一种重组卡介苗菌株建立及其应用 本发明涉及到外源基因，用电转化法导入卡介苗(Bacilluscalmette-Guerin，BCG)中，构建新的菌株(重组卡介苗即rBCG-GFP-IL-2)。该菌株已于2000年7月21日由中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC NO：M 200012。提议的分类命名为：重组卡介苗(分支杆菌)(Mycobacterium sp.rBCG-GFP-IL-2)。并利用外源基因及其表达产物的特性鉴定新的菌株。同时用动物实验证明了重组卡介苗和猪苓多糖的协同抗肿瘤作用。
目前，膀胱癌的治疗仍以手术为主，但术后复发率较高，如何合理用药控制术后复发及消除残存癌细胞是当今急需解决的问题，作为生物反应调节剂卡介苗的膀胱腔内灌注预防术后复发。已取得了肯定的疗效，但其疗效机理仍处于推测阶段，是目前研究的热点。
由于膀胱癌患者血和尿中白介素2(Interleukin-2，IL-2)的活性低下，也影响其疗效，用卡介苗加IL-2联合灌注可协同提高机体的主动免疫和被动免疫功能，治疗患者22例，复发率仅为12％，证实卡介苗和IL-2的联合用药疗效优于单用卡介苗，但部分病人出现卡介苗引起的膀胱刺激症状。如何减少治疗中出现的副作用，提高疗效是目前要解决的问题。
本发明利用绿色荧光蛋白(Green Fluerence Protein，GFP)作为报告基因，在穿梭质粒中插入IL-2基因，构建复合表达绿色荧光蛋白和白介素2的重组卡介苗(rBCG-GFP-IL-2)，其方法是用碱变性法从质粒(Dmut)和(PZS-III-I)分别用限制性内切酶(BamHI)和(EcoRI)消化DNA，分别获得质粒片段和IL-2片段，再用T4连接酶连接，转化大肠杆菌。在含卡那霉素琼脂培养平板上筛选阳性重组子，从而获得新的重组质粒(pDGFP-IL-2)，获得的新重组质粒经扩增后，再用电转化法，转化卡介苗，获得新的重组卡介苗菌株。这种新的rBCG-GFP-IL-2菌株除具有卡介苗的免疫刺激作用外，还兼有IL-2的功能。本发明利用rBCG-GFP-IL-2菌株研究和阐明卡介苗的作用部位和作用机理外，同时用猪苓多糖(polyporus umbellatuspolysacride)弥补生物制剂的不足之处和协同作用，从而建立一种有效消除肿瘤细胞的方法，其疗效已在动物实验证明。
由于选用具有抗癌和利水渗湿地中药猪苓多糖，它可弥补单用生物反应调节剂治疗的不足之处，协同卡介苗和IL-2的抗癌作用。已研究证明，猪苓多糖具有免疫和抑瘤活性，它能抑制小鼠S180腹水瘤细胞内DNA的合成及cAMP磷酸酯酶活性，可使6～7％荷瘤小鼠肿瘤完全消退，它与卡介苗和用可增强正常人外周血单个核细胞中免疫细胞的杀伤活性，同时还发现猪苓多糖需要IL-2作为第一信号激活免疫细胞后可发挥更强的杀伤作用，说明猪苓多糖，卡介苗及细胞因子在治疗膀胱癌方面不是独立的，而是有它们之间的内在联系和协同作用，克服了过去单用IL-2半衰期短，用量大和毒性强的特点。将报告基因(GFP)和IL-2基因，通过穿梭质粒同时导入卡介苗构成了rBCG-GFP-IL-2新菌株，这种菌株具有表达IL-2的功能，又能作为猪苓多糖作用的第一信使，其次是能表达绿色荧光蛋白，作为一种分子探针，追踪重组卡介苗的作用部位。
本发明的积极效果：
1.重组卡介苗(rBCG-GFP-IL-2)具有卡介苗和IL-2功能，并减少单用IL-2时，用量大，毒性强的特点，局部表达量可能增加，还可作为猪苓多糖作用的第一信使；
2.重组卡介苗(rBCG-GFP-IL-2)由于能表达GFP，用荧光显微镜观察病理切片时，可观察到自发荧光亮点，对机理研究有重要意义；
3.猪苓多糖除具有协同重组卡介苗抗癌作用外，还可减轻其的不良反应：
4.三者有机结合，互相取长补短，从而提高疗效，并对新机理的发现提供客观依据。
以下就本发明的实施、试验事例举例说明：
1.重组卡介苗(rBCG-GFP-IL-2)作用机理研究。
方法：在小鼠左大腿外侧注射重组卡介苗，一周后取接种部位组织冰冻切片，在荧光显微镜下观察，可见注射rBCG-GFP-IL-2的组织切片发生明亮的绿色荧光，而对照组则无荧光，用rBCG-GFP-IL-2与T24细胞共培养后，在激光共聚焦显微镜下也可观察到绿色荧光，该菌株可用于卡介苗或重组卡介苗作用机理研究。
2.重组卡介苗加猪苓多糖联合治疗肿瘤材料：细胞株，黑色素瘤细胞株B16，小鼠：清洁级NIH小鼠，28-32g重。方法：体外培养的黑色素瘤细胞株B16，调整浓度至5×105个/ml，取200ul接种于小鼠左大腿外侧皮下，然后在局部分别注射重组卡介苗和重组BCG加猪苓多糖，并设立对照组，治疗后处死小鼠，切下左后肢，剥去表皮，测量肿瘤大小。