化合物WS727713.pdf

化合物WS727713
技术领域
本发明涉及一种用作药物或化妆品的新化合物、其制备方法以及含有该化合物的药物组合物。
背景技术
黑皮质素(MC)是一类肽类激素，它们来源于前激素原翻译后修饰的酶裂解过程。MC包括促黑激素(MSH)，如α-MSH、β-MSH和γ-MSH，以及促肾上腺皮质激素(ACTH)。这些MC通过膜MC受体(MC-Rs)来调节多种生理机能。已经克隆出5种MC-R(MC1-R、MC2-R、MC3-R、MC4-R和MC5-R)并对它们进行了表征。MC1-R(第一种被发现的α-MSH受体)在皮肤的黑色素细胞中表达，参与表皮黑色素的色素形成和动物显色。
最近发现MC1-R与疼痛和炎症有关，在炎症细胞，如嗜中性粒细胞或单核细胞中，MC1-R的mRNA表达。MC1-R可能介导α-MSH抑制单核细胞中一氧化氮的生成和嗜中性粒细胞的游走。有证据表明α-MSH分子能减轻人类炎症应答动物模型的炎症反应。α-MSH能减轻一般性刺激物诱导的鼠皮肤炎症。并且，α-MSH能抑制角叉菜胶诱导的鼠爪水肿。因此，MC1-R激动剂有望用作炎症反应的治疗药物。
发明内容
本发明涉及一种用作黑皮质素受体调节剂的新化合物、其制备方法以及含有该化合物的药物或化妆品组合物。
更具体地是，本发明涉及具有减轻炎症反应效果的黑皮质素受体激动剂化合物。
本发明的发明者还发现黑皮质素受体调节剂，如WS727713具有有效的抗炎作用。因此，黑皮质素受体调节剂，如WS727713可用作抗炎药物的活性组分以及与黑皮质素受体调节相关的疾病的治疗或预防药物，所述的相关疾病包括：缺血/再灌注损伤、脑部炎性疾病、肾脏炎性疾病、肝炎、脓毒血症/败血病性休克、缺氧性休克、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、风湿性关节炎(RA)、痛风性关节炎、主动脉反流(AR)、青少年慢性关节炎、骨关节炎、肾炎、诱导耐受、接触性过敏反应、肠炎(IBD)、性功能障碍、移植、疼痛、艾滋病、炎症后色素减退、花斑癣、特发性滴状色素减少症、发热、功能性肠疾病、肥胖、厌腻、糖尿病、皮肤外分泌腺调节、灰发(局限性灰发)、白发、胰腺炎、纤维变性疾病(肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、局限性硬皮病、系统性硬化、硬皮病性皮肤移植物抗宿主病、肝硬化、原发性和博来霉素诱导的肺纤维化以及环孢菌素诱导的肾病)、眼色素层炎(特别是氏综合征和结节病)、脉管炎、微生物感染、腹部疾病、外阴前庭炎综合征、黑素瘤侵袭、厌食等。
因此，本发明的一个目的是提供一种具有上述生物活性的化合物。
本发明的另一个目的是提供一种通过使假诺卡氏菌属(Pseudoncardia)的WS727713产生菌在培养基中发酵，从而制备WS727713的方法。
本发明的另一个目的是提供一种以WS727713作为活性组分的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供黑皮质素受体调节剂(如WS727713)在治疗和预防上述疾病中的应用。
因此，本发明包括以下内容：
(1)一种有以下特性的基本纯的WS727713化合物。
a)分子式：C₃₀H₄₄N₈O₈
b)¹H核磁共振谱：
(500MHz，DMSO-d6)δ9.76(1H，s，可交换)，8.76(1H，d，J＝7.5Hz，可交换)，8.23(1H，d，J＝5Hz，可交换)，7.76(1H，dd，J＝8.5和3Hz，可交换)，7.25-7.17(5H，m)，5.71(1H，dd，J＝10.5和5Hz)，5.08(1H，dd，J＝11和4Hz，可交换)，5.03(1H，m)，4.99(1H，m)，4.92(1H，m)，4.85(1H，m)，4.83(1H，d，J＝3Hz，可交换)，4.76(1H，br d，J＝12Hz，可交换)，4.12(1H，dd，J＝16.5和8.5Hz)，3.65(1H，dd，J＝16.5和3Hz)，3.58(1H，m)，3.07(1H，dd，J＝13.5和8.5Hz)，2.94(1H，br d，J＝13Hz)，2.86(1H，dd，J＝13.5和6Hz)，2.73-2.68(2H，m)，2.58(1H，m)，2.24(1H，br d，J＝13Hz)，2.08(1H，br d，J＝14Hz)，1.88(1H，m)，1.67(1H，m)，1.55(1H，m)，1.42-1.36(2H，m)，1.21(1H，m)，1.19(3H，d，J＝7Hz)，1.09(1H，m)，0.76(3H，d，J＝6.5Hz)，0.75(3H，d，J＝6.5Hz)；
c)¹³C核磁共振谱：
(125MHz，DMSO-d6)δ173.8(s)，171.7(s)，170.4(s)，169.8(s)，169.1(s)，167.6(s)，137.2(s)，129.2(d)x2，128.0(d)x2，126.3(d)，60.2(d)，53.2(t)，51.1(d)，50.8(d)，49.6(d)，47.4(d)，47.0(t)，44.7(d)，41.2(t)，36.4(t)，35.4(t)，33.2(t)，23.6(d)，23.5(t)，23.1(q)，21.7(q)，21.0(t)，15.8(q)。
(2)一种属于假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的放线菌株，其保藏编号为FERM BP-7570。
(3)一种具有黑皮质素受体调节剂活性的化合物，其是通过在培养基中培养上述(2)所述的放线菌株并从所述菌株的发酵液中回收该化合物而得到的。
(4)一种制备上述(1)所述化合物WS727713的方法，该方法包括在培养基中培养属于假诺卡氏菌属的WS727713产生菌，然后从发酵液中回收该化合物。
(5)上述(4)所述的方法，其中所述属于假诺卡氏菌属的WS727713产生菌是上述(2)所述的放线菌株。
(6)一种药物或化妆品组合物，该组合物含有上述(1)所述的化合物WS727713或其盐，以及可药用的、基本无毒的载体或赋形剂。
(7)一种用作药物或化妆品的上述(1)所述的化合物。
(8)一种制备具有黑皮质素受体调节剂活性的化合物的方法，该方法包括在培养基中培养属于假诺卡氏菌属的、能产生具有黑皮质素受体调节剂活性的化合物的放线菌株，并回收所述化合物。
(9)一种具有黑皮质素受体调节剂活性的化合物，其是通在培养基中培养属于假诺卡氏菌属的、能产生具有黑皮质素受体调节剂活性的化合物的放线菌株，并从该菌株的培养液中回收该化合物而得到的。
(10)一种包括上述(1)所述的化合物或其盐的黑皮质素受体调节剂。
(11)一种调节黑皮质素受体的方法，该方法包括将上述(1)所述化合物或其盐对人或动物进行给药。
(12)上述(1)所述的化合物或其盐在制备具有黑皮质素受体调节作用的药物或化妆品中的应用。
(13)一种用于治疗或预防疾病的药物或化妆品的组合物，该药物组合物包括上述(1)所述的化合物或其盐，以及一种可药用的、基本无毒的载体或赋形剂；所述疾病包括：缺血/再灌注损伤、脑部和肾脏炎性疾病、肝炎、脓毒血症/败血病性休克、缺氧性休克、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、风湿性关节炎(RA)、痛风性关节炎、主动脉反流(AR)、青少年慢性关节炎、骨关节炎、肾炎、诱导耐受、接触性过敏反应、肠炎(IBD)、性功能障碍、移植、疼痛、艾滋病、炎症后色素减退、花斑癣、特发性滴状色素减少症、发热、功能性肠疾病、肥胖、厌腻、糖尿病、皮肤外分泌腺调节、灰发(局限性灰发)、白发、胰腺炎、纤维变性疾病(肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、局限性硬皮病、系统性硬化、硬皮病性皮肤移植物抗宿主病、肝硬化、原发性和博来霉素诱导的肺纤维化以及环孢菌素诱导的肾病)、眼色素层炎(特别是氏综合征和结节病)、脉管炎、微生物感染、腹部疾病、外阴前庭炎综合征、黑素瘤侵袭或厌食。
(14)一种用于治疗或预防疾病的方法，该方法包括将上述(1)所述的化合物或其盐对人或动物进行给药；所述疾病包括：缺血/再灌注损伤、脑部和肾脏炎性疾病、肝炎、脓毒血症/败血病性休克、缺氧性休克、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、风湿性关节炎(RA)、痛风性关节炎、主动脉反流(AR)、青少年慢性关节炎、骨关节炎、肾炎、诱导耐受、接触性过敏反应、肠炎(IBD)、性功能障碍、移植、疼痛、艾滋病、炎症后色素减退、花斑癣、特发性滴状色素减少症、发热、功能性肠疾病、肥胖、厌腻、糖尿病、皮肤外分泌腺调节、灰发(局限性灰发)、白发、胰腺炎、纤维变性疾病(肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、局限性硬皮病、系统性硬化、硬皮病性皮肤移植物抗宿主病、肝硬化、原发性和博来霉素诱导的肺纤维化以及环孢菌素诱导的肾病)、眼色素层炎(特别是氏综合征和结节病)、脉管炎、微生物感染、腹部疾病、外阴前庭炎综合征、黑素瘤侵袭或厌食。
(15)上述(1)所述的化合物或其盐在制备用于治疗或预防疾病的药物中的应用，所述疾病包括：缺血/再灌注损伤、脑部和肾脏炎性疾病、肝炎、脓毒血症/败血病性休克、缺氧性休克、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、风湿性关节炎(RA)、痛风性关节炎、主动脉反流(AR)、青少年慢性关节炎、骨关节炎、肾炎、诱导耐受、接触性过敏反应、肠炎(IBD)、性功能障碍、移植、疼痛、艾滋病、炎症后色素减退、花斑癣、特发性滴状色素减少症、发热、功能性肠疾病、肥胖、厌腻、糖尿病、皮肤外分泌腺调节、灰发(局限性灰发)、白发、胰腺炎、纤维变性疾病(肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、局限性硬皮病、系统性硬化、硬皮病性皮肤移植物抗宿主病、肝硬化、原发性和博来霉素诱导的肺纤维化以及环孢菌素诱导的肾病)、眼色素层炎(特别是氏综合征和结节病)、脉管炎、微生物感染、腹部疾病、外阴前庭炎综合征、黑素瘤侵袭或厌食。
附图说明
图1是红外光谱图。
图2是¹H核磁共振谱的图。
图3是¹³C核磁共振谱的图。
具体实施方式
通过以下性质可以说明所述的对黑皮质素受体活性具有有效调节作用的化合物的特征。图1-3是示出红外光谱、¹H核磁共振谱和¹³C核磁共振谱的图。
a)分子式：C₃₀H₄₄N₈O₈
b)ESI-MS(+：m/z)：645(M+H)⁺
c)红外光谱(图1)：
vmax(KBr)：3310，2950，1640，1545，1450，1410，1370，1350，1300，1245，1160，1125，1095，995cm^-1
d)¹H核磁共振谱(图2)：
(500MHz，DMSO-d6)δ9.76(1H，s，可交换)，8.76(1H，d，J＝7.5Hz，可交换)，8.23(1H，d，J＝5Hz，可交换)，7.76(1H，dd，J＝8.5和3Hz，可交换)，7.25-7.17(5H，m)，5.71(1H，dd，J＝10.5和5Hz)，5.08(1H，dd，J＝11和4Hz，可交换)，5.03(1H，m)，4.99(1H，m)，4.92(1H，m)，4.85(1H，m)，4.83(1H，d，J＝3Hz，可交换)，4.76(1H，br d，J＝12Hz，可交换)，4.12(1H，dd，J＝16.5和8.5Hz)，3.65(1H，dd，J＝16.5和3Hz)，3.58(1H，m)，3.07(1H，dd，J＝13.5和8.5Hz)，2.94(1H，br d，J＝13Hz)，2.86(1H，dd，J＝13.5和6Hz)，2.73-2.68(2H，m)，2.58(1H，m)，2.24(1H，br d，J＝13Hz)，2.08(1H，br d，J＝14Hz)，1.88(1H，m)，1.67(1H，m)，1.55(1H，m)，1.42-1.36(2H，m)，1.21(1H，m)，1.19(3H，d，J＝7Hz)，1.09(1H，m)，0.76(3H，d，J＝6.5Hz)，0.75(3H，d，J＝6.5Hz)；
c)¹³C核磁共振谱(图3)：
(125MHz，DMSO-d6)δ173.8(s)，171.7(s)，170.4(s)，169.8(s)，169.1(s)，167.6(s)，137.2(s)，129.2(d)x2，128.0(d)x2，126.3(d)，60.2(d)，53.2(t)，51.1(d)，50.8(d)，49.6(d)，47.4(d)，47.0(t)，44.7(d)，41.2(t)，36.4(t)，35.4(t)，33.2(t)，23.6(d)，23.5(t)，23.1(q)，21.7(q)，21.0(t)，15.8(q)。
特别地是，WS727713具有以下理化性质：
分子式：C₃₀H₄₄N₈O₈
ESI-MS(+：m/z)：645(M+H)⁺
HR-ESI-TOF/MS(+：m/z)
计算值    645.3360(M+H)⁺
实测值    645.3387(M+H)⁺
旋光度：
[α]_D(23℃)32°(c＝0.5，在DMSO中)
溶解度：
可溶于：甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、DMSO
难溶于：H₂O
显色反应：
阳性：碘蒸汽反应、硫酸铈反应、Ehrlich反应、Dragendorff反应
阴性：Molish反应、茚三酮反应
薄层色谱(TLC)：

  固定相 展开剂  Rf值  硅胶60 F254^*  RP-18W F254S HPTLC^* CHCl₃∶CH₃OH＝10∶1 MeCN∶H₂O＝80∶20  0.45  0.53
^*由E.Merck制造
高效液相色谱(HPLC)：
条件：
流动相：35％的乙腈水溶液
柱：Mightysil RP-18 GP(4.6×150mm)
流速：1.0mL/min
检测：UV 210nm波长处
滞留时间：9.3min
红外光谱(图1)：
v_max(KBr)：3310，2950，1640，1545，1450，1410，1370，1350，1300，1245，1160，1125，1095，995cm^-1
1H核磁共振谱(图2)：
(500MHz，DMSO-d6)δ9.76(1H，s，可交换)，8.76(1H，d，J＝7.5Hz，可交换)，8.23(1H，d，J＝5Hz，可交换)，7.76(1H，dd，J＝8.5和3Hz，可交换)，7.25-7.17(5H，m)，5.71(1H，dd，J＝10.5和5Hz)，5.08(1H，dd，J＝11和4Hz，可交换)，5.03(1H，m)，4.99(1H，m)，4.92(1H，m)，4.85(1H，m)，4.83(1H，d，J＝3Hz，可交换)，4.76(1H，br d，J＝12Hz，可交换)，4.12(1H，dd，J＝16.5和8.5Hz)，3.65(1H，dd，J＝16.5和3Hz)，3.58(1H，m)，3.07(1H，dd，J＝13.5和8.5Hz)，2.94(1H，br d，J＝13Hz)，2.86(1H，dd，J＝13.5和6Hz)，2.73-2.68(2H，m)，2.58(1H，m)，2.24(1H，br d，J＝13Hz)，2.08(1H，br d，J＝14Hz)，1.88(1H，m)，1.67(1H，m)，1.55(1H，m)，1.42-1.36(2H，m)，1.21(1H，m)，1.19(3H，d，J＝7Hz)，1.09(1H，m)，0.76(3H，d，J＝6.5Hz)，0.75(3H，d，J＝6.5Hz)。
¹³C核磁共振谱(图3)：
(125MHz，DMSO-d6)δ173.8(s)，171.7(s)，170.4(s)，169.8(s)，169.1(s)，167.6(s)，137.2(s)，129.2(d)x2，128.0(d)x2，126.3(d)，60.2(d)，53.2(t)，51.1(d)，50.8(d)，49.6(d)，47.4(d)，47.0(t)，44.7(d)，41.2(t)，36.4(t)，35.4(t)，33.2(t)，23.6(d)，23.5(t)，23.1(q)，21.7(q)，21.0(t)，15.8(q)。
颜色与形态：
白色晶体
熔点：
272-277℃(分解)
生产菌株No.727713的特点
菌株No.727713由在日本千叶县采集的落叶样品中分离得到。采用Shirling和Gottlieb(Shirling，E.B.和D.Gottlieb：Methods forcharacterization of Streptomyces species，Int.J.Syst.Bacteriol，16，313-340，1966)以及Waksman(Waksman，S.A.：The actinomycetes Vol.2：Classification，identification and description of genera and species，The Williams and Wilkins出版公司，巴尔的摩，1961)所述的方法和培养基来进行菌株No.727713的分类学研究。将分离的菌株在30℃下培养14天后进行观察。使用光学显微镜和扫描电子显微镜对生长在腐殖酸-维生素琼脂培养基(Hayakawa，M.和Nonomura，H.：Humicacid-vitamin agar，a new medium for the selective isolation of soilactinomycetes，J.Ferment.Techno1.，65，501-509，1987)上的培养物进行形态学观察。在酵母提取物-淀粉琼脂培养基上测定菌株生长的温度范围，所述培养基的配制方法为将2g酵母提取物(由Daigo Eiyo株式会社出品，大阪，日本)、10g可溶性淀粉和16g琼脂溶于1000mL自来水中(灭菌前使用1N NaOH将pH调至7.2)。在加有0.1％酵母提取物的Pridoham-Gottlieb氏培养基(Pridoham，T.G.和D.Gottlieb：The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as anacid for species determination，J.Bacteriol，56：107-114，1948)上测定碳源的利用情况。本研究中使用的颜色名称采用MethuenHandbook of Colour(Kornerup，A.和J.H.Wanscher：MethuenHandbook of Colour，Methuen，London，1978)中所述的标准。细胞制备和二氨基庚二酸异构体的检测是按照Becker等人(Becker，B.，M.P.Lechevalier，R.E.Gordon和H.A.Lechevalier：Rapid differentiationbetween Nocardia and Streptomyces by paper chromatography ofwhole-cell hydrolysates，Appl.Microbiol，12，421-423，1964)的方法进行。全细胞糖类组分的测定是按照Lechevalier和Lechevalier(Lechevalier，M.P.和H.A.Lechevalier：Chemical composition as acriterion in the classification of aerobic actinomycetes，Int.J.Syst.Bacteriol.，20，435-443，1970)的方法进行。按照Reichert等人(KatrinReichert，Andre Lipski，Silke Pradella，Erko Stackebrandt和KarlheinzAltendorf：Pseudonocardia asaccharolytica sp.nov.andPseudonocardia sulfidoxydans sp.nov.，two new dimethyldisulfide-degrading actinomycetes and emended description of thegenus Pseudonocardia，Int.J.Syst.Bacteriol，48，441-449，1998)的方法测定16S rDNA的序列。并从DDBJ数据库(http://www.ddbj.nig.ac.jp)中检索出模式菌株的16S rDNA序列。使用CLUSTAL程序建立系统发育树(Thompson，J.D.，Gibson，T.J.，Plewniak，F.，Jeanmougin，F.和Higgins，D.G.：The CLUSTAL Xwindows interface：flexible stradesies for multiple sequence alignmentaided by quality analysis tools，Nucleic Acids Res，24：4876-4882，1997)。
菌株No.727713的细菌学特征如下。
表1和表2分别示出该菌株在不同琼脂培养基上的培养特征和生理特征。所述菌株被观察到在酵母提取物-麦芽提取物琼脂培养基、燕麦粉琼脂培养基以及蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂培养基上生长，而在无机盐-淀粉琼脂培养基、甘油-天冬酰胺琼脂培养基以及酪氨酸琼脂培养基上不生长。在腐殖酸-维生素琼脂培养基上仅可见气生菌丝体，其气生菌丝团的颜色为白色。生长物反面的颜色为淡橙黄色。在胰蛋白胨-酵母提取物培养液和蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂培养基中不产生类黑素。该菌株不产生可溶性色素。菌丝团颜色对pH不敏感。
关于形态学特征，基质菌丝体发育良好，并呈不规则分支状。可观察到有膨大的菌丝片断形成。这种菌株产生的气生菌丝体上具有直的孢子丝，每个孢子丝包含10个以上的孢子。孢子呈梭形(1.6-2.3×0.5-0.6μm)。并且孢子表面光滑。未观察到硬颗粒(scleroticgranules)、孢子囊以及游动孢子或碎片。
菌株No.727713可在11-32℃的温度范围内生长，最适生长温度是28℃。
在该菌株的全细胞水解物中能检测到内消旋二氨基庚二酸、乳糖和阿拉伯糖，细胞壁类型为IV型。
序列表中SEQ ID NO：1为菌株No.727713的部分序列。菌株No.727713和假诺卡氏菌属成员的16s rDNA序列的相似值为91.8-97.4％，在系统发育树上形成单簇(数据未列出)。
基于上述形态学和化学特征以及系统进化分析，认为菌株No.727713属于假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)(参见Lechevalier，M.P.和H.A.Lechevalier：Chemical composition as a criterion in theclasification of aerobic actinomycetes，Int.J.Syst.Bacteriol.，20，435-443，1970；Pridham，T.G.，et al.：Appl.Microbiol.6：54，1958)。因此，将该菌株命名为假诺卡氏菌No.727713(Pseudonocardia sp.No.727713)。该菌株已在国际承认的用于专利程序的微生物保藏单位日本国家高级产业技术研究院(AIST)(地址：日本茨城县Tsukuba市东1丁目1番地1，AIST Tsukuba Central 6，邮编：305-8566)保藏，保藏编号为FERM BP-7570(保藏日期：2001年4月25日)。
表1  菌株No.727713的培养特征  培养基  培养特征  酵母提取物-麦芽提取物  琼脂培养基  (ISP-2)   燕麦粉琼脂培养基  (ISP-3)    无机盐-淀粉琼脂培养基  (ISP-4)  甘油-天门冬酰胺琼脂培养基  (ISP-5)  蛋白胨-酵母提取物-铁琼脂培养基  (ISP-6)    酪氨酸琼脂培养基  G：良好  A：未观察到  R：淡橙黄色(5A5)  S：未检测到  G：中等  A：未观察到  R：淡橙黄色(5A5)  S：未检测到  G：未观察到   G：未观察到   G：弱  A：未观察到  R：淡橙黄色(5A5)  S：未检测到  G：未观察到
缩写A：气生菌丝体，
G：生长，
S：可溶性色素，
R：反面颜色。
在30℃培养14天后可观察到这些特征。并根据MethuenHandbook of Colour(Kornerup，A.和J.H.Wanscher，第三版，252页，Methuen出版公司，伦敦，1978)所述方法来进行颜色描述。
表2  菌株No.727713的生理特征  条件  特征  生长的温度范围  最适生长温度  类黑素的生成  可溶性色素的生成  碳源利用  D-葡萄糖  蔗糖  D-木糖  D-果糖  L-鼠李糖  棉子糖  L-阿拉伯糖  肌醇  D-甘露糖  11-32℃    28℃    -  -   -  +  +  +  ±    +  +  +  +
应该理解WS727713的制备不限于利用本文所述的特定的生物，以所述的生物为例只是为了达到说明的目的。本发明还包括使用能合成WS727713的任何突变株，所述的突变株包括自然突变株和将上述生物经传统方法，如重组DNA技术、X射线辐射、紫外线辐射以及使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍和2-氨基嘌呤进行处理等方法而得到的人工突变株。
WS727713的制备
在具有上述特性的化合物中，所述的WS727713化合物可以通过这样的方式来制备：在有氧条件下(例如振荡培养和深层培养等)，将属于假诺卡氏菌属的WS727713产生菌培养在含有可同化碳源和氮源的培养基中。
培养基中优选的碳源是碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖或甘油等。
优选的氮源是花生粉、酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨、聚胨、麸质颗粒、棉籽粉、大豆粉、大豆颗粒、玉米浆、干酵母、小麦胚等，以及无机和有机含氮化合物，如铵盐(例如硝酸铵、硫酸铵和磷酸铵等)、尿素或氨基酸等。
可以方便地将碳源和氮源结合使用，而无需使用它们的纯品，这是因为纯度较低的原料含有微量的生长因子和相当数量的矿质营养素，而更适合使用。
当需要时，可以在培养基中加入无机盐，如碳酸钠或碳酸钙、磷酸钠或磷酸钾、氯化钠或氯化钾、碘化钠或碘化钾、镁盐、铜盐、锌盐、铁盐或钴盐等。
如果有必要的话，特别是当培养基中泡沫较多时，可以加入消泡剂，如液体石蜡、脂肪油、植物油、矿物油或硅树脂等。
可以通过多种途径实现培养混合物的搅拌和通气，如使用螺旋浆或类似的机械搅拌设备进行搅拌，以及旋转或振荡发酵罐等。
发酵通常可以在约10℃-40℃，优选为20℃-30℃下进行约50小时-150小时，这些条件可根据发酵条件和规模而改变。
可以采用各种常规的用于回收和纯化生物活性物质的方法从所得发酵液中回收WS727713，例如，使用合适的溶剂或某些溶剂的混合物进行溶剂萃取、层析或从合适的溶剂或溶剂混合物中进行重结晶。
WS727713可以溶剂化物的形式存在，该溶剂化物也包括在本发明的范围内，该溶剂化物优选包括水化物和醇化物。
以下示出一些生物学数据作为说明上述化合物生物学特性的实例。
试验1.结合测定
结合缓冲液的组成为：25mM HEPES-KOH(pH 7.0)，1.5mMCaCl₂，1mM MgSO₄，100mM NaCl，1mM 1，10-二氮杂菲，0.2％ BSA，并且每100mL溶液加入1片Complete^TM蛋白酶抑制剂(由Boehringer-Mannheim出品)。结合测定按照Receptor Biology公司的方法经改进而进行。膜悬浮液(25μL)、[¹²⁵I]-NDP-MSH(25μL，NEN，3.08×10^-11M终浓度)、缓冲液(50μL)和抑制剂于37℃孵育60min。然后混合物经GF/C(在0.5％聚乙烯亚胺中预浸渍)过滤后，用冰冷的PBS(-)洗涤2次。干燥后，用Top计数器(由Packard公司出品)测定GF/C滤膜上俘获的放射性活度。
在补充有10％FBS和抗生素的RPMI1640培养基中培养B16细胞。并将已伸展未汇合的细胞用冰冷的PBS(-)洗涤2次后刮下来。然后将该细胞经超声处理后，在4℃下2,000rpm离心5min。将由此获得的上清液在4℃下30,000rpm离心60min。分离得到的细胞膜部分用冰冷的PBS(-)悬浮，并在-80℃下贮存。
各种受体蛋白的终浓度如下：MC1-R(B16)，0.139mg/mL；MC3-R(重组体^*)，0.0693mg/mL；MC4-R(重组体^*)，0.104mg/mL；MC5-R(重组体^*)，0.070mg/mL(^*：由Receptor Biology公司出品)。
如表3所示，WS727713能抑制[¹²⁵I]-NDP-MSH与黑皮质素受体结合。结果显示WS727713可以作为黑皮质素受体的激动剂或拮抗剂。
表3  WS727713和NDP-MSH对[¹²⁵I]-NDP-MSH结合黑皮质素受体的影响  IC50(M) MC1-R MC3-R  MC4-R  MC5-R  NDP-MSH  WS727713 4.05×10^-11 1.21×10^-7 8.15×10^-11 4.16×10^-6  2.64×10^-10  1.81×10^-6  5.58×10^-10  2.50×10^-6
试验2.WS727713剂量依赖性地降低LPS诱导的小鼠产生TNF-α
肿瘤坏死因子(TNF-α)是急性和慢性炎性疾病及损伤中的病理过程和机能失调的基础。神经免疫调节肽α-MSH能调节包括TNF-α在内的促炎细胞因子的活性和合成。为了对WS727713进行试验，在两次重复实验中向雄性小鼠(ICR)腹膜内注射脂多糖(LPS；Sigma，L-3129，E.coli 0127:B8，100μg/只)的生理盐水溶液或空白生理盐水。在注射LPS之前30min的时候，腹膜内注射WS727713。在注射WS727713的60mim之后处死小鼠。使用酶联免疫吸附测定法来测定血清TNF-α的浓度(TNF-αELISA试剂盒；由Amersham公司出品)。结果见表4。
如表4所示，通过给药WS727713，可以剂量依赖性地减少LPS诱导的TNF-α水平。结果表明WS727713具有黑皮质素受体激动剂的作用。
表4  WS727713对LPS诱导的小鼠TNF-α生成的影响  血清TNF-α浓度  (pg/mL)  抑制率  (％)  载体空白对照  (0.5％MC/生理盐水)  WS727713  (10mg/kg腹腔注射)  WS727713  (32mg/kg腹腔注射.)  8533±1602   3695±385   2556±892   0   56.7   70.0   WS727713  (100mg/kg腹腔注射)  NDP-MSH  (100μg/只腹腔注射)  NDP-MSH  (100μg/只静脉注射)  2038±973   4808±175   2187±1120   76.1   43.7   74.4 
MC：甲基纤维素
基本纯的化合物WS727713是黑皮质素受体MC1-R、MC3-R、MC4-R和/或MC5-R的调节剂，特别地是具有MC1-R激动剂活性。含有基本纯的化合物WS727713的药物组合物可以用作炎症或免疫疾病的治疗和预防的药物。此外，所述组合物可以用于治疗炎症，特别地是由NF-kB激活和/或炎性细胞因子的释放而引起的炎症。
而且，含有基本纯的化合物WS727713的药物制剂可以用于以下疾病的治疗和预防：
与慢性和急性炎症及免疫调节相关的疾病，如：炎性肠病、肠激惹综合征、腹部疾病、胆囊疾病、克隆氏病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、外伤性关节炎、风疹性关节炎、肌肉变性、胰腺炎(急性或慢性)、牛皮癣、肾小球肾炎、血清病、狼疮(系统性红斑狼疮)、荨麻疹、scleraclerma、硬皮病、慢性甲状腺炎、Grave’s病(格雷夫斯病、毒性弥漫性甲状腺肿)、皮炎(接触性或特应性)、外阴前庭炎综合征、皮肌炎、脱发、异位性湿疹、鱼鳞病、发热、脓毒症、偏头痛、丛集性头痛、阿尔茨海默病、帕金森病、克-雅二氏病、多发性硬皮病、结核、痴呆以及移植或移植物-宿主排斥(如：肾、肝、心、肺、胰脏、骨髓、角膜、小肠、皮肤同种异体移植物、皮肤同种移植物和异种移植物等)。
呼吸器官变态反应和疾病，如：哮喘、急性呼吸窘迫综合征、花粉症、过敏性鼻炎和慢性阻塞性肺疾患；中枢神经系统炎性疾病，如：HIV脑炎、脑型疟、脑脊膜炎和共济失调-毛细血管扩张症；疼痛，如：术后痛、神经肌肉痛、头痛、癌症引起的疼痛、牙痛和关节炎疼痛。
病毒和自身免疫疾病，如：1型单纯性疱疹病毒(HSV-1)感染、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)感染、巨细胞病毒感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、艾迪生病(肾上腺自身免疫疾病)、原发性肾上腺功能不全、自身免疫多腺体疾病(也称为自身免疫多腺体综合征)、慢性活动性肝炎或急性肝炎感染(包括甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎)、自身免疫胃炎、自身免疫溶血性贫血和自身免疫中性白细胞减少症；真菌感染，如：蕈样肉芽肿病。
心血管系统疾病，如：动脉粥样硬化、移植造成的动脉粥样硬化、外周血管病、炎性血管疾病、间歇性跛行、再狭窄、脑血管中风、短暂性缺血发作、心肌缺血和心肌梗塞。以及高血压、高脂血症、冠心病、不稳定心绞痛、血栓形成、凝血酶诱导的血小板聚集和/或由血栓形成和/或动脉粥样硬化斑块形成而引起的后遗症。
中风和其它脑缺血性疾病和/或与所述疾病相关的神经退行性改变，以及脑外伤后的神经退行性改变或脑外伤后遗症。
晒伤(晒斑)、痤疮、白斑、局限性脱发、光过敏性疾病、白化病、灰发(局限性灰发)、白发病、干皮病及卟啉病。
神经退行性疾病，如：抑郁、焦虑、强迫症(强制性障碍)、神经官能症、精神病、失眠(睡眠障碍)、睡眠性呼吸暂停以及毒品或药物滥用。
男性性功能障碍，如：阳萎、性欲缺乏和勃起功能障碍(包括不能勃起或勃起维持时间短、不能射精、早泄或不能达到高潮)。女性性功能障碍，如：性唤起障碍或与性欲、性接受度、性高潮和/或性功能触发点紊乱相关的疾病，以及性交疼痛，早产，痛经，月经过多及子宫内膜异位症。
与体重有关的疾患，如：肥胖症和厌食(如：食欲、代谢率、脂肪摄取或碳水化合物的需求发生改变所引起)，以及糖尿病(由糖耐量提高和/或胰岛素抵抗降低所引起)。
肺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌，以及骨癌、皮肤癌(如黑素瘤侵袭)或者血管源性疾病(包括实体瘤的形成和生长)。
纤维变性疾病，如：肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、局限性硬皮病、系统性硬化、硬皮病性皮肤移植物抗宿主病、肝硬化、原发性和博来霉素诱导的肺纤维化、以及环孢菌素诱导的肾病。
动物疾病，如：动物病毒感染包括猫免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒和犬免疫缺陷病毒。
眼色素层炎，特别是氏综合征和结节病，脉管炎和微生物感染。
本发明的药物和化妆品组合物可以以药物制剂的形式，例如固体、半固体或液体形式的药物制剂而被应用，所述的制剂含有作为活性组分的黑皮质素受体调节剂，如化合物WS727713，其与适于外部、肠道或非胃肠道给药的有机或无机载体或赋形剂一起构成混合物。活性组分可以与(例如)通常无毒的、可药用的载体混合，从而制成片剂、丸剂、胶囊、栓剂、溶液、乳剂、混悬剂、注射剂、软膏、搽剂、滴眼剂、洗剂、凝胶剂、霜剂以及任何适合应用的剂型。
所使用的载体可以是水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石粉、玉米淀粉、角蛋白、胶态硅石、马铃薯淀粉、尿素和其他适于制备固体、半固体、液体制剂的载体物质，此外，还可以使用辅助剂、稳定剂、填充剂、增稠剂、增溶剂以及着色剂和香料。
当将所述组合物用于人体时，优选的是通过静脉、肌肉、局部或口服给药。黑皮质素受体调节剂，如WS727713的有效治疗剂量根据接受治疗的每一个患者个体的年龄和身体条件而变化并取决于接受治疗的患者的所述条件。在个体患者接受治疗时，如果采用静脉给药，黑皮质素受体调节剂，如WS727713的每日给药剂量通常为O.001-100mg/kg体重；如果采用肌肉给药，黑皮质素受体调节剂，如WS727713的每日给药剂量通常为0.001-100mg/kg体重；如果采用口服给药，黑皮质素受体调节剂，如WS727713的每日给药剂量通常为0．01-320mg/kg体重。
下面给出实施例以便更具体地说明本发明。
实施例1
(1)用于制备WS727713的Pseudonocardia sp.No.727713的发酵
将1菌环量的斜面培养物接种于60mL已灭菌的种子培养基中，所述的种子培养基装于225mL的广口三角烧瓶中，其中含有2％可溶性淀粉、0.8％酵母提取物和0.5％琼脂(灭菌前将pH调至7.0)。将三角烧瓶置于旋转摇床(220rpm，5.1cm半径)上，在30℃下孵育7天。然后按2％的接种量转接入5瓶225mL广口三角烧瓶中，每瓶装有80mL与上述相同的、已灭菌的培养基中。将三角烧瓶置于旋转摇床(220rpm，5.1cm半径)上，在30℃下孵育4天。
将得到的种子培养物以2％的接种量接入装有20L已灭菌的生产培养基的发酵罐(30L)中，所述生产培养基的组成为1％葡萄糖、1.5％可溶性淀粉、0.5％酵母提取物、1％β-环糊精、1％CaCO₃、0.05％Adekanol LG-109(由日本Asahi Denka Kogyo K.K.公司出品)以及0.05％硅树脂KM-70(由日本Shin-Etsu化学株式会社出品)，在灭菌前将培养基pH调至7.0。在28℃下以20L/min的通气量和200rpm的搅拌速度发酵5天。
采用高效液相色谱分析法按以下所示的条件来监测发酵液中WS727713的生成。
(分析型高效液相色谱条件)
柱          Mightysil RP-18 GP 150-4.6，5μm
            (5μm，4.6mm ID×150mm L，日本关东化学株式会社)
洗提液     CH₃CN∶H₂O＝35∶65
流速        1mL/min.
温度        室温
检测        UV在210nm波长处
保留时间    9.3min
(2)WS727713的分离：
培养完成后，在室温和搅拌条件下，使用等量的丙酮对发酵液(16L)提取几分钟。并以硅藻土作为助滤剂将提取液过滤。滤液经真空浓缩得到水溶液(15L)。将所得溶液上样于Diaion HP20(由三菱化学株式会社出品)柱(800mL)，使用20％乙腈(4L)洗柱。再分别用40％乙腈(2.4L)和60％乙腈(3.6L)洗脱。用水将洗脱液(6.0L)稀释至12L，然后通过1L的Daisogel SP-120-ODS-B(15/30μm，由日本大创株式会社出品)柱(已用水装过柱)。用32.5％乙腈洗脱。使用分析型高效液相色谱按上述的条件监测洗脱过程。将含有WS727713的级分合并，并真空浓缩得到粉末。将粉末溶于少量甲醇中，并通过水而结晶。过滤晶体，经干燥后得到1.5g白色针状的WS727713。
                        工业应用
本发明所述的新化合物具有黑皮质素受体调节剂活性，可以用作抗炎药物的活性组分以及与黑皮质素受体调节相关的疾病的治疗和预防的药物。
本申请是根据澳大利亚专利No.2004901919，并将其内容以引用方式并入本文。
                             序列表
<110>日本藤泽药品工业株式会社(Fujisawa Pharmaceutical Co.，Ltd.)
<120>新化合物
<130>09726
<150>AU2004901919
<151>2004-04-08
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1483
<212>DNA
<213>Pseudonocardia sp.No.727713
<220>
<221>misc_feature
<222>(469)..(470)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(530)..(530)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(836)..(836)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc feature
<222>(865)..(865)
<223>n is a，c，g，or t
<400>1
gcacgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgag cggtaaggcc tttcggggta   60
cacgagcggc gaacgggtga gtaacacgtg ggtgacctgc cctcagctct gggataagcc  120
tgggaaactg ggtctaatac cggatatgac ttcacatcgc atggtgtgtt gtggaaagtt  180
ttttcggctg gggatgggcc cgcggcctat cagcttgttg gtggggtgat ggcctaccaa  240
ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac actgggactg agacacggcc  300
cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcgcaa tgggcggaag cctgacgcag  360
cgacgccgcg tgggggatga cggccttcgg gttgtaaacc tctttcgcca gggacgaaga  420
gtgattgacg gtacctggat aagaagcacc ggccaactac gtgccagcnn ccgcggtaat  480
acgtagggtg cgagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gagctcgtan gcggtgtgtc  540
gcgtcgatcg tgaaaacttg gggcttaact ctgagcttgc ggtcgatacg ggcatcactt  600
gagttcggca ggggagactg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag  660
gaacaccggt ggcgaaggcg ggtctctggg ccgatactga cgctgaggag cgaaagcgtg  720
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtggg cgctaggtgt  780
gggggccatt ccacggtctc tgtgccgcag caacgcatta agcgccccgc ctgggnagta  840
cggccgcaag gctaaaactc aaagnaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt  900
ggattaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctgggttt gacatgcact agacgcacat  960
agagatatgt gttcccttgt ggctggtgtg caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020
tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc tcgttccatg ttgccagcgg    1080
gttatgccgg ggactcatgg gagactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg    1140
tcaagtcatc atgcccctta tgtccagggc ttcacacatg ctacaatggc cagtacagag    1200
ggctgcgaga ccgtgaggtg gagcgaatcc cttaaagctg gtctcagttc ggattggggt    1260
ctgcaactcg accccatgaa gttggagtcg ctagtaatcg cagatcagca acgctgcggt    1320
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacgtc acgaaagttg gtaacacccg    1380
aagccgacgg cctaacccgc ttgcgggagg gagtcgtcga aggtgggact ggcgattggg    1440
acgaagtcgt aacaaggtag ccgtaccgga aggtgcggct gta                      1483