反转录酶分析试剂盒及其使用以及用于在生物样品中进行RT活性分析的方法.pdf

反转录酶分析试剂盒及其使用 以及用于在生物样品中 进行RT活性分析的方法
    本发明涉及到一种反转录酶(RT)分析试剂盒，该试剂盒用于在生物样品中进行RT活性分析。本发明还涉及到一种方法以及该RT试剂盒在生物样品中进行RT定性和定量分析中的应用，可根据情况在该分析之后进行与紊乱或疾病相关的RT活性状况的评估，该评估可根据该RT活性分析的结果进行。发明背景

    在包括人类免疫缺陷病毒(HIV)在内的所有反转录病毒中，对于其进行的从病毒RNA合成DNA，反转录酶(RT)是一种关键性的酶(Baltimore-70，Temin-70，Barre-Sinoussi et al-83)。这一过程涉及到三种酶活性：第一条DNA链的合成，DNA/RNA杂合体中的病毒RNA的降解以及第二条链的合成(综述见Goff)。

    反转录病毒可以以外生和内生形式存在。其主要的区别在于内生的反转录病毒已经进入了胚系并且由此而存在于该生物体的所有的细胞中，与之相比，外生的反转录病毒只能进入具有该特定病毒的适当受体的细胞。人类中的内生反转录病毒(ERVs)被称为HERVs。内生反转录病毒的整合前病毒形式具有同外生反转录病毒相同的基本结构。一些HERVs向胚系中的整合被认为在3.5到4.5千万年以前便已经发生。因此，它们存在于所有的人类细胞中并且按照普通孟德尔定律进行遗传。这些反转录病毒序列占哺乳动物基因组的1％并因此也占人类基因组的1％。

    许多HERVs家族存在于人类基因组中。对于不同的家族，HERVs的每单倍体基因组拷贝数从单拷贝到成千个拷贝不等。最高的核苷酸序列保守性在pol基因中被发现。这一特征被用于推断HERV家族间的亲缘关系。尽管许多HERVs及它们的ORFs是缺陷型的，在多个组织类型的多数HERV家族中已经检测到mRNA转录本(综述见Wilkinson et al.1994，leib-Msch and Seifarth 1996)。另外，在普通的人类胎盘、卵母细胞、teratacarcinomas、乳腺肿瘤组织以及在一些自体免疫患者的唾液腺中已经发现了具有聚合酶和蛋白酶的病毒粒子(综述见Wilkinson et al.1994，Urnovitz and Murphy 1996，Tnjes et al.，1997)。诸如缺氧和紫外照射这样的逆境(stress)条件可能也会诱导HERVs的表达，该表达同在感染性反转录病毒的观察一致(综述见Duvic1995)。

    一些HERVs已被定位于基因组内的染色体断点(Di Cristofano etal.1995，Meese et al.1996)。位于不同的染色体位点的HERV序列间的重组可能导致基因组重排列，该重排列包括转位、反转、重复和删除。这样的重组事件引起了基因组的不稳定，该不稳定性是进化的重要特征。另外，许多肿瘤的特征也在于特定的基因组重排，该重排被认为在肿瘤发生中起着关键作用。感染性反转录病毒的存在和肿瘤在宿主中的发展之间的关系提示HERVs与癌症有联系。在缺乏感染性病毒的情况下在原发性肿瘤样品也经常可以观察到毒粒颗粒和反转录病毒相关抗原(Weiss 1984，Faff e al.1992)。另外，在患有癌症的患者体内经显示具有针对反转录病毒蛋白的抗体(Weiss 1984)。进一步，HERV序列被发现在特定的肿瘤衍生细胞系中高效表达(综述见Lwer et al.1996)。

    内生前病毒还可以同外生变体进行重组(Martinelli et al.1990)。新的重组体获得一种新的表型。这可能促成新感染性反转录病毒的进化。由于其它部分的突变可能是有害的并与颗粒的形成不相容，主要受影响的为env基因。一些反转录株系被发现在一个物种中是共生的并且在另一个物种中是病原体。这些发现显示出异源移植的一个严重问题。被移植组织提供的共生ERVs在新的宿主中可能是病原性的。它们可能同反转录病毒融合所需的细胞表面受体相互作用，该受体存在于新宿主的细胞表面。另外还可能同该组织受体的基因组中的内生反转录病毒发生重组并且创造出新的感染性反转录病毒，该病毒可能在种群中传播。内生和外生的反转录病毒均可促成遗传材料在种间的横向和垂直传播并且为新病原物质的进化提供机制。

    感染性的反转录病毒和ERVs均已被发现表现出免疫调控功能(综述见Krieg et al.1992)。这些效应主要在小鼠中进行了研究，但是有观察支持HERVs的类似机制的存在。如果HERV序列能够减量调节对一种免疫应答调节，这些序列可以导致自体免疫疾病。这些效应可被HERV蛋白直接调节或者通过影响参与该免疫应答的分子的表达而间接调节。HERV蛋白可被暴露于细胞表面。对这些蛋白序列的自体耐受的丧失可导致针对暴露这些蛋白的细胞的自体免疫反应。反转录病毒感染之后产生的抗体可能同HERV编码的蛋白交联反应并导致自体耐受的丧失。这一现象已经在转基因小鼠中有所观察(Zinkernagel et al.1990)。另外，在小鼠中观察到了对ERV所编码的env蛋白的耐受的丧失，该小鼠自发产生了自体免疫的肾小球肾炎(综述见Krieg et al.1990和1992)。对人类的一些观察可能支持内生和外生反转录病毒蛋白之间的交联抗体的存在。已经在自体免疫患者的血中检测到针对反转录病毒蛋白的抗体(综述见Krieg et al.1992，Urnovitz and Murphy 1996)。在特定的情况下发现该血清还同外生的反转录病毒反应。反转录病毒感染已经被同自体免疫疾病的发生相联系(综述见Krieg et al.1990和1992)。进一步，感染性反转录病毒蛋白同自体抗原表现出部分的相似性，该自体抗原通常为自体抗体的目标(综述见Krieg et al.1992)。它们可以引发针对这些目标的自体免疫应答，该机制被称为分子拟态(molecular mimicry)。但是，HERV蛋白同已知的自体抗原的相似性尚未被检测出。

    对RT活性的分析已经成为用于在细胞培养中进行反转录病毒的检测和定量的常规技术。它们同p24抗原分析一起被用作HIV分离物的证实性测试(Jackson-88，Gupta-87)。在寻找针对HIV的有效抗病毒剂的尝试中RT也是一个主要目标。一种传统的RT活性分析通过使用一种可溶性酶分析而进行，该分析具有一种人工的模板引物结构体并以氚化的三磷酸脱氧核糖核苷酸作为核苷酸底物(Baltimore-71，Leeet al-87)。这一早期系统基于对掺入三氯乙酸沉淀的RNA/DNA杂合体中的放射性的检测。β放射性核苷酸的使用需要使用闪烁液以进行放射性的检测，该检测由于淬灭问题经常导致很低的重复性。这一方法相对繁琐并且不容易适用于对大量样品的大规模检测。该方法还对样品中的干扰因素十分敏感。

    在过去十年对HIV的深入研究中，RT分析已经使用不同工艺进行改善。I125标记的底物提供了更高的灵敏度并且消除的淬灭和闪烁液的使用(Neumüller et al-90)。连接于固相的模板或引物的引入简化了底物同产物的分离，避免了对TCA沉淀的需求并且产生了“一管RT分析”(Gronowitz et al-90，EP 0 447 442 B1)。

    更近一段时间以来，在RT分析中使用放射活性作为标记已经被修饰核苷酸碱基所淘汰，该修饰核苷酸碱基含有抗原表位或对限定配基具有高亲和性的结构。这些表位或结构的在新生RNA/DNA杂合体中的存在被随后用于结合抗体，该抗体与诸如ELISA酶这样的物质的抗体进行偶联。随后在一个二级酶分析中测定所结合的ELISA的量。

    Porstmann et al 1991利用5-溴-脱氧尿嘧啶(BrdU)三磷酸作为RT分析中的核酸底物。所掺入的BrdUMP的量在二级步骤中进行测定，该测定在一种免疫分析中进行，该分析使用偶联有单克隆抗-BrdU抗体的碱性磷酸酶。

    Eberle and R.Seibl 1992地高辛标记的dUTP在新生DNA中的掺入量以代替放射性标记的dTTP。为能够将未掺入的核苷酸从新生DNA中分离，生物素标记的dUTP也被加入至反应混合物中。在反转录之后，新生的双链标记DNA被固定化于经链亲合素包埋的ELISA孔中并且通过与偶联有过氧化物酶的抗地高辛抗体结合而进行光度测定。该程序已经成为一种试剂盒RT分析的基础，该试剂盒可购自BoehringerMannheim。

    Urabe et al 1994已经开发出一种非放射性RT分析，该分析基于生物素-dUTP在一种固定化的odT/prA结构体中的掺入。掺入的核苷酸底物的量在加入偶联有碱性磷酸酶的链亲合素之后进行光度测量。本发明之前的最新工艺为Ekstrand et al 1996所开发。在该分析中与一个96孔板的孔相共价结合的多聚(rA)被用作在反转录步骤期间BrdUMP的掺入的模板。掺入DNA的BrdUMP的量随后根据与Porstmann etal 1991使用的类似的程序进行免疫测定。该方法可通过Cavidi Tech，Sweden的RT测定试剂盒来实现。

    NEN(New England Nuclear，USA)商业应用的另一种RT活性检测的原理为使用序列特异性探针进行新生cDNA检测。该酶反应使用一种不均一多聚RNA分子以及一个20碱基寡聚核苷酸引物，该引物与该RNA分子5’末端的序列相互补。RT反应期间产生一条完整的DNA链。在RNA模板水解之后以两个不同的寡聚核苷酸探针来合成该cDNA，这两种探针为捕获探针和检测探针。捕获探针被用于将cDNA结合于一个微孔板的孔内。检测探针同辣根过氧化物酶偶联，该探针经洗脱除去未利用的核苷酸底物和游离探针后提供一种颜色反应。

    在最后一个类型的分析中的检测灵敏度可通过对RT反应产生的cDNA进行多聚酶链反应扩增来提高。该扩增DNA可在此之后以不同类型的标记探针进行检测(Sliver 93，Heneine 1995，US5817457，US5849494)。

    对于在生物样品中的RT活性的知识的应用，使用给出定量结果的RT分析是较为理想的。这样的应用包括疾病或紊乱监测，在该监测中不同时间进行的测量的RT分析结果被进行比较，这样的应用还包括对疾病或紊乱的诊断，在该诊断中RT活性水平同标准水平比较来显示是否该患者有患病危险或事实上已经患有被怀疑的疾病或紊乱。

    在某些情况下需要在生物样品中使用一种尽可能敏感的分析，即，该分析能够测出尽可能低的RT活性，以便使RT活性的存在和数量级可以同早期的紊乱和疾病相关联。发明描述

    本发明提供了一种RT分析，该分析易于被应用于检测目的并且该分析对于RT活性非常敏感。

    更精确地，本发明直接指一种反转录酶(RT)分析试剂盒，该分析试剂盒包括一种或多种包装物，该包装物含有固相结合多聚核糖腺苷酸(prA)和/或多聚脱氧腺苷酸(pdA)模板，通过使一种基于聚苯乙烯的固相同一种含有甲基咪唑(methylimidazole)的偶联溶液以及prA和/或pdA相接触并随后进行温育、以洗涤缓冲液进行洗涤、干燥和包装来获得该包装物。该试剂盒还含有适配RT类型的分隔包装的分析组分，这些组分选自由缓冲液，二价金属离子、螯合剂、多胺、RNA酶抑制剂、还原试剂、盐、稳定化试剂和去污剂的单独组分或其混合物，以及冻干的脱氧核苷酸三磷酸、引物、保护试剂和浓缩的洗涤缓冲液单独组分或其混合物，以及文字的分析试剂盒使用指导组成的群体中。根据情况该试剂盒可含有冻干的参照酶。根据情况该试剂盒可进一步含有一种检测系统组分，该组分含有冻干的偶联有碱性磷酸酶抗BrdU单克隆抗体、碱性磷酸酶底物缓冲液以及碱性磷酸酶底物，例如pNPP片剂。

    在本发明的RT分析试剂盒的一个优选的实施方案中，该固相为一微滴定板，并且在该方案中向每个孔内加入了一份偶联溶液，该溶液含有100mM 1-甲基咪唑，以及0.5-2mg/ml prA和/或pdA，随后在10-60℃下温育0.5-10小时并且以洗涤缓冲液洗涤每个孔以除去1-甲基咪唑，该洗涤缓冲液含有bis-tris-丙烷，

    在本发明的RT分析试剂盒的一个特别优选的实施方案中，向每个孔内加入100μl偶联溶液，该溶液含有100mM 1-甲基咪唑，以及1mg/ml prA和/或pdA，随后在室温下温育2小时并且以2×300μl洗涤缓冲液洗涤每个孔，该洗涤缓冲液含有10mM bis-tris-丙烷，，在37℃干燥该板25分钟并且在该板置于箔包裹中并对该包裹进行真空密封。

    在本发明的RT分析试剂盒的一个进一步的实施方案中，该分析组分选自由Tris和Hepes缓冲液，、二价金属离子Mg2+和Mn2+，螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇双(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)以及多胺精胺和亚精胺、RNA酶抑制剂硫酸肝素和硫酸葡聚糖、还原试剂二硫苏糖醇(DTT)和二硫赤藓醇(DTE)，谷胱甘肽、NaCl和KCl、稳定化试剂新生小牛血清(NCS)和牛血清白蛋白(BSA)、去污剂吐温-20和Triton X-100、脱氧核苷酸三磷酸BrdUTP、引物寡聚dT或寡聚dN，其中N为另一种T类似物，如U、以及保护试剂ATP，GTP和CTP组成的群体。

    本发明还涉及本发明的试剂盒对于在生物样品中进行定性和定量分析的使用，生物样品的例子如选自细胞抽提物和生物流体的生物样品，生物流体例如血浆、血清、脊髓液、滑膜液和胸膜液(pleuralfluid)。

    在一个优选的实施方案中，根据本发明所进行的应用之后根据该RT活性分析的结果估测RT活性相关的紊乱或疾病状况。

    另外，本发明指一种在生物样品中进行RT活性的定量和定性分析的方法，该方法包括使用并且遵循本发明的RT分析试剂盒的书面说明书以在生物样品中进行RT活性分析，生物样品的例子如选自细胞抽提物和生物液体的生物样品，生物液体例如血浆、血清、脊髓液、滑膜液和胸膜液。

    在一个优选的实施方案中，在本发明的方法之后根据该RT活性分析的结果估测RT活性相关的紊乱或疾病状况。

    本发明在此通过参照图表和实施方案更详细的描述来阐明，但是这些实施方案不能被视为对附加的权利要求所定义的保护范围进行限制。附图简述

    图1.以两种方法测定培养基中RT活性，培养基来自PK细胞系培养物。所获得的吸光值对加入反应混合物的培养基的量进行作图。

    图2.在滑膜液样品中进行的RT活性直接测定，该样品收集自患有风湿性关节炎的患者。用于作图的数值获自1μl的样品并且进行了过夜RT反应。

    图3.以两种方法在来自乳腺癌的抽提物中进行RT活性的测定。所获得的吸光值对加入反应混合物的抽提物的量进行作图。

    图4.在来自乳腺癌活检样品中的抽提物中进行的RT活性直接测定，该样品收集自患有风湿性关节炎的患者。用于对蛋白浓度进行作图的数值获自1μl的样品并且进行了过夜RT反应。

    图5.以两种方法检测了在A)HTLV 1转化细胞的培养物的培养基中的细胞以及在B)来自BLV感染的培养物中的RT活性。所获得的吸光值对加入反应混合物的样品的量进行作图。

    图6.在来自SIV感染的恒河猴的血清中进行RT活性的直接检测。以在一个4小时RT分析中获得的吸光值对血清取样天数作图。本发明的实施方案的详细描述

    本发明的RT试剂盒含有三种不同类型的组分，即

    1)一个模板，该模板由连接于一种固相的聚核糖腺苷酸(prA)或聚脱氧腺苷酸(pdA)组成。

    2)反应混合物，该混合物使得酶可以依赖于引物的方式使用连接的模板多聚核苷酸聚合产生一种新的DNA链。

    3)一种检测系统组分，该系统用于体外合成的DNA链的免疫检测。1)固相结合模板

    已经开发出一种方法，在该方法中prA或pdA可以连接于特定类型的微滴定板，该连接的方式使该多聚核苷酸可用作引物依赖的dNTP掺入的模板，该掺入通过病毒和细胞RNA和DNA依赖的DNA聚合酶进行。已经展示了在两种可购自Nalge Nunc International的微滴定板CovaLinkTM和NucleoLinkTM上进行的工作。本发明的分析试剂盒使用的偶联prA的微滴定板，该板来自NucleoLinkTM型号。方法和缓冲液在表1中有所描述。由于该方法并不对应于制造商推荐或建议的方法，该结合的机制并非已知或在文献中有明确描述。一个可能的反应机制涉及到一些反应基团，这些基团在制造程序期间引入，但并非为已知和有目的的用途而植于该特定表面。预期以来自其它商业来源的其它基于聚苯乙烯的微滴定板可获得类似的结果。已经发表了一种用于化学激活聚苯乙烯以获得一个与CovaLinkTM平板性质相同的表面(Zammatteo et al-96)。其它用于将多聚核苷酸连接于塑料表面的几种方法也已经发表(Zammatteo et al-96，Gregorious et al-95，Niveleau et al-93，Rasmussen et al-91，Ghosh和Muss-87)。2)适配RT类型的反应混合物

    用于通过RNA和DNA依赖的DNA聚合酶在可溶系统中使用纯化的酶而获得核苷酸掺入的一般条件是简单并且已知的。它们包括一种保持pH在7.5左右的缓冲液，一种二价金属离子，Mg2+或有时使用Mn2+，一种盐以调节离子强度，对于某些酶还含有一种还原试剂和少量去污剂。同该简单缓冲液一起提供的酶应能够使用所添加的模板、引物和脱氧核苷酸三磷酸以合成一条DNA链。这一通用概念并不受存在于最佳或特别适配的反应条件的差异的影响，这些条件为不同类别或类型的反转录酶所需。另一个重要的方面是该反应混合物对加入的作为RT酶活性来源的生物液体或细胞抽提物的耐受能力。

    使用诸如细胞培养物上清这样的粗样品以及纯化的酶进行的系统测试揭示了其它反应组分，这些组分被用于创建反应混合物，该混合物对反转录酶作了最优化处理或特别适配。

    表2含有用于组建对个体RT类型适配的反应混合物的组分的简述。典型反应混合物的组成见表3。

    本发明的反转录酶分析方法如下文的描述进行。该分析中的第一步为向偶联有prA的微滴定板加入100μl的反应混合物，随后在33℃下预温育20-60分钟。含有反转录酶的样品随后被加入50μl缓冲液，所产生的最终分析体积为150μl，随后将该微滴定板在33℃下温育。将每个样品加入同样的两个微滴定板中以进行两个分析时间，分析时间分别标准化为3小时和约16-20小时的过夜。在每个试剂盒均含有的书面说明书或使用手册中提供了分步程序。该试剂盒含有建议或指导，该建议或指导针对如何对不同类型的反转录酶分析组分进行适配以用于下列应用之一或全部：1)RT活性定量。2)在细胞抽提物、细胞上清和/或生物液体中RT活性的检测，这些液体包括血浆、血清、脊髓液、滑膜液和胸膜液，但不限于这些。3)RT活性阻断抗体的检测。4)RT活性抑制物质的IC50值的检测。

    我们通过使用这些反应混合物和固相结合模板而设计了 中的分析，该分析不仅在RT活性的直接测量中比前述的其它基于固相结合的模板的分析更加敏感，而且可以检测先前未知的反转录酶活性。3.体外合成的DNA链的免疫检测

    聚合酶在样品中使用在反应混合物中提供的溴-脱氧尿苷酸三磷酸(BrdUTP)而合成一条DNA链。

    所掺入的BrdUMP通过偶联于碱性磷酸酶的BrdU结合单克隆抗体进行检测。被结合抗体的碱性磷酸酶活性随后通过加入一种含有底物的溶液而进行定量，该溶液含有对硝基苯基磷酸酯(para-nitro phenylphosphate)，pNPP。当pNPP被碱性磷酸酶切断时该底物溶液变黄。在一个标准ELISA酶标仪中在405nm波长下测量吸光密度(OD)。通过背景进行校正的OD值正比于样品中的RT活性。

    检测步骤如下文进行。在每个试剂盒均含有的书面说明书或使用手册中提供了分步程序。缓冲溶液的组分在表4中提供。

    在反转录酶分析之后，使用可购得的ELISA洗板机或通过在含有洗涤缓冲液的桶中对该板进行一系列浸泡。该偶联抗体可根据情况在试剂盒中以冻干的形式提供。在双蒸水中以1％的tritonX-100重构后将100μl抗体溶液加入每个孔中并且随后在33℃下温育90分钟。为除去过量的抗体，该平板随后以相同的方式进行第二次洗涤。由缓冲液和pNPP药片制备底物溶液，该缓冲液和pNPP药片可根据情况由试剂盒提供。随后以适当的时间间隔测量OD值。

    所结合的碱性磷酸酶的量与黄色产物的浓度的线性关系在高OD值时消失。通过在不同时间测量OD，可以能够对于具有在反转录酶分析步骤期间形成的大量或少量产物的样品给出有用的数值，即，特定仪器的线性读取范围内的OD值。当在30分钟、2小时和16-20小时，即，过夜后进行OD测量时，参照RT酶能够给出具有有用的OD值的滴定曲线，该参照酶可根据情况由一些试剂盒含有，但并非所有试剂盒都含有。

    由本发明的RT分析试剂盒而获得的改善的性能在表5中进行阐明。通过先前已知的来自Cavidi Tech AB的Lenti RT试剂盒和本发明的分析试剂盒而获得HIV-1 RT滴定曲线。以OD值对RT酶浓度进行作图并且使用最小二乘方近似成直线。表6中的k值为所计算出来的直线的斜率，该值为该分析的敏感度的一个指标。可以看出本发明的试剂盒所具有的k值高出一个数量级。在特定的表述中这意味着从含有非常低的浓度的HIV-1反转录酶的样品中进行有效的测量和/或意味着对时间的节省。更短的反转录酶分析时间和/或更短的磷酸酶读标时间对于本发明的试剂盒的使用者来说意味着更短的周期时间(turn-around time)。

    本发明的试剂盒典型组分

    A.连接有prA和/或pdA的两个96孔微滴定板。

    B.一种样品稀释剂以及含有对RT类型进行适配的组分I-IX混合物的反应缓冲液，这些组分列于表2。

    C.混合的或者分开盛放于药瓶中的冻干的反应混合物X-XII。

    D.冻干的参照酶，它是重组、天然纯化或病毒颗粒的。

    E.浓缩的洗涤缓冲液

    F.冻干碱性磷酸酶偶联的抗BrdU单克隆抗体，名为“RT产物六踪物”

    G.碱性磷酸酶底物缓冲液和pNPP药片。

    H.书面说明书或者手册实施例实施例1在细胞上清中的PERV(猪内生反转录病毒)RT的改良检测

    猪细胞系PK-15(猪肾)已知可以连续产生少量的PERV。将来自PK15细胞培养物的上清进行连续稀释。在各稀释度下对Cavidi tech AB的C型RT分析试剂盒和本发明的Mn2+RT分析的能力进行测试。图1所示的数据由过夜RT分析产生。

    同一种先前工艺相比，本发明的分析所表现出的敏感度高出约25倍。通过使用更多的样品来补偿检测灵敏度的差异是不可能的，这是因为在较高的上清浓度下(＞2μl/孔)C型分析受困于背景水平的增加以及时间和/或样品量的线性偏差的增加。

    本发明的分析试剂盒可用于针对伴随着异源移植的外生反转录病毒的转移和/或内生反转录病毒的激活的可能性的研究。实施例2反转录酶在滑膜液中直接的检测

    近来的DNA杂交实验已经暗示了风湿症紊乱与反转录病毒相关序列的存在之间的联系。来自风湿性关节炎患者的滑膜液的冷冻样品获自位于Karolinska sjukhuset，Stockholm，Sweden的风湿病学部(系)。该样品中在冷冻之前已经通过低速离心除去了细胞和碎片。融化该样品，进行一系列的稀释并且检测RT活性。

    所获得的活性被重新计算成为OD405/h。图2为在本发明的滑膜液RT分析中使用1μl样品并进行过夜酶反应后所发现的RT活性。通过CavidiTech AB的Lenti或C型RT分析在被检测的样品中未检测到RT活性。实施例3在来自人类乳腺癌的抽提物中的RT活性检测

    MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)在人类中的内生或外生对应物涉及到人类乳腺癌的发生。通过使用MMTV RT以最优化分析条件，在来自乳腺癌的抽提物中无需预先的浓缩或纯化便检测出了RT活性。来自人类乳腺癌的冷冻抽提物获自位于Akademiska sjuhuset，Uppsala，Sweden的肿瘤学部(系)。该肿瘤组织经匀浆并悬浮于标准缓冲液中(pH7.4)。通过低速离心进行澄清后收集上清。融化该样品，进行一系列的稀释并且在本发明的Mg2+RT分析和Cavidi tech AB的Lenti或C型RT分析中检测RT活性的存在。

    图3所示为所获得的结果的代表性例子，该结果使用过夜RT反应和2小时的AP反应而获得。本发明的Mg2+RT分析和Cavidi tech AB的Lenti RT分析的检测灵敏度之间的差异约为400倍。在Cavidi techAB的C型RT分析中未能检测出活性。

    图4所示为通过在来自不同患者的肿瘤抽提物中进行的Mg2+RT分析所检测到的RT活性的变化。

    本发明的分析试剂盒可用于针对在乳腺癌的发生中的外生反转录病毒和/或内生反转录病毒的作用的研究以及被用于诊断目的。实施例4在来自细胞培养物的上清中进行的HTLV(人类T细胞白血病病毒)样病毒检测

    一些HTLV感染的个体会继续发展成为肿瘤或脊髓病症。成体T细胞白血病相关疾病最初在日本和南亚的特定部分被描述。一种神经紊乱，热带痉挛性下肢轻瘫，最早在来自加勒比海的患者中被描述。能够检测对病毒的暴露和/或低水平病毒活性的连续存在的方法是需要的。

    一种高度相关的牛病毒，牛白血病病毒(BLV)，在一些牛体内为一种病原，这些牛对于牛奶和牛畜牧业具有重要的经济价值。BLV被用于对一种针对BLV/HTLV的RT活性进行最优化。

    图5A所示为本发明的RT分析试剂盒和Cavidi tech AB的Lenti RT分析试剂盒的检测灵敏度之间的差异。来自HTLV转化细胞系MT-2的细胞培养上清被连续地稀释并且这两种RT分析被用于测定各样品中的RT的量。所使用的RT反应时间为过夜(14小时)。

    图5B所示为来自FLK-BLV细胞的上清的一整套稀释液的对应数据。(该细胞被BLV慢性感染)。

    总共获得的检测灵敏度对于HTLV酶为约25倍，对于BLV酶为约30倍。灵敏度的增加对于从MT-2细胞的上清中获得显著的信号是很重要的。实施例5来自SIV感染的恒河猴的粗血清中的RT活性直接检测

    RT活性在血清中的定量可被用于检测在急性lenti病毒感染期间的病毒复制。该血清活性随后被RT抑制抗体所消除。

    在一次处理研究中，4只cynomolgus macaque(Macacafascicularis)的一组作为未处理参照而被SIVsm的十倍猴类感染剂量进行感染。在感染后的显示时间点采样的血清被进行一系列的稀释并且使用本发明的Lenti分析进行RT活性分析。一个4小时的RT反应含有5μl的血清样品，并且所获得的吸光值被重新计算为OD405/h并且对感染后的天数进行作图，见图6。

    本发明的Lenti分析敏感得足以通过对在急性阶段感染取样的血清进行的分析而检测病毒复制。目前用于在人类血液供体中进行HIV阳检筛选的测试基于对抗HIV-1蛋白的抗体的检测，该测试不能检测处于感染的急性阶段的感染者。这些测试在某些国家通过以ELISA对病毒抗原进行的检测或通过PCR进行的对病毒基因组的检测来补充。这两类的测试均可能无法检测异常病毒株，这些异常病毒株由于HIV病毒中的巨大的遗传和免疫变化而造成。对于所有的反转录病毒的复制的检测RT具有不可或缺的功能，并且本分析对于急性感染提供了一种有吸引力的替代方法。表1用于产生prA包埋的NucleoLinkTM微滴定板的程序偶联溶液100mM1mg/ml-甲基咪唑pH 6.25多聚核糖腺苷酸洗涤缓冲液10mMBis-Tris丙烷pH 6.25向每个孔内加入100μl偶联溶液。在室温下温育2小时。以2×300μl洗涤缓冲液洗涤各孔。在37℃下干燥25分钟。将板放入箔包装中并进行真空密封。在-20℃下保存。表2

    用于组成对RT类型进行适配的反转录分析的组分

        组分            底物                  最终反应混合物中的

                                              有效浓度范围

    I   缓冲液          Tris，Hepes           10-100mM；pH7.0-8.0

    II  二价金属离子    Mg2+，Mn2+          0-20mM

    III 螯合剂          EDTA，EGTA            0-0.5mM

    IV  多胺            精胺，亚精胺          0-20mM

    V   RNA酶抑制剂     硫酸肝素，            0-100μg/ml

                        硫酸葡聚糖

    VI  还原试剂        DTT，DTE，            0-5mM

                        谷胱甘肽

    VII 盐              NaCl，KCl             0-100mM

    VIII稳定化试剂      NCS，BSA              0-1mg/ml

    IX  去污剂          吐温-20，             0-1.0％

                        TritonX-100

    X   脱氧核苷三磷酸  BrdUTP                1-50μM

    XI  引物            寡聚dT                5-100ng/ml

    XII 保护试剂        ATG，GTP，CTP         0-5mM

    缩写：

    EDTA乙二胺四乙酸

    EGTA乙二醇双(β-氨基乙醚)N，N，N，’N’-四乙酸

    DTT二硫苏糖醇

    DTE二硫赤藓醇

    NCS新生牛血清

    BSA牛血清白蛋白表3

    本发明的优化Lenti反转录酶分析的组分

        组分              底物              最终反应混合物中的有效

                                            浓度范围

    I   缓冲液            Hepes-HCl         10mM；pH7.6

    II  二价金属离子      MgCl2            4mM

    III 螯合剂            EGTA              0.2mM

    IV  多胺              精胺              2mM

    V   RNA酶抑制剂       硫酸葡聚糖        50μg/ml

    VI  还原试剂

    VII  盐

    VIII稳定化试剂        BSA               0.5mg/ml

    IX  去污剂            TritonX-          0.5％

                          100

    X   脱氧核苷三磷      BrdUTP            16μM

        酸

    XI  引物              寡聚dT            80ng/ml

    XII 保护试剂          GTP               0.5mM

        防腐剂            NaN3             1.92mM本发明的优化BLV/HTLV反转录酶分析的组分

    组分             底物               最终反应混合物中的有

                                        效浓度范围I   缓冲液           Hepes-HCl          10mM；pH7.8II  二价金属离子     MgCl2             8mMIII 螯合剂           EGTA               0.2mMIV  多胺             亚精胺             1mMV   RNA酶抑制剂      硫酸葡聚糖         2μg/mlVI  还原试剂         谷胱甘肽           0.6mMVII 盐VIII稳定化试剂       BSA                0.5mg/ml

                     NCS                0.5％IX  去污剂           TritonX-100        0.5％X   脱氧核苷三磷酸   BrdUTP             16μMXI  引物             寡聚dT             80ng/mlXII 保护试剂         GTP                0.5mM

    防腐剂           NaN3              1.92mM 本发明的优化Mg2+反转录酶分析的组分

     组分            底物            最终反应混合物中的有

                                     效浓度范围I   缓冲液           Hepes-HCl       10mM；pH7.6II  二价金属离子     MgCl2          25mMIII 螯合剂           EGTA            2.5mMIV  多胺             精胺            0.15mM

                     亚精胺          3mMV   RNA酶抑制剂VI  还原试剂         谷胱甘肽        1mMVII 盐VIII稳定化试剂       BSA             0.5mg/ml

                     NCS             0.25％IX  去污剂           TritonX-100     0.5％X   脱氧核苷三磷酸   BrdUTP          16μMXI  引物             寡聚dT          80ng/mlXII 保护试剂         ATP，GTP        0.5mM

    防腐剂           NaN3           1.92mM本发明的优化Mn2+反转录酶分析的组分

    组分             底物         最终反应混合物中的有效浓

                                  度范围I   缓冲液          Hepes-HCl     10mM；pH7.5II  二价金属离子    MnCl2        6mMIII 螯合剂          EDTA          0.3mMIV  多胺            亚精胺        12mMV   RNA酶抑制剂VI  还原试剂        谷胱甘肽      4mMVII 盐VIII稳定化试剂      BSA           0.2mg/mlIX  去污剂          TritonX-      0.5％

                    100X   脱氧核苷三磷    BrdUTP        16μM

    酸XI  引物            寡聚dT        80ng/mlXII 保护试剂        GTP           0.5mM

    防腐剂          NaN3         1.92mM本发明的优化滑膜液反转录酶分析的组分

    组分           底物            最终反应混合物中的有效

                                   浓度范围I   缓冲液         Hepes-HCl       10mM；pH7.6II  二价金属离子   MnCl2          1.2mMIII 螯合剂         EDTA            0.13mMIV  多胺           亚精胺          8mMV   RNA酶抑制剂    硫酸葡聚糖      17μg/mlVI  还原试剂       谷胱甘肽        0.3mMVII 盐             KCl             20mMVIII稳定化试剂     BSA             0.3mg/mlIX  去污剂         TritonX-        0.5％

                   100X   脱氧核苷三磷   BrdUTP          16μM

    酸XI  引物           寡聚dT          80ng/mlXII 保护试剂       GTP             0.5mM

    防腐剂         NaN3           1.92mM表4

    检测系统中的组分

    洗涤缓冲液

    3mM Tris-HCl，pH 8.6

    0.01％ 吐温-20

    0.75％ Triton X-100

    用于抗BrdUTP单克隆抗体

    25mM Bis-Tris丙烷pH 8.9

    250mg/ml脱脂奶粉

    0.01％ 吐温-20

    1％    Triton X-100

    1.92mM NaN3

    碱性磷酸酶底物溶液

    200mM Tris-HCl，pH 9.8

    1mM MgCl2

    0.5mg/ml pNPP

    3.9mM  NaN3表5从Cavidi Tech的Lenti RT分析和本发明的改进分析中获得的RT酶浓度与OD值之间的关系

                         Cavidi Tech的

                         Lenti RT分析       改进分析

          pg/ml      3小时RT/30分钟AP   3小时RT/30分钟AP

          1240             1.274              nd

          551              0.594              nd

          245              0.332              9.999

          109              0.175              1.837

          48.4             0.108              0.989

          21.5             0.070              0.525

          9.6              0.052              0.264

          4.25             0.046              0.174

          1.89             0.054              0.121

          0.839            0.041              0.101

          0.373            0.042              0.091

          0.166            0.040              0.081

          0.074            nd                 0.075

          0.033            nd                 0.075

          0                0.042              0.078

         pg/ml          过夜RT/2小时AP          过夜RT/2小时AP

         1240               9.999                     nd

         551                9.999                     nd

         245                9.999                     9.999

         109                9.999                     9.999

         48.4               1.91                      9.999

         21.5               0.961                     9.999

         9.6                0.55                      9.999

         4.25               0.267                     2.283

         1.89               0.148                     1.134

         0.839              0.094                     0.6

         0.373              0.075                     0.334

         0.166              0.056                     0.198

         0.074              nd                        0.144

         0.033              nd                        0.124

         0                  0.048                     0.094

         pg/ml          过夜RT/过夜AP             过夜RT/过夜AP

         1240               9.999                     nd

         551                9.999                     nd

         245                9.999                     9.999

         109                9.999                     9.999

         48.4               9.999                     9.999

         21.5               9.999                     9.999

         9.6                9.999                     9.999

         4.25               2.217                     9.999

         1.89               1.155                     9.999

         0.839              0.595                     9.999

         0.373              0.403                     2.289

         0.166              0.191                     1.171

         0.074              nd                        0.701

         0.033              nd                        0.577

         0                  0.115                     0.251nd＝未进行表6

    从Cavidi Tech的Lenti RT分析和本发明的改进Lenti RT分析中获得的k值来自Cavidi Tech的Lenti RT分析改进的分析 K值K值3小时RT/30分钟AP 0.00123小时RT/30分钟AP0.0165过夜RT/2hrAP 0.0432过夜RT/2hrAP0.5145过夜RT/过夜AP 0.5453过夜RT/过夜AP5.2827参考文献Baltimore D.(1970)RNA肿瘤病毒的毒粒中的RNA依赖的DNA聚合酶。  RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour  viruses.Nature 226：1209-1211。Baltimore D，Smoler D(1971)RNA肿瘤病毒的DNA聚合酶对引物的  要求和模板特异性。Primer requirement and template specificity  of the DNA polymerase of RNA tumor viruses.PNAS 68，1507-  11.Barre-Sinoussi F，Chermann JC，Rey F，Nugeyre MT，Chamaret S，  Gruest J，Dauguet C，Axler-Blin C，Vezinet-Brun F，Rouzioux  C，Rozenbaum W，Montagnier L(1983)。从可能患有获得免疫力  缺陷综合症(AIDS)的患者体内对一种嗜淋巴细胞反转录病毒的分  离。Isolation of a Tlymphotropic retrovirus from a patient at  risk for acquired immune deficiency syndrome(AIDS).Science  220(4599)：868-71。Bird RE，Chang-Yeh A.(1996)用于在一种样品中使用酸性pH或提  高的温度来检测病毒的转录酶的方法和试剂盒。Methods and kits  for detecting viral transcriptase activity in a sample using  an acidic pH or an elevated temperature.US5817457。Di Cristofano A，Strazullo M，Longo L，La Mantia G(1995)ZNF80  基因座的鉴定和基因组定位：该锌指基因的表达由ERV9内生反转录  病毒家族的单生(solitary)LTR控制。Characterization and  genomic mapping of the ZNF80 locus：expression of this  zinc-finger gene is driven by a solitary LTR of ERV9 endogenous  retroviral family.Nucleic Acids Res 23(15)：2823-30。Duvic M(1995)人类免疫力缺陷病毒和皮肤：争议选编。Human  immunodeficiency virus and the skin：selected controversies.  J Invest Dermatol 105(1 Suppl)：117S-121S。Eberle J，and R.Seibl.(1992)一种通过ELISA来测量反转录酶活  性的新方法。A new method for measuring reverse transcriptase  activity by ELISA.J.Virol.Methods 40：347-356。Ekstrand D.H.L.，Awad R.J-K.，Kllander C.F.R.and Gronowitz  J.S.(1996)一种用于RT活性的检测和定量的敏感分析，该分析基  于同载体结合的模板和非放射性产物检测的使用，本分析特别涉及  到HIV分离A sensitive assay for the detection and  quantification of RT activity，based on the use of carrier  bound template and non-radioactive product detection，with  special reference to HIV isolation.Biotechnology and Applied  Biochemistry.23，95-105。Faff O，Murray AB，Schmidt J，Leib-Msch C，Erfle V，Hehlmann  R，Thelen K，Lwer J，Kurth R(1992)。来自人类T47D细胞系  的类似反转录病毒的粒子同小鼠乳腺肿瘤病毒相关，并且来自人类  内生来源。Retrovirus-like particles from the human T47D cell  line are related to mouse mammary tumour virus and are of human  endogenous origin.J Gen Virol 73：1087-97。Ghosh SS，Musso GF(1987)寡核苷酸同固相支持物的共价结合。  Covalent attachment of oligonucleotides to solid supports。  Nucleic Acids Res 15(13)：5353-72。Goff S.P.(1990)反转录病毒的反转录酶：合成，结构与功能。  Retrovirus reverse transcriptase：Synthesis，Structure and  Function.Review.J.Acquir.Imm.Defic.Syndr.3：817-31。Gregorius K，Mouritsen S，Elsner HI(1995)水包埋  (hydroconting)：一种将生物大分子同固相偶联的新方法。  Hydrocoating：a new method for coupling biomolecules to solid  phases.J Immunol Methods 181(1)：65-73。Gronowitz JS.，Neumüller M.，Lennerstrand J.，Bhikabahai R.，  Unge T.，Weltman H & Kllander CFR.(1991)用于单管反转录  酶分析和组合纯化和活性分析的结合有载体的模板，该模板特别同  HIV相关。Carrier bound templates for single tube reverse  transcriptase assays and for combined purification and  activity analyses，with special reference to HIV.  Biotech.Appl.Biochem 13：127-142。Gupta，P.，Balachandran，Grovit，K.，Webster，D.，and Rinaldo.  C.(1987)J.Clin.Microbiol.25，1122-1125。Heneine W，Yamamoto S，Switzer WM，Spira TJ，Folks TM.(1995)  在来自人类免疫缺陷病毒类型I的感染者的血清中通过一种高灵敏  度分析进行的反转录酶活性检测。Detection of reverse  transcriptase by a highly sensitive assay in sera from persons  infected with human immunodeficiency virus type 1.J Infect  Dis 171：1210-1216。Heneine W，Folks；Thomas M，Switzer W M，Yamamoto S.(1995)用  于反转录酶的灵敏检测的方法。Methods for sensitive detection  of reverse transcriptase.US5849494：Jackson，B.，Sannerud，K.，Rhame，F.，Tsang，R.，and Balfour，  H.H.(1987)Diagn.Microbiol.Infect.Dis.7，185-192。Krieg AM，Steinberg AD(1990)反转录病毒和自体免疫。Retroviruses  and autoimmunity.J Autoimmun.3(2)：137-66。Krieg AM，Gourley MF，Perl A(1992)内生反转录病毒：自休免疫  中的可能的病原物质。Endogenous retroviruses：potential  etiologic agents in autoimmunity.FASEB J 6(8)：2537-44。Kllander CFR，Gronowitz JS，Neumüller TM，Karlstrm RA，  Lngstrm-Persson UM.(1988)。用于聚合酶活性测定的方法。  Method for polymerase activity determination.Svensk patent  no 8804344-3，EP 0 447 442 B1。Lee M.，Sano K.，Morales F.E.，and D.T.Imagawa.(1987)检测  人类免疫缺病毒和对其进行定量的敏感的反转录酶分析。Sensitive  reverse transcriptase assay to detect and quantitate human  immunodeficiency virus.J.Clin.Microbiol.25：1717-21。Leib-Msch C and Seifarth W(1996)人类反转录元件  (retroelements)的进化和生物学意义。Evolution and biological  significance of human tetroelements.Virus genes 11：133-145。Lwer R，Lwer J，Kurth R(1996)我们所有人体内都具有的病毒：  人类内生反转录病毒序列的特征化和生物学意义。The viruses in  all of us：characteristics and biological significance of  human endogenous retrovirus sequences.Proc Natl Acad Sci U  S A 93(11)：5177-84。Martinelli SC，Goff SP(1990)在Moloney鼠白血病病毒中的一个  缺失突变通过同近缘相关的内生前病毒进行重组而迅速回复。Rapid  reversion of a deletion mutation in Moloney murine leukemia  virus by recombination with a closely related endogenous  provirus.Virology 174(1)：135-44。Meese E，Gottert E，Zang KD，Sauter M，Schommer S，Mueller-  Lantzsch N(1996)人类内生反转录病毒元件K10(HERV K10)：通  过体细胞杂合体作图和荧光原位杂交而进行染色体定位。Human  endogenous retroviral element k10(HERV-K10)：chromosomal  localization by somatic hybrid mapping and fluorescence in  situ hybridization.Cytogenet Cell Genet 72(1)：40-2。Neumüller M.，Karlstrm A.R.，Kllander C.F.R.，and J.S.  Gronowitz。(1990)通过使用酶法合成的5-(125I)碘-2’-脱氧尿  苷酸三磷酸而进行的DNA多聚化酶的改进分析，该分析通过抗HIV  反转录酶抗体的直接定量和血清DNA聚合酶分析而阐示。Improved  assays for DNA-polymerizing enzymes by the use of  enzymatically synthetized 5-(125I)iodo-2’deoxyuridine  triphosphate，illustrated by direct quantitation of anti-HIV  reverse transcriptase antibody and by serum DNA polymerase  analyses.Biotech.Appl.Biochem.12：34-56。Niveleau A，Sage D，Reynaud C，Bruno C，Legastelois S，Thomas  V，Dante R(1993)半抗原、蛋白质和核酸同修饰过的聚苯乙烯支  持物的共价连接。Covalent linking of haptens，proteins and  nucleic acids to a modified polystyrene support.Immunol  Methods 159(1-2)：177-87。Porstmann T.，Meissner K.，Glaser R.，Dpel S-H.，and G.Sydow。  (1991)对HIV相关的反转录酶特异的敏感的非放射性分析。A  sensitive non radioactive assay specific for HIV associated  reverse transcriptase.J.Virol.Meth.31：181-188。Rasmussen SR，Larsen MR，Rasmussen SE(1991)DNA在聚苯乙烯微  孔上的共价固定化：该分子反在5’末端进行结合。Covalent  immobilization of DNA onto polystyrene microwells：the  molecules are only bound at the 5’end.Anal Biochem  198(1)：138-42。Silver J，Maudru T，Fujita K and Repaske R.(1993)一种用于  反转录酶活性的能够检测单个毒粒的RT-PCR分析。An RT-PCR assay  for the enzyme activity of reverse transcriptase capable of  detecting single virions.Nucleic Acids Res 21：3593-3594。Temin HM，Mizutani S.(1970)在劳氏肉瘤病毒的毒粒中的RNA依赖  的DNA聚合酶。RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous  sarcoma virus.Nature 226：1211-1213。Tnjes RR，Boller K，Limbach C，Lugert R，Kurth R.  Characterization of human endogenous retrovirus type K  virus-Like particles generated from recombinant  baculoviruses。(1997)产自重组杆状病毒的人类内生反转录病毒  类型K病毒样颗粒的鉴定。Virology 233(2)：280-91.Urabe T，Sano K，Nakano T，Odawara F，Lee MH，Otake T，et al。  (1994)通过非放射性同位素反转录酶类型分析对人类免疫缺陷病毒  类型1(HIV-1)和HIV-2进行区分。Differentiation between  human immunodeficiency virus type 1(HIV-1)and HIV-2 isolates  by nonradioisotopic reverse transcriptase-typing assay.J  Clin Microbiol；32：1870-75。Urnovitz HB，and Murphy WH(1996)人类内生反转录病毒：天然性  质、发生和在人类疾病中的临床上的牵涉。Human endogenous  retroviruses：Nature，occurrence，and clinical implications  in human disease.Clin Microbiol Rev 9：72-99。Weiss R：人类RNA肿瘤病毒研究。The search for human RNA tumor  viruses.In R Weiss，N Teich，H Varmus，and J Coffin(eds)RNA  肿瘤病毒(第二版，第一集)。RNA Tumor viruses(2nd ed vol 1)1205  1281.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，  New York，1984。Wilkinson DA Mager DL and Leong J-A(1994)。内生人类反转录病  毒。“反转录病毒科”Endogenous human retroviruses.In“The  Retroviridae”(JA Levy，Ed)，vol 3，pp 465-535.3 vols Plenum  Press，New York。Zammatteo N，Girardeaux C，Delforge D，Pireaux JJ，Remacle J  (1996)聚苯乙烯微孔的胺化：对用于杂交分析的DNA探针的共价植  入的应用。Amination of polystyrene microwells：application to  the covalent grafting of DNA probes for hybridization assays.  Anal Biochem 236(1)：85-94。Zinkernagel RM，Cooper S，Chambers J，Lazzarini RA，Hengartner  H，Arnherter H(1990)针对一种转基因病毒抗原的病毒诱导的自  体抗体反应。Virus-induced autoantibody response to a  transgenic viral antigen.Nature 345：68-71。