用于活细胞培养的工艺和支撑结构 【技术领域】
本发明涉及一种根据权利要求1的前序部分所述的活细胞培养工艺，并且涉及一种包括结晶纤维素的结构的应用。本发明还涉及一种根据权利要求8的前序部分所述的用于活细胞培养的纤维素支撑结构制造工艺，根据权利要求16至18的前序部分所述的用于活细胞培养的支撑结构，以及一种根据权利要求19的前序部分所述的用于制造支撑结构的中空模具。
背景技术
常常希望体外培养诸如已从器官获取的细胞的活细胞，以将培养好的细胞移植到同一器官中，并因此获得或者修复组织机能。体外培养细胞或者细胞组织通常还称为“组织工程”。该组织优选地为与硬组织或者骨组织相对的软组织，例如皮肤、肌肉或者脂肪组织。
已知在诸如培养瓶或者培养碟的培养皿中培养活细胞，培养皿覆盖有培养基，活细胞在培养皿的底部上形成单层(“二维”)细胞层。然而，就细胞的特性而言，如此培养的细胞与器官内组织单元中体内发现的同种类型的细胞不同，这会相当大地削弱它们的诊断和治疗价值。
活组织通常包括大量借助于信号分子相互影响的未分化细胞，并假定细胞使其自身适应于小分子物质的浓度梯度内，且能够以特定的方式起作用。术语“位置信息”也可在用在这里。在组织细胞之间存在称之为细胞外基质的支撑结构，其包括由细胞释放的大分子，并将细胞稳定在它们各自的位置中。如果细胞外基质遭到破坏，并且细胞混合，则通常情况下，变异的体细胞不再能自身重排和重建失去了的结构。但是，已经发现如果使这些细胞与适当的相邻细胞形成它们原始的空间关系，则它们就能恢复正常机能。
已知方法试图通过在还称之为支架的专用支撑结构内“三维”培养细胞来再造细胞外基质。支架是具有较大的内表面积的至少呈泡沫状、多孔结构。
可生物降解(“可消溶的”)材料的支架是已知的。这些是已提到过的，此外，使在支架内逐渐生长的细胞能由它们自身的细胞外基质来取代支架。
美国已公开的专利申请US 2005/0063939A1描述了一种适用于组织工程的支架，该支架包括一种包含柠檬酸的可生物降解的弹性聚合物。欧洲专利说明书EP 1 053 757 B1描述了一种胶原质(凝胶体)的载体材料。国际已公开的专利申请WO 2006/099137A1描述了一种用于伤口愈合的支架，该支架包括交联的纤维蛋白和/或白蛋白。国际已公开的专利申请WO 2002/062961公开了利用肽制造支架，其中肽将其自身排列在较大的单元(“自组装”肽)中以包埋细胞。
使用可消溶材料的可能存在的缺点是，它们分解得太快而不能确保必需的机械稳定性。特别地，存在如下风险，即借助于可消溶支架制造的器皿将不能可靠地承载血液。另一个可能的缺点是留有残积物，这启动了异体反应或排斥反应。因为这些和其它原因，也已推荐使用不可消溶材料的支架。
说明书WO 03/070084描述了一种由诸如尼龙、硅橡胶、硅树脂、聚氨酯和聚酯的不可消溶纤维制造的用于血管再造的管状支架。国际已公开的专利申请WO 2006/096791公开了多种可消溶和不可消溶的合成聚合物的应用，这些聚合物目前可用于制造所谓的纳米丝，由这些纳米丝来构造涂层支架。不可消溶材料的缺点在于，它们至少启动了轻微的组织反应。此外，在长期植入体内的情况下，材料将有可能遭到侵蚀和破坏。
在体外培养细胞或组织时，必需采取措施向细胞供给养分和/或氧。欧洲已公布的专利申请EP 1 230 939 A1描述了一种由猪的部分胃肠道制备的初生血管组织基质。在制备过程中，要确保存在带有输入动脉和输出静脉的完整的血管分支。当通过所谓的去细胞方法去除动物细胞时，将要将合成的基质注满血液，并繁殖人类细胞。如此，能够将充足的养分、矿物质和氧供应至更多的细胞和更大的层厚。然而，可能存在的缺点是，所使用的基质包含相当多的动物蛋白和其它潜在的抗原分子。另一个可能存在的缺点是，基质的动物源使工艺更难标准化。
国际已公开的专利申请WO 2006/042287A2公开了一种用于在组织工程中使用的具有微通道的多层支架，该支架上涂敷有细菌纤维素。然而，此处描述的支架本质上优选地用于培养软骨组织，并对于移植而言只有有限的适用性。特别地，不清楚是怎样实现利用细菌纤维素进行涂覆的，这是因为所述过程既没有产生均匀的层，又没有指出该层是怎样粘着于基层的。
国际已公开的专利申请WO 2001/61026A1公开了一种细菌源性微晶纤维素的中空体的制造工艺，中空体是可移植入老鼠的颈动脉中而不会出现诸如异体反应或血栓症的副作用的。但是，此处描述的工艺仅仅适于制造长度约为20mm的中空体。
【发明内容】
本发明所要解决的问题
本发明的目的在于，提供一种用于培养活细胞的改良工艺。本发明另外的目的在于，提供一种包括结晶纤维素的结构的新应用。本发明的另一个目的在于，提供一种包括结晶纤维素的支撑结构的改良的制造工艺，和一种用于培养活细胞的改良的支撑结构，以及一种用于制造包括结晶纤维素的支撑结构的改良的中空模具。
根据本发明的解决方案
为了实现该目的，本发明讲授了一种具有权利要求1所述特征的用于培养活细胞的工艺，一种具有权利要求7所述特征的包括结晶纤维素的结构的应用，一种具有权利要求8所述特征的支撑结构的制造工艺，具有权利要求16、17或18所述特征的支撑结构和一种具有权利要求19所述特征的中空模具。
可将根据本发明的支撑结构在细胞的培养中有利地用作细胞外基质的取代物。
本发明的一个方面是，在用于活细胞培养的支撑结构的制备中，它使用结晶纤维素的有利特性，该结晶纤维素优选地是天然形式的微晶纤维素，例如由醋酸菌菌种的细菌制成的微晶纤维素。
本发明可实现的优点在于，支撑结构是无毒且无免疫性的。特别地，对于支撑结构，在移植在诸如人类器官的器官中后，不会启动异体反应或免疫反应，或仅启动减小的异体反应或免疫反应。
本发明的另一个可实现的优点在于，不消溶该支撑结构。因此在细胞的培养过程中或甚至是在其后长期内，能够特别确保较大的机械稳定性。
可实现的优点在于，虽然不消溶该支撑结构，但它并不妨碍，或几乎不妨碍体外和体内的细胞培养，这尤其因为一种具有低纤维素含量的结构已能确保高稳定性，并且支撑结构的其余部分可主要由水组成。特别地，这能确保信号分子的替代和/或信号分子梯度的增大，这对细胞的培养是非常重要的。它还有助于确保支撑结构对于细胞外基质的形成或附着不构成妨碍或仅构成轻微的妨碍。可实现的附加优点是，支撑结构具有类似于目标组织的机械特性。就基本特性而言，本发明使得利用根据本发明的支撑结构培养的组织与其中不存在纤维素的组织没有不同或仅有少量不同。
本发明的可实现的优点是可利用模具制造支撑结构。特别地，可在天然示例上设计或模仿适合于特定目的的结构。
根据本发明的用于制造根据本发明的支撑结构和中空模具的工艺方面利用了“破坏模具”原则。
根据本发明的用于制造根据本发明的中空模具的工艺可实现的目的是，在脱模过程中凹部不再构成障碍。因此，特别地，以简单的方式使用甚至是具有复杂形状的中空模具也是可能的。特别地，可实现的优点是可以简单的方式制造甚至是具有复杂形状的支撑结构，特别是具有凹部的支撑结构。
本发明能用于例如以这样的方式体外单独或共同培养不同的细胞类型，以致从那里形成可对其进行长期研究的更大的组织单元。根据本发明的工艺和根据本发明的支撑结构特别适于三维培养诸如哺乳动物细胞的细胞。培养工艺和支撑结构还可用于活组织的制备和/或再生，特别是人体器官或组织的制备和/或再生。本发明能用于再造天然组织的细胞外结构，这继而繁殖在那些组织中自然产生的细胞类型。
在细胞或组织已经体外培养后，将它们移植到例如活体内，特别是哺乳动物内，特别是人类内。然而，还可想到，在不对它进行预先繁殖的情况下移植支撑结构以允许进行体内繁殖。通过设置该结构，支撑结构能启动体内细胞的自组织。以那种方式，本发明
首次提供了体内逐一且稳定地重建(软)组织的
可能性。
根据本发明的解决方案的构成和进一步发展
支撑结构优选地包括结晶纤维素。支撑结构优选地主要由水和结晶纤维素、特别优选地由微晶纤维素组成，就像由醋酸菌菌种的细菌形成的一样。优选材料包括小于10％的结晶纤维素。在优选材料中，将水以部分且具有变化强度的方式结合于微晶纤维素。在试验中已证明结晶纤维素是组织亲和性特别好的。纤维素形成的生物体优选地是细菌，特别优选地是醋酸菌菌种的细菌。可以想象到其它同样待使用的纤维素形成的微生物，例如土壤杆菌、根瘤菌、八叠球菌、假单胞菌、无色菌、气杆菌和菌胶团的适当菌种。因为醋酸菌的纤维素合成的复合酶的基因是已知的，因此，利用已知的分子生物学工艺，还可将它们引入到例如大肠杆菌的其它微生物内，其结果这些生物体也能合成纤维素。结晶纤维素和其它材料的结合体构成的支撑结构同样是可以想象的，但是，例如具有例如在国际已公开的专利申请WO 2006/096791中所公开的合成可消溶或不可消溶聚合物。将上述说明书的相关内容全部以参引的方式结合到本公开中。还可想到的是，支撑结构包括如在例如欧洲专利说明书EP 1 053 757中公开的胶原质、如在国际已公开的专利申请WO 2006/099137A1中所公开的纤维蛋白和/或清蛋白、如在例如欧洲已公开的专利申请EP 1 230 930 A1中所公开的细胞化的天然组织。将上述说明书的相关内容全部以参引的方式结合到本公开中。其它材料优选地基本上完全由结晶纤维素所包裹。
特别优选的支撑结构在其内部具有多个彼此分离的空隙。空隙可以是例如球状的或可形成管状通道，特别优选地为螺旋通道。空隙通过诸如管状通道的开口特别优选地连接于支撑结构的外部。本发明的该实施方式可实现的优点是待培养的细胞或待培养的细胞的前体能自外部通过开口进入空隙。还可想到诸如营养培养基或血液的基质流过其内已安放有细胞的空隙，以向细胞供给营养和氧或借助于流动影响细胞的成长。开口还能用于使诸如角蛋白的细胞产物能够传到外部。
优选的支撑结构包括在至少一个位置中分支的至少一个管状空隙。特别优选地，这些分支中的至少一些分支在不同的位置处再次会聚。特别优选地，支撑结构包括类似于血管系统的由分支的管路和再会聚的管路构成的系统。空隙优选地在至少两个位置中通过开口连接于支撑结构的外部。特别优选地，空隙分支的位置和分支再次会聚的位置布置在空隙通过开口连接于支撑结构的外部的两个位置之间。本发明的该实施方式可实现的优点是，诸如营养液或血液的液体能穿过分支，将液体在两个位置中的第一位置引入，并在第二位置再次去除。
在根据本发明的纤维素构成的支撑结构的制造工艺中，该纤维素优选地是结晶纤维素。纤维素形成的生物体优选地是细菌，特别优选地是醋酸菌菌种的细菌。描述了多种营养培养基用于培养醋酸菌。常用的适当培养基是1954年第58期生化期刊(Biochemical Journal)第345‑352页中所描述的Schramm‑Hestrin培养基。将上述论文的相关内容全部以参引的方式结合到本公开中。这种培养基的缺点是由于它包含酵母抽提物和蛋白胨，因此它不能精确地予以限定。
一种完全合成的培养基对于执行本发明来说是首选的，这种合成的培养基如由Forng等人于1989年在第55卷第5期应用与环境生物学报(Applied and Environmental Biology)第1317‑1319页所描述的培养基。将上述论文的相关内容全部以参引的方式结合到本公开中。这种培养基的缺点是细菌生长得稍缓。
还可想到利用所谓的红茶菌来执行本发明。这种培养物不仅包括醋酸菌，还包括许多其它共生的生物体，例如酵母和细菌，并能完全由红茶和蔗糖(100g/l)组成的培养物支撑。
在根据本发明的制造工艺中，例如，通过塑性变形，通过破损所导致的外形损失，或优选地通过熔化或蒸发所导致的转变为集合体的液态或汽态的至少部分相变会发生不可逆变形。但是，本发明的实施方式同样是可想象的，在这些实施方式中变形由例如借助于溶剂的化学处理，或例如借助超声波的机械处理来实现。中空模具在脱模步骤中不可逆地变形的部分优选地在变形前靠近形成在中空模具中的纤维素。使中空模具脱模的步骤优选地在支撑结构已经完全充满中空模具后执行。
在根据本发明的制造工艺的优选实施方式中，中空模具包括外部模具和至少一个模芯。本发明的这个实施方式可实现的优点是，具有空隙的支撑结构可利用中空模具形成。模芯优选地为中空模具在脱模时发生不可逆变形的部分。本发明的这个实施方式的一个方面是，它不使用从一旦脱模就被取回的模具的现有技术中所获知的原理。中空模具还可包括多于一个的模芯。在具有多个模芯的情况下，优选地至少一个模芯、特别优选地全部模芯在脱模步骤中不可逆地变形。在脱模过程中，模芯优选地至少部分经过热处理。脱模步骤优选地包括至少部分地熔化该模芯。使整个模芯或仅使模芯的特定部分熔化是可能的。例如，可以想象的是，模芯包括一种或多种不可熔组分，这些不可熔组分接合一种或多种可熔组分，优选地由该一种或多种可熔组分保持在一起。
在本发明的优选实施方式中，中空模具在脱模步骤中熔化的部分的熔点高于28℃，特别优选地为30℃或高于30℃，尤其优选地为60℃或高于60℃。本发明的这个实施方式可实现的优点是，在纤维素的培养过程中模芯保持稳定。在本发明的优选实施方式中，中空模具在脱模步骤中熔化的部分的熔点低于100℃，特别优选地低于80℃，尤其优选地为62℃。本发明的这个实施方式可实现的优点是，当熔化模芯时，并不损害纤维素支撑结构。
在中空模具的脱模过程中，将模芯优选地充分地去除，特别优选地定量地，也就是说不留残余物地去除。
模芯在脱模过程中熔化的部分优选地是基本上疏水的。本发明的这个实施方式的一个方面是由这样一个事实构成的应用，即疏水材料受到纤维素体的亲水表面的排斥。本发明的这个实施方式可实现的优点是可将中空模具充分定量地去除。
在本发明的优选实施方式中，模芯在脱模过程中熔化的部分包括热塑性材料，特别优选地包括热塑性蜡和/或聚合物材料。热塑性材料的模芯可实现的优点是，它们可用浇铸法制造。蜡和/或聚合物材料的另一个优点是，可简单地用磨光法使它们的表面平滑，以便有助于合成纤维素的紧密附着。
优选的蜡和/或聚合物材料包括聚乙烯醇(PVA)，特别优选地其数量大于1％，尤其优选地大于50％。在本发明的特别优选的实施方式中，蜡和/或聚合物材料基本上完全由聚乙烯醇构成。本发明的这个实施方式可实现的优点是，在将中空模具去除后，能避免留下有毒残余物，这是因为聚乙烯醇是无毒的。
另一种优选的蜡和/或聚合物材料是在牙科中已知的所谓“夏蜡(summer wax)”。本发明的这个实施方式可实现的优点是，即使保持类似装饰的设计结构，该材料也是如此机械稳定的。本发明的这个实施方式可实现的优点是，在将中空模具去除后，能避免留下有毒残余物，这是因为夏蜡是无毒的。
在优选的制造工艺中，模芯具有在至少一个位置中分支的至少一个束。这些分支中的至少一些分支优选地在不同的位置中再次会聚。本发明的这个实施方式可实现的优点是可在支撑结构中形成一种类似于血管系统的由分支管和再会聚的管构成的系统。模芯优选地由蜡丝组成，优选地由从牙科中获知的夏蜡构成的蜡丝组成。这些丝优选地彼此熔合。
一种由该制造工艺制造的优选的支撑结构具有至少一个开口，变形的、优选地为熔化的模芯或其残余物可通过该开口离开支撑结构的内部。优选的支撑结构在其内部具有至少一个凹部，优选地使完全充满中空体内部的刚性模芯在不使模芯变形的情况下不能自中空体中去除掉。支撑结构优选地在内部具有至少一个空隙，该空隙仅通过穿过其横截面小于空隙的横截面的窄部自外部是可接近的。
【附图说明】
下文参照简图和实施方式更为详细地描述本发明。图中：
图1以简图的形式示出了用于根据本发明的支撑结构制造工艺的模芯的第一实施方式的第一立体图；
图2以简图的形式示出了用于根据本发明的制造工艺的模芯的第一实施方式的第二立体图；
图3以简图的形式示出了用于根据本发明的制造工艺的模芯的第二实施方式的立体图；
图4以简图的形式示出了用于实现根据本发明的制造工艺的装置的横截面视图；
图5以简图的形式示出了根据本发明的支撑结构的实施方式的立体图。
【具体实施方式】
图1和图2示出了装置1，该装置1用于制造由诸如夏蜡形成的螺旋缠绕蜡丝构成的适当模芯2、3所构成的纤维素支撑结构。将细丝布置在两个平面中，每个平面中的细丝基本上彼此平行定向。第一平面中的蜡丝2以相对于第二平面的蜡丝3成例如90°的角度定向。两个平面直接彼此叠置，并且在图1中仅出于清楚的目的以偏置的方式示出。在一些位置中，第一平面的细丝2接触第二平面的细丝3。螺旋蜡丝可在例如挤压工艺中制造而成。装置1适于制造具有螺旋空隙的纤维素支撑结构，一些螺旋空隙通过通路彼此连接。
一种用于根据本发明的支撑结构制造工艺的模芯的第二实施方式示于图3中。将例如直径约为50‑100um的球状蜡滴4悬挂于例如蜡丝或钢丝5的细线上，这些细线5锚固于例如板6的本体6。该装置适用于制造具有多个球状空隙的支撑结构，这些球状空隙由蜡滴4制成，将所述空隙通过由金属丝5产生的狭窄通道连接于支撑结构的外部。
一种用于实现根据本发明的支撑结构制造工艺的装置的实施方式示于图4中。无菌器皿7充满了无菌营养液8，该无菌营养液8包括20g葡萄糖、5g酵母抽提物、5g细菌蛋白胨、2.7g磷酸钠和1.15g一水柠檬酸，该无菌营养液8ph 6.0，并与经过3天初步培养的醋酸菌(例如，木醋杆菌，DSM No.2325，DSZM Brunswick)一起进行菌体培养。大约7天后，当已在液面上形成厚度约为3mm的纤维素层9时，该层9由特氟隆(ePTFE膨体聚四氟乙烯，例如W.L.Gore and Associates Inc.的GLIDE牙线)制成的网10支撑，该网10被夹持在用载玻片承载的玻璃框架中。将具有多个平面的中空模具与由夏蜡形成的模芯11、12、13一起放置在由网10支撑的纤维素表面9上，并在培养箱中在28℃下进行培养。
中空模具通常花费2到3周来繁殖细菌，并完全充满纤维素。在此期间，必须确保在必要的情况下，更换已经被消耗或被蒸发的培养液8。当中空模具完全充满纤维素时，去除支撑结构并将该支撑结构加热至65℃，以使模芯融化并在支撑结构中留下空隙。同时，加热也用于为支撑结构消毒。
图5示出了已经借助于由蜡丝形成的模芯制成的支撑结构14的示例，其中，蜡丝已经一起熔化以形成一种由分支并再次会聚的束构成的网15。所使用的蜡丝是在牙科领域中可购买到的由夏蜡形成的蜡丝。当纤维素已经完全充满具有以交织的蜡丝15做模芯的中空模具时，将支撑结构去除并加热至65℃，以熔化交织的蜡丝。因此可从支撑结构14中基本上完全去除蜡。留下类似于血管系统的由分支和再次会聚的管形成的空隙。空隙在两个位置中通过通路连接到支撑结构的外部。在空隙通过通路连接到支撑结构14的外部的这两个位置之间设有空隙分支得到位置和分支再次会聚的位置。