。将在添加有50nM MTX和500μg/mL G418的HT-培养基中传代培养的CD27/Lec8-4和CD27/DG44-8使用0.02％EDTA溶液(由Nacalai Tesque制造)进行剥离，并用PBS清洗相应的细胞。在清洗后，将1到5x10⁵个细胞悬浮在50μL 1％BSA-PBS中，并向其分配50μL/孔的作为第一抗体的免疫大鼠抗血清或杂交瘤培养上清液，然后在冰上的温度下反应30分钟。此外，同时将细胞与作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)、小鼠IgG1同种型对照(由Cosmo Bio制造)和大鼠IgG2a同种型对照(由Cosmo Bio制造)，以及作为阳性对照的抗RCAS1抗体22-1-1(由MBL制造)和抗CD27小鼠单克隆抗体(由Beckman Coulter制造)进行反应。在反应完成后，将细胞通过离心用PBS清洗两次，并向其加入50μL/孔的作为第二抗体的ALEXA488标记的抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)抗体(Invitrogen)，然后在冰上的温度下在暗处反应30分钟。在再次通过离心用PBS清洗细胞两次后，将细胞悬浮在500μL 1％BSA-PBS中，并使用流式细胞仪(由Beckman Coulter，Cytomics FC500 MPL制造)测量由488nm氩激光器激发的510到530nm的荧光。

(5)小鼠骨髓瘤细胞的制备

使用正常培养基(10％FCS RPMI培养基)对8-氮杂鸟嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8U.1(P3-U1；从ATCC购买)进行培养，并将2x10⁷个或以上的细胞保存到细胞融合时，作为亲本细胞系进行细胞融合。

(6)杂交瘤的制备

将在实施例(1)中获得的小鼠脾细胞和在实施例(5)中获得的骨髓瘤细胞以10∶1的比例进行混合并离心(250xg，5分钟)。在充分打散由此获得的沉淀级份的细胞团后，在37℃和搅拌下以每10⁸个小鼠脾细胞0.5ml的量加入1g聚乙二醇-1000(PEG-1000)、1ml MEM培养基和0.35ml二甲基亚砜的混合溶液，以1到2分钟的时间间隔向悬液中数次加入1ml MEM培养基，然后通过加入MEM培养基将总体积调整到50ml。

将悬液离心(900rpm，5分钟)，将由此获得的沉淀级份的细胞轻柔打散，然后通过重复吸入和打出移液管，将细胞轻轻悬浮在100mlHAT培养基中[通过向补充有10％胎牛血清的RPMI培养基添加HAT培养基补充物(由Invitrogen制造)而制备的培养基]。将悬液以200μl/孔的量分配到96孔培养板中，并在5％CO₂培养箱中在37℃下培养8到10天。

在培养后，对培养上清液取样，使用在部分(3)和(4)中描述的荧光细胞染色选择与CD27/Lec8-4反应并且不与CD27/DG44-8和Lec8细胞反应的孔。然后，从如此筛选到的孔中含有的细胞，通过有限稀释法进行两次克隆，并获得单个细胞克隆。

结果，建立了分别生产与糖链缺陷型CD27特异性结合的单克隆抗体KM4030和KM4031的杂交瘤KM4030和KM4031(图12)。以同样方式建立了分别生产与糖链缺陷型CD27特异性反应的单克隆抗体KM4026、KM4027和KM4028的杂交瘤KM4026、KM4027和KM4028。

这些生产与糖链缺陷型CD27特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤，是通过下述过程获得的：使用在参与糖链合成过程的酶、转运蛋白的活性没有缺陷的DG44细胞以及其中UDP-半乳糖转运蛋白的活性降低或缺失的Lec8细胞系，构建表达每种含有正常糖链的CD27和糖链缺陷型CD27的重组细胞；设计允许筛选不与含有正常糖链的CD27表达细胞或Lec8细胞系结合、但是只特异性与糖链缺陷型CD27表达细胞结合的单克隆抗体的系统；以及然后执行约6000个孔规模的筛选分析。

(7)单克隆抗体的纯化

将在部分(6)中获得的杂交瘤细胞，以5到20x10⁶个细胞/动物的剂量通过腹膜内注射给药到用鲨肝油烷处理过的7周龄雌性裸鼠(ICR)中。当在10到21天内杂交瘤发展成腹水肿瘤时，从小鼠收集腹水液(1到8mL/动物)，然后通过注射过滤器(孔径：5μm)过滤以除去固形物。通过使用辛酸沉淀方法[《抗体实验室指南》，Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]进行纯化，获得了纯化的IgG单克隆抗体。通过结合ELISA，使用亚类分型试剂盒(大鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒，由DS Pharma Biomedical制造)进行了单克隆抗体亚类的确定。结果显示，每种抗体的亚类确定如下：抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4026为大鼠IgG2a类型，抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4027为大鼠IgG2b类型，抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4028为大鼠IgG1类型，抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4030为大鼠IgG2a类型，抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4031为大鼠IgG1类型。

实施例4

抗糖链缺陷型CD27特异性单克隆抗体的反应性的检测

使用下述竞争性ELISA系统，检测抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4030和KM4031的反应特异性。首先，将实施例1中获得的Lec8产生的CD27-Fc以5μg/ml/50μl/孔的量分配在96孔ELISA板中(Greiner制造)，然后在4℃放置过夜进行吸附。在洗板后，以200μl/孔的量向板中加入1％BSA-PBS，然后在室温放置1小时以阻断剩余的活性基团。然后弃去1％BSA-PBS，将作为第一抗体的稀释的抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4030纯化抗体或KM4031纯化抗体以50μl/孔分配到板中。同时，以20、2、0.2和0.02μg/mL的浓度加入作为结合竞争物质的Lec8产生的CD27-Fc蛋白、DG44产生的CD27-Fc蛋白或人类免疫球蛋白，以便抗体与结合竞争性物质共存。将板在室温放置2小时。将板用0.05％聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯[相当于ICI的商品名吐温20，由Wako Pure Chemical制造]-PBS(在后文中称为“吐温-PBS”)清洗，并向板中加入50μL/孔的作为第二抗体的过氧化物酶标记的兔抗大鼠免疫球蛋白(由Zymed制造)，然后将其在室温下放置1小时。将板用吐温-PBS清洗，并通过加入2，2-联氮双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵(ABTS)底物溶液[1mmol/L ABTS-0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 4.2)，0.1％H₂O₂]进行显色。使用读板器(Emax；Molecular Devices)测量吸光度(OD415nm)。

图13显示了抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4030和KM4031的竞争性ELISA的结果。结果证明，DG44产生的CD27-Fc和人类免疫球蛋白不抑制抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4030和KM4031与Tn抗原结合的CD27-Fc之间的结合，但是它们抑制Tn抗原结合的CD27-Fc。此外，对于抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4026、KM4027和KM4028来说，获得了同样的结果。从上述结果证明了本发明的抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031特异性识别糖链缺陷型CD27。

图28(A)和28(B)显示了抗糖链缺陷型CD27单克隆嵌合抗体KM4026、KM4027、KM4028、M4030和KM4031对糖链缺陷型CD27-Fc的结合活性的基于Biacore的评估结果。结合活性使用Biacore T100(由GE Healthcare Bio-Sciences制造)通过表面等离子体共振(SPR)测定。

使用胺偶联试剂盒(由Biacore制造)按照随附的说明书通过胺偶联将抗人类IgG4抗体(由Pharmingen制造)固定化在CM5传感器芯片(由GE Healthcare Bio-Sciences制造)上。对于在实施例1(7)中获得的DG44生产的CD27-Fc来说，加入使用Prozyme Glyco酶法脱糖基化试剂盒(由Prozyme制造)和ProO-Link Extender Deglycosylation Plus(由Prozyme制造)中的唾液酸酶A或β(1-4)半乳糖苷酶、按照随附的说明书进行糖链消化酶处理的Tn抗原类型的CD27-Fc或唾液酸化Tn抗原类型的CD27-Fc，使其捕获在固定化有抗人类IgG4抗体的芯片上以获得200到250RU(共振单位)。然后，将从20000ng/mL分五步稀释的测定样品(抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031)以30μL/min的流速在芯片上通过，获得每种浓度的传感器谱，并使用安装在装置上的分析软件Biacore T100评估软件(由Biacore制造)进行分析。

结果证明，抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体表现出对Tn抗原类型的CD27-Fc和唾液酸化Tn抗原类型的CD27-Fc的结合活性。从上述结果证明，所有本发明的抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体都结合Tn和唾液酸化Tn抗原。

实施例5

编码抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体的cDNA的分离和分析

(1)从产生抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体的杂交瘤细胞制备mRNA

从实施例3中获得的相应杂交瘤KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031的5x10⁷到1x10⁸个杂交瘤细胞中，使用RNAeasy Mini试剂盒(Qiagen制造)和Oligotex^TM-dt30<Super>mRNA纯化试剂盒(Takara制造)按照其随附的说明书制备了相应的抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体的mRNA。

(2)抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体的H链和L链可变区的基因克隆

使用BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences制造)，按照其随附的说明书，从实施例5(1)中获得的单克隆抗体的mRNA获得了cDNA。使用如此获得的cDNA作为模板，并使用大鼠IgG1特异性引物(SEQ ID NO：14)、大鼠IgG2a特异性引物(SEQ ID NO：15)大鼠IgG2b特异性引物(SEQ ID NO：16)或大鼠CH1特异性引物(SEQ ID NO：17)通过进行PCR，扩增了相应抗体的重链可变区(在后文中称为“VH”)的cDNA片段。此外，通过使用大鼠Ig(κ)特异性引物(SEQ ID NO：18)和(SEQ ID NO：19)代替抗体的相应亚类特异性引物，通过进行PCR扩增了相应抗体的轻链可变区(在后文中称为“VL”)的cDNA片段。用于扩增KM4026、KM4030和KM4031的VL和VH的PCR使用Advantage 2 PCR试剂盒(由Clontech制造)按照其随附的说明书进行，而用于扩增KM4027和KM4028的VL和VH的PCR使用KOD Plus聚合酶(由Toyobo制造)按照其随附的说明书进行。

接下来，为了确定克隆到的核苷酸序列，将获得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并将源自KM4026、KM4030和KM4031的每个PCR产物使用TOPO TA克隆试剂盒(由Invitrogen制造)按照其随附的说明书插入到pCR载体中，而源自KM4027和KM4028的每个PCR产物使用用于测序的Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)按照其随附的说明书插入到pCR载体中。使用其中插入有PCR扩增片段的质粒转化大肠杆菌，制备从相应克隆获得的质粒，然后进行DNA测序。结果，获得了包含全长VH cDNA的质粒和包含全长VL cDNA的质粒，其中被认为是起始密码子的ATG序列存在于cDNA的5′-末端中。克隆的流程图显示在图14中。

(3)抗CD27单克隆抗体可变区的基因序列的分析

在实施例5(2)中获得的质粒中包含的抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031的VH的完整核苷酸序列由SEQ ID NO：20到24显示，由这些核苷酸序列推导出的包含信号序列的VH的完整氨基酸序列由SEQ ID NO：25到29显示，质粒中包含的VL的完整核苷酸序列由SEQ ID NO：30到34显示，由这些核苷酸序列推导出的包含信号序列的VL的完整氨基酸序列分别由SEQ ID NO：35到39显示。

此外，基于与常规抗体的氨基酸序列的比较，鉴定了相应的单克隆抗体的VH和VL的CDR。抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4026的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42显示，而VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45显示。抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4027的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48显示，而VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51显示。抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4028的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54显示，而VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57显示。抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4030的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60显示，而VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63显示。抗糖链缺陷型CD27单克隆抗体KM4031的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66显示，而VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69显示。

实施例6

抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体的制备

(1)抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体表达载体的构建

在本发明中制备的嵌合抗体，是其中在US97/10354中公开的人类IgG1的H链恒定区和人类κ的L链恒定区分别连接到在实施例5(3)中获得的抗CD27大鼠单克隆抗体的H和L链的可变区中的嵌合抗体。为此，使用在实施例5(3)中获得的包含每个单克隆抗体的VL和VH的pCR载体以及在US97/10354中公开的包含人类IgG1的H链恒定区和人类κ的L链恒定区的抗体表达载体pKANTEX93，按照下列步骤构建了抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体表达载体(图15、16、17和18)。

使用10ng包含KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031的VL或VH的pCR载体作为模板，制备了总共20μL的溶液，其中含有2μL 10x KOD Plus缓冲液、2μL 2mmol/L dNTP、1μL 25mmol/L硫酸镁、1μL KOD Plus聚合酶(由Toyobo制造)、对每种抗CD27单克隆抗体的VL和VH特异的10μmol/L引物各1μL。使用如此制备的溶液进行如下的PCR：在94℃加热5分钟，然后进行30个循环，每个循环由94℃反应1分钟和68℃反应2分钟构成。KM4026的VL的引物由SEQ ID NO：70和71显示，KM4026的VH的引物由SEQ ID NO：72和73显示；KM4027的VL的引物由SEQ ID NO：74和75显示，KM4027的VH的引物由SEQ ID NO：76和77显示；KM4028的VL的引物由SEQ ID NO：78和79显示，KM4028的VH的引物由SEQ ID NO：80和81显示；KM4030的VL的引物由SEQ ID NO：82和83显示，KM4030的VH的引物由SEQ ID NO：84和85显示；KM4031的VL的引物由SEQ ID NO：86和87显示，KM4031的VH的引物分别由SEQ ID NO：88和89显示。

将每种PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离。收集特异的PCR扩增条带，并使用用于测序的Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)按照其随附的说明书插入到pCR Blunt-TOPO载体中。将获得的每个抗体的VL用限制性酶EcoRI(由New England Biolabs制造)和BsiWI(由New England Biolabs制造)消化，由此获得VL的EcoRI-BsiWI片段。此外，将每个抗体的VH用限制性酶NotI(由New England Biolabs制造)和ApaI(由New England Biolabs制造)消化，由此获得NotI-ApaI片段。

使用Ligation High(由Toyobo制造)按照其随附的说明书，将抗CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031的VL的每个EcoRI-BsiWI片段连接到用限制性酶EcoRI和BsiWI消化pKANTEX93所获得的DNA片段中。使用连接的DNA片段转化大肠杆菌DH5α(由Toyobo制造)，制备从相应克隆获得的质粒，使用BigDye终止物循环测序FS简便反应试剂盒(由PE Biosystems制造)按照其随附的说明书进行反应，然后使用同一公司的测序仪ABI PRISM 3700分析它们的核苷酸序列。结果，获得了其中插入有抗CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031的VL的编码cDNA的pKANTEX93。随后，使用Ligation High(由Toyobo制造)按照其随附的说明书，将抗CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031的VH的每个NotI-ApaI片段连接到用限制性酶NotI和ApaI消化具有抗CD27单克隆抗体的每个VL插入序列的pKANTEX93所获得的DNA片段中。使用连接的DNA片段转化大肠杆菌DH5α(由Toyobo制造)，制备从相应克隆获得的质粒，使用BigDye终止物循环测序FS简便反应试剂盒(由PE Biosystems制造)按照其随附的说明书进行反应，然后使用同一公司的测序仪ABI PRISM 3700分析它们的核苷酸序列。结果获得了具有抗CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031的VL和VH的每个编码cDNA的插入片段的抗CD27嵌合抗体表达载体。

(2)抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体在动物细胞中的表达

使用在部分(1)中获得的抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体表达载体，通过常用的方法[《抗体工程实用指南》，Antibody Engineering，A Practical Guide，W.H.Freeman and Company(1992)]进行抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体在动物细胞中的表达，获得产生抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体的转化体(嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031)。作为用于所需抗体表达的动物细胞，使用了其中α1，6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)被双敲除的CHO/DG44细胞系(在后文中称为“FUT8敲除的CHO细胞”)。已知岩藻糖不能添加到在该宿主细胞中表达的抗体的复杂的N-连接糖链的核心上[WO2002/31140]。

(3)纯化的嵌合抗体的制备

在通过普通的培养方法对部分(2)中获得的每种转化体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031进行培养后，回收细胞悬浮液并在3000rpm和4℃下离心20分钟以回收培养上清液，然后使用0.22μm孔径的Millex GV滤器对培养上清液进行过滤除菌。使用Mab Select，以与实施例1(7)中相同的方式，从如此获得的培养上清液中纯化抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031。

(4)抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体的岩藻糖含量的测定

按照WO2002/31140中描述的方法，测量了其中岩藻糖的1-位通过α-键连接到每个抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体的Fc区的复杂的N-连接糖链中的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位上的糖链的比例。结果在下面的表2中给出。

从这些结果证明了岩藻糖没有添加到实施例6(3)中构建的嵌合抗体上。

表2

实施例7

抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体活性的评估

在下面的部分(1)到(3)中，评估了实施例6中获得的抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031的活性。

(1)抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体对人类糖链缺陷型CD27-Fc的结合活性的基于Biacore的评估

为了对抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028和嵌合KM4030对人类糖链缺陷型CD27-Fc的结合活性进行动力学分析，通过表面等离子体共振方法(SPR方法)测量了结合活性。所有下面的操作都使用Biacore T100(由GE Healthcare Bio-Sciences制造)执行。通过胺偶联将实施例1(7)中或源自Lec8的CD27-Fc固定化在CM5传感器芯片上(由GE Healthcare Bio-Sciences制造)。将从9μg/mL起进行三倍连续稀释以给出5种不同浓度的测定样品(嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031)，根据自动化程序(Single Kinetix)，以浓度增加的次序相继并连续添加到固定化有CD27-Fc的芯片上，然后进行测量。使用安装在装置上的分析软件Biacore T100评估软件(由Biacore制造)，使用二价被分析物模型进行分析，由此计算每种抗体对人类糖链缺陷型CD27-Fc的结合速率常数ka和解离速率常数kd。

由此获得的每个抗体的结合速率常数ka1、解离速率常数kd1和解离常数KD(kd1/ka1)，在下面的表3中给出。

如表3中所示，所有嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031都对人类糖链缺陷型CD27-Fc表现出高亲和性，范围为1x10^-8到1x10^-9mol/L。

表3

(2)通过荧光细胞染色(流式细胞仪分析)评估抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体的反应特异性

使用以与实施例2中相同的方式构建的CD27/DG44-4、CD27/Lec8-4和Lec8细胞作为测定细胞。将在添加有500μg/mL G418的HT-培养基中传代培养的CD27/DG44-4和在添加有50nmol/L MTX和500μg/mL G418的HT-培养基中传代培养的CD27/Lec8-4，使用0.02％EDTA溶液进行剥离，然后用PBS洗涤。然后，将5x10⁵个细胞悬浮在50μL 1％BSA-PBS中，制备每种抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体(嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031)的抗体溶液，以给出0.02、0.2、2和10μg/mL的浓度，然后将每种抗体溶液以50μL/孔的量分配到板中作为第一抗体，然后在冰上的温度下反应1小时。作为阳性对照，使用了作为抗Tn抗体的抗RCAS1小鼠抗体22-1-1(由MBL制造)和抗CD27小鼠抗体O323(由Santa Cruz Biotechnology制造)。在反应完成后，使用PBS进行两次离心，并以50μL/孔的浓度加入ALEXA Fluoro 488标记的抗人类免疫球蛋白G(H+L)、ALEXA Fluoro 488标记的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)或ALEXA Fluoro 488标记的抗人类免疫球蛋白M(μ)作为第二抗体，然后在冰上的温度下在暗处反应30分钟。再一次使用PBS重复两次离心，并将细胞清洗和悬浮在500μL 1％BSA-PBS中。通过流式细胞仪(由Beckman Coulter制造，Cytomics FC500MPL)测量用488nm氩激光激发的510到530nm的荧光。结果显示在图19(A)到19(C)中。

结果，所有抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体不与Lec8细胞和CD27/DG44-4细胞结合，但是只表现出与表达糖链缺陷型CD27的CD27/Lec8-4细胞的结合。

从这些结果证明，本发明的抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031特异性识别在细胞表面上表达的糖链缺陷型CD27。

(3)抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC活性)的评估

以下述方式测量了抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031对实施例2中构建的CD27/Lec8-4细胞的ADCC活性。

(3)-1靶细胞悬液的制备

将在添加有50nmol/L MTX和500μg/mL G418的HT-培养基中传代培养的CD27/Lec8-4细胞，使用0.02％EDTA溶液进行剥离，用PBS洗涤，用含有5％透析过的胎牛血清(dFBS，由Invitrogen制造)且不含酚红的RPMI 1640培养基(Invitrogen制造)(在后文中称为“ADCC培养基”)清洗，然后悬浮在同样的培养基中以调整到最适浓度，并用作靶细胞悬液。

(3)-2效应细胞悬液的制备

通过下面的方式，从健康人的外周血分离外周血单核细胞(PBMC)。使用添加有0.5mL肝素钠(由Shimizu Pharmaceutical制造)的注射器，收集50ml健康人外周血。在Monopoly溶解培养基(由DS Pharma Biomedical制造)上将3.5mL收集到的外周血轻轻分层，取其3mL分配到每个15-mL管中。然后，通过以400xg离心、破裂并在室温放置20分钟，分离出单核细胞层。将如此获得的单核细胞级份用ADCC培养基清洗两次，然后悬浮在同样培养基中以给出最适细胞计数，并用作效应细胞悬液。

(3)-3ADCC活性的测量

以下述方式，使用LDH-细胞毒性测试Wako(由Wako制造)，按照其随附的说明书测量ADCC活性。

首先，将50μL/孔的抗体溶液分配到96孔U型底板(由Falcon制造)中，在所述抗体溶液中每种抗体从30μg/mL起进行10倍稀释，以给出0.003μg/mL的浓度。接下来，以1x10⁴个细胞/50μL/孔的量向其中分配在部分(3)-1中制备的靶细胞悬液。最后，以2.5x10⁵个细胞/50μL/孔的量向其中分配在部分(3)-2中制备的效应细胞悬液，以给出150μL的总体积，然后在37℃下反应4小时。因此，实验以25∶1的效应细胞(E)：靶细胞(T)比例进行。ADCC活性通过下列公式计算。结果显示在图20中。

(公式)

ADCC活性(％)＝([样品的吸光度]-[靶细胞自发释放的吸光度]-[效应细胞自发释放的吸光度])/([靶细胞总释放的吸光度]-[靶细胞自发释放的吸光度]x100

结果，所有其中没有核心岩藻糖与抗体Fc区的复杂N-连接糖链结合的抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031，都对CD27/Lec8-4细胞显示出高的ADCC活性。

从这些结果证明，所有本发明的抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031，都对表达糖链缺陷型CD27的细胞具有高的ADCC活性。

(4)抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC活性)的评估

以下述方式测量了抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031对实施例2中构建的CD27/Lec8-4细胞的CDC活性。

将CD27/Lec8-4细胞用PBS清洗，用添加有10％dFBS的RPMI1640培养基清洗，然后悬浮在同样的培养基中以给出最适浓度，并用作靶细胞悬液。将靶细胞悬液分配到96孔平底板(由Greiner制造)中，以给出5x10⁴个细胞/50μL/孔的密度。此外，向其中加入所制备的具有适合浓度的抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体溶液和人类补体(由Sigma制造)，以给出150μL/孔的总体积。此外，分别制备了作为阴性对照的无抗体反应孔(0％细胞毒性孔)和作为阳性对照的无细胞反应孔(100％细胞毒性孔)。将反应在5％CO₂培养箱中在37℃下进行2小时。在反应完成后，向相应的反应孔加入15μL WST-1试剂(由Roche制造)，然后在37℃下反应约4小时。使用读板器(Emax)测量每个孔的吸光度(OD450nm-OD690nm)。从每个孔的吸光度，通过下列公式计算CDC活性(细胞毒性[％])。结果在图21中给出。

(公式)

CDC活性(细胞毒性[％])＝{1-(反应孔的吸光度-100％裂解孔的吸光度)/(0％裂解孔的吸光度-100％裂解孔的吸光度)}x100

结果，所有本发明获得的抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031都表现出CDC活性。

实施例8

在细胞膜上表达食蟹猴CD27的CHO细胞的构建

(1)食蟹猴CD27基因的克隆

按照下列步骤，从源自食蟹猴外周血的RNA，分离了CD27编码基因。制备了总共5μL溶液，其含有3.3μg使用Trizol(由Invitrogen制造)从食蟹猴外周血分离到的RNA作为模板，以及随附于Superscript III第一链试剂盒(由Invitrogen制造)的1μL寡聚dT和1μL dNTP混合物。将如此制备的溶液在65℃下反应5分钟，并在冰上淬灭1分钟。然后向其中加入随附于Superscript III第一链试剂盒的2μL 10x RT缓冲液、2μL DTT、1μL RNase OUT和1μL RT，然后在50℃下进行反转录反应50分钟。在反应完成后，将反应溶液在85℃加热5分钟使反转录酶失活，并加入随附于Superscript III第一链试剂盒的1μL RNase H，然后在37℃反应20分钟以完全降解RNA。将该源自食蟹猴外周血的单链cDNA储存在-20℃直到使用。

制备总共25μL的溶液，其含有1.25μL上述制备的源自食蟹猴外周血的单链cDNA作为模板，2.5μL 10x KOD Plus缓冲液、2.5μL 2mmol/L dNTP、1μL 25mmol/L硫酸镁、0.5μL KOD Plus聚合酶(由Toyobo制造)、20pmol从恒河猴CD27的5’非翻译区序列设计的mfCD27_5UTR(SEQ ID NO：90)和20pmol从恒河猴CD27的3’非翻译区序列设计的mfCD27_3UTR(SEQ ID NO：91)。将如此制备的溶液在94℃加热5分钟，并在下列反应条件下进行PCR：30个循环，每个循环由94℃反应30秒和68℃反应2分钟构成。将反应溶液通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用用于测序的Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)，按照其随附的说明书将约800-bp的PCR产物插入到pCR Blunt-TOPO载体中。使用其中插入有PCR扩增片段的载体转化大肠杆菌DH5α(由Toyobo制造)，并制备从相应克隆获得的质粒，然后使用BigDye终止物循环测序FS简便反应试剂盒(由PE Biosystems制造)按照其随附的说明书进行反应，然后使用同一公司的测序仪ABI PRISM 3700分析它们的核苷酸序列。结果，获得了其中克隆有食蟹猴CD27编码cDNA(SEQ ID NO：92)的质粒pCR mfCD27(图22)。

(2)猴CD27表达质粒pKANTEX mfCD27His的构建

按照下列步骤构建了在C-末端附有His标签的食蟹猴CD27表达载体pKANTEX mfCD27His。

制备总共50μL的溶液，其含有10ng pCR mfCD27作为模板，以及5μL 10x KOD Plus缓冲液、5μL 2mmol/L dNTP、2μL 25mmol/L硫酸镁、1μL KOD Plus聚合酶(由Toyobo制造)、0.2μL 100μmol/L的mfCD27toKAN_5(SEQ ID NO：93)和0.2μL 100μmol/L的mfCD27HisKAN_3(SEQ ID NO：94)。将如此制备的溶液在94℃加热5分钟，并在下列反应条件下进行PCR：94℃加热5分钟，然后进行30个循环，每个循环由94℃反应30秒和68℃反应2分钟构成。将反应溶液通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并使用用于测序的Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(由Invitrogen制造)，按照其随附的说明书将约800-bp的PCR产物插入到pCR Blunt-TOPO载体中。使用其中插入有PCR扩增片段的载体转化大肠杆菌DH5α(由Toyobo制造)，并制备从相应克隆获得的质粒，使用BigDye终止物循环测序FS简便反应试剂盒(由PE Biosystems制造)按照其随附的说明书进行反应，然后使用同一公司的测序仪ABI PRISM 3700分析它们的核苷酸序列。结果，获得了其中克隆有在C-末端附有His标签的编码食蟹猴CD27的cDNA(SEQ ID NO：95)的质粒pCR mfCD27His(图23)。

使用Ligation High(由Toyobo制造)，按照其随附的说明书，将用限制性酶NotI和SalI(由Takara Bio制造)消化pCR mfCD27His而获得的约800-bp的DNA片段，连接到用限制性酶NotI和SalI(由Takara Bio制造)消化实施例2中构建的pKANTEX CD27而获得的约10-kbp的DNA片段中。使用连接的DNA片段转化大肠杆菌DH5α(由Toyobo制造)，并制备从相应克隆获得的质粒，使用BigDye终止物循环测序FS简便反应试剂盒(由PE Biosystems制造)按照其随附的说明书进行反应，然后使用同一公司的测序仪ABI PRISM 3700分析它们的核苷酸序列。结果，获得了用于表达在C-末端附有His标签的食蟹猴CD27的质粒pKANTEX mfCD27His(图24)。

将用pKANTEX mfCD27His转化的大肠杆菌DH5α接种到200mLLB培养基中，然后培养过夜。在培养完成后，回收细菌并使用QIAfilter质粒中提试剂盒(由Qiagen制造)，按照其随附的说明书纯化质粒。然后，将50μg纯化的质粒用限制性酶AatII(由New England Biolabs制造)消化进行线性化。

(3)猴CD27表达质粒pKANTEX mfCD27His的导入

通过将部分(2)中构建的食蟹猴CD27表达质粒pKANTEXmfCD27His基因导入到Lec8细胞和CHO/DG44细胞中，建立了表达食蟹猴CD27的Lec8和DG44细胞。基因导入以与实施例1(6)中相同的方式进行，差别在于使用pKANTEX mfCD27His作为待导入的质粒。在基因导入后，将细胞悬浮在30mL HT-培养基中，以100μL/孔的量将细胞悬液接种在96孔板上，进行三份平行样。接种后1天，将培养基更换为含有500μg/mL G418的传代培养基，然后培养10天。然后获得了G418抗性克隆。将源自于Lec8的食蟹猴CD27表达细胞系命名为食蟹猴CD27/Lec8细胞，而源自于DG44的食蟹猴CD27表达细胞系命名为食蟹猴CD27/DG44细胞。

实施例9

评估抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体与猴CD27蛋白的交叉反应性

使用实施例8中构建的食蟹猴CD27/DG44和食蟹猴CD27/Lec8细胞作为测定细胞。

(1)使用荧光细胞染色(流式细胞仪分析)评估抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体与猴CD27表达细胞的反应性

按照下列步骤测量了每种抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031与食蟹猴CD27表达细胞的结合活性。

将在添加有500μg/mL G418的HT-培养基中传代培养的食蟹猴CD27/DG44和食蟹猴CD27/Lec8细胞，使用0.02％EDTA溶液进行剥离，并将相应的细胞用PBS洗涤。然后，将5x10⁵个细胞悬浮在50μL1％BSA-PBS中，并以50μL/孔的量向其中分配每种制备的含有10μg/mL抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体(嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031)的抗体溶液作为第一抗体，然后在冰上的温度下反应1小时。作为阳性对照，使用了抗CD27小鼠抗体O323。在反应完成后，使用PBS通过离心将细胞清洗两次，并以50μL/孔的量向其加入ALEXA Fluoro 488标记的抗人类免疫球蛋白G(H+L)或ALEXA Fluoro 488标记的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)(都由BioLegend制造)作为第二抗体，然后在冰上的温度下在暗处反应30分钟。再一次使用PBS通过离心将细胞清洗两次后，将细胞悬浮在500μL 1％BSA-PBS中，并通过流式细胞仪(由Beckman Coulter制造，Cytomics FC500MPL)测量用488nm氩激光激发的510到530nm的荧光。结果显示在图25中。

结果证明，抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4030和嵌合KM4031与表达糖链缺陷型CD27的食蟹猴CD27/Lec8细胞反应。另一方面，抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026和嵌合KM4028与食蟹猴CD27/Lec8细胞的反应性不显著。此外，证实了所有抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体都不与食蟹猴CD27/DG44细胞结合。

(2)评估抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体对猴CD27表达细胞的ADCC活性

将在添加有500μg/mL G418的HT-培养基中传代培养的食蟹猴CD27/Lec8细胞，使用0.02％EDTA溶液进行剥离，用PBS清洗，用ADCC培养基清洗，然后悬浮在相同培养基中以给出最适浓度，并用作靶细胞悬液。此外，以与实施例7中相同的方式进行效应细胞悬液的制备和ADCC活性的测量。结果显示在图26中。

结果，所有的抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031，都对含有未结合半乳糖的O-连接糖链的食蟹猴CD27/Lec8细胞(糖链缺陷型食蟹猴CD27细胞)表现出ADCC活性。

从上述结果证明，所有本发明的抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4026、嵌合KM4028、嵌合KM4030和嵌合KM4031都表现出对糖链缺陷型食蟹猴CD27细胞的交叉反应性。这表明，每种抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体在它们与糖链缺陷型食蟹猴CD27的反应性方面显示出强和弱，并表现出将被识别的表位类型的差异。

此外，使用通过流式细胞仪分析证实了其中细胞表面上CD27的表达量几乎相等的细胞，在实施例2中构建的人类CD27/Lec8细胞和实施例8中构建的食蟹猴CD27/Lec8细胞中测量了抗糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4030的ADCC活性。效应细胞悬液从同样的健康人外周血制备。结果显示在图27中。

结果表明，糖链缺陷型CD27嵌合抗体嵌合KM4030对食蟹猴CD27/Lec8细胞和人类CD27/Lec8细胞表现出相等的ADCC活性。

实施例10

人源化抗体的制备

(1)抗糖链缺陷型CD27人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列的设计

以下列方式设计抗糖链缺陷型CD27人源化抗体的VH的氨基酸序列。

首先，选择分别用于移植SEQ ID NO：58、59和60所显示的抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030VH的CDR1到CDR3的氨基酸序列的人类抗体的VH的FR的氨基酸序列。使用GCG软件包(由Genetics Computer Group制造)作为序列分析系统，根据常规蛋白的氨基酸序列数据库，通过BLASTP方法[Nucleic Acids Res.，25，3389(1997)]，搜索与抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030具有高度同源性的人类抗体。当将同源性分值与实际氨基酸序列的同源性相比时，SWISSPROT数据库登记号BAH04525，人类中抗H3N2流感病毒的中和单克隆抗体的全部组成成分(在后文中称为“BAH04525”)表现出83.9％的同源性，并且它是具有最高同源性的人类抗体，因此选择该抗体的FR的氨基酸序列。

将由SEQ ID NO：58到60所显示的抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030的VH的CDR的氨基酸序列移植到如此确定的人类抗体的FR的氨基酸序列的适合位置中。通过这种方式，设计了由SEQ ID NO：96显示的抗糖链缺陷型CD27人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0。

接下来，以下列方式设计抗糖链缺陷型CD27人源化抗体的VL的氨基酸序列。

选择分别用于移植SEQ ID NO：61到63所显示的抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030VL的CDR1到CDR3的氨基酸序列的人类抗体的VL的FR的氨基酸序列。Kabat等已经将通常所知的各种不同人类抗体的VL，根据其氨基酸序列的同源性分类成四个亚组(HSGI到IV)，并报道了每个亚组的共有序列[《免疫学重要的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美国健康与人类服务部(US Dept.Health and Human Services)(1991)]]。因此，在人类抗体VL的亚组I到IV的共有序列的FR的氨基酸序列与抗糖链缺陷型CD27大鼠抗体KM4030VL的FR的氨基酸序列之间进行了同源性检查。

作为同源性分析的结果，HSGI、HSGII、HSGIII和HSGIV的同源性分别为86.3％、60.0％、73.8％和73.8％。因此，KM4030VL的FR的氨基酸序列与亚类I具有最高的同源性。

根据这些结果，将抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030的VL的CDR的氨基酸序列移植到人类抗体的VL的亚类I的共有序列的FR的氨基酸序列的适合位置中。但是，因为SEQ ID NO：38所显示的抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030的VL的氨基酸序列中第124位的Leu，在对应于Kabat所引用的人类抗体FR的氨基酸序列的区域中不是使用频率最高的氨基酸残基，而是以相对高频率使用的氨基酸残基，因此使用了上面提到的在抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030的氨基酸序列中识别的氨基酸残基。通过这种方式，设计了由SEQ ID NO：97显示的抗糖链缺陷型CD27人源化抗体的VL的氨基酸序列LV0。

在上面设计的抗糖链缺陷型CD27人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0和VL的氨基酸序列LV0，是其中仅仅将抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030的CDR氨基酸序列移植到所选的人类抗体的FR氨基酸序列中的序列，但是，一般来说，当制备人源化抗体时，在仅仅简单地将大鼠抗体的CDR氨基酸序列移植到人类抗体FR中的情况下，其结合活性常常降低。因此，为了避免结合活性的降低，在移植CDR氨基酸序列的同时，在人类抗体与大鼠抗体之间不同的FR氨基酸残基中，进行了被认为对结合活性有影响的氨基酸残基的修饰。因此，在本实施例中，以下述方式鉴定了被认为对结合活性有影响的FR的氨基酸残基。

首先，使用计算机模拟技术构建了包含上面设计的抗糖链缺陷型CD27人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0和VL的氨基酸序列LV0的抗体V区(HV0LV0)的三维结构。三维结构坐标的制备和三维结构的显示使用软件Discovery Studio(由Accelrys制造)，按照其随附的说明书进行。此外，也以同样方式构建了抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030的V区的三维结构的计算机模型。此外，通过同样地构建包含氨基酸序列的三维结构模型，在所述氨基酸中选出HV0LV0与抗糖链缺陷型CD27大鼠抗体KM4030的VH和VL的FR氨基酸序列不同的氨基酸残基，并将其修饰成抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030的氨基酸残基，对抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030、HV0LV0和修饰产物的V区的三维结构进行比较，由此鉴定到预测对抗体的结合活性具有影响的氨基酸残基。

结果，在据认为改变了抗原结合区的三维结构、因此对抗体的结合活性具有影响的HV0LV0的FR的氨基酸残基中，分别选择了HV0序列中的第30位Ser、第48位Val、第49位Ser、第77位Asn、第93位Val、第97位Ala和第117位Thr，以及LV0序列中的第21位Ile、第40位Pro、第58位Val、第85位Thr和第87位Tyr作为氨基酸残基。通过将这些选择的氨基酸残基的至少一个或多个氨基酸序列修饰成在抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030的氨基酸序列的相同位置上存在的氨基酸残基，设计了具有各种不同修饰的人源化抗体的VH和VL。

具体来说，对于抗体VH来说，在SEQ ID NO：96所显示的氨基酸序列中导入至少一个修饰，所述修饰选自用Asn取代第30位Ser、Ile取代第48位Val、Ala取代第49位Ser、Gly取代第77位Asn、Thr取代第93位Val、Thr取代第97位Ala和Val取代第117位Thr。此外，对于抗体VL来说，在SEQ ID NO：97所显示的氨基酸序列中导入至少一个修饰，所述修饰选自用Leu取代第21位Ile、Leu取代第40位Pro、Ile取代第58位、Ala取代第85位Thr和Phe取代第87位Tyr。

通过对HV0LV0的FR中存在的至少一个氨基酸残基进行修饰，设计了HV2LV0、HV3LV0、HV5LV0和HV7LV0的可变区氨基酸序列，H链可变区HV2、HV3、HV5和HV7的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：101、103、105和107显示。

(2)抗糖链缺陷型CD27人源化抗体的制备和评估

使用以高频率使用的密码子，将编码抗糖链缺陷型CD27人源化抗体可变区的氨基酸序列的DNA构建在哺乳动物细胞中，当进行氨基酸序列修饰时，使用用于抗糖链缺陷型CD27大鼠单克隆抗体KM4030的VH或VL的氨基酸序列的编码DNA的密码子。抗糖链缺陷型CD27人源化抗体的HV0和LV0的氨基酸序列的编码DNA序列分别由SEQID NO：98和99显示，而其上进行了氨基酸修饰的可变区HV2、HV3、HV5和HV7的氨基酸序列的编码DNA序列分别由SEQ ID NO：100、102、104和106显示。