一种食用保健原料缬草液的制备方法及其应用.pdf

本发明涉及一种食用原料缬草液的制备方法及其应用。按重量/体积比在缬草原料中加入4倍量的体积比浓度为70％的乙醇提取2小时，过滤，残渣按照上述方法重复提取一次后，弃去药渣，收集并合并滤液，然后加入水调节乙醇的浓度至含醇量为45％，静置24小时，再次过滤并弃去滤饼，滤液减压浓缩至为缬草原料重量的10倍体积即得食用缬草液。采用上述方法提取出的缬草液可以单独做为一种食用原料，也可以和其他辅料混合成食用原料，制备为经口食用的产品。本发明制备工艺简捷，成本低，产品纯度高，无毒副作用，为一种经口食用的纯天然保健品，对改善人体睡眠，使人快速的产生睡意具有十分有效的作用。

1、  一种食用保健原料缬草液的制备方法，其特征在于：按重量/体积比在缬草原料中加入4倍量的体积比浓度为70％的乙醇提取2小时，过滤，残渣按照上述方法重复提取一次后，弃去药渣，收集并合并滤液，然后加入水调节乙醇的浓度至含醇量为45％，静置24小时，再次过滤并弃去滤饼，滤液减压浓缩至为缬草原料重量的10倍体积即得食用缬草液。

2、  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在所述缬草液中加入为缬草原料重量1％～10％的防腐剂，制备为经口食用的产品。

3、  如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在以100克缬草原料为计算单位提取出来的1000毫升缬草液中加入5克防腐剂，制备为经口食用的产品。

4、  如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述防腐剂包括苯甲酸钠、苯甲酸、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙、丙酸钠、对羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸或双乙酸钠。

5、  一种如权利要求1所制备的缬草液的应用，其特征在于：该缬草液单独做为一种食用原料，或者与其他辅料混合成食用原料制备成经口食用的产品，。

6、  如权利要求4所述缬草液的应用，其特征在于：所述其他辅料包括水、淀粉、蔗糖、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁、微晶纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羧甲基淀粉钠。

一种食用保健原料缬草液的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种食用保健原料的制备方法，特别是一种食用保健原料缬草液的制备方法及其应用。
背景技术
缬草为败酱科缬草属，全世界共有200多个品种，主要生长在气候温和和潮湿的地区，我国大约有30多个品种，主要分布在西南和东北地区。
缬草主要利用其根及根茎，缬草根及根茎中主要含有缬草素类，乙酰氧基缬草素、缬草素、异缬草素、二乙酰基缬草素、高缬草素1、高缬草素2、羟基缬草素、千里光缬草素、二氢缬草素、缬草素醇B1-B8、氯化缬草素等多种成分。
缬草在古罗马时代就被当作一种香料使用，古罗马人经常将其泡在水中饮用，在我国民间也有作茶饮用的历史。另外，缬草提取物中所含的挥发油或液体物质，口服后还具有镇静、安眠、抗惊厥、抗抑郁、扩张冠状血管、降血压、调节血脂、抗心率失常、改善心肌微循环、抗氧化、抗疲劳、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食用保健原料缬草液的制备方法及其应用。经该方法制得的产品对人体睡眠有良好的改善作用，能使人快速的产生睡意。
为实现上述发明目的，本发明采用的具体技术方案如下：
一种食用保健原料缬草液的制备方法，其特征在于：按重量(g)/体积(ml)比在缬草原料中加入4倍量的体积比浓度为70％的乙醇提取2小时，过滤，残渣按照上述方法重复提取一次后，弃去药渣，收集并合并滤液，然后加入水调节乙醇的浓度至含醇量为45％，静置24小时，再次过滤并弃去滤饼，滤液减压浓缩至为缬草原料重量(g)的10倍体积(ml)即得食用缬草液。
采用上述方法提取出的缬草液可以单独做为一种食用原料，制备成经口食用的产品，也可以和其他辅料混合成食用原料，制备为经口食用的产品。
本发明所述的食用缬草液的制备方法还包括：向缬草液中加入药材重量1％～10％的防腐剂，例如向每100g药材提取出的缬草液中加入5克苯甲酸钠。所述的防腐剂还包括苯甲酸、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙、丙酸钠、对羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸或双乙酸钠。
本发明所述的缬草液的应用包括：
1、以单一的缬草液为原料制备为经口食用的产品。
2、以缬草液为主要原料，外加其他辅助原料如水、淀粉、蔗糖、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁、微晶纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羧甲基淀粉钠混合制备为经口食用的产品。
安全性毒理学试验
本发明所述的缬草液经四川省疾病预防控制中心的安全性毒理学评价试验，评价报告如下：
缬草液安全性毒理学评价实验报告
1.材料和方法
1.1样品：由四川科伦新光医药有限公司提供的缬草液，样品为褐绿色液体。成人每日推荐量为10ml/60kg.bw。厂家提供2倍浓缩液，比重为1.07。
1.2实验动物：昆明种小鼠和SD大鼠由四川省医学科学院实验动物研究所和四川省中药研究所实验动物中心提供。动物批准证号：SCXK(川)2004-16SPF级、SCXK(川)2005-19SPF级；实验动物房为SPF级，实验许可证号为川实动管043，温度20-25℃，相对湿度40％-70％。
1.3主要仪器与试剂
1.3.1主要仪器：CX4型全自动生化分析仪、METILER电子天平、OLYMPUS BH-2型显微镜、解剖器械、血球分析仪、超净工作台。
1.3.2主要试剂：生化试剂盒、环磷酰胺、1，8-二羟基蒽醌、叠氮化钠、2-氨基芴、4-硝基喹啉-N氧化物、丝裂霉素C、S-9混合液。
1.4大小鼠急性毒性实验：分别采用昆明种小鼠SD大鼠各20只，雌雄各半，体重18-22g、180-220g，随机分成两组，每组10只。实验按最大耐受剂量法设21400mg/kg.bw，直接取2倍浓缩液，大小鼠均按20ml/kg.bw一次经口灌胃给予受试物。灌胃前动物禁食16h，不限饮水，观察7天内动物的中毒症状及及死亡情况，实验结束称体重后处死动物作大体解剖。
1.5遗传毒性实验：
1.5.1Ames实验：实验自制经多氯联苯(Aroclor 1254)诱导雄性大鼠肝S₉，按标准方法配制成S₉混合液后作为活化系统，用间接致突变物(20μg/皿2-氨基芴用于TA₉₇、TA₉₈、TA₁₀₀，50μg/皿1，8-二羟基蒽醌用于TA₁₀₂菌)测定S₉活性，每皿加S₉混合液的量为0.5ml。试验采用TA₉₇、TA₉₈、TA₁₀₀、TA₁₀₂四种菌株，受试物设8、40、200、1000、5000μg/皿五个剂量组及溶剂对照组(蒸馏水)、自发对照组和阳性对照组。首先配制受试物工作液：准确称取5.0g受试物(2倍浓缩液)，加蒸馏水至100ml混匀即为最高工作浓度50mg/ml，试验时取该工作液100μl加入平皿即为最高受试物终浓度(5000μg/皿)，以最高浓度为基础用蒸馏水5倍往下稀释即得以下浓度。在加和不加S₉的实验条件下进行平板掺入法试验。每组作三个平行皿，重复试验一次。-S₉阳性对照物：TA₉₇和TA₉₈用0.5μg/皿的4-硝基喹啉-N-氧化物；TA₁₀₀用1.5μg/皿的叠氮化钠(NaN₃)；TA₁₀₂用1.0μg/皿的丝裂霉素C(MMC)；+S₉阳性对照物TA₁₀₂用50μg/皿的1，8-二羟基蒽醌，其余三个菌株采用20μg/皿的2-氨基芴(2-AF)。每皿加入阳性对照的体积为0.1ml。
1.5.2小鼠骨髓多染红细胞微核试验：采用昆明种小鼠50只，体重25-30g，雌雄各半，试验设2500mg/kg.bw、5000mg/kg.bw、10000mg/kg.bw三个剂量组，另设溶剂(蒸馏水)阴性对照及环磷酰胺阳性对照组(CP，40mg/kg.bw).称取2.5g、5.0g、10.0g受试物(2倍浓缩液)以及0.04gCP，然后分别加蒸馏水至20ml混匀即可。灌胃体积按20mg/kg.bw，试验采用30h两次灌胃法，两次间隔24h，于第二次给受试物后6h脱颈椎处死动物，取胸骨髓按《食品安全毒理学评价程序和方法》(GB15193-2003)中规定进行制片，固定，Giemsa染色后，在油镜下每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞(PCE)中含微核细胞数，计数微核的千分率。观察200个嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值(PCE/NCE)。
1.5.3小鼠精子畸形试验：采用雄性昆明小鼠25只，体重25-29g，将小鼠随机分为5组，每组5只动物，实验2500mg/kg.bw、5000mg/kg.bw、10000mg/kg.bw三个剂量组，另设溶剂(蒸馏水)阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组(CP，40mg/kg.bw)。称取2.5g、5g、10g受试物(2倍浓缩液)，加蒸馏水至20ml，另称取0.04g CP，加蒸馏水至20ml混匀即可。灌胃体积按20mg/kg.bw每日经口灌胃一次，连续灌胃5天，于首次给受试物后第35天，脱颈椎处死动物取双侧付睾进行制片，按《食品安全毒理学评价程序和方法》(GB15193-2003)中规定，甲醇固定，1％伊红染色后，在高倍镜下每只动物计数10000条完整精子，记录精子畸形、畸形类型及计算精子畸形率。
1.630天喂养试验：选用断乳鼠80只，雌雄各半，体重为60-90g，试验2.08ml/kg.bw、4.17ml/kg.bw、8.33ml/kg.bw三个剂量组(分别相当于人体推荐摄入量的25、50、100倍)，另设阴性对照组，每组20只大鼠，雌雄各半。试验采用灌胃法，量取52.0m、104.3ml、208.3ml2倍浓缩液，分别加蒸馏水至250ml，充分混匀，冷藏保存，用完再配。每天按10ml/kg.bw灌胃一次，连续30天，每天观察动物的一般表现、行为、中毒症状及死亡，每周计算两次进食量，并称一次体重，根据食物摄入量，计算食物利用率，试验结束时经股动脉放血后处死动物，采血用常规方法测定血液学指标，用美国贝克曼库尔特有限公司生产的CX4型全自动生化分析仪及广州标佳科技有限公司提供的试剂盒，测定血生化指标，解剖动物观察内脏改变，称肝、肾、脾、睾丸重，测定其脏体比，取肝、肾、脾、胃肠、睾丸(卵巢)作组织病理学检查。试验期间动物自由进食、饮水。
1.7传统致畸试验：采用健康性成熟未交配过的SD大鼠，雌鼠70只，雄鼠40只，体重200-300g，雌雄鼠按1∶1同笼交配，以查见阴栓的当天为妊娠0天，次日为第一天，将查见阴栓的雌鼠随机分成四组，每组12只，设2.08ml/kg.bw、4.17ml/kg.bw、8.33ml/kg.bw三个剂量组，另设一个蒸馏水阴性对照组，量取52.0ml、104.3ml、208.3ml2倍浓缩液，分别加蒸馏水至250ml，充分混匀，冷藏保存，用完再配。于妊娠第7-16天，按10ml/kg.bw每天经口灌胃一次，分别与零天、第七天、第十二天、第十六天、第二十天，称一次体重，调整灌胃量，于妊娠第20天称重后经股动脉放血处死动物，剖腹取出子宫，记录总着床数、活胎数、死胎数、吸收胎数和黄体数，称子宫连活胎总重、活胎重、卵巢重、胎盘重并量胎鼠身长，逐个检查胎鼠的外观，将1/2胎鼠放入鲍音氏液中固定两周检查内脏，其余胎鼠去内脏后按《食品安全毒理学评价程序和方法》(GB15193-2003)中规定，经固定、染色、透明后检查骨骼。
1.8试验数据统计：小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验采用卡方检验，小鼠精子畸形试验采用秩和检验，30天喂养试验经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值小于0.05，则用Dunnett法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如P值小于0.05，则用Dunnett’s T3法进行两两比较，致畸试验中孕鼠增重用方差分析，胎鼠身长、体重、窝平均胎数、子宫连重量用t检验，上述统计均用SPSS11.0for Windows软件处理。
2、结果
2.1急性毒性试验：给受试物后大小鼠的一般表现和行为均未见异常，观察期内未见动物死亡(表1)，缬草液对大小鼠急性经口MTD均大于21400mg/kg.bw，按急性分级属无毒级。
表1缬草液对大小鼠急性经口毒性试验结果

2.2遗传毒性试验
2.2.1Ames试验：由表2、表3中可见无论在加和不加S₉条件下，受试物各剂量组的平均回变菌落数均未超过溶剂对照组二倍，而阳性对照组的平均回变菌落数均超过溶剂对照二倍以上，呈现明显阳性反应，上述结果表明该受试物未诱导四种菌株回变菌落数增加。
表2缬草液Ames试验结果(第一次)

注：以上结果为3个平皿的均值±标准差。
表3缬草液Ames试验结果(第二次)

注：以上结果为3个平皿的均值±标准差
2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：结果见表4，受试物三个剂量组的微核千分率与阴性对照组比较，经卡方检验，雌雄鼠的微核率均无显著性变异(p＞0.05)，而环磷酰胺阳性对照组则非常显著高于阴性对照组(p＜0.01)。结果未见受试物诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率增高。
表4缬草液微核试验结果

2.2.3小鼠精子畸形实验：受试物各剂量组与阴性对照组精子畸形率(表5)经秩和检验无显著性差异(P＞0.05)，而环磷酰胺阳性对照组则非常显著高于阴性对照组(P＜0.01)。精子畸形类型主要表现以下不定形、无钩为主。上诉结果表明受试物未诱发小鼠精子畸形率增高。
表5缬草液对小鼠精子畸形实验结果

2.3大鼠30天喂养试验
试验期间动物健康状况良好，体重持续增长，定时喂饲后各组动物均未出现中毒症状，也未见动物死亡。
2.3.1缬草液对大鼠体重的影响
由表6可见，三个剂量组雌雄大鼠的初始体重以及1-4周体重以及第30天的体重与对照组比较，经统计学检查，差异无显著性(P＞0.05)
表6缬草液对大鼠体重的影响

2.3.2缬草液对大鼠进食量的影响
由表7可见，三个剂量组雌雄大鼠的每周进食量与对照组相比较，经统计学检验，差异无显著性(P＞0.05)
表7缬草液对大鼠进食量的影响

2.3.3缬草液对大鼠食物利用率的影响
结果见表8，三个剂量组雌雄大鼠的每周食物利用率以及总食物利用率与对照组比较，经统计学检验无显著性差异(P＞0.05)
表8缬草液对大鼠食物利用率的影响(X±S)

2.3.3血液学检查结果
由表9可见，三个剂量组雌雄大鼠的血液学指标与对照组相比，经统计学检验无明显差异(P＞0.05)。所测值仍在本室历史正常范围内。
表9缬草液对大鼠血液学指标的影响(X±S)

2.3.4末期生化检验结果
由表10可见，雄鼠低、高剂量组尿素氮和肌酐明显高于对照组，经统计学检验有显著性差异(P＜0.05、P＜0.05)，雄鼠三个剂量组总蛋白和白蛋白也都明显高于对照组，经统计学检验有显著性差异(P＜0.05、P＜0.05)，其他各剂量组雌雄大鼠的生化检测项目，与对照组比较，经统计学检验，差异无显著性(P＞0.05)。所测值仍在本室正常值范围内。
表10缬草液对大鼠末期生化检测结果(X±S)

续表10缬草液对大鼠末期生化检测结果(X±S)

2.3.5缬草液对大鼠脏体比的影响
结果见表11，三个剂量组雌雄的肝体比、脾体比、肾体比值以及雄鼠的睾体比值与对照组比较，经统计学检验，差异均无显著性(P＞0.05)
表11缬草液对大鼠脏体比的影响(X±S)

续表11缬草液对大鼠脏体比的影响(X±S)

2.3.6病理学检查
试验结束后处死动物，进行大体解剖，肉眼未见异常改变。组织病理学检查结果显示：对照组有1例肝组织局灶性轻度炎细胞侵润外，其余受检组织形态结构正常；受试物高剂量组有1例肾间质区轻度炎细胞侵润外，其余受检组织形态结构正常。以上所发现均为动物自发病变，未见受试物高剂量组引起动物中毒性损伤改变(见表12-18)。
表12肝脏的组织学观察

表13肾脏的组织学观察

表14脾脏的组织学观察

表15胃的组织学观察

表16空肠的组织学观察

表17睾丸的组织学观察

表18卵巢的组织学观察

2.4传统致畸实验
2.4.1缬草液对孕鼠体重的影响
见表19，各剂量组与对照组初始体重均衡(经方差分析，方差齐，P＞0.05)，第16天高剂量组体重与对照组比较增加有显著性(P＜0.01)，其他各剂量组孕鼠体重变化与阴性对照组比较，经方差分析无显著性差异(P＞0.05)。
表19缬草液对孕鼠体重的影响(X±s)

注：**表示与对照组相比，p＜0.01。
2.4.2缬草液对大鼠胎鼠的影响
见表20，三个剂量组的孕鼠平均活胎数、子宫连胎总重、胎仔平均体重、胎仔平均身长与阴性对照组比较，经t检验无显著性差异(p＞0.05)。
表20缬草液对大鼠胎鼠的影响(X±s)

2.4.3缬草液对胎鼠骨骼发育的影响
见表21，三个剂量组及阴性对照组的胎鼠骨骼检查，仅见胸骨骨化不全和缺失，未见肋骨、胸骨、椎骨等畸形。
表21缬草液对胎鼠骨骼的发育影响

2.4.4缬草液对大鼠内脏的影响
见表22，三个剂量组及阴性对照组共检查334只胎鼠，均未见内脏异常。
表22缬草液对胎鼠内脏的影响

3.小结
3.1缬草液对大小鼠急性经口毒性试验结果MTD＞21400mg/kg.bw，按急性毒性分级，属无毒级。
3.2三项遗传毒性试验(Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验以及小鼠精子畸形实验)结果未见靓金金牌缬草液致突变作用。
3.330天喂养实验，可见动物生长发育正常，体重持续增长，体态活泼，被毛光华柔顺，大、小便未见异常改变，实验期间未见动物出现中毒症状及死亡。对动物的体重、每周进食量、每周食物利用率及总食物利用率、脏体比值无明显影响；血液血常规检测结果与对照组比较无显著性差异(p＞0.05)，末期血生化指标检测结果见雄鼠低、高剂量组尿素氮和肌酐显著高于对照组(p＜0.05)，雄鼠三个剂量组的总蛋白和白蛋白均显著高于对照组(p＜0.01、p＜0.05)但所测值均在本室正常值范围内。组织病理学检查结果，除动物自发病变外，未见受试物高剂量组引起动物中毒性损伤改变。
3.4传统致畸实验，连续10天经口灌胃后，对孕鼠体重、胎鼠以及胎鼠骨骼发育均无明显影响，也未见胎鼠外观、内脏及骨骼畸形。结果未见受试物对孕鼠有母体毒性、胚胎毒性及致畸性)。
本发明制备工艺简捷，成本低，产品纯度高，无毒副作用，为一种经口食用的纯天然保健品，对改善人体睡眠，使人快速的产生睡意具有十分有效的作用。
具体实施方式
实施例1
取缬草1000克，置于回流提取罐中，加入乙醇水溶液(体积比：乙醇占70％，水占30％)4000ml，加热，回流提取2小时，采用滤布过滤，滤液备用；残渣按照上述方法重复提取一次，滤布过滤，弃去药渣，合并2次提取的提取液，加入适量饮用水，调节乙醇浓度达到45％，静置24小时，过滤，弃去滤饼，滤液减压浓缩至体积为1000ml，加入苯甲酸钠，即得缬草液。
实施例2
取缬草液1000m，加水5000ml，摇匀，过滤，灌装，分装，制备成经口食用的产品。
实施例3
取缬草液1000ml，加水50000ml，摇匀，过滤，灌装，分装，制备成经口食用的产品。
实施例4
取缬草液1000ml，加入淀粉2000g，混合均匀，制备成颗粒状、块状，经口食用。
实施例5
按重量/体积比在以100克缬草原料提取出来的1000毫升缬草液中加入5克苯甲酸钠得到经口食用的产品。
实施例6
按重量/体积比在以100克缬草原料提取出来的1000毫升缬草液中加入5克山梨酸得到经口食用的产品。