全植入式人工角膜基质及其制备方法.pdf

本发明属生物医学工程学领域，涉及一种新型的全植入式人工角膜基质及其制备方法。本发明的人工角膜基质由自体离体脂肪干细胞为种子细胞，接种于聚乳酸聚羟基乙酸共聚物支架材料。所述的种子细胞能在生物支架所形成的三维空间中能够摄取营养，排泄废物，合适的支架材料既能维持种子细胞的位置、形态，也能参与细胞分化状态的调控。经动物实验证明，本角膜基质具有良好生物相容性，避免了传统人工角膜基质对机体的毒性反应及诱发排斥反应，植入后随着时间推移完全降解后，角膜可恢复透明，能满足机体对视力的要求。

1、  全植入式人工角膜基质，其特征是由种子细胞和支架材料组成，所述的种子细胞接种于所述的支架材料，所述的种子细胞选自自体离体脂肪干细胞，细胞接种密度为3～5×10⁶/cm³；所述的支架材料采用聚乳酸聚羟基乙酸共聚物，其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比为65～75∶35～25。

2、  按权利要求1所述的全植入式人工角膜基质，其特征是所述的种子细胞接种密度为4×10⁶/cm³；所述的支架材料，其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比为70比30。

3、  按权利要求1所述的全植入式人工角膜基质的制备方法，其特征是包括下述步骤：
(1)制备支架材料
将聚乳酸与聚羟基乙酸按质量比溶于1，4二氧六环配成的10％溶液；在溶液中加NaCl颗粒搅拌制得均匀悬液，将悬液滴入表面皿，并流延成PLGA膜；干燥后蒸馏水浸泡，再干燥后，分别用PBS及培养基浸泡、备用；
(2)选择接种细胞浓度
将不同浓度的离体脂肪干细胞分别接种于支架材料上，培养箱中放置、消化收集细胞，得流失细胞量；培养24小时后，将细胞材料复合物于培养液中晃动并换培养皿培养，收集培养液并消化收集贴壁的细胞，将原培养液中细胞一并计数，得未粘附的细胞数和细胞粘附率；
(3)制备全植入式人工角膜基质
用无血清的DMEM调整细胞浓度至1×10⁶/ml，细胞悬液加DiO试剂混合，放入培养箱孵育，去上清，重复洗涤后，将标记的细胞按3～5×10⁶/cm³接种在支架材料上，培养1周后备用。

4、  按权利要求3的方法，其特征是所述的步骤1的聚乳酸与聚羟基乙酸质量比为65～75比35～25。

5、  按权利要求3的方法，其特征是所述的步骤2的细胞粘附率＝(接种的细胞数-流失的细胞数-未粘附的细胞数)/(接种的细胞数-流失的细胞数)。

6、  按权利要求3的方法，其特征是所述的步骤2的细胞接种密度为3～5×10⁶/cm³。

全植入式人工角膜基质及其制备方法
技术领域
本发明属生物医学工程学领域，涉及一种新型的全植入式人工角膜基质(totally implantable artificial corneal stroma)及其制备方法。
背景技术
因角膜烧伤、角膜溃疡、角膜白斑等角膜疾病而致盲的患者临床上较多见。同种异体角膜移植手术是治疗这些角膜盲患者主要而有效的方式。目前，我国角膜盲患者达到400万之多，并且随着激光手术的逐步开展和人口老龄化的不断加剧，异体角膜来源日益匮乏，临床上眼科医生对供体角膜的需求越发迫切。实践表明，以异体角膜为供体的高危角膜移植手术远期预后不佳。眼表局部免疫微环境的破坏造成术后移植物排斥反应的高发是其主要原因。目前，组织工程技术已成功地应用于多种组织构建并修复缺损。因此，构建具有良好生物学活性且能满足一定生理功能要求的的组织工程角膜具有重大的探索价值与临床实际应用意义。近年来，技术日趋成熟的组织工程化人工角膜为本领域提供了一个新的思路。它是以可降解材料为支架，在体外进行细胞培养，让细胞在材料表面及内部进行三维生长、分化成多层细胞，最后得到类似于供体角膜的“人工供体角膜”。
角膜基质层是角膜构成的主要部分，占角膜厚度的90％。它主要由角膜基质细胞、胶原纤维和其他细胞外基质组成。正常情况下，角膜基质细胞处于静止状态，此外，角膜基质细胞间的胶原纤维成层平行排列，直径一致，间距相等。角膜基质特征性的组织学结构是维持角膜透明的重要条件，是其他组织所不能替代的。应用组织工程技术构建角膜基质一方面可为角膜上皮、内皮细胞生长和组织形成过程中提供含有必要生长因子、信号的生理环境。另一方面，它还可作为组织工程角膜上皮、内皮的载体，克服体外培养的上皮组织、内皮组织质地松软无法直接缝合固定、难以转移的缺陷。因此，角膜基质组织的构建是组织工程技术构建角膜的主要任务、难点和关键所在。
由于使用自体角膜基质细胞对个体健侧角膜损伤较大，使用异体角膜基质细胞又存在排异反应发生的可能性。开辟新的种子细胞来源并将其用于构建角膜基质组织便成为急需解决的难题。近期国内外陆续报道了多种角膜组织外的细胞特别是某些成体干细胞可能参与了角膜基质的构成。2006年Yamagami等研究显示，正常人角膜基质中存在骨髓来源细胞，尽管该研究并未明确骨髓来源细胞存在的意义，但至少说明了骨髓来源细胞参与了角膜基质的构成。随着干细胞研究的发展，以自体成体干细胞为种子细胞构建组织工程角膜基质越来越凸现其优越性。
成体干细胞(Adult Stem Cells，ASCs)是存在于成人机体骨髓、脂肪、皮肤等组织基质中的未分化细胞，来源可靠且具有向多种组织定向分化潜能，是目前种子细胞研究的热点之一。骨髓基质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是存在于骨髓组织中的ASCs，具有多向分化潜能，体外扩增能力强。但BMSCs在骨髓组织中含量极少，成人骨髓平均10万个有核细胞中含有1个BMSCs，而且随着传代次数增加或捐献者年龄增加，BMSCs逐渐变大，自我更新的细胞减少，克隆形成率降低，细胞失去多向分化潜能，因此，也限制了BMSCs的应用。
ADSCs(Adipose-Derived Stem Cells)是存在于脂肪组织中的ASCs。因脂肪组织在人体分布广泛，来源充足，且获取自体脂肪组织对机体创伤较小，病人易于接受，是理想的种子细胞来源。自2001年以来，Zuk等报道经脂肪抽吸术获得的抽吸物含有大量的ADSCs，并且能够在特定的条件下向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化。而且随年龄增长，细胞数目不减少，仍然保持多向分化的潜能。ADSC不但具有与骨髓基质干细胞相似的向成骨、软骨、脂肪、肌肉和神经等细胞多分化的能力，而且表达与MSC相同的表面标志如CD29、CD105、CD106、及CD166等。目前国内外尚未见以脂肪干细胞为种子细胞用于构建人工角膜的报道。
组织工程的核心是模拟机体正常组织，在体外建立细胞与生物支架复合体，并将其用于替代机体病变的组织或器官。由此可见，良好的细胞外基质替代物即支架材料也是构建组织工程化角膜基质的重要组成部分。合适的支架材料既能维持种子细胞的位置、形态，也能参与细胞分化状态的调控。与此同时，种子细胞能够在生物支架所形成的三维空间中能够摄取营养，排泄废物。总的来说，理想的组织工程角膜的支架材料应具备以下特点：良好的生物相容性，避免对机体的毒性反应及诱发排斥反应；具有一定的坚韧性，既能满足三维立体成形的需要，又能耐受体内回植时的机械力作用；支架材料的降解速率与机体正常细胞或者种子细胞合成细胞外基质的速率相匹配，尽量依靠新生组织修复病变组织或器官；有一定的透光性，特别是材料吸收后应尽量满足机体对视力的要求。
聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)共聚物PLGA属于人工合成可降解高分子材料，具有良好的生物相容性，在机体内没有发现严重的机型组织反应和毒理反应，而且无抗原性。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的全植入式人工角膜基质(totally implantableartificial corneal stroma)。
本发明的全植入式人工角膜基质能应用于临床替代机体病变的角膜组织。
本发明的另一目的是提供上述人工角膜基质的制备方法。
本发明全植入式人工角膜基质的技术方案是：通过模拟机体正常角膜基质组织，在体外建立细胞与生物支架复合体，并将其用于替代机体病变的角膜组织。与此同时，借助可降解生物材料的自然降解特性，在该人工角膜基质修复组织缺损的同时逐步提高角膜透明度，最终使角膜透明，恢复患者视力。
本发明全植入式人工角膜基质主要由种子细胞和合适的支架材料组成。
所述的种子细胞采用脂肪干细胞，接种于支架材料，能够在生物支架所形成的三维空间中能够摄取营养，排泄废物，所述的脂肪干细胞为自体离体脂肪干细胞，所述的细胞接种密度为3～5×10⁶/cm³优选4×10⁶/cm³；所述的合适的支架材料采用聚乳酸聚羟基乙酸共聚物，其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比为65～75∶35～25，优选70比30，本支架材料既能维持种子细胞的位置、形态，也能参与细胞分化状态的调控。
本发明全植入式人工角膜基质采用具有良好生物相容性的离体自体脂肪干细胞与聚乳酸聚羟基乙酸共聚物复合物，避免了传统人工角膜基质对机体的毒性反应及诱发排斥反应；该复合物具有一定的坚韧性，既能满足三维立体成形的需要，又能耐受体内回植时的机械力作用；此外，该复合物的支架降解速率与机体正常细胞或者种子细胞合成细胞外基质的速率相匹配，能依靠新生组织修复病变组织或器官；经动物实验结果证明，当该复合物植入体内随着时间推移完全降解后，角膜可恢复透明，从而满足机体对视力的要求。
本发明的技术方案通过下述步骤实现：
1.制备支架材料
首先将聚乳酸与聚羟基乙酸以一定配比溶于1，4二氧六环配置成10％的溶液，然后在溶液中加入一定比例、选定粒径的NaCl颗粒，并在磁力搅拌机上搅拌制得均匀悬液，将悬液滴入表面皿，并流延成PLGA膜，自然干燥后将材料薄膜从表面皿中取出，用蒸馏水浸泡，最后取出材料薄膜，干燥后分别用PBS及培养基各浸泡以备用；
本发明的支架材料，其中聚乳酸与聚羟基乙酸质量比为65～75比35～25，经动物体内回植实验验证，该支架材料具有较好的生物相容性及适宜的体内降解速度。
2.选择接种离体自体脂肪干细胞浓度
将ADSCs按不同细胞浓度分别接种于支架材料上制得细胞材料复合物，各5块；于培养箱中放置一定时间后，消化收集细胞，计数仪计数，得出流失的细胞量；细胞材料复合物培养24小时后，将细胞材料复合物于培养液中晃动，并换入另一培养皿培养，收集培养皿培养液并消化收集贴壁的细胞，将原培养液中细胞一并计数，得出未粘附的细胞数；
细胞粘附率＝(接种的细胞数-流失的细胞数-未粘附的细胞数)/(接种的细胞数-流失的细胞数)。实验结果表明，3～5×10⁶/cm³范围内的细胞接种密度具有较高的材料黏附率及细胞粘附量。
3.制备全植入式人工角膜基质
用无血清的DMEM调整细胞浓度至1×10⁶/ml，每毫升细胞悬液加5微升的DiO试剂，混合均匀，放入培养箱孵育，去上清，重复洗两次后把标记好的细胞按4×10⁶/cm³接种在PLGA材料上，于培养箱中培养1周后备用。
4.全植入式人工角膜基质使用实验
将体外构建的兔自体脂肪干细胞与PLGA材料组织工程化复合物回植到的兔角膜基质：取健康纯种新西兰大白兔，肌内注射氯胺酮及地西泮麻醉后，在环转辅助下制作角膜上皮基质瓣，约1/2角膜厚度，然后在暴露的植床上切除一定直径角膜基质，再将上述兔自体脂肪干细胞与PLGA角膜基质组织工程化复合物放置到角膜板层间，最后用10-0的尼龙线间段缝合，术毕予0.3％妥布霉素/0.1％地塞米松滴眼液局部使用3周。结果显示，上述人工角膜基质植入体内后随着时间推移可完全降解，角膜也逐步恢复透明，能更好地修复角膜基质缺损，满足机体对视力的要求。
本发明人工角膜基质的优势在于：
1、传统的人工角膜基质是使用角膜基质细胞作为种子细胞，由于这种细胞若来源于自体角膜基质细胞对个体健侧角膜损伤较大；若来源于异体角膜基质细胞则存在排异反应发生的可能性；本发明人工角膜基质采用脂肪干细胞作为种子细胞：脂肪组织在人体分布广泛，来源充足，且获取自体脂肪组织对机体创伤较小，患者易于接受，是理想的种子细胞来源；研究证实脂肪干细胞能够在特定的条件下向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化；脂肪组织随年龄增长，细胞数目不减少，仍然保持多向分化的潜能。
2、传统的角膜基质支架包括从动物中提取的胶原及明胶，作为支架材料，它们一方面在体内受胶原酶的作用极易降解，另外容易诱发角膜排斥反应，并且与角膜上皮细胞相容性不甚理想且稳定性差，不适用于移植手术。本发明人工角膜基质中的特定质量比的聚乳酸及聚羟基乙酸的共聚物可按要求加工成各种结构形状，同时它们具有良好的生物相容性且降解产物无毒。
3、本发明方法构建的人工角膜基质，使用时仅需先切除病变角膜基质，然后再将该复合物回植，手术易于掌握，术后常规抗炎处理，护理方便。
附图说明
图1原代rADSC培养72h，倒置显微镜×40。
图2rADSC培养96h，倒置显微镜×40。
图3PLGA材料大体观。
图4PLGA材料电镜扫描图。
图5荧光倒置显微镜观察DiO标记ADSCs在材料中的粘附生长情况，
其中，A，细胞材料复合物体外培养1天，×100；
B，细胞材料复合物体外培养1天，×200；
C，细胞材料复合物体外培养7天，×100；
D，细胞材料复合物体外培养7天，×200。
图6扫描电镜观察细胞材料复合物，
其中，A图示rADSCs在材料表面生长良好，可见细胞分布均匀，×50，
B图示细胞形态呈纤维样，透过细胞间隙可见下方PLGA纤维，×300。图7双光子显微镜观察细胞材料复合物，
其中，A，细胞材料复合物示意图；B，双光子显微镜选取30um断层扫描成像，可见细胞分布均匀；C，单纯细胞扫描成像；D，单纯材料扫描成像；E，细胞材料复合物共显像。
图8裂隙灯观察角膜基质修复情况。
图9HE染色观察角膜基质修复器概况。
图10活体共聚焦角膜显微镜动态观察角膜，标尺为50um。
图11免疫组织化学检查波形蛋白及平滑肌肌动蛋白表达×100。
图12透射电镜观察角膜基质纤维排列方向及大小，
其中，A为正常角膜基质，B为复合物组。
具体实施方式
实施例1全植入式人工角膜基质的体外制备及检测
1、实验仪器及试剂6月龄雌性新西兰大白兔，体重2～2.5kg(上海市中国科学研动物研究中心)。DMEM(Dulbeco’smodified eagle’smedium)粉剂为美国GIBCO公司产品；I型胶原酶为美国Worthington公司产品；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)为美国Hyclone公司产品；地塞米松及转铁蛋白为美国Sigma公司产品；L-谷氨酰胺、抗坏血酸及胰蛋白酶为上海实生生物技术有限公司产品；青霉素及链霉素为华北制药有限公司产品；NaHCO₃为上海虹光化工厂产品。LSM-510双光子显微镜购自德国Zeiss公司。JSM-6701F扫描电镜购自日本Jeo公司。
2、兔脂肪干细胞的原代培养及传代按1mg/kg氯胺酮联合0.5mg/kg安定肌注麻醉。取实验动物兔皮下脂肪组织约2～3g，将脂肪组织在无菌条件下装入含5％FBS的10ml DMEM培养液50ml离心管中；用链霉素溶液及PBS；反复冲洗兔脂肪组织；将脂肪组织置培养皿中，剪碎；剪碎的脂肪组织置于50ml离心管中，加入0.075％I型胶原酶溶液40ml，在37℃恒温消化30min，1500rpm离心10min，去上清，获得高密度的细胞沉淀物，加入DMEM培养液+10％FBS培养液使细胞重悬；按10⁶/ml细胞浓度接种于培养皿，加入培养液至8ml置37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下，培养48～72小时后首次换液；倒置相差显微镜下观察有大量细胞贴壁和漂浮的血细胞，用PBS反复冲洗去除漂浮的细胞，加入DMEM+10％FBS培养液；隔天换液，细胞融合至80％传代；传代前用PBS洗涤，加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA 2ml，观察大部分细胞胞质回缩、形态变圆，加入2ml含血清的DMEM培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以0.5×10⁶/cm²细胞浓度接种于新的培养皿内；3～4天后细胞达近融合状态，再次进行传代；倒置显微镜观察细胞形态，拍照。
3、制备PLGA支架材料，首先将PLGA材料(LA/GA＝70/30，Mw＝104900)溶于1，4二氧六环配置成10％(质量体积比)的溶液，然后在溶液中加入一定比例、选定粒径的NaCl颗粒，磁力搅拌制得均匀悬液，将悬液滴入表面皿，并流延成厚度为20um的PLGA膜；自然干燥48h，真空干燥24h后，从表面皿中取出制得的材料薄膜，蒸馏水浸泡48h，每隔8h时更换蒸馏水；取出材料薄膜，干燥后分别用PBS及培养基各浸泡1d，备用。
4、脂肪干细胞接种于PLGA材料，将步骤1制得的细胞按4×10⁶/cm³接种于5mm×5mm×1mm的PLGA材料上；倒置荧光显微镜观察细胞形态，拍照。
5、结果显示：
(1)ADSCs接种于培养皿6h后开始贴壁，24h～48h内细胞生长缓慢；72h后，有细胞克隆形成，细胞伸展呈成纤维细胞样，生长有方向性(图1)；P1代细胞后可观察细胞仍为成纤维细胞样(图2)。
(2)PLGA支架材料大体观察，材料厚1mm(图3)；扫描电镜检查提示PLGA材料均匀铺开并形成多孔状的空隙(图4)。
(3)DiO标记的ADSCs与PLGA材料复合物在激光共聚焦显微镜下观察，体外培养1天后可见绿色荧光的细胞均匀粘附于PLGA材料上(图5A)；细胞形态呈纤维样或卵圆状(图5B)；细胞材料复合物共培养至第7天时细胞量明显比第1天时增多，大部分区域细胞融合成片，可见明显绿色荧光(图5C)；细胞形态以卵圆状为主(图5D)。
(4)细胞材料复合物培养1周后，细胞与材料粘附良好，细胞分泌基质较旺盛，与PLGA纤维连成一体(图6)。
(5)双光子显微镜的断层扫描，可见细胞材料复合物的某一断层，并进行三维成像；培养1周后可见细胞均匀黏附于材料内部，细胞形态以成纤维样为主(图7)。
实施例2全植入式人工角膜基质的体内(动物)实验
1、实验仪器6月龄雌性新西兰大白兔，体重2～2.5kg(上海市中国科学研动物研究中心)。DMEM(Dulbeco’s modified eagle’s medium)粉剂为美国GIBCO公司产品；I型胶原酶为美国Worthington公司产品；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)为美国Hyclone公司产品；地塞米松及转铁蛋白为美国Sigma公司产品；L-谷氨酰胺、抗坏血酸及胰蛋白酶为上海实生生物技术有限公司产品；青霉素及链霉素为华北制药有限公司产品；NaHCO₃为上海虹光化工厂产品；波形蛋白单克隆抗体购自美国Lab Vision公司；平滑肌蛋白单克隆抗体购自美国Lab Vision公司；0.3％妥布霉素/0.1％地塞米松滴眼液购自美国Alcon公司；0.4％倍诺喜购自日本参天制药公司。LSM-510双光子显微镜购自德国Zeiss公司。JSM-6701F扫描电镜购自日本Jeo公司。常用医用材料与器械均为市购。
2、脂肪干细胞与PLGA复合物体内移植实验
将体外构建的实验兔自体脂肪干细胞与PLGA材料组织工程化复合物回植到的兔角膜基质：取健康纯种新西兰大白兔，肌内注射15mg/kg的氯胺酮及4mg/kg的地西泮麻醉后，在环转辅助下制作直径为8mm的角膜上皮基质瓣，约1/2角膜厚度，在暴露的植床上切除直径为6.5mm的角膜基质，再将直径为7mm的上述离体的兔自体脂肪干细胞与PLGA角膜基质组织工程化复合物放置到角膜板层间，最后用10-0的尼龙线间段缝合；术毕予0.3％妥布霉素/0.1％地塞米松滴眼液局部使用3周。手术后1周内每天裂隙灯显微镜检查，在3，6及9周时裂隙灯拍照。
3、结果显示：
(1)移植手术后，细胞与材料复合物组及单纯材料组占据角膜中央，呈不透明白色，第3周开始，材料降解加速，中央角膜组织逐渐恢复透明，第6周时，可见材料降解明显，但仍有少量材料残留，故表现为角膜云翳，第9周时，角膜中央基本透明(图8)。
(2)移植手术后9周角膜HE染色切片(图9)显示，复合物组新生组织中基质细胞形态较为规则，细胞相对周围正常角膜基质较大；移植区内新生胶原排列较为规则，与相邻胶原间连接紧密，二者之间未见明显的分界线(图10A)，正常角膜基质(图10B)为接近，表现为胶原纤维束排列规则、整齐，角膜基质细胞分布均匀；测定石蜡切片角膜厚度，复合物组为(231.0±2.9)mm，正常角膜基质胶原纤维直径为(29.2±2.9)nm；经秩和检验法统计分析，Z_complexes＝0.286，P＝0.775，二者无统计学差异。
(3)活体共聚焦角膜显微镜动态观察各实验组角膜：正常的表层上皮细胞有明亮的、中等亮度和暗的三种表现，表皮细胞排列疏松，呈多角形，以六边形为主，明亮的细胞核可见或不可见；实验组的上皮层未有明显异常(图10A)，基质层中可见在相对暗的背景下明亮的角膜细胞核，被背景物质分隔开，不能观察到胞浆、细胞边界和胶原层，修复区附近可见明显神经纤维生长(图11B箭头所示)；各实验组内皮层均表现为规则的六边型镶嵌体，细胞边界呈黑色，胞体明亮，未见细胞核(图11C)。
(4)免疫组织化学检测Vimentin及Smooth Muscle Actin蛋白表达：作为纤维母细胞标记的Vimentin以及纤维母细胞活化迁移标记的Smooth muscle actin在各组角膜基质中均表达阴性(图11)，提示角膜基质修复良好。
(5)在胶原纤维排列方面，各实验组角膜胶原排列紊乱，与排列整齐、规则的正常角膜胶原束有明显不同(图12)；在胶原纤维直径方面，正常角膜基质胶原纤维直径为29.2±2.9nm(图12.A)；复合物组为28.5±2.9nm(图12.B)，实验组胶原纤维直径与正常角膜基质比较的统计值分别为Zt_omplexes＝-1.725，P＝0.086＞0.05，实验组胶原纤维直径大小与正常角膜基质之间无统计学差异，证实了复合物修复角膜基质缺损后角膜之所以透明的原因。