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1、10申请公布号CN101990984A43申请公布日20110330CN101990984ACN101990984A21申请号200910169666922申请日20090831CICC4018820071213A23K1/00200601A23K1/1420060171申请人中国农业科学院饲料研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号72发明人王建华滕达高美云杨雅麟田子罡54发明名称一种高抗氧化低致敏性饲用发酵豆粕的制备方法57摘要本发明涉及生物发酵技术领域，以豆粕和麸皮为原料，利用微生物发酵技术有效去除豆粕中的大豆抗营养因子，同时得到富含分子量低于15KDA的多肽的优质发酵豆粕，。
2、尤其是一种固态发酵的制备高抗氧化低致敏性豆粕的微生物发酵工艺。原始出发菌株米曲霉ASPERGILLUSORYZAE，CICC401881株经过活化，扩大培养后，用含有012土温TWEEN80的无菌水制备孢子数目为106/ML的孢子悬浮液，作为豆粕发酵接种液。以10的接种量接种到豆粕发酵基料中豆粕粉碎过20目，豆粕麸皮31，料水比109，混合均匀，于28发酵48H。于60烘干，对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN101990984A1/1页21一种饲用高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法，。
3、其步骤为A原始出发菌株米曲霉经过马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基活化，28，静止培养60H，作为活化孢子。B挑取活化孢子一环划线接种马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，28，静止培养48H后，用含有012TWEEN80的无菌水制备孢子数目为106/ML的孢子悬浮液，作为豆粕发酵接种液。C将B中的豆粕发酵接种液以10的接种量接种到豆粕发酵基料中豆粕粉碎过20目，豆粕麸皮31，料水比109。，混合均匀，于28发酵48H。于60烘干，对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。2根据权利要求1所述的高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法，其步骤A所述的活化孢子和培养孢子的马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，将去皮马铃薯200G，切成小块。
4、，加入到装有700ML双蒸水的烧杯中，沸水煮30MIN，两层纱布过滤，定容至1L，加入20G葡萄糖和20G琼脂，加热溶解后，分装到试管中，蒸汽灭菌121，20MIN。3根据权利要求1所述的高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法，其步骤A所述的菌种为米曲霉ASPERGILLUSORYZAE，CICC401881株。4根据权利要求1所述的高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法，其步骤B所述的悬浮孢子制备液为含有012TWEEN80的无菌水。权利要求书CN101990984A1/4页3一种高抗氧化低致敏性饲用发酵豆粕的制备方法一技术领域0001本发明涉及生物发酵技术领域，以豆粕和麸皮为原料，利用微生物发酵技术有。
5、效去除豆粕中的大豆抗营养因子，同时得到富含分子量低于15KDA的多肽的优质发酵豆粕，尤其是一种固态发酵的制备高抗氧化低致敏性豆粕的微生物发酵工艺。二背景技术0002我国是世界上最大的养殖生产国之一，同时也是世界上饲料原料特别是蛋白质原料的需求大国。饲料粮主要是玉米原料再加鱼粉、豆粕及各种微量元素配制而成。占饲料比重很大的蛋白质、能量饲料接近或超过70。我国饲料工业生产中蛋白质饲料资源的严重不足已成为事实，对国际原料市场有很深的依赖性，已使我国配合饲料的生产成本居高不下，价格波动使生产企业处于亏损的边缘，抑制了饲料工业发展。饲料蛋白作为是制约中国畜牧业发展的第一大权重因子，主控权受制于国外，因此。
6、饲料蛋白成为我国畜牧业发展的第一大原料供给瓶颈和食物供给安全瓶颈，具有重要的国计民生和国民经济意义，更具有重要的国家安全意义。由于动物源蛋白资源日益短缺，价格居高不下，使得植物性蛋白饲料在动物饲料中的应用逐渐增加，其中豆粕是用量最大，也是最重要的一类植物性蛋白质饲料。0003发酵豆粕指是通过现代生物发酵技术对原料豆粕进行发酵处理后的产物。发酵过程中可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶等多种酶活，消除抗营养因子，消解大豆抗原蛋白实现大豆生物脱敏，把大分子量的大豆蛋白质分解为多肽、寡肽、甚至小肽，从而增加水溶性，提高消化率，利于动物消化吸收。纤维类物质分解为糖，部分糖被转化为乳酸，并产生大量有益微生物，使豆。
7、粕转化成高营养价值的功能性饲料。可作为断奶仔猪、幼禽，尤其是高档经济动物的优良蛋白质来源。饲料原料和全价饲料的氧化可使自身的饲喂价值显著降低。最终的结果是营养成分的质量降低、动物的健康受损、动物的性能降低以及生产成本增高。0004本发明技术主要针对上述的提供豆粕营养价值的关键问题，通过研究米曲霉固体发酵的工艺参数，最终获得一种饲用高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法。为解决优质饲料蛋白资源紧缺特别是为幼龄动物提供优良蛋白原料和发酵豆粕饲料产品的抗氧化稳定性提供了技术支撑。三发明内容0005本发明的目的在于通过米曲霉固态生物发酵，提供一种具有高抗氧化低致敏性发酵豆粕的制备方法，促进豆粕在幼龄动物饲喂。
8、中的应用，解决优质蛋白饲料资源的紧缺问题。0006本发明的目的通过以下技术方案予以实现。0007本发明提供的一种饲用高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法，其步骤如下0008A原始出发菌株米曲霉经过马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基活化，28，静止培养60H，作为活化孢子。说明书CN101990984A2/4页40009B挑取活化孢子一环划线接种马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，28，静止培养48H后，用含有012吐温TWEEN80的无菌水制备孢子数目为106/ML的孢子悬浮液，作为豆粕发酵接种液。0010C将B中的豆粕发酵接种液以10的接种量接种到豆粕发酵基料中豆粕粉碎过20目，豆粕麸皮31，料水比109。，混。
9、合均匀，于28发酵48H。于60烘干，对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。0011本发明步骤A中所述的活化孢子的马铃薯葡萄糖琼脂培养基按照马铃薯200G提取液1I，葡萄糖20克，琼脂20克。0012本发明步骤A中所述的菌种为米曲霉ASPERGILLUSORYZAE1株，该菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏中心CICC40188。本发明步骤B中所述的制备豆粕发酵接种液的培养基配方与步骤A相同。0013本发明具有以下有益效果0014与其他化学和物理方法比较，本发明所用的微生物发酵法具有对饲料营养成分的影响与破坏较小。同时大大提高了豆粕的营养品质。豆粕发酵后，蛋白溶解度增加，大分子蛋白质被明显降解，通过。
10、专用软件GLYKOBANDSCANVERSION50针对豆粕发酵前后的蛋白的磷酸缓冲液抽提液PBS，PH74KH2PO4024G/L，NA2HPO4144G/L，NACL80G/L，KCL02G/L的十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳SDSPAGE条带浓度分析表明，分子量大于45KDA的蛋白质在未发酵豆粕中占40，发酵豆粕中为8；分子量介于15KDA和45KDA之间的蛋白质在未发酵豆粕中占55，发酵豆粕中为57；分子量小于15KDA的蛋白质在未发酵豆粕中仅占5，发酵豆粕中提高为35胰蛋白酶抑制剂含量由发酵前3508MG/G降至发酵后0655MG/G；发酵后水解度为2172；从表3和图1可以看出发。
11、酵豆粕中主要的抗原蛋白如伴球蛋白亚基分子量为5776KDA和大豆球蛋白的5个亚基分子量均大于58KDA都得到有效地降解，从而可以降低其抗原性。尤其是抗氧化活性的提高方面，发酵后豆粕质量浓度为8MG/ML时，对二苯代苦味肼基自由基DPPH的清除率达到55，为相同浓度未发酵豆粕的236倍。附图说明0015图1豆粕发酵前后的SDSPAGE蛋白质电泳图谱0016下面结合附图对本发明做进一步说明。0017图1为豆粕发酵前后的SDSPAGE蛋白质电泳图谱，其中泳道1为蛋白质分子量标准，从上至下依次为940KDA，662KDA，450KDA，350KDA，285KDA，200KDA，144KDA；泳道2为未。
12、发酵豆粕样品；泳道3和4为发酵豆粕样品。四具体实施方式0018本发明提供的一种饲用高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法的具体实施方式如下0019本实施例所用的菌株为米曲霉ASPERGILLUSORYZAE，保藏于中国工业微生物菌种保藏中心CICC40188。0020A去皮马铃薯200G，切成小块，加入到装有700ML双蒸水的烧杯中，沸水煮30MIN，说明书CN101990984A3/4页5两层纱布过滤，定容至1L，加入20G葡萄糖和20G琼脂，加热溶解后，分装到试管中，蒸汽灭菌121，20MIN，制成活化孢子和培养孢子的马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基。0021B原始出发菌株米曲霉经过马铃薯葡萄糖琼脂斜。
13、面培养基活化，28，静止培养60H，作为活化孢子。0022C挑取活化孢子一环划线接种马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，28，静止培养48H后，用含有012TWEEN80的无菌水制备孢子数目为106/ML的孢子悬浮液，作为豆粕发酵接种液。D豆粕发酵接种液以10的接种量接种到豆粕发酵基料中豆粕粉碎过20目，豆粕麸皮31，料水比109。，混合均匀，于28发酵48H，于60烘干0023E对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。0024经上述实例中微生物发酵法制备的高抗氧化低致敏性豆粕与未发酵豆粕相比，营养特性得到明显改善。豆粕发酵后，蛋白溶解度增加，大分子蛋白质被明显降解，通过专用软件GLYKOBANDSCANV。
14、ERSION50针对豆粕发酵前后的蛋白的PBS抽提液PBSPH74KH2PO4024G/L，NA2HPO4144G/L，NACL80G/L，KCL02G/L的SDSPAGE电泳条带图1浓度分析表明，分子量大于45KDA的蛋白质在未发酵豆粕中占40，发酵豆粕中为8；分子量介于15KDA和45KDA之间的蛋白质在未发酵豆粕中占55，发酵豆粕中为57；分子量小于15KDA的蛋白质在未发酵豆粕中仅占5，发酵豆粕中提高为35表3胰蛋白酶抑制剂含量由发酵前3508MG/G降至发酵后0655MG/G；发酵后水解度为2172；豆粕中主要的抗原蛋白如伴球蛋白亚基分子量为5776KDA和大豆球蛋白的5个亚基分子量均大于58KDA都得到有效地降解表3和图1，从而可以降低其抗原性。尤其是抗氧化活性的提高方面，发酵后豆粕质量浓度为8MG/ML时，对DPPH的清除率达到55，为相同浓度未发酵豆粕的236倍。通过米曲霉固态发酵豆粕，营养价值得到大大提高，其效果如下0025表1豆粕发酵前后成分的比较00260027表2不同豆粕添加量对抗氧化活性的影响说明书CN101990984A4/4页600280029表3豆粕发酵前后的蛋白分子量分配比例00300031，/_CK处理值对照值100/对照值说明书CN101990984A1/1页7图1说明书附图。