一种耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明涉及一种耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。背景技术 低温、 干旱、 高温等逆境因子是影响农作物产量与品质的重要因素， 据估计， 仅 低温造成世界各地水稻平均每年减产 5-10 ％， 严重低温的年份 (3-4 年一次 ) 造成减产 20-40％。
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应， 伴随着许多生理生化及发育上的 变化。明确植物对逆境的反应机制， 将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前， 植 物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、 分子水平， 并与遗传学和遗传工程研究相结合， 探索用生 物技术来改进植物生长特性， 其目的是提高植物对逆境的适应能力。
在干旱、 高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下， 植物能够在分子、 细胞和整体水平 上做出相应的调整， 以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱 导表达， 这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答， 而且能够调节其它相关基因 的表达或参与信号传导途径， 从而使植物避免或减少伤害， 增强对胁迫环境的抗性。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供的耐逆性相关蛋白， 来自籼稻 (Oryza sativa)， 是如下 (a) 或 (b) ：
(a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ；
(b) 将序列 1 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或 添加且与植物耐逆性相关的由序列 1 衍生的蛋白质。
为了使 (a) 中的蛋白质便于纯化， 可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。
表 1 标签的序列
标签 Poly-Arg Poly-His FLAG Strep-tagII c-myc残基 5-6( 通常为 5 个 ) 2-10( 通常为 6 个 ) 8 8 10序列 RRRRR HHHHHH DYKDDDDK WSHPQFEK EQKLISEEDL上述 (b) 中的蛋白质可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达得到。 上述 (b) 中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列 2 所示的 DNA 序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和 / 或在其 5′端和 / 或 3′端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。
本发明还保护所述蛋白的编码基因或基因组基因。
所述编码基因可为如下 1) 或 2) 或 3) 或 4) 或 5) 的 DNA 分子 ：
1) 序列表中序列 2 自 5’ 末端第 73 至 789 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
2) 序列表中序列 2 自 5’ 末端第 5 至 856 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
3) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ；
4) 在严格条件下与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋 白的 DNA 分子 ；
5) 与 1) 或 2) 或 3) 或 4) 限定的 DNA 序列具有 90％以上同源性且编码植物耐逆 性相关蛋白的 DNA 分子
所述基因组基因可为如下 1) 或 2) 或 3) 或 4) 的 DNA 分子 ：
1) 序列表中序列 3 所示的 DNA 分子 ； 2) 序列表中序列 4 所示的 DNA 分子 ；
3) 在严格条件下与 1) 或 2) 限定的 DNA 序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的 DNA 分子 ；
4) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列具有 90％以上同源性且编码植物耐逆性相关 蛋白的 DNA 分子。
序列 2 所示的 DNA 片段中， 自 5’ 末端第 5 至 30 位核苷酸为上游引物， 自 5’ 末端 第 836 至 856 位核苷酸为下游引物， 自 5’ 末端第 73 至 789 位核苷酸为基因的开放阅读框。 该基因没有内含子， 所以序列表的序列 2 自 5’ 末端第 5 至 856 位核苷酸与序列表的序列 4 自 5’ 末端第 1004 至 1855 位核苷酸是完全一致的。
含有所述基因的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系和重组菌均属于本发明的 保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载 体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外 源基因的 3’ 端非翻译区域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA 加工或基因表达的 DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到 mRNA 前体的 3’ 端。使用所述基因构 建重组植物表达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启 动子， 它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用 ； 此外， 使用本发明的基因构建植物 表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是 ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅读框相同， 以保证整个序列 的正确翻译。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的， 也可以是合 成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植 物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可在植物中表达的编码可产 生颜色变化的酶或发光化合物的基因、 具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因 等。从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为在 pCAMBIA1300 的 Kpn I 和 Sal I 酶切位点之间插入 特异 DNA 片段得到的重组质粒 ； 所述特异 DNA 片段是用限制性内切酶 Kpn I 和 Xhol 双酶切 pJIT163-AK068115 得到的小片段 ； 所述 pJIT163-AK068115 是将序列表中序列 2 自 5’ 末端 第 5 至 856 位核苷酸所示的 DNA 分子插入 pJIT163 的 BamH I 和 HindIII 酶切位点之间得 到的重组质粒。
扩增所述基因的引物也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法， 是将所述基因导入目的植物中， 得到 如下 (A) 和 / 或 (B) 和 / 或 (C) 的转基因植物 ：
(A) 耐逆性高于所述目的植物的转基因植物 ；
(B) 株高高于所述目的植物的转基因植物 ；
(C) 谷穗和 / 或谷粒大于所述目的植物的转基因植物。
所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。 携带有所述基因的 表达载体可通过使用 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电导、 农杆 菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织， 并将转化的植物组织培育成植株。所述目 的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物， 所述单子叶植物可为水稻， 如日本晴或 9311。所述耐逆性具体可为耐寒性。
本发明提供了一种来源于水稻的新蛋白， 该蛋白与耐逆性、 生长速度以及谷穗和 谷粒的大小相关， 可用于培育耐逆性转基因植株， 也可用于培育生长速度快、 谷穗谷粒大的 转基因植株， 在作物遗传改良方面具有重要的应用价值。 附图说明
图 1 为基因芯片分析超级杂交稻亲本培矮 64S 不同发育时期、 不同组织器官在干 旱、 低温、 高温条件下 OsXGD 的表达水平 ； 1， 2， 3 代表苗期， 孕穗期， 抽穗开花期 ； L 代表叶 片， P 代表穗 ； k 代表对照， c 代表低温， h 代表高温， d 代表干旱。
图 2 为基因的 Harpin-induced 1 domain。
图 3 为 PCR 扩增产物的电泳图谱 ； M： 200bp marker ； 1-4 ： PCR 扩增产物。
图 4 为 pMD-18T 载体的图谱。
图 5 为重组质粒构建中各酶切片段的电泳图谱 ； M： 500bp marker ； 1： Kpn I 和 Xhol 酶切 pJIT163-AK068115 ； 2： Kpn I 和 Sal I 酶切 pCAMBIA1300。
图 6 为实施例 3 中转基因植株的 PCR 鉴定图谱 ； M： marker ； 1-14 ： 生根且成活的小 苗， 其中泳道 5 为 T13-1 株系， 泳道 13 为 T17-1 株系 ； 15 ： 日本晴 ( 阴性对照 )。
图 7 为实施例 3 中 T1 代转基因植株冷处理后的生长状况 ； DZ ： 空载体对照 ； WT ： 的 日本晴 ； T13-1、 T17-1 ： 转基因植株的两个株系。
图 8 为实施例 3 中 T1 代转基因植株的生长状况、 稻穗和稻粒照片。
图 9 为实施例 3 中 T1 代转基因植株、 T2 代转基因植株的稻穗照片。
图 10 为实施例 4 中 T1 代转基因植株的稻穗照片。 具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％， 如无特殊说明， 均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平均值。
籼稻品种培矮 64S( 水稻 PA64) ： 获自中国水稻杂交育种中心 ( 中国， 长沙 ) ； 中 国科学院亚热带农业生态研究所保证向公众提供 ； 参考文献 ： 梁永书等， 籼粳交组合培矮 64S/ 日本晴 F2、 F3 及 F6 代主要农艺性状分析， 植物学通报 Chinese Bulletin of Botany 2008， 25(1) ： 59-66。
水稻日本晴 ： 种子获自中国水稻杂交育种中心 ( 中国， 长沙 ) ； 中国科学院亚热带 农业生态研究所保证向公众提供 ； 参考文献 ： 梁永书等， 籼粳交组合培矮 64S/ 日本晴 F2、 F3 及 F6 代主要农艺性状分析， 植物学通报 Chinese Bulletin of Botany 2008， 25(1) ： 59-66。
水稻 9311 ： 中国科学院亚热带农业生态研究所保证向公众提供 ； 参考文献 ： 杨 德卫等， 基于 CSSL 的水稻抽穗期 QTL 定位及遗传分析， 植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010， 45(2) ： 189-197。
Columbia 拟南芥 ( 哥伦比亚生态型拟南芥 ； Col-0) ： 中国科学院亚热带农业生态 研究所保证向公众提供 ； 参考文献 ： 王金兰等， 在拟南芥中 OsRAA1 异位表达促进开花及下 胚轴伸长， 科学通报， 2009 年第 54 卷第 18 期 ： 2819-2825。 pJIT163 载 体 ： 中国科学院亚热带农业生态研究所保证向公众提供 ； 参考文 1 1 1 献： Feng-Yun Zhao， Xue-Jie Zhang ， Ping-Hua Li ， Yan-Xiu Zhao and Hui Zhang， Co-expression of the Suaeda salsa SsNHX1 and Arabidopsis AVP1 confer greater salt tolerance to transgenic rice than the single SsNHX1， Molecular Breeding， 1 380-3743(Print)1572-9788(Online)， Volume 17， Number 4/2006 年 7 月， 341-353。
实施例 1、 OsXGD 基因的发现
以超级杂交稻为材料， 应用 Affymetrix 基因芯片技术和含 51， 279 转录子的水稻 基因组表达芯片 (The GeneChip Rice Genome Array， Part Number900601)， 系统地分析 了超级稻亲本培矮 64S 不同发育时期、 不同组织器官在干旱、 低温、 高温条件下全基因组的 表达谱， 发现了与耐逆性高度有关的基因。探针如序列表的序列 5 所示 (GeneChip Rice Genome Array Probe Set ID ： Os.12119.1.S1_at)。结果见图 1 和表 1。
表 1 不同处理的各组织器官的相对表达量
1Lck 2Lc 2Lck 3Lh 2Pck 3Pc50.4 1078.8 76.4 823.0 18.7 457.91Lc 2Lck 2Ld 2Pck 2Pd 3Pck1575.9 76.4 1021.2 18.7 78.5 163.22Lck 2Lh 3Lck 2Pc 3Pck 3Pd76.4 742.0 197.6 129.6 163.2 480.8OsXGD 基 因 位 于 水 稻 第 1 号 染 色 体 上。OsXGD 蛋 白 含 238 个 氨 基 酸 残 基。 CG 含 量 为 60.7 ％， 无 内 含 子。OsXGD 蛋 白 的 等 电 点 为 10.08。OsXGD 基 因 含 有 一 个 Harpin-induced 1 domain， 在植物的敏感反应中有重要的作用， 见图 2。DANMAN 分析表 明该蛋白是一个亲水性蛋白。OsXGD 基因可能的启动子区在 ORF 上游 1200 多 bp 处， 有一 些顺式作用元件， 如 cis-acting element involved in heat stress responsiveness， gibberellin-responsive element 等， 3 region 在终止密码子下游 60 多 bp 处。基因芯片 数据表明该基因可能与水稻抗寒、 耐热、 耐旱性有关， 在水稻各组织器官， 各个发育生长时 期均有一定水平的表达， 但也受多种逆境因子诱导高表达。 初步分析为 - 转录因子基因 ( 指 挥员基因 )。
OsXGD 基因的编码序列如序列表的序列 2 自 5’ 端第 73 至 789 位核苷酸所示， 基因 组基因如序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示 ( 序列 3 和序列 4 为反向互补序列 )， 编码 的蛋白质 (OsXGD 蛋白 ) 如序列表的序列 1 所示。OsXGD 基因受高温、 低温与干旱诱导、 在各 生长发育时期与组织器官均显著上调。
实施例 2、 OsXGD 基因的克隆和重组表达载体的构建
一、 OsXGD 基因的克隆 提取水稻 PA64 的基因组 DNA， 以基因组 DNA 为模板 ( 无内含子 )， 用 P1 和 P2 组成 的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 (OsXGD 基因 ) ；
P1( 正向引物 ) ： 5’ -TCTAGACATCCATCACTCGTTCGATCTCTCCC-3’ ；
P2( 反向引物 ) ： 5’ -CACGTGTGTGTCGTGTCGTTCCCAGCC-3’ 。
PCR 反 应 条 件 ： 94 ℃ /5min ； 94 ℃ /30s， 57 ℃ /40s， 72 ℃ /1min， 30 个 循 环 ； 72℃ /10min。
PCR 扩增产物 (OsXGD 基因 ) 的电泳图谱见图 3。
二、 重组表达载体的构建
1、 将步骤一得到的 PCR 扩增产物连接到 pMD-18T 克隆载体 (TA Cloning， 济南泰天 和生物科技有限公司 )( 见图 4) 上， 获得 pMD-18T-AK068115(OsXGD)， 测序验证。
2、 将 pMD-18T-AK068115 用 BamH I(T 载体上自带的 ) 和 HindIII 酶切， 回收小片 段； 将 pJIT163(pGreen， http://www.pgreen.ac.uk/) 用 BamH I 和 HindIII 酶切， 回收大片 段； 将大片段和小片段连接， 得到 pJIT163-AK068115(OsXGD)。pJIT163 带上有 2×35S 启动 子， pJIT163-AK068115(OsXGD) 中将目的基因与强启动子连接起来。
3、 将 pJIT163-AK068115 用 Kpn I 和 Xhol 酶 切， 回 收 小 片 段 ； 将 pCAMBIA1300(CambiaLabs ， http://www.cambia.org/daisy/bioforge_legacy/3725. html) 用 KpnI 和 Sal I 酶 切， 回收大片段 ； 将 大 片 段 和 小 片 段 连 接， 得到重组质粒 pCAMBIA1300-AK068115(OsXGD)。各酶切片段的电泳图谱见图 5。
将重组质粒 pCAMBIA1300-AK068115(OsXGD) 进行测序， 结果表明 ： 该重组质粒的 骨架为 pCAMBIA1300， 在 Kpn I 和 Sal I 酶切位点之间插入了 2×35S 启动子和序列表中序 列 2 自 5’ 末端第 5 至 856 位核苷酸所示的 OsXGD 基因， 由 2×35S 启动子启动 OsXGD 基因。
三、 对照载体的构建
将 pJIT163 用 Kpn I 和 Xhol 酶切， 回收小片段 ； 将 pCAMBIA1300 用 Kpn I 和 Sal I 酶切， 回收大片段 ； 将大片段和小片段连接， 得到对照质粒。
实施例 3、 转基因水稻的获得和鉴定 诱导培养基 ： NB+2， 4-D(2.0mg/mL)+6-BA(0.2mg/mL)+Sucrose(30g/L)+Agar(10g/L)。 继代培养基 ： NB+2， 4-D(2.0mg/mL)+CHL(0.3g/L)+Maltose(30g/L)+Agar(8g/L)。
筛 选 培 养 基： L3+2， 4-D(2.0mg/mL)+Pro(0.5g/L)+Gln(0.5g/L)+ 头 孢 霉 素 (500mg/L)+ 羧苄青霉素 (400mg/L)+ 潮霉素 (25mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(8g/L) ； pH ＝ 5.8。
预 分 化 培 养 基： NB+Pro(0.5g/L)+CHL(0.3g/L)+6-BA(1.0mg/mL)+NAA(2.0mg/ mL)+ABA(5.0mg/mL)+ 羧苄青霉素 (200mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(10g/L) ； pH ＝ 5.8。
分 化 培 养 基： NB+Pro(0.5g/L)+CHL(0.3g/L)+6-BA(2.0mg/mL)+KT(1.0mg/ mL)+Agar(10g/L)+NAA(0.5mg/mL)+IAA(0.5mg/mL)+ 羧苄青霉素 (200mg/L)+Maltose(30g/ L) ； pH ＝ 5.8。
生根培养基 ： MS+NAA(0.5mg/L)+Maltose(30g/L)+Agar(10g/L) ； pH ＝ 5.8。
一、 转基因水稻的获得
1、 重组农杆菌和愈伤组织的准备
用冻融法 (Ca++buffer) 将重组质粒 pCAMBIA1300-AK068115(OsXGD) 导入根癌农 杆菌 EHA105( 购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 )， 获得的重组农杆菌。重组农杆菌划 LB 板 (LB+50mg/L 卡那霉素 +34mg/L 氯霉素 )， 两天后挑单菌落划 LB 板 (LB+50mg/L 卡那霉 素 +34mg/L 氯霉素 ) 全皿， 过夜后将菌重悬于 50ml 共培养基 (NBM+0.1mM 乙酰丁香酮 ) 中， 调 OD600 ＝ 0.5， 即为重组农杆菌菌液。
挑选健康日本晴种子剥去颖壳， 置于 37 ℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的 三角瓶中， 先用体积分数为 75％乙醇表面灭菌 2min， 用无菌水冲洗 1 次， 0.1％ HgCl 消毒 12min， 用无菌水冲洗 5 次， 再放入次氯酸钠原液消毒 40min， 无菌水冲洗 5 次， 于灭菌的滤纸 上晾干， 然后接种到诱导培养基上， 让胚的一半接触培养基。 每皿 18-20 粒， 置于 25-26℃下 暗培养， 以诱导愈伤组织。 20 天后， 挑选表面干爽、 结构致密的愈伤组织， 去除谷粒和愈伤中 的芽头转到继代培养基上， 这时候谷粒中营养已经被吸收而变软， 继代培养 1 次 (14 天 )。 挑选表面干爽结构致密的愈伤组织， 于灭菌的滤纸上风干至表面发白。
2、 重组农杆菌介导转化
将愈伤组织转移到重组农杆菌菌液中浸泡 30min， 每隔 5min 摇晃一次。然后用无 菌水冲洗愈伤组织 5 次至液体不浑浊， 用灭菌滤纸吸干水分， 于灭菌的滤纸上风干至愈伤 表面发白。 将愈伤组织转移到共培养基 (NBM+0.1mM 乙酰丁香酮 ； 其上有用液体共培养基浸 湿的滤纸 )， 25-26℃下暗培养 3 天。
3、 筛选培养
将愈伤组织转入灭过菌的三角瓶中， 用菌水冲洗 5 次至液体不浑浊， 再用加有 500mg/L 头胞霉素和 400mg/L 羧苄青霉素的灭菌水浸泡 30min， 每隔 5min 摇晃一次。用灭 菌滤纸吸干水分， 于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白。 在筛选培养基上 25-26℃下暗 培养， 20 天后将长出抗性愈伤的愈伤整体转入新的筛选培养基中。
4、 分化培养
两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤整体转移到预分化培养基中，
25-26℃， 14h 光照培养 ( 光强 1000-1500lx)， 3-7 天陆续有愈伤组织变绿。 将预分化培养基 中变绿的愈伤组织转到分化培养基中， 置于 25-26℃， 14h 光照培养 ( 光强 1000-1500lx)， 每 20 天更换一次培养基。
5、 生根和移栽
绿 苗 高 5-8cm 时，转 移 到 生 根 培 养 基， 25-26 ℃， 14h 光 照 培 养 ( 光 强 1000-1500lx)3-4 周。将生根且成活的小苗移栽至泥土中， 培养至成熟。
成活的幼苗取叶片， 提取基因组 DNA， 用潮霉素引物 (P3 和 P4) 进行 PCR 鉴定， 鉴定 图谱见图 6。PCR 鉴定阳性的植株为转 OsXGD 基因水稻 T0 代植株。
P3 ： 5’ -ACCTGCCTGAAACCGAACTG-3’ ；
P4 5’ -CTGCTCCATACAAGCCAACC-3’ 。
T1 代表示 T0 代自交产生的种子及由它所长成的植株。T2 代表示 T1 代自交产生的 种子及由它所长成的植株。
二、 转空载体对照水稻的获得
用对照质粒代替重组质粒 pCAMBIA1300-AK068115， 其它同步骤一， 获得转空载体 对照水稻 T0 代植株。
三、 转基因水稻的鉴定
1、 耐寒性鉴定
分别检测转 OsXGD 基因水稻的两个株系 (T13-1 和 T17-1) 的 T1 代、 转空载体对照 水稻 (DZ) 的 T1 代和日本晴水稻 (WT) 的耐寒性， 每个株系 30 株。
将水稻种子播种后置于人工气候箱中， 先在 22℃下生长到 3 叶期， 然后 6℃冷处理 7 天， 再在 22℃下恢复生长 10 天， 拍照。照片见图 7。转基因植株大多存活， 而转空载体植 株和野生型植株几乎全部枯黄死亡。
2、 生长和生产性能鉴定
将 T1 代种子 (T13-1 或日本晴或转空载体对照水稻 ) 播种于田间 ( 每个株系 30 株 )， 收穗时进行观察并拍照， 照片见图 8A， 收获稻穗后， 稻穗的照片见图 8C 和图 8D。将 T1 代种子 (T17-1 或日本晴或转空载体对照水稻 ) 播种于花盆 ( 每个株系 30 株 )， 收穗时进行 观察并拍照， 照片见图 8B。转空载体对照水稻的表型和日本晴一致。
结果表明 ： 转基因植株生长加速， 增高、 增大近一倍， 谷穗和谷粒均显著增大。
3、 生产性能鉴定
将日本晴和 T13-1 的 T1 代和 T2 代种子播种于田间 ( 每个株系 30 株 )， 收获谷穗 后对谷穗进行观察并拍照， 照片见图 9。
结果表明 ： 转基因植株的谷穗、 谷粒均显著增大。
实施例 4、 转基因水稻的获得和鉴定
用水稻品种 9311 代替日本晴， 其它方法同实施例 3， 得到转基因水稻和转空载体 对照水稻。
将 9311、 转基因水稻的 T1 代种子和转空载体对照水稻的 T1 代种子播种于田间 ( 每 个株系 30 株 )， 收获谷穗后对谷穗进行观察并拍照， 照片见图 10。转空载体对照水稻的表 型和日本晴一致。
本发明涉及一种耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。背景技术 低温、 干旱、 高温等逆境因子是影响农作物产量与品质的重要因素， 据估计， 仅 低温造成世界各地水稻平均每年减产 5-10 ％， 严重低温的年份 (3-4 年一次 ) 造成减产 20-40％。
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应， 伴随着许多生理生化及发育上的 变化。明确植物对逆境的反应机制， 将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前， 植 物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、 分子水平， 并与遗传学和遗传工程研究相结合， 探索用生 物技术来改进植物生长特性， 其目的是提高植物对逆境的适应能力。
在干旱、 高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下， 植物能够在分子、 细胞和整体水平 上做出相应的调整， 以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱 导表达， 这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答， 而且能够调节其它相关基因 的表达或参与信号传导途径， 从而使植物避免或减少伤害， 增强对胁迫环境的抗性。
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应， 伴随着许多生理生化及发育上的 变化。明确植物对逆境的反应机制， 将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前， 植 物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、 分子水平， 并与遗传学和遗传工程研究相结合， 探索用生 物技术来改进植物生长特性， 其目的是提高植物对逆境的适应能力。
在干旱、 高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下， 植物能够在分子、 细胞和整体水平 上做出相应的调整， 以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱 导表达， 这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答， 而且能够调节其它相关基因 的表达或参与信号传导途径， 从而使植物避免或减少伤害， 增强对胁迫环境的抗性。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供的耐逆性相关蛋白， 来自籼稻 (Oryza sativa)， 是如下 (a) 或 (b) ：
(a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ；
(b) 将序列 1 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或 添加且与植物耐逆性相关的由序列 1 衍生的蛋白质。
为了使 (a) 中的蛋白质便于纯化， 可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。
表 1 标签的序列
标签 Poly-Arg Poly-His FLAG Strep-tagII c-myc残基 5-6( 通常为 5 个 ) 2-10( 通常为 6 个 ) 8 8 10序列 RRRRR HHHHHH DYKDDDDK WSHPQFEK EQKLISEEDL上述 (b) 中的蛋白质可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达得到。 上述 (b) 中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列 2 所示的 DNA 序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和 / 或在其 5′端和 / 或 3′端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。
本发明还保护所述蛋白的编码基因或基因组基因。
所述编码基因可为如下 1) 或 2) 或 3) 或 4) 或 5) 的 DNA 分子 ：
1) 序列表中序列 2 自 5’ 末端第 73 至 789 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
2) 序列表中序列 2 自 5’ 末端第 5 至 856 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
3) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ；
4) 在严格条件下与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋 白的 DNA 分子 ；
5) 与 1) 或 2) 或 3) 或 4) 限定的 DNA 序列具有 90％以上同源性且编码植物耐逆 性相关蛋白的 DNA 分子
所述基因组基因可为如下 1) 或 2) 或 3) 或 4) 的 DNA 分子 ：
1) 序列表中序列 3 所示的 DNA 分子 ； 2) 序列表中序列 4 所示的 DNA 分子 ；
3) 在严格条件下与 1) 或 2) 限定的 DNA 序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的 DNA 分子 ；
4) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列具有 90％以上同源性且编码植物耐逆性相关 蛋白的 DNA 分子。
序列 2 所示的 DNA 片段中， 自 5’ 末端第 5 至 30 位核苷酸为上游引物， 自 5’ 末端 第 836 至 856 位核苷酸为下游引物， 自 5’ 末端第 73 至 789 位核苷酸为基因的开放阅读框。 该基因没有内含子， 所以序列表的序列 2 自 5’ 末端第 5 至 856 位核苷酸与序列表的序列 4 自 5’ 末端第 1004 至 1855 位核苷酸是完全一致的。
含有所述基因的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系和重组菌均属于本发明的 保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载 体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外 源基因的 3’ 端非翻译区域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA 加工或基因表达的 DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到 mRNA 前体的 3’ 端。使用所述基因构 建重组植物表达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启 动子， 它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用 ； 此外， 使用本发明的基因构建植物 表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是 ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅读框相同， 以保证整个序列 的正确翻译。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的， 也可以是合 成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植 物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可在植物中表达的编码可产 生颜色变化的酶或发光化合物的基因、 具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因 等。从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为在 pCAMBIA1300 的 Kpn I 和 Sal I 酶切位点之间插入 特异 DNA 片段得到的重组质粒 ； 所述特异 DNA 片段是用限制性内切酶 Kpn I 和 Xhol 双酶切 pJIT163-AK068115 得到的小片段 ； 所述 pJIT163-AK068115 是将序列表中序列 2 自 5’ 末端 第 5 至 856 位核苷酸所示的 DNA 分子插入 pJIT163 的 BamH I 和 HindIII 酶切位点之间得 到的重组质粒。
扩增所述基因的引物也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法， 是将所述基因导入目的植物中， 得到 如下 (A) 和 / 或 (B) 和 / 或 (C) 的转基因植物 ：
(A) 耐逆性高于所述目的植物的转基因植物 ；
(B) 株高高于所述目的植物的转基因植物 ；
(C) 谷穗和 / 或谷粒大于所述目的植物的转基因植物。
所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。 携带有所述基因的 表达载体可通过使用 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电导、 农杆 菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织， 并将转化的植物组织培育成植株。所述目 的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物， 所述单子叶植物可为水稻， 如日本晴或 9311。所述耐逆性具体可为耐寒性。
本发明提供了一种来源于水稻的新蛋白， 该蛋白与耐逆性、 生长速度以及谷穗和 谷粒的大小相关， 可用于培育耐逆性转基因植株， 也可用于培育生长速度快、 谷穗谷粒大的 转基因植株， 在作物遗传改良方面具有重要的应用价值。 附图说明
图 1 为基因芯片分析超级杂交稻亲本培矮 64S 不同发育时期、 不同组织器官在干 旱、 低温、 高温条件下 OsXGD 的表达水平 ； 1， 2， 3 代表苗期， 孕穗期， 抽穗开花期 ； L 代表叶 片， P 代表穗 ； k 代表对照， c 代表低温， h 代表高温， d 代表干旱。
图 2 为基因的 Harpin-induced 1 domain。
图 3 为 PCR 扩增产物的电泳图谱 ； M： 200bp marker ； 1-4 ： PCR 扩增产物。
图 4 为 pMD-18T 载体的图谱。
图 5 为重组质粒构建中各酶切片段的电泳图谱 ； M： 500bp marker ； 1： Kpn I 和 Xhol 酶切 pJIT163-AK068115 ； 2： Kpn I 和 Sal I 酶切 pCAMBIA1300。
图 6 为实施例 3 中转基因植株的 PCR 鉴定图谱 ； M： marker ； 1-14 ： 生根且成活的小 苗， 其中泳道 5 为 T13-1 株系， 泳道 13 为 T17-1 株系 ； 15 ： 日本晴 ( 阴性对照 )。
图 7 为实施例 3 中 T1 代转基因植株冷处理后的生长状况 ； DZ ： 空载体对照 ； WT ： 的 日本晴 ； T13-1、 T17-1 ： 转基因植株的两个株系。
图 8 为实施例 3 中 T1 代转基因植株的生长状况、 稻穗和稻粒照片。
图 9 为实施例 3 中 T1 代转基因植株、 T2 代转基因植株的稻穗照片。
图 10 为实施例 4 中 T1 代转基因植株的稻穗照片。 具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％， 如无特殊说明， 均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平均值。
籼稻品种培矮 64S( 水稻 PA64) ： 获自中国水稻杂交育种中心 ( 中国， 长沙 ) ； 中 国科学院亚热带农业生态研究所保证向公众提供 ； 参考文献 ： 梁永书等， 籼粳交组合培矮 64S/ 日本晴 F2、 F3 及 F6 代主要农艺性状分析， 植物学通报 Chinese Bulletin of Botany 2008， 25(1) ： 59-66。
水稻日本晴 ： 种子获自中国水稻杂交育种中心 ( 中国， 长沙 ) ； 中国科学院亚热带 农业生态研究所保证向公众提供 ； 参考文献 ： 梁永书等， 籼粳交组合培矮 64S/ 日本晴 F2、 F3 及 F6 代主要农艺性状分析， 植物学通报 Chinese Bulletin of Botany 2008， 25(1) ： 59-66。
水稻 9311 ： 中国科学院亚热带农业生态研究所保证向公众提供 ； 参考文献 ： 杨 德卫等， 基于 CSSL 的水稻抽穗期 QTL 定位及遗传分析， 植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010， 45(2) ： 189-197。
Columbia 拟南芥 ( 哥伦比亚生态型拟南芥 ； Col-0) ： 中国科学院亚热带农业生态 研究所保证向公众提供 ； 参考文献 ： 王金兰等， 在拟南芥中 OsRAA1 异位表达促进开花及下 胚轴伸长， 科学通报， 2009 年第 54 卷第 18 期 ： 2819-2825。 pJIT163 载 体 ： 中国科学院亚热带农业生态研究所保证向公众提供 ； 参考文 1 1 1 献： Feng-Yun Zhao， Xue-Jie Zhang ， Ping-Hua Li ， Yan-Xiu Zhao and Hui Zhang， Co-expression of the Suaeda salsa SsNHX1 and Arabidopsis AVP1 confer greater salt tolerance to transgenic rice than the single SsNHX1， Molecular Breeding， 1 380-3743(Print)1572-9788(Online)， Volume 17， Number 4/2006 年 7 月， 341-353。
实施例 1、 OsXGD 基因的发现
以超级杂交稻为材料， 应用 Affymetrix 基因芯片技术和含 51， 279 转录子的水稻 基因组表达芯片 (The GeneChip Rice Genome Array， Part Number900601)， 系统地分析 了超级稻亲本培矮 64S 不同发育时期、 不同组织器官在干旱、 低温、 高温条件下全基因组的 表达谱， 发现了与耐逆性高度有关的基因。探针如序列表的序列 5 所示 (GeneChip Rice Genome Array Probe Set ID ： Os.12119.1.S1_at)。结果见图 1 和表 1。
表 1 不同处理的各组织器官的相对表达量
1Lck 2Lc 2Lck 3Lh 2Pck 3Pc50.4 1078.8 76.4 823.0 18.7 457.91Lc 2Lck 2Ld 2Pck 2Pd 3Pck1575.9 76.4 1021.2 18.7 78.5 163.22Lck 2Lh 3Lck 2Pc 3Pck 3Pd76.4 742.0 197.6 129.6 163.2 480.8OsXGD 基 因 位 于 水 稻 第 1 号 染 色 体 上。OsXGD 蛋 白 含 238 个 氨 基 酸 残 基。 CG 含 量 为 60.7 ％， 无 内 含 子。OsXGD 蛋 白 的 等 电 点 为 10.08。OsXGD 基 因 含 有 一 个 Harpin-induced 1 domain， 在植物的敏感反应中有重要的作用， 见图 2。DANMAN 分析表 明该蛋白是一个亲水性蛋白。OsXGD 基因可能的启动子区在 ORF 上游 1200 多 bp 处， 有一 些顺式作用元件， 如 cis-acting element involved in heat stress responsiveness， gibberellin-responsive element 等， 3 region 在终止密码子下游 60 多 bp 处。基因芯片 数据表明该基因可能与水稻抗寒、 耐热、 耐旱性有关， 在水稻各组织器官， 各个发育生长时 期均有一定水平的表达， 但也受多种逆境因子诱导高表达。 初步分析为 - 转录因子基因 ( 指 挥员基因 )。
OsXGD 基因的编码序列如序列表的序列 2 自 5’ 端第 73 至 789 位核苷酸所示， 基因 组基因如序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示 ( 序列 3 和序列 4 为反向互补序列 )， 编码 的蛋白质 (OsXGD 蛋白 ) 如序列表的序列 1 所示。OsXGD 基因受高温、 低温与干旱诱导、 在各 生长发育时期与组织器官均显著上调。
实施例 2、 OsXGD 基因的克隆和重组表达载体的构建
一、 OsXGD 基因的克隆 提取水稻 PA64 的基因组 DNA， 以基因组 DNA 为模板 ( 无内含子 )， 用 P1 和 P2 组成 的引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩增产物 (OsXGD 基因 ) ；
P1( 正向引物 ) ： 5’ -TCTAGACATCCATCACTCGTTCGATCTCTCCC-3’ ；
P2( 反向引物 ) ： 5’ -CACGTGTGTGTCGTGTCGTTCCCAGCC-3’ 。
PCR 反 应 条 件 ： 94 ℃ /5min ； 94 ℃ /30s， 57 ℃ /40s， 72 ℃ /1min， 30 个 循 环 ； 72℃ /10min。
PCR 扩增产物 (OsXGD 基因 ) 的电泳图谱见图 3。
二、 重组表达载体的构建
1、 将步骤一得到的 PCR 扩增产物连接到 pMD-18T 克隆载体 (TA Cloning， 济南泰天 和生物科技有限公司 )( 见图 4) 上， 获得 pMD-18T-AK068115(OsXGD)， 测序验证。
2、 将 pMD-18T-AK068115 用 BamH I(T 载体上自带的 ) 和 HindIII 酶切， 回收小片 段； 将 pJIT163(pGreen， http://www.pgreen.ac.uk/) 用 BamH I 和 HindIII 酶切， 回收大片 段； 将大片段和小片段连接， 得到 pJIT163-AK068115(OsXGD)。pJIT163 带上有 2×35S 启动 子， pJIT163-AK068115(OsXGD) 中将目的基因与强启动子连接起来。
3、 将 pJIT163-AK068115 用 Kpn I 和 Xhol 酶 切， 回 收 小 片 段 ； 将 pCAMBIA1300(CambiaLabs ， http://www.cambia.org/daisy/bioforge_legacy/3725. html) 用 KpnI 和 Sal I 酶 切， 回收大片段 ； 将 大 片 段 和 小 片 段 连 接， 得到重组质粒 pCAMBIA1300-AK068115(OsXGD)。各酶切片段的电泳图谱见图 5。
将重组质粒 pCAMBIA1300-AK068115(OsXGD) 进行测序， 结果表明 ： 该重组质粒的 骨架为 pCAMBIA1300， 在 Kpn I 和 Sal I 酶切位点之间插入了 2×35S 启动子和序列表中序 列 2 自 5’ 末端第 5 至 856 位核苷酸所示的 OsXGD 基因， 由 2×35S 启动子启动 OsXGD 基因。
三、 对照载体的构建
将 pJIT163 用 Kpn I 和 Xhol 酶切， 回收小片段 ； 将 pCAMBIA1300 用 Kpn I 和 Sal I 酶切， 回收大片段 ； 将大片段和小片段连接， 得到对照质粒。
实施例 3、 转基因水稻的获得和鉴定 诱导培养基 ： NB+2， 4-D(2.0mg/mL)+6-BA(0.2mg/mL)+Sucrose(30g/L)+Agar(10g/L)。 继代培养基 ： NB+2， 4-D(2.0mg/mL)+CHL(0.3g/L)+Maltose(30g/L)+Agar(8g/L)。
筛 选 培 养 基： L3+2， 4-D(2.0mg/mL)+Pro(0.5g/L)+Gln(0.5g/L)+ 头 孢 霉 素 (500mg/L)+ 羧苄青霉素 (400mg/L)+ 潮霉素 (25mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(8g/L) ； pH ＝ 5.8。
预 分 化 培 养 基： NB+Pro(0.5g/L)+CHL(0.3g/L)+6-BA(1.0mg/mL)+NAA(2.0mg/ mL)+ABA(5.0mg/mL)+ 羧苄青霉素 (200mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(10g/L) ； pH ＝ 5.8。
分 化 培 养 基： NB+Pro(0.5g/L)+CHL(0.3g/L)+6-BA(2.0mg/mL)+KT(1.0mg/ mL)+Agar(10g/L)+NAA(0.5mg/mL)+IAA(0.5mg/mL)+ 羧苄青霉素 (200mg/L)+Maltose(30g/ L) ； pH ＝ 5.8。
生根培养基 ： MS+NAA(0.5mg/L)+Maltose(30g/L)+Agar(10g/L) ； pH ＝ 5.8。
一、 转基因水稻的获得
1、 重组农杆菌和愈伤组织的准备
用冻融法 (Ca++buffer) 将重组质粒 pCAMBIA1300-AK068115(OsXGD) 导入根癌农 杆菌 EHA105( 购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 )， 获得的重组农杆菌。重组农杆菌划 LB 板 (LB+50mg/L 卡那霉素 +34mg/L 氯霉素 )， 两天后挑单菌落划 LB 板 (LB+50mg/L 卡那霉 素 +34mg/L 氯霉素 ) 全皿， 过夜后将菌重悬于 50ml 共培养基 (NBM+0.1mM 乙酰丁香酮 ) 中， 调 OD600 ＝ 0.5， 即为重组农杆菌菌液。
挑选健康日本晴种子剥去颖壳， 置于 37 ℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的 三角瓶中， 先用体积分数为 75％乙醇表面灭菌 2min， 用无菌水冲洗 1 次， 0.1％ HgCl 消毒 12min， 用无菌水冲洗 5 次， 再放入次氯酸钠原液消毒 40min， 无菌水冲洗 5 次， 于灭菌的滤纸 上晾干， 然后接种到诱导培养基上， 让胚的一半接触培养基。 每皿 18-20 粒， 置于 25-26℃下 暗培养， 以诱导愈伤组织。 20 天后， 挑选表面干爽、 结构致密的愈伤组织， 去除谷粒和愈伤中 的芽头转到继代培养基上， 这时候谷粒中营养已经被吸收而变软， 继代培养 1 次 (14 天 )。 挑选表面干爽结构致密的愈伤组织， 于灭菌的滤纸上风干至表面发白。
2、 重组农杆菌介导转化
将愈伤组织转移到重组农杆菌菌液中浸泡 30min， 每隔 5min 摇晃一次。然后用无 菌水冲洗愈伤组织 5 次至液体不浑浊， 用灭菌滤纸吸干水分， 于灭菌的滤纸上风干至愈伤 表面发白。 将愈伤组织转移到共培养基 (NBM+0.1mM 乙酰丁香酮 ； 其上有用液体共培养基浸 湿的滤纸 )， 25-26℃下暗培养 3 天。
3、 筛选培养
将愈伤组织转入灭过菌的三角瓶中， 用菌水冲洗 5 次至液体不浑浊， 再用加有 500mg/L 头胞霉素和 400mg/L 羧苄青霉素的灭菌水浸泡 30min， 每隔 5min 摇晃一次。用灭 菌滤纸吸干水分， 于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白。 在筛选培养基上 25-26℃下暗 培养， 20 天后将长出抗性愈伤的愈伤整体转入新的筛选培养基中。
4、 分化培养
两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤整体转移到预分化培养基中，
25-26℃， 14h 光照培养 ( 光强 1000-1500lx)， 3-7 天陆续有愈伤组织变绿。 将预分化培养基 中变绿的愈伤组织转到分化培养基中， 置于 25-26℃， 14h 光照培养 ( 光强 1000-1500lx)， 每 20 天更换一次培养基。
5、 生根和移栽
绿 苗 高 5-8cm 时，转 移 到 生 根 培 养 基， 25-26 ℃， 14h 光 照 培 养 ( 光 强 1000-1500lx)3-4 周。将生根且成活的小苗移栽至泥土中， 培养至成熟。
成活的幼苗取叶片， 提取基因组 DNA， 用潮霉素引物 (P3 和 P4) 进行 PCR 鉴定， 鉴定 图谱见图 6。PCR 鉴定阳性的植株为转 OsXGD 基因水稻 T0 代植株。
P3 ： 5’ -ACCTGCCTGAAACCGAACTG-3’ ；
P4 5’ -CTGCTCCATACAAGCCAACC-3’ 。
T1 代表示 T0 代自交产生的种子及由它所长成的植株。T2 代表示 T1 代自交产生的 种子及由它所长成的植株。
二、 转空载体对照水稻的获得
用对照质粒代替重组质粒 pCAMBIA1300-AK068115， 其它同步骤一， 获得转空载体 对照水稻 T0 代植株。
三、 转基因水稻的鉴定
1、 耐寒性鉴定
分别检测转 OsXGD 基因水稻的两个株系 (T13-1 和 T17-1) 的 T1 代、 转空载体对照 水稻 (DZ) 的 T1 代和日本晴水稻 (WT) 的耐寒性， 每个株系 30 株。
将水稻种子播种后置于人工气候箱中， 先在 22℃下生长到 3 叶期， 然后 6℃冷处理 7 天， 再在 22℃下恢复生长 10 天， 拍照。照片见图 7。转基因植株大多存活， 而转空载体植 株和野生型植株几乎全部枯黄死亡。
2、 生长和生产性能鉴定
将 T1 代种子 (T13-1 或日本晴或转空载体对照水稻 ) 播种于田间 ( 每个株系 30 株 )， 收穗时进行观察并拍照， 照片见图 8A， 收获稻穗后， 稻穗的照片见图 8C 和图 8D。将 T1 代种子 (T17-1 或日本晴或转空载体对照水稻 ) 播种于花盆 ( 每个株系 30 株 )， 收穗时进行 观察并拍照， 照片见图 8B。转空载体对照水稻的表型和日本晴一致。
结果表明 ： 转基因植株生长加速， 增高、 增大近一倍， 谷穗和谷粒均显著增大。
3、 生产性能鉴定
将日本晴和 T13-1 的 T1 代和 T2 代种子播种于田间 ( 每个株系 30 株 )， 收获谷穗 后对谷穗进行观察并拍照， 照片见图 9。
结果表明 ： 转基因植株的谷穗、 谷粒均显著增大。
实施例 4、 转基因水稻的获得和鉴定
用水稻品种 9311 代替日本晴， 其它方法同实施例 3， 得到转基因水稻和转空载体 对照水稻。
将 9311、 转基因水稻的 T1 代种子和转空载体对照水稻的 T1 代种子播种于田间 ( 每 个株系 30 株 )， 收获谷穗后对谷穗进行观察并拍照， 照片见图 10。转空载体对照水稻的表 型和日本晴一致。
结果表明 ： 转基因植株的谷穗、 谷粒均显著增大。9101993484 A CN 101993487
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