脂缩肽脱酰方法 发明领域
本发明涉及脂缩肽(lipodepsipeptides)，特别是假粘蛋白(pseudomycin)和丁香霉素天然产物的N-酰基侧链的脱酰化和从中制备的化合物。
发明背景
假粘蛋白和丁香霉素是从丁香假单孢菌(PseudomoHassyringae)(植物相关细菌)的液体培养基中分离出来的天然产物，并且已经证明具有抗真菌活性。(即参见Harrison，L.等，“假粘蛋白，来自丁香假单孢菌的具有广谱抗真菌活性的一族新的肽”，遗传微生物学杂志(J.Gen.Microbiology)137(12)，2857-65(1991)和美国专利No.5576298和5837685)。与先前描述的来自丁香假单孢菌的抗真菌剂(例如丁香霉素，丁香假单孢菌毒素和syringostatins)不同，假粘蛋白A-C含有羟基天冬氨酸，天冬氨酸，丝氨酸，脱氢氨基丁酸，赖氨酸和二氨基丁酸。
假粘蛋白A，A’，B，B’，C，C’的肽部分相应于L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl)，在N-末端Ser的OH基上有末端羧基封闭的大环。这些类似物区别在于N-酰基侧链，即假粘蛋白A被3，4-二羟基十四烷酰基N-酰基化，假粘蛋白A’被3，4-二羟基十五烷酰基N-酰基化，假粘蛋白B被3-羟基十四烷酰基N-酰基化，假粘蛋白B’被3-羟基十二烷酰基N-酰基化，假粘蛋白C被3，4-二羟基十六烷酰基N-酰基化及假粘蛋白C’被3-羟基十六烷酰基N-酰基化。(即参见Ballio，A.，等，“来自丁香假单孢菌的新的生物活性脂缩肽：假粘蛋白”，FEBS Letters，355(1)，96-100，(1994)和Coiro，V.M.，等人，“利用来自NMR数据的几何间距和分子力学通过计算机模拟测定丁香假单孢菌MSU 16H植物毒性脂缩肽假粘蛋白A的溶液构象”，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)257(2)，449-456(1998))。
已知假粘蛋白和丁香霉素具有一些不利的生物学作用。例如静脉内施用假粘蛋白时发现了破坏静脉内皮，破坏组织，炎症，和对宿主组织的局部毒性。因此，需要鉴定该类化合物中对治疗真菌感染有用而没有当前发现的不利副作用的化合物。
发明概述
本发明提供将脂缩肽天然产物的N-酰基侧链脱酰化产生相应地环状化合物的方法。假粘蛋白的脱酰作用产生下面结构式I代表的假粘蛋白氨基环状化合物。该环状化合物可用作制备相应的天然产物的半合成衍生物的起始物。
该方法包括使假粘蛋白天然产物与选自ECB脱酰酶和多链丝霉素酰基转移酶的脱酰酶反应产生结构式I代表的相应的环状化合物。游离胺可以重排产生下面结构式II代表的具有一个游离羟基的环肽环状化合物(也称之为假粘蛋白羟基环状化合物)。化合物II又可以用作产生药学活性的新的衍生物的起始物。
在本发明的另一个实施方案中，上述方法被用来将丁香霉素化合物脱酰化产生丁香霉素氨基环状化合物。例如丁香霉素E的氨基环状化合物具有下面的结构式III。
和假粘蛋白氨基环状化合物一样，丁香霉素氨基环状化合物可以重排生成下面的化合物IV(也称之为丁香霉素羟基环状化合物)。尽管上面描述了化合物I，II，III和IV的特定手性形式，但是其它手性形式都在本发明的范围之内。每一种化合物也以其药学可接受盐，水合物或溶剂合物存在。
定义
本文所用术语“假粘蛋白”指具有下面结构式的化合物：其中R是亲脂部分。该亲脂部分包括C9-C15烷基，C9-C15羟基烷基，C9-C15二羟基烷基，C9-C15链烯基，C9-C15羟基链烯基，或C9-C15二羟基链烯基。假粘蛋白化合物A，A’，B，B’，C，C’由上面式I代表，其中R如下定义。假粘蛋白A R＝3，4-二羟基十四烷酰基假粘蛋白A’R＝3，4-二羟基十五烷酰基假粘蛋白B R＝3-羟基十四烷酰基假粘蛋白B’R＝3-羟基十二烷酰基假粘蛋白C R＝3，4-二羟基十六烷酰基假粘蛋白C’R＝3-羟基十六烷酰基。
发明的详细描述
申请人发现了将广谱脂缩肽天然产物的N-酰基侧链酶促脱酰化产生相应的环状化合物的方法。令人惊奇地，游离胺环状化合物重排产生游离羟基衍生物，例如上面结构式II和IV所示化合物。通过将化合物I或III暴露于pH≥6，分别可以将化合物I和III转化为化合物II和IV。如果期望的产物是化合物I或III，则人们可以通过加入酸例如三氟乙酸而将从脱酰化假粘蛋白或脱酰化丁香霉素生成重排产物的速度降低。但是，加入酸可能会导致胺环状化合物的产率降低。在较低的pH下，酶可以从反应混合物中沉淀出，从而中止转化。因此，反应混合物的pH优选不低于大约5.5。人们可以使其经分子量膜(即截留分子量是10000-50000)通过从反应中分离酶而防止酶沉淀。通过膜的流出液含有具有小于10000-5000分子量的化合物(例如化合物I-IV)，并且可能不包括较高分子量的酶。然后可以将流出液的pH调低以稳定产物。
和酸脱酰化方法(例如室温下在含水溶剂中的三氟乙酸)不一样，本发明酶促方法可以用来将带有或不带有γ或δ羟基侧链的假粘蛋白或丁香霉素类似物脱酰化。因此，起始天然产物的范围扩展得非常大。例如，使用本发明方法可以将假粘蛋白A，A’，B，B’，C或C’脱酰化。而酸脱酰化方法只适用假粘蛋白A，A’和C。
合适的酶包括ECB脱酰酶和多链丝霉素酰基转移酶(从Wako纯化学品有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)可获得粗产品和纯化形式产品，如161-16081脂肪酰基转移酶，纯的，和164-16081脂肪酰基转移酶，粗产品)。可以从犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)获得ECB脱酰酶(例如参见LaVerne，D，等人，“通过犹他游动放线菌将棘白菌素B脱酰化”，抗生素杂志(J.ofAntibiotics)，42(3)，382-388(1989))。可以通过在这里引作参考的美国专利No.5573936中描述的方法纯化犹他游动放线菌ECB脱酰酶。人们也可以使用在变青链霉菌(Streptomyces lividans)中克隆并表达的酶。用PenG酰胺酶和邻苯二甲酰酰胺酶将假粘蛋白A脱酰化的尝试没有成功。
使用标准脱酰方法完成酶促脱酰这一点对于本领域技术人员是公知的。例如，使用多链丝霉素酰基转移酶的一般方法可以参见Yasuda，N，等人，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)53，3245(1989)和Kimura，Y.，等人，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)53，497(1989)。
脱酰化方法一般在大约20℃和大约60℃，优选大约室温(25℃)和大约40℃之间的温度下进行。更高温度可能促进重排产物(化合物II)的生成。在pH8.0和在大约50℃和大约60℃之间的温度下酶是最佳活性的。尽管在更高pH和更高温度下反应更快，但是在更高pH下可能会发现更多的重排产物。因此，反应的pH一般保持在大约5.5和大约8.0之间。反应时间将随着pH和温度的不同而不同。但是，在高温和高pH值下，用限定的酶浓度和饱和的底物浓度，反应时间达10分钟。因为假粘蛋白A在较高pH下不稳定，所以假粘蛋白A的脱酰作用一般在较低pH(大约5.0和6.0之间)和温度(大约25℃)下进行。例如在含有0.05M KPO4和0.8M KCl的缓冲液中可以进行假粘蛋白A的脱酰作用。底物的饱和水平一般在每毫升反应大约0.5毫克和大约1毫克之间。
如上文所讨论的，假粘蛋白是从丁香假单孢菌分离出来的天然产物，其已经表征为含有内酯键封闭的环肽部分并且包括非常见氨基酸4-氯苏氨酸(ClThr)，3-羟基天冬氨酸(HOAsp)，2，3-脱氢-2-氨基丁酸(Dhb)和2，4-二氨基丁酸(Dab)的脂缩肽(lipodepsinonapeptides)。培养丁香假单孢菌各菌株产生不同的假粘蛋白类似物(A，A’，B，B’，C和C’)的方法在下文中作一般性描述，并且更详细地描述于这里引作参考的2000年4月14日Hilton等人申请的PCT专利申请登记号No.PCT/US00/08728，发明名称是“用丁香假单孢菌生产假粘蛋白”，这里引作参考的2000年4月14日Kulanthaivel等人申请的PCT专利申请登记号No.PCT/US00/08727，发明名称是“假粘蛋白天然产物”，和各自这里引作参考的美国专利No.5576298和No.5837685之中。
生产一种或多种假粘蛋白的丁香假单孢菌的分离的菌株是本领域公知的。野生型菌株MSU174和通过转座子诱变产生的该菌株的突变株MSU 16H描述于美国专利No.5576298和5837685中；HarriSon，L.等人，“假粘蛋白，来自丁香假单孢菌的具有广谱抗真菌活性的一族新的肽家族”，遗传微生物学杂志(J.Gen.Microbiology)137，2857-65(1991)；和Lamb等人，“荧光假单孢菌的转座子诱变和标记：抗真菌剂生产对于防治荷兰榆木病是必需的”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84，6447-6451(1987)。
适合生产一种或多种假粘蛋白的丁香假单孢菌菌株可以从环境的来源包括植物(例如大麦植物，柑橘植物和丁香植物)以及象土壤，水，空气和灰尘这样的来源分离到。优选的菌株从植物分离。从环境来源分离到的丁香假单孢菌菌株可以称之为野生型。本文使用的“野生型”指在丁香假单孢菌的正常种群中天然存在的优势基因型(例如自然中发现的而不是实验室制备的丁香假单孢菌菌株或分离物)。象大多数生物一样，使用的产生假粘蛋白的培养物(丁香假单孢菌菌株例如MSU174，MSU 16H，MSU206，25-B1，7H9-1)的特征不同。因此，通过本领域公知的方法可以获得这些菌株的子代(例如重组体，突变株和变种)。
丁香假单孢菌的突变株也适合生产一种或多种假粘蛋白。本文使用的“突变株”指菌株表型中突发的可遗传的变化，其可以自发发生或者通过已知的诱变剂诱导，例如照射(例如紫外照射或X-射线)，化学诱变剂(例如甲磺酸乙酯(EMS)，二环氧辛烷，N-甲基-N-硝基-N’-亚硝基鸟嘌呤(NTG)，和亚硝酸)，点特异性诱变，和转座子介导的诱变，通过用有效产生超量生产一种或多种假粘蛋白即超过其它假粘蛋白过量生产一种假粘蛋白(例如假粘蛋白B)或者在有利的生长条件下生产一种或多种假粘蛋白的突变株的诱变剂的量处理细菌可以产生丁香假单孢菌的生产假粘蛋白的突变株。尽管要使用的诱变剂的类型和量可以不同，但是优选的方法是将NTG系列稀释至1-100微克/毫升范围的水平。优选的突变株是过量生产假粘蛋白B并且在基本确定成分培养基中生长的那些突变株。
可以针对丁香假单孢菌的环境分离物，突变株，和其它期望的菌株选择期望性状的生长习性，生长培养基营养源，碳源，生长条件，氨基酸要求等等。优选地，对丁香假单孢菌的生产假粘蛋白的菌株选择在基本确定成分培养基例如N21培养基中生长和/或以高于大约10微克/毫升的水平生产一种或多种假粘蛋白。优选的菌株表现出当在包括三种或更少氨基酸和任选地或者一种脂质，马铃薯产物或者其组合的培养基上生长时生产一种或多种假粘蛋白的特性。
使用本领域公知的方法通过转化丁香假单孢菌菌株可以产生重组体菌株。通过使用重组DNA技术，可以将丁香假单孢菌菌株转化以表达除了这些菌株产生的抗生素以外的各种基因产物。例如，人们可以修饰菌株以导入内源假粘蛋白生物合成基因的多个拷贝以实现更大的假粘蛋白产率。
为了从野生型丁香假单孢菌或丁香假单孢菌突变株生产一种或多种假粘蛋白，在包括有效量的三种或更少氨基酸，优选谷氨酸，甘氨酸，组氨酸或其组合的含水营养培养基中振荡下培养微生物。或者将甘氨酸与一种或多种马铃薯产物和脂质混合。在对丁香假单孢菌的生长和生产期望的一种或多种假粘蛋白有效的条件下进行培养。有效条件包括大约22℃至大约27℃的温度和大约36小时至大约96小时的培养时间。在培养丁香假单孢菌期间控制培养基中氧的浓度对于产生假粘蛋白是有利的。优选地，氧的水平保持在大约5％至50％饱和，更优选大约30％饱和。通入空气，纯氧气或含有氧气的气体混合物可以调节培养基中氧的浓度。
培养丁香假单孢菌期间控制培养基的pH也是有利的。在碱性pH下假粘蛋白不稳定，如果培养基的pH高于大约6保持超过大约12小时则发生明显降解。优选地，培养基的pH保持在6和4之间。当分批培养时，丁香假单孢菌可以产生一种或多种假粘蛋白。然而葡萄糖和任选地酸或碱(例如羟铵)的分批补料或者半连续进料来控制pH提高生产率。通过利用其中葡萄糖和羟铵自动进料的连续培养方法能进一步提高假粘蛋白生产率。
丁香假单孢菌的选择能影响产生的一种或多种假粘蛋白的量和分布。例如，MSU 16H和67 H1菌株各自优势产生假粘蛋白A，但是也产生假粘蛋白B和C，一般比例为4∶2∶1。与MSU 16H菌株生产的假粘蛋白水平相比，67 H1菌株一般产生高大约3-5倍的假粘蛋白水平。与MSU 16H和67 H1菌株相比，25-B1菌株产生更多的假粘蛋白B和更少的假粘蛋白C。不同的是7H9-1菌株优势产生假粘蛋白B并且比其它菌株生产更大量的假粘蛋白B。例如，该菌株能生产的假粘蛋白B至少超过假粘蛋白A或C的10倍。
如上文讨论的，这里描述的方法也用于将丁香霉素化合物脱酰化。可以分别从丁香假单孢菌丁香变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)菌株B301D，PS268，和SY12的培养物产生丁香霉素E，丁香霉素B，和丁香霉素A。也可以从丁香假单孢菌丁香变种分离丁香霉素A1和G。根据Zhang，L.，和J.Y.Takemoto，“丁香假单孢菌植物毒素丁香霉素对Rhodotorula pilimanae的质膜功能的影响”，植物病理学(Phytopathol.)77(2)：297-303(1987)的描述在马铃薯葡萄糖培养液中培养B301D和PS268菌株。在补加有100M对苯二酚葡糖苷(Sigma Chemical Co.，A4256；St.Louis，Mo.)和0.1％果糖(SRMAF)(19，23)的丁香霉素基本培养基中培养SY12菌株。如先前Bidwai，A.P.，和J.Y.Takemoto，“细菌植物毒素，丁香霉素，诱导红萝卜质膜多肽的蛋白质激酶-介导的磷酸化作用”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84，6755-6759(1987)所述通过高效液相色谱纯化SR-E，ST-B和SS-A。含有35％脱氧胆酸钠(Sigma ChemicalCo.，AP528；St.Louis，Mo.)和酮康唑(Sigma Chemical Co.，K-1003；St.Louis，Mo.)的溶解的AmB被用作试验标准物。在这里引作参考的美国专利No.5830855中可以看到有关三种环脂缩肽丁香霉素E，丁香假单胞菌素B和Syringostatin A的产生和分离的详细描述。
假粘蛋白或丁香霉素环状化合物或相应的重排化合物(化合物II和IV)可以被分离并且以其本身或者以其药学可接受盐或溶剂合物形式使用。术语“药学可接受盐”指从无机酸和有机酸衍生的与无毒酸加成盐。合适的盐衍生物包括卤化物，硫氰酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，亚硫酸盐，亚硫酸氢盐，芳基磺酸盐，烷基磺酸盐，膦酸盐，磷酸一氢盐，磷酸二氢盐，偏磷酸盐，焦磷酸盐，链烷酸盐，环烷基链烷酸盐，芳基链烷酸盐，己二酸盐，藻酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，富马酸盐，葡庚酸盐，甘油磷酸盐，乳酸盐，马来酸盐，烟酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，果胶酯酸盐，苦味酸盐，新戊酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，二葡糖酸盐，三氟乙酸盐等等。
术语“溶剂化物”指包括一个或多个溶质分子(即假粘蛋白和丁香霉素化合物)和一个或多个药学溶剂分子例如水，乙醇等等的聚集体。当溶剂是水时，聚集体称之为水合物。通常通过在加热下将环状化合物或重排化合物(化合物II或IV)溶解于合适的溶剂中并且缓慢冷却产生非晶形或结晶溶剂合物形式而产生溶剂化物。
实施例
生物样品
从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，Parklawn Drive，Rockville，MD，USA公开获得丁香假单孢菌MSU 16H，保藏号No.ATCC 67028。丁香假单孢菌菌株25-B1，7H9-1和67 H1于2000年3月23日保藏在美国典型培养物保藏中心，登记的保藏号如下：25-B1 保藏号No.PTA-16227H9-1 保藏号No.PTA-1 62367 H1 保藏号No.PTA-1621
化合物缩写
实施例中使用下面的缩写代表各所列出的材料：
ACN-乙腈
TFA-三氟乙酸
DMF-二甲基甲酰胺
实施例1
该实施例举例描述使用ECB脱酰酶对假粘蛋白A的脱酰作用。
在含有0.05M磷酸钾和0.8M氯化钾的缓冲水溶液900微升中加入假粘蛋白A(50微克)和纯化的ECB脱酰酶(50微升)。pH保持6.0至8.0。温度从25℃提高到40℃。通过HPLC监测反应(Waters C18μBondapak 3.9X300毫米柱，235nm，1％乙腈/0.2％三氟乙酸(4分钟)至60％乙腈/0.2％三氟乙酸(16分钟))。发现假粘蛋白胺环状化合物(化合物I)和重排的假粘蛋白羟基环状化合物(化合物II)。
在电雾化电离质谱(ESIMS)中化合物I和II都表现出相同的M+H离子(m/z981.3)，相应于分子式C37H61CIN12O17(参见下面表I)。1H和TOCSY(全相关光谱学)NMR光谱的详细分析能排布水解产物的所有的质子，这支持结构I和II。I的丝氨酸残基的β-质子的1H NMR化学位移(4.83和4.46ppm)与在假粘蛋白A，B和C中发现的那些一致，表明肽大环是完整的。此外，正如所预期的，TOCSY谱没有证明典型的酰胺质子作为丝氨酸自旋体系的一部分。另一方面，在II中，丝氨酸β-质子大大移向高磁场位移(3.78和3.74ppm)，提示这些质子不具有内酯官能度。这一点以及在TOCSY谱中，除了α质子以外，β-质子与酰胺质子相关，处于8.04ppm，表明大环内酯重排为II所示的肽核心。
表I
H2O+CD3CN中I和II的1H NMR数据a 氨基酸 位置 I II Ser NH - 8.04 α 4.30 4.30 β1 4.83 3.78 β2 4.46 3.74 Dab-1D NH 9.19 7.99 α 4.06 4.19 β1 2.03 2.15 β2 2.01 γ1 3.03 2.92 γ2 2.96 Asp NH 8.51 8.20 α 4.61 4.56 β1 2.89 2.84 β2 2.83 2.75 Lys NH 7.90 8.11 α 4.23 4.06 β1 1.79 1.76 β2 1.71 1.68 γ1 1.27 1.30 γ2 1.25 δ 1.54 1.54 ε 2.84 2.84 NH2 7.34 7.34 Dab-2D NH 8.35 8.31 α 4.29 4.34 β1 2.14 2.09 β2 1.98 1.91 γ 2.90 2.92 NH2 7.53 7.49 Thr NH 7.73 7.74 α 4.24 4.21 β 3.98 3.98 γ 1.18 1.16
表I(续) 氨基酸 位置 I II Dhb NH 9.65 9.26 β 6.69 6.62 γ 1.69 1.66 OHAsp NH 7.82 7.83 α 4.95 4.99 β 4.72 4.75 ClThr NH 7.92 7.95 α 4.90 4.62 β 4.27 4.25 γ1 3.48 3.57 γ2 3.42 3.51
a相对于溶剂信号(1.94ppm)报道的化学位移。
b排布可以内部变化。
使用上述相同的一般方法可以将具有N-酰基的其它假粘蛋白或丁香霉素化合物脱酰化。